CN103543262B - 一种量子点标记免疫层析试纸的制备方法 - Google Patents

一种量子点标记免疫层析试纸的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103543262B
CN103543262B CN201310485288.1A CN201310485288A CN103543262B CN 103543262 B CN103543262 B CN 103543262B CN 201310485288 A CN201310485288 A CN 201310485288A CN 103543262 B CN103543262 B CN 103543262B
Authority
CN
China
Prior art keywords
epstein
quantum dot
barr virus
monoclonal antibody
labeled
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201310485288.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103543262A (zh
Inventor
文德敏
申有长
于晓永
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Hua Weitian And Bio Tech Ltd
Original Assignee
Beijing Hua Weitian And Bio Tech Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Hua Weitian And Bio Tech Ltd filed Critical Beijing Hua Weitian And Bio Tech Ltd
Priority to CN201310485288.1A priority Critical patent/CN103543262B/zh
Publication of CN103543262A publication Critical patent/CN103543262A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103543262B publication Critical patent/CN103543262B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56994—Herpetoviridae, e.g. cytomegalovirus, Epstein-Barr virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
    • G01N2333/05—Epstein-Barr virus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及医学免疫检测方法，特别是涉及使用量子点标记免疫层析试纸，以免疫学的方法检测EB病毒的方法。一种量子点标记免疫层析试纸，在塑料板上从下到上依次粘贴有玻璃纤维素膜A、量子点标记EB病毒IgA单克隆抗体的玻璃纤维素膜B、硝酸纤维素膜、吸水纸；其中，所述硝酸纤维素膜一端有EB病毒多克隆抗体和兔抗鼠二抗，以此形成检测带T和质控带C；所述量子点标记的EB病毒IgA单克隆抗体位于玻璃纤维素膜B的另一端，与检测带T和质控带C相对应，并且量子点标记的EB病毒IgA单克隆抗体位于进样点一端。该方法的检测灵敏度比目前常用的一种检测方法的检测灵敏度高1000倍左右。

