CN102520165A

CN102520165A - 一种量子点荧光免疫层析高灵敏定量检测的方法

Info

Publication number: CN102520165A
Application number: CN2011104524394A
Authority: CN
Inventors: 王东
Original assignee: BEIJING KANGMEI TIANHONG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING KANGMEI TIANHONG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2011-12-29
Filing date: 2011-12-29
Publication date: 2012-06-27
Anticipated expiration: 2031-12-29
Also published as: CN102520165B

Abstract

本发明公开了一种量子点荧光免疫层析高灵敏定量检测的方法，本发明的方法利用量子点优良的荧光特性，结合量子点荧光标记技术和免疫层析技术，在优化试纸条结构和各组成部件的基础上，构建荧光免疫层析试纸条，试纸条免疫层析后，采用荧光定量仪检测定量带和质控带荧光信号强度，并以质控带校正定量带荧光强度，进而依据荧光定量仪获取的标准曲线实现分析物的定量检测。本发明方法简单、快速、准确、成本低，且灵敏很高。与常规胶体金免疫层析方法相比，本发明具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确的优势。本发明适用于血样、尿样、唾液、粪便等样本，可应用于重大疾病、毒品检测、食品安全等检测。

Description

一种量子点荧光免疫层析高灵敏定量检测的方法

技术领域

本发明涉及一种以优选材料为基础，利用荧光量子点标记配体实现分析物定量检测的方法，特别公开了一种高灵敏量子点荧光免疫层析方法，可实现病原体、重大疾病(如肿瘤、心血管疾病)、违禁药品、毒品检测、食品安全等多种分析物的半定量与定量检测，属于荧光免疫检测技术领域。

背景技术

免疫层析(immunochromatography)是近十年来兴起的一种快速诊断技术，以双抗体夹心法为例，其原理是将特异的抗体先固定于层析膜(如硝酸纤维素膜)的某一区带，当该干燥的层析膜一端滴加样本(尿液或血清)后，由于毛细作用，样本将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样本中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。

免疫层析试纸条具有精确、快速和操作简单等优点。胶体金免疫层析技术已经在临床检验中得到了广泛应用，其基本原理是通过胶体金标记物与分析物及包被抗体或抗原反应形成胶体金本身的颜色(红色)，可通过肉眼观察检测结果。但是对于某些抗原或抗体含量极低的样本，胶体金的颜色很浅且很难用肉眼来判断结果，灵敏度低。

也有根据检测带结合的胶体金的数量不同，其所对应的吸光度不一致，而进行定量检测，如中国专利201010132561.9，200910090040.9，200910090041.3等基于胶体金分别对HCG、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌肠毒素B等进行了定量检测；中国专利03137101.9描述了胶体金免疫层析定量检测装置及定量方法。美国专利US60/576327和60/592202，及其在中国申请的专利200580025931.6都对免疫层析定量检测进行了论述。但相比于荧光检测，吸光度检测具有灵敏度低、线性范围窄等缺陷。

量子点(QDs)又叫半导体纳米晶，通常是由II～VI族或III～V族元素组成的稳定的、尺寸介于1～20nm之间的纳米微晶体，是20世纪90年代发展的一种具有优良光谱特性和光化学稳定性的生物荧光标记物。其具有许多优良的光学特性：(1)量子点的荧光发射光谱窄而对称，荧光发射波长可调，且覆盖范围可从紫外到近红外区。(2)量子点的吸收光谱宽且连续，可实现一元激发，多元发射，适合于多色标记。(3)量子点具有较强的光学稳定性。CdSe/ZnS量子点的光稳定性是罗丹明6G的100倍以上。(4)量子点摩尔吸光系数可以高达10⁶L/(mol·cm)，且荧光量子产率高(50～80％)，因而可产生较强荧光信号。(5)量子点斯托克斯位移较大，荧光寿命长(20～50ns)，使得信号可以显著区分于背景和其它荧光基团。量子点是一种理想的应用于超灵敏和多组分生物化学分析的荧光探针，在荧光免疫分析和多组分检测、免疫示踪分子定位、纳米生物传感器、实时检测、细胞成像、体内成像、疾病诊断等方面具有独特的作用和广泛应用前景。根据文献报道，量子点作为新一代生物荧光标记物，具有取代传统有机染料的潜力。

