CN103543268A - 检测乙脑病毒的方法及量子点标记免疫层析试纸及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学免疫检测方法，特别是涉及使用量子点标记免疫层析试纸，以免疫学的方法检测乙脑病毒的方法。一种量子点标记免疫层析试纸，在塑料板上从下到上依次粘贴有玻璃纤维素膜A、量子点标记乙脑病毒IgG单克隆抗体的玻璃纤维素膜B、硝酸纤维素膜、吸水纸；其中，所述硝酸纤维素膜一端有乙脑病毒多克隆抗体和兔抗鼠二抗，以此形成检测带T和质控带C；所述量子点标记的乙脑病毒IgG单克隆抗体位于玻璃纤维素膜B的另一端，与检测带T和质控带C相对应，并且量子点标记的乙脑病毒IgG单克隆抗体位于进样点一端。该方法的检测灵敏度比目前常用的一种检测方法的检测灵敏度高1000倍左右。

Description

检测乙脑病毒的方法及量子点标记免疫层析试纸及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学免疫检测方法，特别是涉及使用量子点标记免疫层析试纸，以免疫学的方法检测乙脑病毒的方法。
背景技术
乙脑病毒于1935年首先在日本患者脑组织中分离获得，因此又称日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV），为球形单股正链RNA病毒，属于黄病毒科黄病毒属，直径20～30nm，内有衣壳蛋白与核酸构成的核心，外披以含脂质的囊膜，表面有囊膜糖蛋白刺突，即病毒血凝素，囊膜内尚有内膜蛋白，参与病毒的装配，乙脑病毒基因组全长11kb，自5′至3′端依次编码结构蛋白C、M、E以及非结构蛋白NS1—NS5。当人体被带病毒的蚊虫叮蛟后，病毒即进入血液循环中。发病与否，一方面取决于病毒的毒力与数量，另一方面取决于机体的反应性及防御机能。如果已经接种过乙脑疫苗，体内存在一定数量的抗体，此时人体抗体病能力较强，病毒即被消灭，不发病或不表现临床症状。当人体抵抗力较弱，而感染病毒量大，毒力强时，病毒经血循环即可突破血脑屏障侵入中枢神经系统，并在神经细胞内复制增殖，导致中枢神经系统广泛病变。不同的神经细胞对病毒感受不同，以及脑组织在高度炎症时引起的缺氧、缺血、营养障碍等，造成中枢病变部位不平衡，如脑膜病变较轻，脑实质病变较重；间脑、中脑病变重，脊髓病变轻。
目前，常用的检测方法为胶体金法，此法虽然检测快速简便，容易操作，但是准确率较低，灵敏度也较低。因此寻求一种价格便宜、操作简便、灵敏度和特异性都较高的检测方法是迫切需要解决的问题。
发明内容
针对上述技术的不足之处，本发明提供一种价格便宜、操作简便、灵敏度和特异性都较高的检测试纸以及用该试纸检测乙脑病毒的方法。
一种量子点标记免疫层析试纸，设有塑料板、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜A、量子点标记乙脑病毒IgG单克隆抗体的玻璃纤维素膜B、吸水纸；
其中，所述塑料板上依次粘贴有玻璃纤维素膜A、量子点标记乙脑病毒IgG单克隆抗体的玻璃纤维素膜B、硝酸纤维素膜、吸水纸；
其中，所述硝酸纤维素膜一端有乙脑病毒多克隆抗体和兔抗鼠二抗，以此形成检测带T和质控带C；
其中，所述量子点标记的乙脑病毒IgG单克隆抗体位于玻璃纤维素膜B的一端，与检测带T和质控带C相对应，并且量子点标记的乙脑病毒IgG单克隆抗体位于进样点一端。
优选的，所述量子点为CdTe/ZnSe核壳量子点。
优选的，所述塑料板为粘性PVC底板。
优选的，所述乙脑病毒多克隆抗体的浓度为0.5g/L。
优选的，所述兔抗鼠二抗的浓度为1.0g/L。
优选的，所述检测带T和质控带C间距不少于5mm。
如上所述的试纸的制备方法，包括如下步骤：
（1）量子点与乙脑病毒IgG单克隆抗体的偶联：
取0.01M的PBS缓冲液100～200uL与5～20uL表面连有羧基的量子点；
选取偶联试剂，偶联试剂选自羟基硫代琥珀酸亚胺、1-（3-二甲基氨丙基）-3乙基碳二胺盐酸盐；
加入乙脑病毒IgG单克隆抗体150～200uL；
摇床反应1～4小时；
层析柱过滤，离心纯化；
用1%～5%的牛血清白蛋白封闭；
4℃保存；
（2）试纸的制备：
用0.05～0.15M的PBS缓冲液稀释乙脑病毒多克隆抗体及兔抗鼠二抗，将0.5g/L乙脑病毒多克隆抗体和1.0g/L兔抗鼠二抗喷在硝酸纤维素膜一端，形成检测带T和质控带C，T带和C带间隔5mm，室温晾干，将硝酸纤维素膜放入PBS缓冲液中，37℃封闭待用，或者干燥后4℃保存；
