CN114113055B - 基于比色化学传感技术检测诺氟沙星的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子检测技术领域，公开了一种基于比色化学传感技术检测诺氟沙星的方法。该方法包括以下步骤：(1)将磁性分子印迹纳米酶与待测样品混合后，经震荡吸附得到诺氟沙星吸附溶液；(2)将所述诺氟沙星吸附溶液与缓冲液、过氧化物、显色底物混合后经反应I得到反应液I，测定所述反应液I的吸光度值，从而测得所述待测样品中的诺氟沙星含量。该方法将对诺氟沙星具有特异性吸附的磁性分子印迹纳米酶与比色化学传感技术相结合，检测灵敏度和准确性高，且检测快速、操作简单、选择性高、重现性和再生性好，回收率符合要求，具有重要的实际应用价值。

Description

基于比色化学传感技术检测诺氟沙星的方法
技术领域
本发明涉及分子检测技术领域，具体涉及一种基于比色化学传感技术检测诺氟沙星的方法。
背景技术
诺氟沙星作为氟喹诺酮类抗生素中一种人畜共用的抗菌药，在动物饲养过程中常用作治疗肠道、呼吸道等系统感染疾病。该药物长期反复使用会在动物体内产生蓄积毒性，经食物链进入人体后，易对人体产生细菌耐药性、过敏反应甚至导致“三致”作用(致癌、致畸、致突变)等严重危害，其残留毒性还会带来生态环境污染。目前食品等样品基质中诺氟沙星残留的检测方法主要有高效液相色谱、色谱/质谱联用技术、酶联免疫分析等，其中色谱分析法仪器设备贵重、样品前处理复杂、需专业人员操作；酶联免疫分析方法相对复杂、反应要求高、容易失活、成本较高，且均需要复杂的样品前处理。
与上述检测方法相比，比色化学传感技术是在反应溶液对光的选择性吸收基础上建立起来的分析技术，可将待测物的浓度信号转换成光学信号，通过肉眼观察颜色变化或利用分光光度计检测溶液吸光度值变化，定性或定量分析待测物浓度。比色化学传感技术具有样品无需标记且用量少、操作简单、检测灵敏度高、检测速度快、实时监测反应动态、环境友好等优点，适用于现场可视化检测。
目前，国内外未见利用比色化学传感技术对诺氟沙星进行定量检测的研究与报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种基于比色化学传感技术检测诺氟沙星的方法，该方法将对诺氟沙星具有特异性吸附的磁性分子印迹纳米酶与比色化学传感技术相结合，检测灵敏度和准确性高，且检测快速、操作简单、选择性高、重现性和再生性好，回收率符合要求，具有重要的实际应用价值。
为了实现上述目的，本发明提供一种基于比色化学传感技术检测诺氟沙星的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将磁性分子印迹纳米酶与待测样品混合后，经震荡吸附得到诺氟沙星吸附溶液；
(2)将所述诺氟沙星吸附溶液与缓冲液、过氧化物、显色底物混合后经反应I得到反应液I，测定所述反应液I的吸光度值，从而测得所述待测样品中的诺氟沙星含量。
优选地，步骤(1)中所述震荡吸附的条件至少满足：转速为80-120rpm、时间为10-15min。
优选地，步骤(2)中所述缓冲液为乙酸-乙酸盐缓冲液，所述过氧化物为过氧化氢，所述显色底物为3，3'，5，5'-四甲基联苯胺；所述反应I的条件至少满足：温度为20-30℃、反应时间为3-6min。
优选地，相对于1g的所述磁性分子印迹纳米酶，所述待测样品的用量为100-150mL、所述缓冲液的用量为500-850mL、所述过氧化物的用量为10-20mmol、所述显色底物的用量为0.2-1mmol。
优选地，所述磁性分子印迹纳米酶的制备方法包括如下步骤：
S1、将含有可溶性三价铁盐的水溶液除氧后，与可溶性二价铁盐、碱溶液混合进行反应II得到反应液II，将所述反应液II经磁分离I收集得到四氧化三铁纳米粒子；
S2、将所述四氧化三铁纳米粒子经四甲基氢氧化铵活化后，与3-氨丙基三乙氧基硅烷混合进行反应III，得到表面氨基化四氧化三铁纳米粒子；
S3、将所述表面氨基化四氧化三铁纳米粒子、诺氟沙星与多巴胺混合进行反应IV后，经磁分离II收集得到所述磁性分子印迹纳米酶。
优选地，步骤S1中所述可溶性三价铁盐、所述可溶性二价铁盐与所述碱溶液中的碱的摩尔比为1:0.35-0.8:3.5-5.5；
所述可溶性三价铁盐选自氯化铁、硫酸铁和硝酸铁中的至少一种，所述可溶性二价铁盐选自氯化亚铁、硫酸亚铁和硝酸亚铁中的至少一种，所述碱溶液选自氢氧化钠-水溶液、氢氧化钾-水溶液和氨水中的至少一种。
优选地，步骤S1中所述反应II的条件至少满足：以通入氮气的方法进行除氧，温度为75-85℃、搅拌速率为500-600rpm、反应时间为0.5-1.5h；
优选地，步骤S1还包括：将所述磁分离I得到的固体A利用水洗涤至pH为6-7，再经真空干燥得到所述四氧化三铁纳米粒子。
优选地，步骤S2中，相对于1g的所述四氧化三铁纳米粒子，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量为2-5mL；
所述反应III的反应溶剂为乙醇-水溶液；
优选地，所述反应III的条件至少满足：以通入氮气的方法进行除氧并进行暗反应，温度为30-50℃、搅拌速率为300-400rpm、反应时间为7-12h。