针对胶体金试纸条的不足和缺陷，量子点荧光定量检测方法利用量子点多波长激发、高强度荧光强度、发射峰窄、峰形对称、发光稳定性好的荧光特性，可提供一种量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法，对分析物进行荧光定量检测。本方法只需改变量子点的粒径或种类，就可得到不同波长的荧光，用不同类型的量子点标记不同的抗体，可产生多色荧光，实现多组分的检测，方法简单快速，灵敏度高。

中国专利200810041133.8，200810186010.3，200810227473.X，200810204008.4，200810123521.0，201010234498.X，201010033615.6，201010206479.6等对量子点用于试纸条进行了描述，但出发点主要在利用基于量子点的基本荧光特性，利用特定抗原抗体对特定物质进行检测，但均未考虑量子点及试纸条各组件对检测的影响，且未阐述荧光定量检测概念及具体方法。而现有定性及定量试纸条多对荧光检测有较大的影响。

故现有定量试纸条主要存在如下缺点：

1)胶体金定量试纸条灵敏度低，线性范围窄。

2)常用试纸条组件(如层析膜、底板、扣卡等)均有较强荧光背景，对量子点荧光信号的检测有很大的干扰。

3)常用试纸条组件在550nm以下有较明显的荧光噪声，故处于此范围的量子点较难与背景噪声区分，很难达到很低的检测下限。

4)量子点免疫层析检测，大多依据检测带(T线)信号定性判定阴阳性，而未能准确定量分析物浓度，且没有把质控带当做内质控信号，对检测带进行校正。

发明内容

本发明要解决的技术问题为针对现有免疫层析技术中背景与信号难区分、灵敏度低、荧光定量方法不明确的问题，提供一种量子点荧光免疫层析方法，从而实现对样本中分析物的高灵敏半定量与定量检测。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：

步骤1)合成荧光发射波长范围为550～1300nm的量子点纳米颗粒；

步骤2)用化学交联或生物分子间特异性作用将分析物对应的配体和质控分子连接到量子点表面，得到配体修饰的量子点和质控分子修饰的量子点；

步骤3)将步骤2)得到的两种量子点标记物固定在标记垫，在层析膜上设有定量带和质控带，其中质控带固定有能与质控分子特异性结合的生物分子，定量带固定有能与分析物结合或与步骤2)所述配体竞争结合分析物的配体；

步骤4)以样品垫、标记垫、层析膜、吸水垫、底板和扣卡构建成荧光免疫层析试纸条，其中层析膜为弱荧光层析膜，底板和扣卡具有低荧光特性；

步骤5)试纸条免疫层析，样本流经定量带和质控带后，检测定量带和质控带荧光信号强度，并以质控带荧光信号强度校正定量带荧光信号强度，进而实现分析物的定量检测。

本发明提供的量子点荧光免疫层析高灵敏定量检测的方法是一种以量子点为荧光信号的、在免疫层析试纸条上实现分析物快速灵敏检测的新方法。

这种方法是将分析物的配体(如抗原、抗体等)修饰量子点，分析物的另一配体固定在层析膜上，利用配体作用，如双抗体夹心法原理结合量子点的荧光性质检测样本中是否含有分析物。

本发明层析试纸条用于定量样本中的至少一种分析物。分析物包括小分子(药物和毒品)、抗原、抗体、激素、抗生素、细菌和病毒及其他生化标志物。其中小分子包含。其中其他生化标志物包括心血管标志物、肿瘤标志物和自身免疫性疾病标志物。

本发明量子点荧光免疫层析高灵敏定量检测的方法能够解决现有技术中背景与信号难区分、灵敏度低、荧光定量方法不准确的不足和缺陷，可实现对微量样本的检测。由于量子点荧光受激发光干扰很小，灵敏度大大提高，其灵敏度是用传统染料和有色标记物检测方法的10～1000倍。

为了提高信号与背景的区分度，本发明选用发射光波长为550～1300nm的量子点。因为在紫外照射下，层析膜、底板和扣卡的荧光强度在550nm以下远强于550nm以上，从而对低浓度分析物检测时产生一定的影响，故可优选发射波长大于550nm的量子点。另外层析膜、底板和扣卡在近红外区域(750～1300nm)荧光强度极弱，并结合量子点合成技术，优选近红外波长的量子点(750～1300nm)可进一步提高灵敏度。