将量子点标记乙脑病毒IgG单克隆抗体均匀喷覆于玻璃纤维膜B一端，与形成的T带和C带相对应，室温干燥，4℃保存；
在塑料板上依次粘帖玻璃纤维素膜A、量子点标记乙脑病毒IgG单克隆抗体的玻璃纤维素膜B、硝酸纤维素膜、吸水纸；
用试纸切刀切割成试纸，干燥后密封保存。
用所述的试纸检测乙脑病毒，包括如下步骤：将样品点样在组装好的试纸上接近乙脑病毒IgG单克隆抗体的一端，反应5min后，在紫外分析仪中观察结果。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：由于在所制备的试纸中加入了核壳量子点，特别是采用了CdTe/ZnSe水溶性核壳量子点，将水溶性的量子点与特异性的通过共价偶联，然后利用双抗夹心原理结合量子点的荧光性质检测样品中是否含有目标物。在紫外灯的照射下，通过观察免疫层析试纸条上检测带和质控带的荧光线，判断检测结果。本发明将免疫反应的高特异性和量子点的荧光特性相结合，利用量子点多波长激发，高强度荧光发射，发射峰窄，峰形对称，发光稳定性好的荧光特性，建立了快速，特异，简便，灵敏的免疫层析检测方法。通过观察荧光信号达到了定量检测的目的。该方法的检测灵敏度比目前常用的一种快速检测方法-胶体金的检测灵敏度高约1000倍左右。
附图说明
图1为试纸制备的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1：一种量子点标记免疫层析试纸，设有塑料板、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜A、量子点标记乙脑病毒IgG单克隆抗体的玻璃纤维素膜B、吸水纸，所述玻璃纤维素膜A为没有点样的市场上购买的玻璃纤维素膜；
其中，所述塑料板上依次粘贴有玻璃纤维素膜A、量子点标记乙脑病毒IgG单克隆抗体的玻璃纤维素膜B、硝酸纤维素膜、吸水纸；
其中，所述硝酸纤维素膜一端有乙脑病毒多克隆抗体和兔抗鼠二抗，以此形成检测带T和质控带C；
其中，所述量子点标记的乙脑病毒IgG单克隆抗体位于玻璃纤维素膜B的一端，与检测带T和质控带C相对应，并且量子点标记的乙脑病毒IgG单克隆抗体位于进样点一端。
优选的，所述量子点为CdTe/ZnSe核壳量子点。
优选的，所述塑料板为粘性PVC底板。
优选的，所述乙脑病毒多克隆抗体的浓度为0.5g/L。
优选的，所述兔抗鼠二抗的浓度为1.0g/L。
优选的，所述检测带T和质控带C间距不少于5mm。
实施例2：如上所述的试纸的制备方法，如图1所示，包括如下步骤：
（1）量子点与乙脑病毒IgG单克隆抗体的偶联：
取0.01M的PBS缓冲液100～200uL与5～20uL表面连有羧基的量子点；
选取偶联试剂，偶联试剂选自羟基硫代琥珀酸亚胺、1-（3-二甲基氨丙基）-3乙基碳二胺盐酸盐；
加入乙脑病毒IgG单克隆抗体150～200uL；
摇床反应1～4小时；
层析柱过滤，离心纯化；
用1%～5%的牛血清白蛋白封闭；
4℃保存；
（2）试纸的制备：
用0.05～0.15M的PBS缓冲液稀释乙脑病毒多克隆抗体及兔抗鼠二抗，将0.5g/L乙脑病毒多克隆抗体和1.0g/L兔抗鼠二抗喷在硝酸纤维素膜一端，形成检测带T和质控带C，T带和C带间隔5mm，室温晾干，将硝酸纤维素膜放入PBS缓冲液中，37℃封闭待用，或者干燥后4℃保存；
将量子点标记的乙脑病毒IgG单克隆抗体均匀喷覆于玻璃纤维膜B一端，与T带和C带相对应，室温干燥，4℃保存；
在塑料板上依次粘帖玻璃纤维素膜A、量子点标记乙脑病毒IgG单克隆抗体的玻璃纤维素膜B、硝酸纤维素膜、吸水纸；
用试纸切刀切割成试纸，干燥后密封保存。
其中，步骤（1）中偶联效果的检测方法如下：
凝胶电泳法：采用0.8琼脂糖凝胶，电压为80V，电泳15min后，在紫外分析仪中观察电泳结果。
斑点印迹法：将0.3g/L乙脑病毒-BSA液点在硝酸纤维素膜上，晾干后浸泡于含5%BSA的0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，10nmol/L，PH=7.4，含NaCl8.5g/L）中，封闭膜上剩余的蛋白结合位点，于37℃孵育1h，封闭后取出，PBS洗涤。制备三个完全相同的乙脑病毒印迹膜，晾干后分别放入量子点标记乙脑病毒IgG单克隆抗体，量子点-BSA及量子点溶液，于37℃摇床反应30min，PBS洗涤。紫外分析仪中观察结果。