优选地，步骤S3中，相对于1重量份的所述诺氟沙星，所述表面氨基化四氧化三铁纳米粒子的用量为16-65重量份、所述多巴胺的用量为5-16重量份；
所述反应IV的反应溶剂为乙醇-Tris-HCl溶液；
优选地，所述反应III的条件至少满足：温度为20-30℃、搅拌速率为250-350rpm、反应时间为1-3h。
优选地，步骤S3还包括：将所述磁分离II得到的固体B利用乙醇-乙酸溶液洗涤4-6次，再用水洗涤2-3次，最后经真空干燥得到所述磁性分子印迹纳米酶。
通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的检测诺氟沙星的方法利用磁性分子印迹纳米酶兼具磁性快速分离、分子特异性识别和类过氧化物酶催化活性的特点，有效简化诺氟沙星检测时的前处理步骤，减少背景干扰且缩短检测时间，对诺氟沙星的现场可视化检测具有重要意义。
(2)本发明提供的检测诺氟沙星的方法利用磁性分子印迹纳米酶与诺氟沙星之间的特异性结合，将结合物直接进行比色化学传感检测，有效提高检测的灵敏度和准确度，且操作简单，检测速度快，能够实现对诺氟沙星的快速检测；此外该方法具有良好的特异性、重现性和回收率，可直接对动物源性食品中诺氟沙星的残留进行检测，具有重要的实际应用价值。
附图说明
图1是实施例1中各组离心管中上清液的吸光度值随波长的变化图；
图2是实施例2中MMIP Nanozyme的过氧化物酶活性与循环利用次数的关系图；
图3是实施例3中未富集的MMIP Nanozyme和MNIP Nanozyme，以及分别富集诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、达诺沙星、磺胺嘧啶或者四环素的MMIP Nanozyme和MNIPNanozyme对应的显色反应液在652nm处的吸光度值，其中横坐标a为诺氟沙星、b为环丙沙星、c为恩诺沙星、d为达诺沙星、e为磺胺嘧啶、f为四环素；
图4是实施例4中富集不同浓度诺氟沙星的MMIP Nanozyme引起的紫外吸收光谱图；
图5是实施例4中诺氟沙星的浓度与富集诺氟沙星的MMIP Nanozyme引起的吸光度差值(ΔA)之间的线性关系图；
图6是本发明提供的检测方法对三个不同品牌的牛奶、鸡蛋和猪肌肉中诺氟沙星检测时的吸光度值，其中横坐标a为空白样品、b为牛奶样品A、c为牛奶样品B、d为牛奶样品C、e为鸡蛋样品、f为猪肌肉样品。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供一种基于比色化学传感技术检测诺氟沙星的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将磁性分子印迹纳米酶与待测样品混合后，经震荡吸附得到诺氟沙星吸附溶液；
(2)将所述诺氟沙星吸附溶液与缓冲液、过氧化物、显色底物混合后经反应I得到反应液I，测定所述反应液I的吸光度值，从而测得所述待测样品中的诺氟沙星含量。
本发明的发明人在研究过程中发现，磁性分子印迹纳米酶不仅具有磁性材料的超顺磁性和大量能够特异性吸附诺氟沙星的位点，还具有类过氧化物酶催化特性，进而将磁性分子印迹纳米酶应用于比色化学传感技术检测诺氟沙星。该磁性分子印迹纳米酶不仅能够在样品前处理过程中，利用表面的吸附位点高选择性地吸附待测样品中残留的诺氟沙星，而且在显色过程中，能够作为催化过氧化物氧化显色底物的催化剂，使得显色反应速率快，减少背景干扰且缩短检测时间。本发明提供的检测诺氟沙星的方法将磁性分子印迹纳米酶与诺氟沙星的结合物直接进行比色化学传感检测，有效提高检测的灵敏度和准确度，且操作简单，检测速度快，能够实现对诺氟沙星的快速检测；此外该方法具有良好的特异性、重现性和回收率，可直接对动物源性食品中诺氟沙星的残留进行检测，具有重要的实际应用价值。
根据本发明，步骤(1)中所述震荡吸附的条件至少满足：转速为80-120rpm，具体可以为80rpm、90rpm、100rpm、110rpm、120rpm，以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值；时间为10-15min，具体可以为10min、11min、12min、13min、14min、15min，以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，有利于提高磁性分子印迹纳米酶对待测样品中诺氟沙星的吸附效率，进而提高对诺氟沙星的检测准确性。
根据本发明，步骤(2)中显色反应所用的缓冲液、过氧化物和显色底物可以采用常规的相互匹配的缓冲液、过氧化物和显色底物。优选情况下，步骤(2)中所述缓冲液为乙酸-乙酸盐缓冲液，所述过氧化物为过氧化氢(H2O2)，所述显色底物为3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，有利于提高显色反应后进行比色分析的灵敏度和准确度。