本发明所用量子点包含单一化合物形成的量子点或是几种化合物组装成的复合物量子点，且量子点具有较强的光稳定性。形成量子点的化合物是从ZnS、CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe、InAs、InP组成的组中选择的，且可掺杂Cu、Mn和Hg。

生物领域应用的量子点主要有水相和有机相两种合成方法，本发明一个实施例采用水相法合成，一般方法为采用巯基化合物(如巯基乙酸、巯基甘油等)作为量子点的稳定剂，巯基通过和量子点表面原子配位来控制量子点生长，同时提供稳定的电荷层保证分散体系的稳定性。该方法虽合成简单，无需进一步表面亲水修饰即可应用，但量子点的生长速率、结晶性、发光效率都远不及有机相合成的量子点。

作为优选，在本发明的一个实施例中，使用水相方法合成700nm和800nm的CdTe/CdSe量子点。

本发明中另一个实施例中，量子点采用有机相合成，一般为：主要是以Cd、Zn的氧化物或盐等为原料，采用长链脂肪酸、脂肪胺和其他种类的磷酸氧化物等充当配体。以十八烯、三辛基氧化磷等高熔点有机化合物为溶剂，在高温条件下生长得到高质量的荧光量子点。有机相合成由于反应温度较高，所得量子点荧光量子产率较高，荧光半峰宽较窄，因此更加得到人们的青睐。

作为优选，在本发明实施例中，使用有机相方法合成630nmCdSe/ZnS量子点，并把量子点由脂溶性转为水溶性，此过程中量子点荧光无明显变化。

质控分子修饰的量子点与配体修饰的量子点可选用相同发射波长的量子点。在本发明的一个实施例中，标记垫中β亚基绒毛膜促性腺激素(β-HCG)的抗体修饰的量子点和质控分子修饰的量子点的发射波长均为630nm。

为了减弱质控分子修饰的量子点对定量带及背景信号的影响，采用双色标记技术，即选用两种发射波长不同的量子点分别标记质控分子和抗体。在本发明的另一个实施例中，标记垫中有机磷的抗体修饰的量子点发射波长为800nm，质控分子修饰的量子点发射波长为700nm。

本发明采用化学交联或生物分子间特异性作用将分析物的配体连接到量子点表面，得到配体修饰的量子点，其中配体能与分析物特异性结合。

本发明中的化学交联为：当量子点表面有活性基团，可与配体或质控分子直接反应时，不需用化学交联剂，反之用化学交联剂把配体修饰到量子点表面。

在本发明的实施例中采用化学交联法对量子点进行蛋白质分子修饰的方法为：利用1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、戊二醛等交联剂将量子点表面的官能团(如羧基、氨基)与蛋白质分子(如抗原、抗体等)表面的官能团(如氨基、羧基、醛基等)连接。

作为优选，在本发明的一个实施例中，采用EDC/NHS交联法对量子点进行修饰，一般步骤为：将量子点溶液与EDC和NHS混合，然后加入一定量的蛋白质，以缓冲液为反应介质，培育4h，加入L-甘氨酸封闭，以色谱、层析柱或超滤离心等方式纯化，从而得到蛋白质修饰的量子点。

生物分子间特异性作用包括生物素-亲和素系统和抗原-抗体系统。作为优选，在本发明的另一个实施例中，采用生物素-亲和素系统结合方式对分析物配体进行量子点修饰，该结合方式具有放大信号的作用，具体为：以EDC将链霉亲和素连接到量子点表面，生物素连接到蛋白质分子表面，通过亲和素-生物素间的相互作用，把蛋白质分子连接到量子点表面。

为了降低对量子点荧光信号的影响，本发明采用弱荧光层析膜、低荧光底板和低荧光扣卡，从而保证获得高荧光信背比，能良好区分信号与背景，进而提高检测灵敏度。

作为优选，在本发明实施例中，底板(8)为黑色，表面附有不干胶，且层析膜(4)、扣卡、底板(8)和不干胶均不含有荧光剂。

为区别于胶体金免疫层析试纸条的检测带，本发明中层析膜上固定分析物配体的区域称为定量带，用于准确定量检测分析物的浓度，并以质控带作内质控校正定量带，以减弱样本、环境因素等的影响。

本发明的免疫层析试纸条可采取常规的层析方式，作为优选，本发明采用预润免疫层析进行分析物检测。其中预润免疫层析试纸条有直接和间接预润两种，在一个实施例中，直接预润免疫层析试纸条由样品垫(1)、过滤膜(2)、标记垫(3)、层析膜(4)、吸水垫(7)、底板(8)和扣卡组成，如图1所示。在标记垫(3)上固定有配体(α-hCG抗体)修饰的量子点，以及质控分子修饰的量子点。在试纸条层析膜上分别设有两条定量带(6)和两条质控带(5)，其中质控带(5)固定有能与质控分子特异性结合的生物分子，定量带(6)固定有能与分析物结合的配体(β-hCG抗体)。分析物(hCG抗原)能与量子点表面的配体(α-hCG抗体)和定量带上的配体(β-hCG抗体)形成双抗体夹心结构。

本发明的另一个实施例中，间接预润免疫层析试纸条由样品垫(1)、标记垫(3)、层析膜(4)、润湿垫(9)、连接垫(10)、吸水垫(7)、底板(8)和扣卡组成，如图2所示。在标记垫(3)上固定有配体(有机磷抗体)修饰的量子点，以及质控分子修饰的量子点。在试纸条层析膜上分别设有定量带(6)和质控带(5)，其中质控带(5)固定有能与质控分子特异性结合的生物分子，定量带(6)固定有能与分析物竞争的配体(有机磷半抗原)。分析物(有机磷)能与量子点表面的配体(有机磷抗体)结合，阻止量子点表面配体(有机磷抗体)与定量带上的配体(有机磷半抗原)结合。

本发明中层析膜(4)包含至少一条用于捕获分析物的定量带(6)，至少一条用于捕获质控分子的质控带(5)。如层析膜包含两条质控带，且其中所示两条质控带分别在定量带两侧，并且以两条质控带为参照分析定量带荧光强度，有利于分析物的准确定量。层析膜包含至少两条定量带时，两条定量带至少检测一种分析物。且检测同一分析物时通过增加定量带的条数可扩大检测范围，避免HOOK效应。

作为优选，本发明的一个实施例中采用两条质控带(5)和两条定量带(6)，以实现分析物的准确定量，减少相关因素的影响。

本发明的一个实施例中所用样本为尿样，且样本进一步包含血清、全血、血浆、唾液和粪便。当样本为全血时，荧光免疫层析试纸条还包括在样品垫与层析膜之间设置的过滤膜(2)，用于分离细胞或干扰物，该过滤膜(2)可分别与样品垫(1)和标记垫(3)直接毛细作用接触(如图1)，也可与标记垫(3)和层析膜(4)直接毛细作用接触。

本发明实施例采用预润免疫层析方法对样本中的分析物进行定量检测。其中预润免疫层析为：加入一定体积的缓冲液到层析膜上，目的是预润湿层析膜，封闭非特异性结合位点，以使量子点标记物均匀通过层析膜，且减少在层析膜上的非特异性吸附，并减缓样本流动速度，从而增加特异性结合。其中缓冲液体积一般为20～80μl，润湿时间一般为10秒～2分钟，而样本层析时间一般为8～25分钟。

本发明的预润免疫层析可为将缓冲液直接或间接滴加于层析膜。而将缓冲液间接滴加于层析膜时，荧光免疫层析试纸条还包括润湿垫和连接垫，其中润湿垫分别与层析膜和连接垫以毛细作用接触，连接垫分别与润湿垫和吸水垫以毛细作用接触。缓冲液通过润湿垫到达层析膜。

本发明采用的缓冲液为pH 7.2～11的碱性缓冲液，且该缓冲液可包含牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性剂。其中表面活性剂可包括吐温20、吐温80、曲拉通X-100、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮等。

作为优选，本发明实施例中，使用缓冲液为包含牛血清白蛋白和吐温20的pH9.0的磷酸缓冲液。

本发明的荧光定量仪包含激发光源模块、滤光模块、光电转换模块、控制分析模块和软件系统。其中激发光源模块包含光源和聚光装置，该光源为发光二极管或激光二极管，波长选择300～400nm之间或500～600nm之间。滤光模块包含滤光片轮，该滤光片轮包含不同种滤光片，以获取相应量子点的荧光信号。光电转换模块包含图像传感器或光电倍增管。

层析结束后，在光源激发下，试纸条产生的荧光信号，经过滤光模块滤除杂散光及背景荧光，到达光电转换模块，转换为数字信号。其中所获质控带与定量带的荧光强度有一定相关性，主要影响因素有温度、湿度、基质等。

本发明检测结果的判定方法为：如果质控带荧光信号强度值超过荧光定量仪内部设定的可接受值，说明检测结果无效；以双抗体夹心法为例，在检测结果有效的前提下，定量带荧光强度与质控带比值越高，表示分析物浓度越高，反之越低；以竞争法为例，定量带荧光强度与质控带比值越低，表示分析物浓度越高，反之越低。

本发明采用荧光定量仪检测一系列不同浓度的标准品，绘制标准曲线。其中标准曲线为标准品系列浓度(c)与所对应的校正荧光信号强度(F)的关系曲线，关系式为F＝f(c)。校正荧光信号强度为F＝αF_定量带/F_质控带，其中α为校正系数，受温度、湿度和基质等影响。然后检测样本，依据标准曲线获得样本中分析物浓度。

本发明可广泛应用于病原体、重大疾病(如肿瘤、心血管疾病等)、违禁药品、毒品检测、食品安全等多种分析物的定量检测。

本发明的主要优点如下：

1)本发明采用量子点作为特异性抗体的标记物，与有机荧光染料相比，具有发光强度高、激发光谱宽、发射光谱窄、荧光寿命长、表面修饰多功能化及稳定性好等优势。并优选了550～1300nm的量子点，以提高与背景的区分度。

2)本发明试剂盒的组成部件中的扣卡、底板以及层析膜在大于550nm时均具有低的荧光特性，以减少对量子点荧光信号获取的影响，从而保证获得高的荧光信背比，进而达到提高灵敏度的目的。

3)本发明采用荧光定量仪检测定量带和质控带荧光信号强度，并以质控带校正定量带荧光信号强度，进而依据荧光定量仪获取的标准曲线实现分析物的定量检测。其中标准曲线为标准品系列浓度(c)与所对应的校正荧光信号强度(F)的关系曲线，关系式为F＝f(c)。校正荧光信号强度为F＝αF_定量带/F_质控带，其中α为校正系数，受温度、湿度和基质等影响。然后检测样本，依据标准曲线获得样本中分析物浓度。

4)本发明只需改变量子点的粒径或种类，就可得到不同波长的荧光，用不同类型的量子点标记不同的抗体，可产生多色荧光标记，实现多组分的检测；利用量子点多色标记技术，减少质控分子对分析物检测的影响，也可减少分析物间的交叉干扰，方法简单快速，灵敏度高，有利于高灵敏定量检测。

5)本发明可利用预润免疫层析技术，增强特异性结合，减少非特异性吸附，增强试剂盒的检测灵敏度，有利于样品中分析物含量极低时的准确定量。

6)本发明方法简单、快速、准确、成本低，且灵敏很高。与常规胶体金免疫层析方法相比，本发明具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确等优势。

附图说明

图1为直接预润免疫层析试纸条的组装示意图，其中1为样品垫，2为过滤膜，3为标记垫，4为层析膜，5为质控带，6为定量带，7为吸水垫，8为底板。

图2为间接预润免疫层析试纸条的组装示意图，其中1为样品垫，3为标记垫，4为层析膜，5为质控带，6为定量带，7为吸水垫，底板，8为底板，9为润湿垫，10为连接垫。

具体实施方式

本发明公开了一种量子点荧光免疫层析高灵敏定量检测的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明所提供的技术方案为：

步骤3)将步骤2)得到的两种量子点标记物固定在标记垫，在层析膜上设有定量带和质控带，其中质控带固定有能与所述质控分子特异性结合的生物分子，定量带固定有能与分析物结合或与步骤2)所述配体竞争结合分析物的配体；

步骤4)以样品垫、标记垫、层析膜、吸水垫、底板和扣卡构建成荧光免疫层析试纸条，其中所述层析膜为弱荧光层析膜，底板和扣卡具有低荧光特性；

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：双抗体夹心测定人绒毛膜促性腺激素(hCG)

(一)量子点合成及修饰

取0.2375g硒粉、2.60mL十八烯和1.57mL三正辛基膦，依次加入25ml小试剂瓶中，加热瓶中混合液体并反复振荡直至硒粉全部溶解，即得硒前体。另取0.0368g氧化镉、0.342g硬脂酸和3.8ml十八烯，依次加入三颈烧瓶中，氮气保护下加热至氧化镉全部溶解。降温使溶液冷却至凝固。取2.25g十八胺和0.95g三辛基氧化膦，加入三颈烧瓶，并加热使固体融解，继续加热至280℃，注入4.2mL硒前体，升温至240℃，使CdSe量子点荧光发射波长增加到所需波长。并以甲醇纯化量子点。

取10mL十八烯、0.110g硫粉，依次加入三颈烧瓶中，在氮气保护下加热至硫粉溶解，即得硫前体。另取0.8375g氧化锌、9mL油酸和2mL十八烯，依次加入三颈烧瓶中，在氮气保护下加热至锌粉溶解，即得锌前体。取2ml CdSe量子点溶液，加入三颈烧瓶中，抽真空去除氯仿，取以上合成的硫前体和锌前体，以及5mL十八烯和1.4g十八胺，依次加入三颈烧瓶中，加热使固体融解，在氮气保护下加热使量子点生长至所需波长，并以甲醇纯化。表征量子点荧光特征，CdSe/ZnS量子点荧光发射波长为630nm，量子产率大于50％。

取0.5～1.0g四甲基氢氧化铵五水合物，加入0.1～1ml巯基丙酸和10ml氯仿，摇均，静置30分钟后，去除上层液体，然后加入100μlCdSe/ZnS量子点溶液。溶液中有红色沉淀析出，48小时后取出红色悬浮物，以氯仿纯化后，溶于水溶液中，得到表面官能团为羧基的量子点。量子点相转移前后荧光特性无明显变化。

向磷酸缓冲液中加入60pmol量子点、10μg EDC和15μg NHS溶液和10～30μg抗β亚基绒毛膜促性腺激素(β-hCG)的单抗溶液，混合均匀并于室温下反应4h，加入1mg甘氨酸封闭。用色谱柱或层析柱分离纯化，得到β-hCG抗体修饰的量子点。同理得到羊抗兔抗体修饰的量子点。

(二)试纸条组装

以摩尔比1∶1的比例混合均匀上述两种量子点标记物，其中混合液中含有1～15％蔗糖、0.01～2％牛血清白蛋白(BSA)和吐温20、吐温80、曲拉通X-100等表面活性剂，其中表面活性剂含量在0.01～2％之间，然后均匀喷涂在标记垫上，37℃干燥后密封，4℃下保存。

以划膜仪在弱荧光层析膜上划四条平行条带，条带间隔5mm，条带宽都约为1mm。其中两侧的两条为质控带，中间为两条定量带。质控带上喷涂兔免疫球蛋白(IgG)，浓度分别为0.3mg/ml和1mg/ml。定量带喷涂抗a亚基绒毛膜促性腺激素(a-hCG)的多抗，浓度为1～3mg/ml。37℃干燥后密封，4℃下保存。

在黑色底板上，依次粘贴样品垫(长30cm，宽16mm)、过滤膜(长30cm，宽10mm)、标记垫(长30cm，宽8mm)、层析膜(长30cm，宽2.5cm)和吸水垫(长30cm，宽16mm)。膜与膜之间都要紧密相连，制成免疫层析试纸大板。示意图如图1所示。用切条机将粘贴好的析试纸大板纵向切成4mm宽的试纸条，放入低荧光扣卡中，干燥后密封，4℃避光保存。

(三)样本检测

用正常人尿液作稀释液，将hCG抗原标准品配制系列浓度标准品溶液如下：0mIU/mL、25mIU/mL、100mIU/mL、300mIU/mL、500mIU/mL、800mIU/mL、1000mIU/mL、3000mIU/mL、5000mIU/mL、8000mIU/mL、10000mIU/mL和15000mIU/mL。将100μl标准品滴加到上样孔上，13分钟后，以荧光定量仪检测(每个样本分别用3个试纸条测定3次，取平均值)，绘制标准曲线。其中质控带用于试纸条有效性判断，并对定量带信号作相应的校正。

将100μl尿液样本滴加到上样孔上，13分钟后以荧光定量仪检测试纸条，依据标准曲线获得样本中hCG的浓度。。

免疫层析的原理为：当样本滴入试纸条样品垫后，样本先与标记垫中的量子点标记物相混合，并沿着层析膜向吸水垫方向毛细运动，分别流经层析膜上的定量带和质控带。当样本中含有hCG，则与量子点表面的β-hCG单抗相结合，当层析至定量带时，会被预先包被于该条带的a-hCG抗体捕获，从而构成双抗体夹心复合物，使量子点停留在定量带。光源激发下，采用荧光定量仪获取定量带和质控带的荧光信号强度，依据荧光定量仪获取的标准曲线，进而分析样本中hCG浓度。样本中hCG含量越高，则结合到定量带的量子点越多，定量带荧光强度越强。

结果表明，其最低检测限为5mIU/mL，最低定量限为10mIU/mL，在定量检测范围内，相关系数R²＞0.99，未出现HOOK效应，且批内与批间重复性均较好，可为早早孕诊断提供参考。

实施例2：竞争法测定有机磷

(一)量子点合成及修饰

CdTe量子点的合成，按体积比2∶1的比例依次向盛有适量的Te粉和硼氢化钠的反应器中加人无水乙醇和一次水，通氮气在60℃水浴中反应直至黑色Te粉完全消失。加人稍过量0.5mol/L H₂SO₄，产生H₂Te并被NaOH溶液吸收，得到NaHTe水溶液。

在氮气下将CdCl₂·2.5 H₂O溶解到100mL超纯水中，然后加人巯基丙酸，在搅拌作用下滴加0.5mol/L NaOH溶液调节溶液的pH为11.2，最后注入0.1mmol NaHTe溶液，其中Cd∶Te∶巯基丙酸的比值为1.0∶0.5∶2.4。所得混合溶液在氮气下100℃加热回流，得到CdTe量子点，并以异丙醇纯化。

取适量CdTe量子点(浓度为1mmol/L)，之后加入巯基丙酸(52.4mg)和Cd²⁺(0.2mmol/L)的混合溶液。Se和NaHB₄反应产生NaHSe，加人0.5mmol/L硫酸后产生H₂Se气体，缓慢通入混合溶液中，在90℃水浴加热回流下得到羧基化CdTe/CdSe量子点，荧光发射波长为700nm和800nm。

根据实施例1的方法，制备链霉亲和素修饰的量子点(荧光发射波长为800nm)。

将有机磷单抗用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0)稀释到1mg/ml，用1ml二甲亚砜(DMSO)溶解1mg N-羟基琥珀酰亚胺生物素(NHSB)，取1ml有机磷单抗溶液加入20～120μl NHSB溶液，室温下反应4小时。加入1mol/L NH₄Cl，在室温下搅拌10分钟。以超滤离心纯化，以除去游离的生物素，得到生物素化的有机磷单抗。

以1∶3～1∶12的比例混合链霉亲和素修饰的量子点和生物素化的有机磷单抗，得到有机磷抗体修饰的量子点(荧光发射波长为800nm)。同理得到羊抗兔抗体修饰的量子点(荧光发射波长为700nm)。

(二)试纸条组装

根据实施例1的方法把量子点标记物喷涂于标记垫。

根据实施例1的方法把抗体和质控分子分别喷涂于层析膜的定量带(一条)和质控带(两条)。其中以有机磷抗体修饰的量子点喷涂于标记垫上；以有机磷包被抗原(半抗原)作为包被抗原包被于试纸条定量带，划线浓度为0.2～1.5mg/ml；以兔IgG包被于质控带。

在黑色底板上，依次粘贴样品垫(长30cm，宽16mm)、标记垫(长30cm，宽8mm)、层析膜(长30cm，宽2.5cm)、连接垫(长30cm，宽10mm)、润湿垫(长30cm，宽10mm)和吸水垫(长30cm，宽16mm)。膜与膜之间都要紧密相连，制成免疫层析试纸大板。示意图如图2所示。用切条机将粘贴好的析试纸大板纵向切成4mm宽的试纸条，放入低荧光扣卡中，干燥后密封，4℃避光保存。

(三)样本检测

用磷酸缓冲液作稀释液，将甲胺磷标准品配制系列浓度标准品溶液如下：0mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L、1mg/L、3mg/L、5mg/L、8mg/L、10mg/L。

用磷酸缓冲液作稀释液，将敌敌畏标准品配制系列浓度标准品溶液如下：0μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L、30μg/L、50μg/L、100μg/L、300μg/L、500μg/L、800μg/L、1000μg/L。

将100μl缓冲液或标准品溶液滴加到上样孔中，13分钟后，以荧光定量仪检测(每个样本分别用3个试纸条测定3次，取平均值)，分别绘制标准曲线。其中质控带用于对定量带信号受环境影响，而作相应的校正。

将100μl样本滴加到上样孔中，13分钟后，以荧光定量仪检测，依据标准曲线获得样本中有机磷的浓度。

免疫层析的原理为：当样本滴入试纸条样品垫后，样本先与标记垫中的量子点标记物相混合，并沿着层析膜向吸水垫方向毛细运动，分别流经层析膜上的定量带和质控带。当样本中含有有机磷时，有机磷与量子点表面有机磷抗体结合，流经定量带时，包被抗原将和有机磷竞争结合量子点表面的有机磷抗体上有限的抗原结合位点，样本中有机磷含量越高，竞争力越强，则定量带上的包被抗原和量子点表面的有机磷抗体结合将越少，定量带荧光强度越弱。无论样本中是否含有有机磷，量子点修饰的羊抗兔抗体均会与包被的兔IgG结合，显现强荧光的质控带。质控带强度与定量带有一定相关性，主要影响因素有环境温度、湿度和基质等。

结果表明，甲胺磷最低检测限为0.1mg/L，最低定量限为0.2mg/L，在定量检测范围内，相关系数R²＞0.99，未出现HOOK效应，且批内与批间重复性均较好，可用于农药残留检测。

敌敌畏最低检测限为1μg/L，最低定量限为5μg/L，在定量检测范围内，相关系数R²＞0.99，未出现HOOK效应，且批内与批间重复性均较好，可用于农药残留检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种量子点荧光免疫层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的量子点荧光免疫层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，步骤1)所述量子点为单一化合物形成的量子点或是几种化合物组装成的复合物量子点。

3.如权利要求2所述的量子点荧光免疫层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，所述化合物是从ZnS、CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe、InAs、InP组成的组中选择，且可掺杂Cu、Mn和Hg。

4.如权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤2)所述配体修饰的量子点与质控分子修饰的量子点的荧光发射波长均为630nm。

5.如权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤2)所述配体修饰的量子点的荧光发射波长为800nm，质控分子修饰的量子点的荧光发射波长为700nm。

6.如权利要求1所述的量子点荧光免疫层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，步骤2)所述配体包含抗原、半抗原、单克隆抗体、多克隆抗体和激素受体。

7.如权利要求1所述的量子点荧光免疫层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，步骤3)所述层析膜包含至少一条质控带，至少一条定量带。

8.如权利要求1所述的量子点荧光免疫层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，步骤3)所述层析膜包含至少两条定量带，且两条定量带至少检测一种分析物。

9.如权利要求1所述的量子点荧光免疫层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，步骤4)所述层析膜在大于550nm时荧光很弱或不含荧光剂。

10.如权利要求1所述的量子点荧光免疫层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，步骤4)所述底板为黑色，表面附有不干胶，且两者均不含荧光剂。

11.如权利要求1所述的量子点荧光免疫层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，步骤4)所述扣卡具有低荧光特性或不含荧光剂。

12.如权利要求1所述的量子点荧光免疫层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，步骤4)所述层析试纸条还包含能使细胞或干扰物与样本中液体分离的过滤膜。

13.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤5)所述免疫层析为预润免疫层析，其中预润免疫层析为先以缓冲液预润层析膜，再加入样本到样品垫中，样本流经定量带和质控带后，进行荧光定量检测。

14.根据权利要求13所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述预润层析膜为将缓冲液直接滴加于层析膜。

15.根据权利要求13所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，当所述预润层析膜为将缓冲液间接滴加于层析膜时，步骤4)所述荧光免疫层析试纸条还包括润湿垫和连接垫，其中润湿垫分别与层析膜和连接垫以毛细作用接触，连接垫分别与润湿垫和吸水垫以毛细作用接触。

16.根据权利要求13所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述缓冲液为pH 7.2～11的碱性缓冲液。

17.根据权利要求16所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述碱性缓冲液为包含牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性剂的碱性缓冲液。

18.根据权利要求16所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述碱性缓冲液为包含牛血清白蛋白和吐温20的pH9.0的磷酸缓冲液。

19.如权利要求1所述的量子点荧光免疫层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，步骤5)所述分析物包括小分子、抗原、抗体、激素、抗生素、细菌或病毒及其他生化标志物。

20.如权利要求19所述的量子点荧光免疫层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，所述小分子包含药物或毒品。

21.如权利要求19所述的量子点荧光免疫层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，所述其他生化标志物包括心血管标志物、肿瘤标志物或自身免疫性疾病标志物。