Description

一种量子点标记免疫层析试纸的制备方法
技术领域
本发明涉及医学免疫检测方法，特别是涉及使用量子点标记免疫层析试纸，以免疫学的方法检测EB病毒的方法。
背景技术
EB病毒是Epstein和Barr于1964年首次成功地将Burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株，并在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒，认为该病毒是多种恶性肿瘤(如鼻咽癌)的病因之一，它主要感染人类口咽部的上皮细胞和B淋巴细胞。在中国南方鼻咽癌患病人群中大多都检测到有EB病毒基因组存在。本病分布广泛，多呈散发性，亦可引起流行。病毒携带者和病人是本病的传染源。经口密切接触为主要传播途径，飞沫传播虽有可能，但并不重要。发病以15～30岁的年龄组为多，6岁以下多呈不显性感染。全年均有发病，似以晚秋初冬为多。一次得病后可获较持久的免疫力。
目前，常用的检测方法是胶体金法，此法虽然检测快速简便，容易操作，但是准确率较低，灵敏度也较低。因此寻求一种价格便宜、操作简便、灵敏度和特异性都较高的检测方法是迫切需要解决的问题。
发明内容
针对上述技术的不足之处，本发明提供一种价格便宜、操作简便、灵敏度和特异性都较高的检测试纸以及用该试纸检测EB病毒的方法。
一种量子点标记免疫层析试纸，设有塑料板、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜A、量子点标记EB病毒IgA单克隆抗体的玻璃纤维素膜B、吸水纸；
其中，所述塑料板上依次粘贴有玻璃纤维素膜A、量子点标记EB病毒IgA单克隆抗体的玻璃纤维素膜B、硝酸纤维素膜、吸水纸；
其中，所述硝酸纤维素膜一端有EB病毒多克隆抗体和兔抗鼠二抗，以此形成检测带T和质控带C；
其中，所述量子点标记的EB病毒IgA单克隆抗体位于玻璃纤维素膜B的另一端，与检测带T和质控带C相对应，并且量子点标记的EB病毒IgA单克隆抗体位于进样点一端。
优选的，所述量子点为CdTe/ZnSe核壳量子点。
优选的，所述塑料板为粘性PVC底板。
优选的，所述EB病毒多克隆抗体的浓度为0.5g/L。
优选的，所述兔抗鼠二抗的浓度为1.0g/L。
优选的，所述检测带T和质控带C间距不少于5mm。
如上所述的试纸的制备方法，包括如下步骤：
(1)量子点与EB病毒IgA单克隆抗体的偶联：
取0.01M的PBS缓冲液100～200uL与5～20uL表面连有羧基的量子点；
选取偶联试剂，偶联试剂选自羟基硫代琥珀酸亚胺、1-(3-二甲基氨丙基)-3乙基碳二胺盐酸盐；
加入EB病毒IgA单克隆抗体150～200uL；
摇床反应1～4小时；
层析柱过滤，离心纯化；
用1％～5％的牛血清白蛋白封闭；
4℃保存；
(2)试纸的制备：
用0.05～0.15M的PBS缓冲液稀释EB病毒多克隆抗体及兔抗鼠二抗，将0.5g/L EB病毒多克隆抗体和1.0g/L兔抗鼠二抗喷在硝酸纤维素膜一端，形成检测带T和质控带C，T带和C带间隔5mm，室温晾干，将硝酸纤维素膜放入PBS缓冲液中，37℃封闭待用，或者干燥后4℃保存；
将量子点标记EB病毒IgA单克隆抗体均匀喷覆于玻璃纤维膜B一端，与形成的T带和C带相对应，室温干燥，4℃保存；
在塑料板上依次粘帖玻璃纤维素膜A、量子点标记EB病毒IgA单克隆抗体的玻璃纤维素膜B、硝酸纤维素膜、吸水纸；
用试纸切刀切割成试纸，干燥后密封保存。
用所述的试纸检测EB病毒，包括如下步骤：将样品点样在组装好的试纸上接近EB病毒IgA单克隆抗体的一端，反应5min后，在紫外分析仪中观察结果。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：由于在所制备的试纸中加入了核壳量子点，特别是采用了CdTe/ZnSe水溶性核壳量子点，将水溶性的量子点与特异性的通过共价偶联，然后利用双抗夹心原理结合量子点的荧光性质检测样品中是否含有目标物。在紫外灯的照射下，通过观察免疫层析试纸条上检测带和质控带的荧光线，判断检测结果。本发明将免疫反应的高特异性和量子点的荧光特性相结合，利用量子点多波长激发，高强度荧光发射，发射峰窄，峰形对称，发光稳定性好的荧光特性，建立了快速，特异，简便，灵敏的免疫层析检测方法。通过观察荧光信号达到了定量检测的目的。该方法的检测灵敏度比目前常用的一种快速检测方法-胶体金的检测灵敏度高约1000倍左右。
附图说明
图1为试纸制备的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1：一种量子点标记免疫层析试纸，设有塑料板、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜A、量子点标记EB病毒IgA单克隆抗体的玻璃纤维素膜B、吸水纸，所述玻璃纤维素膜A为没有点样的市场上购买的玻璃纤维素膜；
其中，所述塑料板上依次粘贴有玻璃纤维素膜A、量子点标记EB病毒IgA单克隆抗体的玻璃纤维素膜B、硝酸纤维素膜、吸水纸；
其中，所述硝酸纤维素膜一端有EB病毒多克隆抗体和兔抗鼠二抗，以此形成检测带T和质控带C；
其中，所述量子点标记的EB病毒IgA单克隆抗体位于玻璃纤维素膜B的另一端，与检测带T和质控带C相对应，并且量子点标记的EB病毒IgA单克隆抗体位于进样点一端。
优选的，所述量子点为CdTe/ZnSe核壳量子点。
优选的，所述塑料板为粘性PVC底板。
优选的，所述EB病毒多克隆抗体的浓度为0.5g/L。
优选的，所述兔抗鼠二抗的浓度为1.0g/L。
优选的，所述检测带T和质控带C间距不少于5mm。
实施例2：如上所述的试纸的制备方法，如图1所示，包括如下步骤：
(1)量子点与EB病毒IgA单克隆抗体的偶联：
取0.01M的PBS缓冲液100～200uL与5～20uL表面连有羧基的量子点；
选取偶联试剂，偶联试剂选自羟基硫代琥珀酸亚胺、1-(3-二甲基氨丙基)-3乙基碳二胺盐酸盐；
加入EB病毒IgA单克隆抗体150～200uL；
摇床反应1～4小时；
层析柱过滤，离心纯化；
用1％～5％的牛血清白蛋白封闭；
4℃保存；
(2)试纸的制备：
用0.05～0.15M的PBS缓冲液稀释EB病毒多克隆抗体及兔抗鼠二抗，将0.5g/LEB病毒多克隆抗体和1.0g/L兔抗鼠二抗喷在硝酸纤维素膜一端，形成检测带T和质控带C，T带和C带间隔5mm，室温晾干，将硝酸纤维素膜放入PBS缓冲液中，37℃封闭待用，或者干燥后4℃保存；
将量子点标记的EB病毒IgA单克隆抗体均匀喷覆于玻璃纤维膜B一端，与T带和C带相对应，室温干燥，4℃保存；
在塑料板上依次粘帖玻璃纤维素膜A、量子点标记EB病毒IgA单克隆抗体的玻璃纤维素膜B、硝酸纤维素膜、吸水纸；
用试纸切刀切割成试纸，干燥后密封保存。
其中，步骤(1)中偶联效果的检测方法如下：
凝胶电泳法：采用0.8琼脂糖凝胶，电压为80V，电泳15min后，在紫外分析仪中观察电泳结果。
斑点印迹法：将0.3g/L EB病毒-BSA液点在硝酸纤维素膜上，晾干后浸泡于含5％BSA的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，10nmol/L，PH＝7.4，含NaCl 8.5g/L)中，封闭膜上剩余的蛋白结合位点，于37℃孵育1h，封闭后取出，PBS洗涤。制备三个完全相同的EB病毒印迹膜，晾干后分别放入量子点标记EB病毒IgA单克隆抗体，量子点-BSA及量子点溶液，于37℃摇床反应30min，PBS洗涤。紫外分析仪中观察结果。
实施例3：用所述的试纸检测EB病毒，包括如下步骤：将样品点样在组装好的试纸上接近EB病毒IgA单克隆抗体的一端，反应5min后，在紫外分析仪中观察结果。用PBS缓冲液及正常人的血液设为空白对照。
结果判定：在C带显现红色荧光带的前提下，目视T带的荧光带强度，与空白对照，荧光越弱，代表待测液中含被检物的浓度越低。
实施例4：试纸检测有效性验证，配制四种浓度的EB病毒溶液，浓度分别为0.5，1.0，2.0，5.0ug/L。利用检测试纸和化学发光试纸盒对样本进行检测，每个浓度检测6次，测定试纸检出结果的有效性。如表一所示，结果表明用本发明制备的试纸检测出来的呈现阳性，并且溶液浓度越大荧光强度越大。
表一：各种浓度EB病毒的试纸条检测结果
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，举凡熟悉此项技艺的专业人士在了解本发明的技术手段之后，自然能依据实际的需要，在本发明的教导下加以变化。因此凡依本发明申请专利范围所作的同等变化与修饰，曾应仍属本发明专利涵盖的范围内。