具体地，当待测样品中不存在诺氟沙星时，磁性分子印迹纳米酶的过氧化物酶催化活性会充分显现，催化H2O2产生羟基自由基，氧化TMB快速显蓝色，在652nm会有最大吸光度值；当待测样品中存在诺氟沙星残留，磁性分子印迹纳米酶会特异吸附诺氟沙星在其表面空腔位点，抑制了磁性分子印迹纳米酶催化H2O2的能力，其652nm吸光度值比不存在诺氟沙星时降低，蓝色溶液变浅。通过以不同浓度的诺氟沙星为横坐标，△A(即空白吸光度值减去样品吸光度值)为纵坐标，构建检测诺氟沙星的标准曲线，结合待测样品的吸光度值，获得待测样品中诺氟沙星的含量。
根据本发明，乙酸-乙酸盐缓冲液中乙酸盐的浓度优选为0.1-0.3mol/L，最适pH为2.5-4，具体地，乙酸-乙酸盐缓冲液可以是乙酸-乙酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钾缓冲液和乙酸-乙酸铵缓冲液中的一种或多种。
根据本发明，步骤(2)中所述反应I的条件至少满足：温度为20-30℃，具体可以为20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃，以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值；反应时间为3-6min，具体可以为3min、4min、5min、6min，以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值。发明人发现，显色反应仅需要一步反应，反应时间短，进而使得基于比色化学传感技术检测诺氟沙星的方法所需时间短，可实现快速测定动物源性食品中诺氟沙星残留。
根据本发明，磁性分子印迹纳米酶、待测样品、缓冲液、过氧化物与显色底物的用量，能够充分吸收待测样品中的诺氟沙星并完全进行显色即可。优选情况下，相对于1g的所述磁性分子印迹纳米酶，所述待测样品的用量为100-150mL、所述缓冲液的用量为500-850mL、所述过氧化物的用量为10-20mmol、所述显色底物的用量为0.2-1mmol。具体地，磁性分子印迹纳米酶可采用浓度为3-5mg/mL的溶液形式与待测样品混合，过氧化物、显色底物也分别采用溶液的形式与其他原料混合，过氧化物溶液中过氧化物的浓度优选为0.01-0.1mol/L，显色底物溶液中显色底物的浓度为3-12mmol/L。
根据本发明，所述磁性分子印迹纳米酶的制备方法包括如下步骤：
S1、将含有可溶性三价铁盐的水溶液除氧后，与可溶性二价铁盐、碱溶液混合进行反应II得到反应液II，将所述反应液II经磁分离I收集得到四氧化三铁纳米粒子；
S2、将所述四氧化三铁纳米粒子经四甲基氢氧化铵活化后，与3-氨丙基三乙氧基硅烷混合进行反应III，得到表面氨基化四氧化三铁纳米粒子；
S3、将所述表面氨基化四氧化三铁纳米粒子、诺氟沙星与多巴胺混合进行反应IV后，经磁分离II收集得到所述磁性分子印迹纳米酶。
发明人发现，在该优选的具体实施方式下，合成的磁性分子印迹纳米酶纯度高且粒径小，不仅类过氧化物酶的酶活性强、表面对诺氟沙星特异性吸附的位点多，而且不会对显色反应产生干扰，更加有利于比色的肉眼识别。
根据本发明，磁分离I和磁分离II分别采用磁性物体进行吸附分离，示例性地，磁性物体为钕铁硼强磁铁。
根据本发明，步骤S1中所述可溶性三价铁盐、所述可溶性二价铁盐与所述碱溶液中的碱的摩尔比为1:0.35-0.8:3.5-5.5。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，有利于三价铁盐和二价铁盐与碱溶液共沉淀形成四氧化三铁纳米粒子的效果更优，反应更完全。更优选地，所述可溶性三价铁盐选自氯化铁、硫酸铁和硝酸铁中的至少一种，所述可溶性二价铁盐选自氯化亚铁、硫酸亚铁和硝酸亚铁中的至少一种，所述碱溶液选自氢氧化钠-水溶液、氢氧化钾-水溶液和氨水中的至少一种。
根据本发明，步骤S1中所述除氧的方法包括：采用向所述水溶液中通入氮气的方法进行除氧；所述反应II的条件至少满足：以通入氮气的方法进行除氧，温度为75-85℃，具体可以为75℃、77℃、79℃、81℃、83℃、85℃，以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值；搅拌速率为500-600rpm，具体可以为500rpm、520rpm、540rpm、560rpm、580rpm、600rpm，以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值；反应时间为0.5-1.5h，具体可以为0.5h、0.7h、0.9h、1.1h、1.3h、1.5h，以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，四氧化三铁纳米粒子的合成速率更快、纳米粒子的颗粒形态更好。
根据本发明，步骤S1还包括：将所述磁分离I得到的固体A利用水洗涤至pH为6-7，再经真空干燥得到所述四氧化三铁纳米粒子。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，有利于提高四氧化三铁纳米粒子的纯度。
根据本发明，步骤S2中，相对于1g的所述四氧化三铁纳米粒子，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量为2-5mL，四甲基氢氧化铵的用量能够将四氧化三铁纳米粒子充分活化即可。
根据本发明，所述反应III的反应溶剂为乙醇-水溶液，乙醇-水溶液中水与乙醇的体积比优选为1：1；所述反应III的条件至少满足：以通入氮气的方法进行除氧并进行暗反应，温度为30-50℃，具体可以为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值；搅拌速率为300-400rpm，具体可以为300rpm、320rpm、340rpm、360rpm、380rpm、400rpm，以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值；反应时间为7-12h，具体可以为7h、8h、9h、10h、11h、12h，以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，有利于提高表面氨基化四氧化三铁纳米粒子的合成速率。
根据本发明，步骤S3中，相对于1重量份的所述诺氟沙星，所述表面氨基化四氧化三铁纳米粒子的用量为16-65重量份、所述多巴胺的用量为5-16重量份。
根据本发明，所述反应IV的反应溶剂为乙醇-Tris-HCl溶液，乙醇-Tris-HCl溶液中乙醇与水的体积比优选为1：1，且含有100mmol/L的Tris-HCl；所述反应III的条件至少满足：温度为20-30℃，具体可以为20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃，以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值；搅拌速率为250-350rpm，具体可以为250rpm、270rpm、290rpm、310rpm、330rpm、350rpm，以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值；反应时间为1-3h，具体可以为1h、1.5h、2h、2.5h、3h，以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值。
根据本发明，步骤S3还包括：将所述磁分离II得到的固体B利用乙醇-乙酸溶液洗涤4-6次，再用水洗涤2-3次，最后经真空干燥得到所述磁性分子印迹纳米酶。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，磁性分子印迹纳米酶分离收集的回收率高、操作简单，且纯度更高。更优选地，所述乙醇-乙酸溶液中乙醇与乙酸的体积比为(95:5)-(98:2)，所述用乙醇-乙酸溶液洗涤和所述用水洗涤的洗涤方式均为超声洗涤。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，多功能酶标仪为美国Thermo Scientific公司生产的MultiskanGO 1510；诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、达诺沙星均购于上海源叶生物科技有限公司；浓度为30重量％的过氧化氢购于国药集团化学试剂有限公司；3，3'，5，5'-四甲基联苯胺购于上海瑞永生物科技有限公司；3-氨丙基三乙氧基硅、多巴胺均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Tris-base购于美国VWR International有限公司；四环素购于上海瑞永生物科技有限公司；其他试剂及牛奶、鸡蛋、猪肉样品均为常规的市售品。
以下实施例中，在没有特别说明的情况下，所述室温为25±5℃。
制备例1
S1、将5.0g六水合氯化铁溶于100mL超纯水后，通氮除氧并进行搅拌；加入1.99g四水合氯化亚铁、40mL浓度为2mol/L氢氧化钠溶液，在温度为80℃、转速为550rpm的条件下反应1h得到反应液II，将反应液II冷却至室温，用磁铁进行分离后收集固体A，用水洗涤固体A至pH为6-7，再经真空干燥得到四氧化三铁纳米粒子(以下称为Fe3O4纳米粒子)；
S2、将步骤S1制得的Fe3O4纳米粒子经四甲基氢氧化铵活化后，用磁铁进行分离后收集活化产物，用水洗涤、真空干燥后，将0.8g活化产物与100mL乙醇-水溶液(乙醇与水的体积比为1:1)混合，通氮除氧并进行搅拌，在40℃时，加入3mL的3-氨丙基三乙氧基硅，在搅拌速率为350rpm的条件下暗反应10h，制得表面氨基化Fe3O4纳米粒子；
S3、将0.5g步骤S2制得的表面氨基化Fe3O4纳米粒子分散在100mL乙醇-Tris-HCl溶液(乙醇与水的体积比为1:1，且含有100mmol/L的Tris-HCl)中，依次加入0.01g诺氟沙星和0.1g多巴胺，在温度为25℃、转速为300rpm的条件下反应3h后，用磁铁进行分离后收集固体B，将固体B利用乙醇-乙酸溶液(乙醇与乙酸的体积比为97:3)洗涤6次，再用水洗涤3次，真空干燥，制得对诺氟沙星有特异性吸附的磁性分子印迹纳米酶(以下称为MMIP Nanozyme)。
采用同样的制备方法，在步骤(3)不添加诺氟沙星的条件下，合成磁性非分子印迹纳米酶(以下称为MNIP Nanozyme)。
制备例2
S1、将4g硫酸铁溶于100mL超纯水后，通氮除氧并进行搅拌；加入1.1g硫酸亚铁、35mL浓度为2mol/L氢氧化钾溶液，在温度为75℃、转速为600rpm的条件下反应0.5h得到反应液II，将反应液II冷却至室温，用磁铁进行分离后收集固体A，用水洗涤固体A至pH为6-7，再经真空干燥得到四氧化三铁纳米粒子(以下称为Fe3O4纳米粒子)；
S2、将步骤S1制得的Fe3O4纳米粒子经四甲基氢氧化铵活化后，用磁铁进行分离后收集活化产物，用水洗涤、真空干燥后，将1g活化产物与100mL乙醇-水溶液(乙醇与水的体积比为1:1)混合，通氮除氧并进行搅拌，在30℃时，加入2mL的3-氨丙基三乙氧基硅，在搅拌速率为300rpm的条件下暗反应12h，制得表面氨基化Fe3O4纳米粒子；
S3、将0.16g步骤S2制得的表面氨基化Fe3O4纳米粒子分散在100mL乙醇-Tris-HCl溶液(乙醇与水的体积比为1:1，且含有100mmol/L的Tris-HCl)中，依次加入0.01g诺氟沙星和0.05g多巴胺，在温度为20℃、转速为350rpm的条件下反应1h后，用磁铁进行分离后收集固体B，将固体B利用乙醇-乙酸溶液(乙醇与乙酸的体积比为97:3)洗涤5次，再用水洗涤2次，真空干燥，制得对诺氟沙星有特异性吸附的磁性分子印迹纳米酶(以下称为MMIPNanozyme)。
制备例3
S1、将4.8g硝酸铁溶于100mL超纯水后，通氮除氧并进行搅拌；加入2.87g硝酸亚铁、55mL浓度为2mol/L氢氧化钾溶液，在温度为85℃、转速为500rpm的条件下反应1.5h得到反应液II，将反应液II冷却至室温，用磁铁进行分离后收集固体A，用水洗涤固体A至pH为6-7，再经真空干燥得到四氧化三铁纳米粒子(以下称为Fe3O4纳米粒子)；
S2、将步骤S1制得的Fe3O4纳米粒子经四甲基氢氧化铵活化后，用磁铁进行分离后收集活化产物，用水洗涤、真空干燥后，将1g活化产物与100mL乙醇-水溶液(乙醇与水的体积比为1:1)混合，通氮除氧并进行搅拌，在50℃时，加入5mL的3-氨丙基三乙氧基硅，在搅拌速率为400rpm的条件下暗反应7h，制得表面氨基化Fe3O4纳米粒子；
S3、将0.65g步骤S2制得的表面氨基化Fe3O4纳米粒子分散在100mL乙醇-Tris-HCl溶液(乙醇与水的体积比为1:1，且含有100mmol/L的Tris-HCl)中，依次加入0.01g诺氟沙星和0.16g多巴胺，在温度为30℃、转速为250rpm的条件下反应3h后，用磁铁进行分离后收集固体B，将固体B利用乙醇-乙酸溶液(乙醇与乙酸的体积比为97:3)洗涤4次，再用水洗涤3次，真空干燥，制得对诺氟沙星有特异性吸附的磁性分子印迹纳米酶(以下称为MMIPNanozyme)。
实施例1
(1)将制备例1获得的MMIP Nanozyme和MNIP Nanozyme分别配制成浓度为4mg/mL的MMIP Nanozyme溶液和MNIP Nanozyme溶液，配制浓度为0.01mg/mL的诺氟沙星溶液、浓度为0.06mol/L的H2O2溶液、浓度为0.008mol/L的TMB溶液和乙酸钠浓度为0.2mol/L、pH＝3.5的乙酸-乙酸钠缓冲液；
(2)设置7组离心管(分别为a组、b组、c组、d组、e组、f组、g组)，a组、b组、e组、f组的离心管中分别加入200μL的MMIP Nanozyme溶液，c组、d组的离心管中分别加入200μL的MNIPNanozyme溶液，b组、d组的离心管中再加入100μL诺氟沙星溶液，a组、c组、e组、f组、g组再加入100μL超纯水，置于转速为100rpm的培养振荡器中吸附15min；
(3)a组、b组、c组、d组、e组、g组的离心管中加入400μL乙酸-乙酸钠缓冲液、250μL的H2O2溶液后，a组、b组、c组、d组、g组再加入50μL的TMB溶液，f组的离心管中加入650μL乙酸-乙酸钠缓冲液、50μL的TMB溶液，混合均匀后均放置在25℃恒温箱中反应4min后，利用外部磁力吸附离心管中的MMIP Nanozyme或者MNIP Nanozyme，吸取上清液置于96孔酶标板中，进行紫外吸收光谱检测(每个样品进行三次平行检测)，结果见图1，其中，图1中纵坐标的吸光度值代表的是各离心管的上清液在相同波长下的吸光度值。
如图1所示，曲线a、c、g分别是MMIP Nanozyme+H2O2+TMB、MNIP Nanozyme+H2O2+TMB和H2O2+TMB比色反应体系的可见光吸收峰，可以看出MMIP Nanozyme的存在能显著催化H2O2氧化TMB，使溶液颜色从无色变为蓝色，且其作用力显著高于MNIP Nanozyme以及H2O2-TMB比色反应体系引起的非酶促氧化，有效证明MMIP Nanozyme具有良好的类过氧化物酶催化活性。曲线a、b分别是存在和不存在诺氟沙星的比色反应体系，可以看出诺氟沙星的存在会使MMIP Nanozyme+H2O2+TMB比色反应体系的吸光度值显著降低，进而抑制MMIP Nanozyme类过氧化物酶的催化活性，这是因为诺氟沙星与MMIP Nanozyme表面的印记空腔结合，使得载体Fe3O4纳米粒子的表面催化面积减少，催化活性降低，从而体系吸光度值降低，这说明本发明建立的基于比色化学传感技术检测诺氟沙星的方法是可行的。
实施例2
(1)将制备例2获得的MMIP Nanozyme配制成浓度为4mg/mL的MMIP Nanozyme溶液，浓度为0.06mol/L的H2O2溶液、浓度为0.008mol/L的TMB溶液和乙酸钠浓度为0.2mol/L、pH＝3.5的乙酸-乙酸钠缓冲液；
(2)离心管加入200μL的MMIP Nanozyme溶液，再加入100μL超纯水、400μL乙酸-乙酸钠缓冲液、250μL的H2O2溶液和50μL的TMB溶液，混合均匀，25℃恒温箱中反应4min，利用外部磁力吸附离心管中的MMIP Nanozyme，吸取上清液置于96孔酶标板中，进行紫外吸收光谱检测(每个样品进行三次平行检测)；
(3)将外部磁力吸附获得的MMIP Nanozyme，使用1mL超纯水洗涤2-3次，重复步骤(2)操作；
(4)重复步骤(2)、步骤(3)六次，根据反应体系的吸光度值变化，评估MMIPNanozyme的重复使用性，结果见图2。图2中纵坐标相对活性(％)代表的是经6次催化反应循环后MMIP Nanozyme的过氧化物酶活性，计算公式为：
相对活性(％)＝本次比色反应体系的吸光度值/最高吸光度值*100％；
如图2所示，MMIP Nanozyme经6次催化反应循环后仍保持有85％以上的类过氧化物酶催化活性，这说明MMIP Nanozyme具有良好的稳定性，对降低诺氟沙星的检测成本具有重要的意义。
实施例3
(1)将制备例1获得的MMIP Nanozyme和MNIP Nanozyme分别配制成浓度为4mg/mL的MMIP Nanozyme溶液和MNIP Nanozyme溶液，分别配制浓度为200ng/mL的诺氟沙星(NOR)溶液、浓度为200ng/mL的环丙沙星(CIP)溶液、浓度为200ng/mL的恩诺沙星(ENR)溶液、浓度为200ng/mL的达诺沙星(DAN)溶液、浓度为200ng/mL的磺胺嘧啶(SD)溶液、浓度为200ng/mL的四环素(TC)溶液、浓度为0.06mol/L的H2O2溶液、浓度为0.008mol/L的TMB溶液和浓度为0.2mol/L、pH＝3.5的乙酸-乙酸钠缓冲液；
(2)设置12组离心管，其中6组离心管中加入200μL的MMIP Nanozyme溶液、另6组离心管中加入200μL的MNIP Nanozyme溶液，6组加入MMIP Nanozyme溶液的离心管和6组加入MNIP Nanozyme溶液的离心管，分别与诺氟沙星溶液、环丙沙星溶液、恩诺沙星溶液、达诺沙星溶液、磺胺嘧啶溶液、四环素溶液6种溶液对应且对应的溶液添加量分别为100μL，然后置于转速为100rpm的培养振荡器中吸附12min；
(3)每个离心管中分别加入400μL乙酸-乙酸钠缓冲液、250μL的H2O2溶液和50μL的TMB溶液，混合均匀后放置在25℃恒温箱中反应4min，经外部磁力吸附离心管中的MMIPNanozyme和MNIP Nanozyme，吸取上清液置于96孔酶标板中，进行紫外吸收光谱检测(每个样品进行三次平行检测)，验证该检测方法的特异性，结果见图3。
如图3所示，诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、达诺沙星、磺胺嘧啶或者四环素经MMIP Nanozyme和MNIP Nanozyme富集分离后，直接进行比色检测，富集诺氟沙星MMIPNanozyme的比色反应体系引起的吸光度差值(ΔA)最大，分别是富集环丙沙星MMIPNanozyme的1.77倍、富集恩诺沙星MMIP Nanozyme的2.27倍、富集达诺沙星MMIP Nanozyme的2.67倍、富集磺胺嘧啶MMIP Nanozyme的6.41倍、富集四环素MMIP Nanozyme的11.42倍。这表明MMIPs NPs能选择性将NOR特异性地结合在空腔中，与其他抗生素相比，MMIPs NPs诱导了oxTMB对NOR的吸光度大大降低，因此，诺氟沙星MMIP Nanozyme耦合比色化学传感技术对诺氟沙星检测具有良好的特异性。在同样的实验条件下，MNIP Nanozyme引起的吸光度差值(ΔA)均小于MMIP Nanozyme，这是因为其表面未形成分子印迹空腔，只存在少量的非特异性吸附。
实施例4
(1)将制备例3获得的MMIP Nanozyme配制成浓度为4mg/mL的MMIP Nanozyme溶液，配制浓度分别为10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL的诺氟沙星溶液，以及浓度为0.06mol/L的H2O2溶液、浓度为0.008mol/L的TMB溶液、浓度为0.2mol/L、pH＝3.5的乙酸-乙酸钠缓冲液；
(2)设置7组离心管，分别为空白组和与6种浓度的诺氟沙星溶液相对应的处理组，离心管中分别加入200μL的MMIP Nanozyme溶液，空白组中加入100μL超纯水，处理组中加入100μL对应浓度的诺氟沙星溶液，然后置于转速为100rpm的培养振荡器中吸附15min；
(3)每个离心管中分别加入400μL乙酸-乙酸钠缓冲液、250μL的H2O2溶液和50μL的TMB溶液，混合均匀后放置在25℃恒温箱中反应4min，经外部磁力吸附离心管中的MMIPNanozyme，吸取上清液置于96孔酶标板中，进行紫外吸收光谱检测(每个样品进行三次平行检测)，结果见图4和图5。图5中纵坐标ΔA代表的是未富集诺氟沙星的MMIP Nanozyme和富集诺氟沙星的MMIP Nanozyme对应的显色反应体系在652nm处的吸光度值差异。
如图4和图5所示，图4显示了富集不同浓度诺氟沙星的MMIP Nanozyme引起的紫外吸收光谱图，吸光度值随诺氟沙星浓度的增加而逐渐降低，这说明MMIP Nanozyme表面的印迹空腔随诺氟沙星浓度的增加逐渐减少，使得载体Fe3O4纳米粒子的过氧化物酶活性受到抑制；图5显示了在诺氟沙星最终浓度为10-300ng/mL范围内，诺氟沙星的浓度与富集诺氟沙星的MMIP Nanozyme引起的吸光度差值(ΔA)成线性关系，线性回归方程为Y＝0.000947X+0.03176(R2＝0.9878)，最低检测限为8.90ng/mL。
测试例1
(1)将制备例1获得的MMIP Nanozyme配制成浓度为4mg/mL的MMIP Nanozyme溶液，分别配制浓度为0.06mol/L的H2O2溶液、浓度为0.008mol/L的TMB溶液和浓度为0.2mol/L、pH＝3.5的乙酸-乙酸钠缓冲液；
(2)以三个不同品牌的牛奶(牛奶样品A、牛奶样品B、牛奶样品C)、鸡蛋(蛋清蛋白混合)和猪肌肉分别作为待测样品，分别准确称取1mL/1g待测样品，置于10mL离心管中，加入4-8mL的EDTA-Mcllvaine缓冲溶液(0.1mol/L)溶解(其中，EDTA-Mcllvaine缓冲溶液在牛奶A、牛奶B、牛奶C及鸡蛋中加入量为8mL，猪肌肉样品中加入量为4mL)；然后在转速为1000rpm的条件下漩涡混合1min后，进行超声提取10min，再在转速为10000rpm的条件下离心5-10min(温度低于5℃)，重复提取3次，合并上清液作为待测样品液；
(3)取100μL步骤(2)制得的待测样品液与200μL的MMIP Nanozyme溶液混合，然后置于转速为100rpm的培养振荡器中吸附15min；
(4)每个离心管中分别加入400μL乙酸-乙酸钠缓冲液、250μL的H2O2溶液和50μL的TMB溶液，混合均匀后放置在25℃恒温箱中反应4min，经外部磁力吸附离心管中的MMIPNanozyme，吸取上清液置于96孔酶标板中，进行紫外吸收光谱检测(每个样品进行三次平行检测)，以超纯水作为对照，结果见图6。
三个不同品牌的牛奶(牛奶样品A、牛奶样品B、牛奶样品C)、鸡蛋(蛋清蛋白混合)和猪肌肉中均未检出诺氟沙星，与ELISA试剂盒对待测样品的检测结果一致，说明本发明中所建立的诺氟沙星检测方法具有良好的准确性。
测试例2
(1)将制备例1获得的MMIP Nanozyme配制成浓度为4mg/mL的MMIP Nanozyme溶液，分别配制浓度为0.06mol/L的H2O2溶液、浓度为0.008mol/L的TMB溶液和浓度为0.2mol/L、pH＝3.5的乙酸-乙酸钠缓冲液；
(2)以三个不同品牌的牛奶(牛奶样品A、牛奶样品B、牛奶样品C)、鸡蛋(蛋清蛋白混合)和猪肌肉分别作为待测样品，分别准确称取1mL/1g待测样品，置于10mL离心管中，加入4-8mL的EDTA-Mcllvaine缓冲溶液(0.1mol/L)溶解(其中，EDTA-Mcllvaine缓冲溶液在牛奶A、牛奶B、牛奶C及鸡蛋中加入量为8mL，猪肌肉样品中加入量为4mL)，再加入一定浓度的诺氟沙星标准溶液，在转速为1000rpm的条件下漩涡混合1min后，进行超声提取10min，再在转速为10000rpm的条件下离心5-10min(温度低于5℃)，重复提取3次，合并上清液作为待测样品液，待测样品液中诺氟沙星的最终加标浓度分别为10ng/mL、50ng/mL和100ng/mL；
(3)取100μL步骤(2)制得的待测样品液与200μL的MMIP Nanozyme溶液混合，然后置于转速为100rpm的培养振荡器中吸附15min；
(4)每个离心管中分别加入400μL乙酸-乙酸钠缓冲液、250μL的H2O2溶液和50μL的TMB溶液，混合均匀后放置在25℃恒温箱中反应4min，经外部磁力吸附离心管中的MMIPNanozyme，吸取上清液置于96孔酶标板中，进行紫外吸收光谱检测(每个待测样品液进行三次平行检测)，并以ELISA试剂盒检测作为对照，结果见表1。
由表1可知，加标浓度分别为10、50、100ng/mL时，本发明提供的检测诺氟沙星的方法对三个不同品牌牛奶检测的加标回收率范围在78.29—95.81％之间，RSD在3.47—9.88％之间；鸡蛋样品的加标回收率为81.89—93.35％，RSD为4.13—8.13％；猪肌肉样品的加标回收率为75.97—89.47％，RSD为2.10—5.99％。加标浓度分别为1、2、4ng/mL时，ELISA试剂盒对三个不同品牌牛奶检测的加标回收率范围81.27—98.89％，RSD在3.11—7.94％之间；鸡蛋样品的加标回收率在83.85—96.24％，RSD为1.79—7.84％；猪肌肉样品的加标回收率为86.93—94.52％，RSD为1.91—7.58％。该结果说明本发明提供的检测诺氟沙星的方法具有一定的可靠性，作为一种新的NOR抗生素残留检测方法，不仅能够保持较高的检测灵敏度、准确度和精密度，而且线性范围较宽，检测过程时间短(只需要30min左右，而ELISA试剂盒需1.5h左右)，成本低廉，可用于快速测定动物源性食品中NOR残留。
表1待测样品的加标回收率实验(n＝3)
综上所述，本发明提供的基于比色化学传感技术检测诺氟沙星的方法为检测诺氟沙星残留的新手段，该方法具有操作简单、快速、成本低、检测时间短、无需大型昂贵仪器设备和肉眼可简单判定结果等优势，可用于动物源性食品中痕量诺氟沙星残留的检测。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种基于比色化学传感技术检测诺氟沙星的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将磁性分子印迹纳米酶与待测样品混合后，经震荡吸附得到诺氟沙星吸附溶液；
(2)将所述诺氟沙星吸附溶液与缓冲液、过氧化物、显色底物混合后经反应I得到反应液I，测定所述反应液I的吸光度值，从而测得所述待测样品中的诺氟沙星含量；
所述磁性分子印迹纳米酶的制备方法包括如下步骤：
S1、将含有可溶性三价铁盐的水溶液除氧后，与可溶性二价铁盐、碱溶液混合进行反应II得到反应液II，将所述反应液II经磁分离I收集得到四氧化三铁纳米粒子；
S2、将所述四氧化三铁纳米粒子经四甲基氢氧化铵活化后，与3-氨丙基三乙氧基硅烷混合进行反应III，得到表面氨基化四氧化三铁纳米粒子，所述反应III的条件包括：以通入氮气的方法进行除氧并进行暗反应；
S3、将所述表面氨基化四氧化三铁纳米粒子、诺氟沙星与多巴胺混合进行反应IV后，经磁分离II收集得到所述磁性分子印迹纳米酶。
2.根据权利要求1所述的基于比色化学传感技术检测诺氟沙星的方法，其特征在于，步骤(1)中所述震荡吸附的条件至少满足：转速为80-120rpm、时间为10-15min。
3.根据权利要求1所述的基于比色化学传感技术检测诺氟沙星的方法，其特征在于，步骤(2)中所述缓冲液为乙酸-乙酸盐缓冲液，所述过氧化物为过氧化氢，所述显色底物为3，3'，5，5'-四甲基联苯胺；
所述反应I的条件至少满足：温度为20-30℃、反应时间为3-6min。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的基于比色化学传感技术检测诺氟沙星的方法，其特征在于，相对于1g的所述磁性分子印迹纳米酶，所述待测样品的用量为100-150mL、所述缓冲液的用量为500-850mL、所述过氧化物的用量为10-20mmol、所述显色底物的用量为0.2-1mmol。
5.根据权利要求1所述的基于比色化学传感技术检测诺氟沙星的方法，其特征在于，步骤S1中所述可溶性三价铁盐、所述可溶性二价铁盐与所述碱溶液中的碱的摩尔比为1:0.35-0.8:3.5-5.5；
所述可溶性三价铁盐选自氯化铁、硫酸铁和硝酸铁中的至少一种，所述可溶性二价铁盐选自氯化亚铁、硫酸亚铁和硝酸亚铁中的至少一种，所述碱溶液选自氢氧化钠-水溶液、氢氧化钾-水溶液和氨水中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的基于比色化学传感技术检测诺氟沙星的方法，其特征在于，步骤S1中所述反应II的条件至少满足：以通入氮气的方法进行除氧，温度为75-85℃、搅拌速率为500-600rpm、反应时间为0.5-1.5h。
7.根据权利要求6所述的基于比色化学传感技术检测诺氟沙星的方法，其特征在于，步骤S1还包括：将所述磁分离I得到的固体A利用水洗涤至pH为6-7，再经真空干燥得到所述四氧化三铁纳米粒子。
8.根据权利要求1所述的基于比色化学传感技术检测诺氟沙星的方法，其特征在于，步骤S2中，相对于1g的所述四氧化三铁纳米粒子，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量为2-5mL；
所述反应III的反应溶剂为乙醇-水溶液。
9.根据权利要求8所述的基于比色化学传感技术检测诺氟沙星的方法，其特征在于，所述反应III的条件至少满足：温度为30-50℃、搅拌速率为300-400rpm、反应时间为7-12h。
10.根据权利要求1所述的基于比色化学传感技术检测诺氟沙星的方法，其特征在于，步骤S3中，相对于1重量份的所述诺氟沙星，所述表面氨基化四氧化三铁纳米粒子的用量为16-65重量份、所述多巴胺的用量为5-16重量份；
所述反应IV的反应溶剂为乙醇-Tris-HCl溶液。
11.根据权利要求10所述的基于比色化学传感技术检测诺氟沙星的方法，其特征在于，所述反应III的条件至少满足：温度为20-30℃、搅拌速率为250-350rpm、反应时间为1-3h。
12.根据权利要求1所述的基于比色化学传感技术检测诺氟沙星的方法，其特征在于，步骤S3还包括：将所述磁分离II得到的固体B利用乙醇-乙酸溶液洗涤4-6次，再用水洗涤2-3次，最后经真空干燥得到所述磁性分子印迹纳米酶。
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