实施例3：用所述的试纸检测乙脑病毒IgG单克隆抗体，包括如下步骤：将样品点样在组装好的试纸上接近乙脑病毒IgG单克隆抗体的一端，反应5min后，在紫外分析仪中观察结果。用PBS缓冲液及正常人的血液设为空白对照。
结果判定：在C带显现红色荧光带的前提下，目视T带的荧光带强度，与空白对照，荧光越弱，代表待测液中含被检物的浓度越低。
实施例4：试纸检测有效性验证，配制四种浓度的乙脑病毒溶液，浓度分别为0.5，1.0，2.0，5.0ug/L。利用检测试纸和化学发光试纸盒对样本进行检测，每个浓度检测6次，测定试纸检出结果的有效性。如表一所示，结果表明用本发明制备的试纸检测出来的呈现阳性，并且溶液浓度越大荧光强度越大。
表一：各种浓度乙脑病毒的试纸条检测结果
Figure BDA0000396783410000051
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，举凡熟悉此项技艺的专业人士在了解本发明的技术手段之后，自然能依据实际的需要，在本发明的教导下加以变化。因此凡依本发明申请专利范围所作的同等变化与修饰，曾应仍属本发明专利涵盖的范围内。

Claims (9)

1.一种量子点标记免疫层析试纸，其特征在于，设有塑料板、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜A、量子点标记乙脑病毒IgG单克隆抗体的玻璃纤维素膜B、吸水纸；
其中，所述塑料板上从下到上依次粘贴有玻璃纤维素膜A、量子点标记乙脑病毒IgG单克隆抗体的玻璃纤维素膜B、硝酸纤维素膜、吸水纸；
其中，所述硝酸纤维素膜一端有乙脑病毒多克隆抗体和兔抗鼠二抗，以此形成检测带T和质控带C；
其中，所述量子点标记的乙脑病毒IgG单克隆抗体位于玻璃纤维素膜B的一端，与检测带T和质控带C相对应，并且量子点标记的乙脑病毒IgG单克隆抗体位于进样点一端。
2.如权利要求1所述的量子点标记免疫层析试纸，其特征在于，所述量子点为CdTe/ZnSe核壳量子点。
3.如权利要求1所述的量子点标记免疫层析试纸，其特征在于，所述塑料板为粘性PVC底板。
4.如权利要求1所述的量子点标记免疫层析试纸，其特征在于，所述乙脑病毒多克隆抗体的浓度为0.5g/L。
5.如权利要求1所述的量子点标记免疫层析试纸，其特征在于，所述兔抗鼠二抗的浓度为1.0g/L。
6.如权利要求1所述的量子点标记免疫层析试纸，其特征在于，所述检测带T和质控带C间距不少于5mm。
7.如上任意一项权利要求所述的量子点标记免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）量子点与乙脑病毒IgG单克隆抗体的偶联：
取0.01M的PBS缓冲液100～200uL与5～20uL表面连有羧基的量子点；
选取偶联试剂；
加入乙脑病毒IgG单克隆抗体150～200uL；
摇床反应1～4小时；
层析柱过滤，离心纯化；
用1%～5%的牛血清白蛋白封闭；
4℃保存；
（2）试纸的制备：
用0.05～0.15M的PBS缓冲液稀释乙脑病毒多克隆抗体及兔抗鼠二抗，将0.5g/L乙脑病毒多克隆抗体和1.0g/L兔抗鼠二抗喷在硝酸纤维素膜一端，形成检测带T和质控带C，T带和C带间隔5mm，室温晾干，将硝酸纤维素膜放入PBS缓冲液中，37℃封闭待用，或者干燥后4℃保存；
将量子点标记的乙脑病毒IgG单克隆抗体均匀喷覆于玻璃纤维膜B一端，与检测带T和质控带C相对应，并且量子点标记的乙脑病毒IgG单克隆抗体位于进样点一端，室温干燥，4℃保存；
在塑料板上依次粘帖玻璃纤维素膜A、量子点标记乙脑病毒IgG单克隆抗体的玻璃纤维素膜B、硝酸纤维素膜、吸水纸；
用试纸切刀切割成试纸，干燥后密封保存。
8.如权利要求7所述的量子点标记免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，步骤（1）中的偶联试剂选自羟基硫代琥珀酸亚胺、1-（3-二甲基氨丙基）-3乙基碳二胺盐酸盐。
9.用权利要求1-6任意一项所述的试纸检测乙脑病毒，其特征在于，包括如下步骤：将样品点样在组装好的试纸上接近乙脑病毒IgG单克隆抗体的一端，反应5min后，在紫外分析仪中观察结果。
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