Claims (2)

1.一种量子点标记免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)量子点与EB病毒IgA单克隆抗体的偶联：
取0.01M的PBS缓冲液100～200μL与5～20μL表面连有羧基的CdTe/ZnSe核壳量子点；
选取偶联试剂；
加入EB病毒IgA单克隆抗体150～200μL；
摇床反应1～4小时；
层析柱过滤，离心纯化；
用1％～5％的牛血清白蛋白封闭；
4℃保存；
(2)试纸的制备：
用0.05～0.15M的PBS缓冲液稀释EB病毒多克隆抗体及兔抗鼠二抗，将0.5g/L EB病毒多克隆抗体和1.0g/L兔抗鼠二抗喷在硝酸纤维素膜上，形成检测带T和质控带C，T带和C带间隔5mm，室温晾干，将硝酸纤维素膜放入PBS缓冲液中，37℃封闭待用，或者干燥后4℃保存；
将量子点标记的EB病毒IgA单克隆抗体均匀喷覆于玻璃纤维膜B上，室温干燥，4℃保存；
在粘性PVC底板上依次粘帖玻璃纤维素膜A、量子点标记EB病毒IgA单克隆抗体的玻璃纤维素膜B、硝酸纤维素膜、吸水纸；
用试纸切刀切割成试纸，干燥后密封保存。
2.如权利要求1所述的量子点标记免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的偶联试剂选自羟基硫代琥珀酸亚胺、1-(3-二甲基氨丙基)-3乙基碳二胺盐酸盐。
CN201310485288.1A 2013-10-16 2013-10-16 一种量子点标记免疫层析试纸的制备方法 Active CN103543262B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310485288.1A CN103543262B (zh) 2013-10-16 2013-10-16 一种量子点标记免疫层析试纸的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310485288.1A CN103543262B (zh) 2013-10-16 2013-10-16 一种量子点标记免疫层析试纸的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103543262A CN103543262A (zh) 2014-01-29
CN103543262B true CN103543262B (zh) 2015-07-22

Family

ID=49966919

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310485288.1A Active CN103543262B (zh) 2013-10-16 2013-10-16 一种量子点标记免疫层析试纸的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103543262B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108267577B (zh) * 2018-01-15 2020-10-09 广州市妇女儿童医疗中心 一种EV71病毒IgA抗体检测试纸条

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1811449A (zh) * 2006-02-23 2006-08-02 上海交通大学 量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法
CN101339196A (zh) * 2008-07-29 2009-01-07 上海师范大学 量子点标记免疫层析试纸快速检测膀胱癌方法
CN101551398A (zh) * 2008-11-26 2009-10-07 中国计量学院 药物残留竞争型量子点标记免疫层析试纸条及其观测装置
CN102520165A (zh) * 2011-12-29 2012-06-27 北京康美天鸿生物科技有限公司 一种量子点荧光免疫层析高灵敏定量检测的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080083266A (ko) * 2005-10-25 2008-09-17 엠엔디 다이어그노스틱 리미티드 인플루엔자 바이러스의 검출용 조성물 및 이를 이용한 키트및 방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1811449A (zh) * 2006-02-23 2006-08-02 上海交通大学 量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法
CN101339196A (zh) * 2008-07-29 2009-01-07 上海师范大学 量子点标记免疫层析试纸快速检测膀胱癌方法
CN101551398A (zh) * 2008-11-26 2009-10-07 中国计量学院 药物残留竞争型量子点标记免疫层析试纸条及其观测装置
CN102520165A (zh) * 2011-12-29 2012-06-27 北京康美天鸿生物科技有限公司 一种量子点荧光免疫层析高灵敏定量检测的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
水泡性口炎病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立;孙秀萍等;《中国预防兽医学报》;20120831;第34卷(第8期);637-641 *
蓝舌病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立;杨俊兴等;《中国兽医科学》;20091231;第39卷(第1期);50-53 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103543262A (zh) 2014-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101339196A (zh) 量子点标记免疫层析试纸快速检测膀胱癌方法
CN111474354A (zh) 2019-nCoV新型冠状病毒检测层析试纸条、检测卡和试剂盒
CN111398593A (zh) 一种快速联合检测卡及其制备方法和应用
CN103529212B (zh) 一种量子点标记免疫层析试纸及其制备方法
CN208367017U (zh) 血清淀粉样蛋白a免疫层析定量检测试纸条
CN205193076U (zh) 一种生物素-亲和素系统快速检测卡
CN115436627A (zh) 一种胱抑素c荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法
CN108845151A (zh) 一种检测甲基苯丙胺的试纸条及其制备方法和应用方法
CN110596396B (zh) 一种检测蛋白的方法以及试纸条和试剂盒
CN106053802A (zh) 一种肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析定量试纸及其制备方法
CN103529211B (zh) 一种量子点标记免疫层析试纸及其制备方法
CN104198702A (zh) 能定量检测血液传染病多指标的量子点标记试条及其方法
CN103543262B (zh) 一种量子点标记免疫层析试纸的制备方法
CN103529213B (zh) 一种量子点标记免疫层析试纸的制备方法
CN108802393A (zh) 一种检测四氢大麻酚酸的试纸条及其制备方法和应用方法
CN108956974A (zh) 一种检测氯胺酮的试纸条及其制备方法和应用方法
CN103760363A (zh) 基于核壳量子点柔性偶联标记物免疫层析试纸条的检测方法
CN208443852U (zh) 用于检测犬c-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡
CN103543269B (zh) 一种量子点标记免疫层析试纸的制备方法
CN103529214B (zh) 一种量子点标记免疫层析试纸及其制备方法
CN110927380A (zh) 一种检测甲基苯丙胺和氯胺酮的双联试纸条及其制备方法和应用方法
CN103529217A (zh) 检测脊髓灰质炎病毒的方法及量子点标记免疫层析试纸及其制备方法
CN103543268B (zh) 一种量子点标记免疫层析试纸的制备方法
CN108072758A (zh) 一种检测双酚a的量子点荧光淬灭免疫层析试纸条及其制备方法
CN103543267A (zh) 检测甲型肝炎病毒的方法及量子点标记免疫层析试纸及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant