CN103884842A - 针对elisa检测用特异性抗体对的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及针对ELISA检测用特异性抗体对的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：将待筛选的至少两个抗体分子分别标记为标记生物素抗体分子和标记显色化合物抗体分子；步骤二：检测所述标记生物素抗体分子和所述标记显色化合物抗体分子是否成功标记；步骤三：分别将选自所述标记生物素抗体分子中的单个标记生物素抗体分子和选自所述标记显色化合物抗体分子的单个显色化合物抗体分子两两配对成抗体对，针对待测抗原进行ELISA检测，采集抗体对检测信号；步骤四：根据所述抗体对检测信号强弱对所述待筛选的至少两个抗体分子对进行筛选。该方法的设计更加系统、全面和高效，能够筛选出最佳抗体对，利用筛选所得抗体对建立的针对待测抗原的ELISA检测方法具有较优的灵敏度。

Description

针对ELISA检测用特异性抗体对的筛选方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及生物制品检测领域，具体是指一种可用于所针对待测抗原的定性及定量分析的ELISA检测用特异性抗体对的筛选方法。

背景技术

酶联免疫吸附检测（ELISA）利用抗原抗体能够专一性结合的性质，早期多被用于抗原定位，现在则多用于抗原的微量检测。目前，基于ELISA技术的定性或定量检测方法已经十分成熟，并且被广泛的应用于各种病毒、病原菌检测，细胞因子检测以及生物大分子药物的药代动力学、免疫原性及活性检测研究等。

酶联免疫吸附检测（ELISA）的基本原理是：将待测的抗原或抗体包被在孔板上，酶标记抗体或抗原与相应的包被抗原或抗体结合，在平板上形成免疫复合物。结合在免疫复合物上的酶可以与相应底物发生显色反应，该显色反应的信号值与包被的待测抗原或抗体的量成一定比例关系，根据信号值强弱可以对待测抗原或抗体进行定性或定量分析。用于显色反应的酶标记化合物可以是碱性磷酸酶、过氧化物酶，也可以是荧光标记或放射性标记等。ELISA酶促显色反应同样能对信号进行放大，实现对待测抗原的微量检测。

利用ELISA进行抗原检测时，双抗体夹心法是最常用的。其原理是首先包被捕获抗体，接着加入待测抗原，使其与捕获抗体形成免疫复合物，然后加入酶标检测抗体与待测抗原结合，此时捕获抗体、检测抗体与待测抗原形成双抗体夹心结构。最后根据酶标记选择合适的方式进行显色反应，根据检测信号对待测抗原进行定性或定量分析。很显然，双抗体夹心ELISA方法的核心是选择合适的捕获抗体和检测抗体组成抗体对。这2个抗体分子除了必须满足能够与待测抗原特异性结合，并具有一定的亲和力之外，更重要的还应确保2个抗体分子是针对待测抗原不同的表位（抗原决定簇），比较理想的状态是这2个表位之间有一定的空间距离，就能保证2个抗体分子都能最大程度的与抗原分子结合，使ELISA检测具有较灵敏的检测限和较宽的线性范围。

关于ELISA双抗体夹心法检测用抗体对的筛选技术方法的文献资料并不多见，也没有比较系统的报道。这部分工作的开展大多还是停留在常规的“鸟枪法”筛选的阶段：比如将待筛选抗体偶联标记后，两两组合并在某固定的待测抗原浓度条件下进行ELISA检测，考察检测信号，并直接根据检测信号强弱或信噪比对满足要求的抗体对进行筛选。有时候，这种比较直观的筛选方法也能够筛选到一些较优的抗体对，然而却很可能遗失掉最优的，因为这种筛选方法并不完备。比较系统和完备的抗体对筛选方法需要考虑的因素其实有很多，抛开抗体对的实际应用环境不说，依赖于信号值强弱的整个筛选过程还需要考虑筛选时ELISA检测条件、抗体浓度、抗原浓度（待测物）以及抗体偶联标记效率等。

抗体浓度需要通过归一化的方式来消除其对信号值的影响，很显然在相互作用未达到饱和的情况下，信号值与所加入的检测抗体的量（浓度）成正相关，不能简单的通过信号值的强弱来对抗体对进行选择，还应该考察检测用的抗体浓度，选择在较低作用浓度下就能得到较高信号值的抗体对。

抗原（待测物）浓度在抗体对筛选过程中同样十分重要，最好选在ELISA检测线性段中间点的浓度，相对捕获抗体和检测抗体的用量均不能饱和，因为抗原（待测物）用量过高或过低会使得ELISA检测信号值落在曲线的上平台或下平台区域，变化不明显就难以通过信号值判断抗体对的优劣。

抗体偶联标记效率是另一个比较重要的关键因素，因为标记效率直接影响信号强弱，即使抗体作用浓度一致，但若标记效率相差较大，信号值的差异也会十分明显。另一方面，标记效率不同于抗体浓度，是很难直接表征的，一般只能通过质谱的方法来考察每个抗体分子偶联多少个显色基团，事实上即使掌握了标记效率的信息，在实际筛选过程中也是难以根据标记效率来调整检测抗体及捕获抗体的用量的，除非进行多次偶联进行偶联效率的筛选，很显然这种做法是不太科学的。那么如何在抗体对的筛选过程中消除偶联标记效率的影响也是研究人员需要解决的。

此外，抗体对筛选过程中，理论上抗体对一旦确定，因为所针对的是抗原的不同表位，这对抗体是可以互为捕获抗体或检测抗体的，但在检测信号方面则可能因为上述原因或其他实验条件而存在不同，这一点同样需要在筛选过程中引起注意。

所以，考虑到上述相关因素，提供一种能够排除了筛选过程中捕获/检测抗体量、标记偶联效率以及待测抗原用量的干扰，使筛选过程更加全面和系统的ELISA检测用抗体对的筛选方法是十分必要的，其更有利于生物大分子药物、病毒、病原菌、细胞因子等的定性及定量ELISA检测方法的开发。

发明内容

本发明的目的是为了克服ELISA双抗体夹心检测法检测用抗体对筛选技术方面的缺陷和不足，针对受ELISA检测条件、抗体浓度、抗原浓度（待测物）以及抗体偶联标记效率的干扰影响较大，容易出现选择不全面和误判的问题，提供了一种针对夹心法ELISA检测用特异性抗体对的筛选方法。

为了实现上述目的，在本发明提供了一种针对ELISA检测用特异性抗体对的筛选方法，其特点是，包括以下步骤：

步骤一：将待筛选的至少两个抗体分子分别标记生物素和显色化合物，成为标记生物素抗体分子和标记显色化合物抗体分子；

步骤二：检测所述标记生物素抗体分子和所述标记显色化合物抗体分子是否成功标记；

步骤三：分别将选自所述标记生物素抗体分子中的单个标记生物素抗体分子和选自所述标记显色化合物抗体分子的单个标记显色化合物抗体分子两两配对成抗体对，利用包被亲和素的ELISA板，以所述单个标记生物素抗体分子作为捕获抗体，所述单个标记显色化合物抗体分子作为检测抗体，对待测抗原进行ELISA检测，采集抗体对检测信号；

步骤四：根据同一抗体分子所组成的抗体对的检测信号不强于该抗体分子与另一抗体分子所组成的抗体对的检测信号这一原则，根据所述抗体对检测信号强弱对所述待筛选的至少两个抗体分子对进行筛选。

较佳地，所述ELISA检测包括固相反应或液相反应。

较佳地，所述待筛选的至少两个抗体分子均为单克隆抗体。

较佳地，所述显色化合物为酶标记物、荧光染料、化学发光染料以及放射性标记中的一种。

更佳地，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记物或碱性磷酸酶标记物。

较佳地，其特征在于，所述待测抗原包括生物大分子药物、病毒、病原菌以及细胞因子。

较佳地，其特征在于，所述的采集抗体对检测信号的步骤之后还包括以下步骤：

对所述的抗体对检测信号进行归一化处理。

本发明的有益效果具体在于：能够排除了筛选过程中捕获/检测抗体量、标记偶联效率以及待测抗原用量的干扰，使筛选过程更加全面和系统。基本原理在于：理想的抗体对应该基于待测抗原的不同表位，并且针对不同抗原表位的抗体对进行ELISA夹心法检测的信号值应该不低于针对同一抗原表位的抗体分子（极端情况是同一个抗体分子）进行组合的ELISA夹心法检测信号值。因为针对同一表位的抗体对必然存在空间位阻而影响结合效率。根据上述原理对ELISA检测过程中使用的特异性抗体对进行筛选，使其能够更为适用于定量ELISA检测。

本发明还采取归一化以及比值的方法来消除捕获抗体/检测抗体用量和偶联效率对检测结果的影响，使得归一化后的检测结果直接反映抗体对与待测抗原的相互作用情况，为抗体对的筛选提供依据。方法简便而又高效。

本发明抗体对的筛选方法能够满足针对某特定待测抗原进行ELISA夹心法检测时，对特异性抗体对进行筛选。该方法的设计更加系统、全面和高效，能够有效的筛选出最佳抗体对，利用筛选所得抗体对所建立的针对待测抗原的ELISA检测方法具有较优的灵敏度及检测范围，能够用于针对不同生物大分子药物、病毒、病原菌、细胞因子等的定性和定量分析。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。

本发明的实施例的方法的具体步骤如下：

1通过免疫技术获得若干个针对某待测抗原不同表位的抗体分子，将这些待筛选的抗体分子分别标记生物素（Biotin）和显色化合物（HRP）。

2利用免疫学方法检测抗体分子是否成功标记，选择成功标记的抗体分子进入后续筛选。

3将分别标记Biotin和HRP的待筛选抗体分子进行两两配对，利用包被亲和素的ELISA板，以标记生物素的抗体分子为捕获抗体，标记显色化合物的抗体分子为检测抗体，对待测抗原进行ELISA检测，采集检测信号。在检测过程中，针对任一对待筛选的抗体分子，ELISA检测条件保持一致（可在同一块96孔板上进行操作），包括亲和素包被量、抗原抗体作用环境、作用时间、显色时间等，加入的线性范围内的待测抗原用量也保持一致。对检测信号进行归一化处理，即将检测信号除以所用抗体分子对的作用浓度（抗体分子对的作用体积一致），排除抗体分子对的加入量对检测信号的影响。

4根据同一抗体分子所组成的抗体对的检测信号不强于该抗体分子与另一抗体分子所组成抗体对的检测信号的这一原则，利用归一化处理后的检测信号，对针对待测抗原的ELISA检测用特异性抗体对进行筛选。筛选原则是：标记Biotin和标记HRP的抗体分子A所组成的抗体对经归一化处理后的检测信号为SA，标记Biotin和标记HRP的抗体分子B所组成的抗体对经归一化处理后的检测信号为SB，标记Biotin的抗体分子A与标记HRP的抗体分子B所组成的抗体对经归一化处理后的检测信号为SAB，标记Biotin的抗体分子B与标记HRP的抗体分子A所组成的抗体对经归一化处理后的检测信号为SBA，那么（SAB×SBA）≥（SA×SB），并且超过越多则越佳，筛选过程排除了偶联标记效率的影响，所得到的抗体对是与待测抗原之间具有较高的亲和力。

实施例1：针对大分子蛋白药物ELISA夹心法检测用特异性抗体对的筛选

1.实验目的

针对大分子蛋白药物建立ELISA夹心检测法，对该蛋白药物进行定量分析，用于表达量检测、PK检测等。利用免疫小鼠杂交瘤融合技术得到6个针对该蛋白药物的特异性抗体，分别记作Mab1、Mab2、Mab3、Mab4、Mab5、Mab6。利用该特异性抗体对的筛选方法从这6个抗体中挑选合适的抗体对，使得该ELISA夹心检测法具有较小的检测限和较宽的定量范围。

2.实验过程及结果

（1）标记偶联：

利用商品化试剂盒（氨基活化偶联法）分别对待筛选的6个针对蛋白药物的特异性抗体偶联生物素（Biotin），记作Mab1-B、Mab2-B、Mab3-B、Mab4-B、Mab5-B、Mab6-B；偶联辣根过氧化物酶（HRP），记作Mab1-H、Mab2-H、Mab3-H、Mab4-H、Mab5-H。

（2）标记检测：

针对生物素标记，取包被了亲和素（Avidin）的ELISA孔板，先加入生物素偶联的特异性抗体结合，接着加入带HRP标记的抗小鼠Mab的抗体进行检测，考察这6个偶联生物素的特异性抗体是否成功标记，结果见表1，“+”越多则代表信号值越强。

针对HRP标记，取包被了抗小鼠Mab的ELISA孔板，加入HRP标记偶联的特异性抗体结合，直接检测，考察这6个偶联HRP的特异性抗体是否成功标记，结果见表2，同样的“+”越多则代表信号值越强。

从表1和表2的结果示例，可以发现Mab4-B和Mab4-H的偶联标记检测情况并不理想，不适合继续后续的抗体对筛选。而其他待筛选抗体均成功偶联生物素或HRP，但偶联检测信号（偶联效率）存在差异。

表1待筛选抗体Biotin标记检测

偶联生物素标记的待测抗体	生物素标记检测
		Mab1-B	+
Mab2-B	++
		Mab3-B	++
Mab4-B	-
		Mab5-B	++
Mab6-B	++

表2待筛选抗体HRP标记检测

偶联生物素标记的待测抗体	HRP标记检测
		Mab1-H	+
Mab2-H	++
		Mab3-H	++
Mab4-H	-
		Mab5-H	++
Mab6-H	+

（3）配对检测：

除了Mab4-B、Mab4-H之外，将分别标记Biotin和HRP的待筛选抗体分子进行两两配对，取包被了亲和素（Avidin）的ELISA孔板，以标记Biotin的抗体为捕获抗体，标记HRP的抗体为检测抗体，对一定量线性范围内的待测抗原进行检测，考察检测信号。整个检测过程在1块ELISA板上进行，分别是5个标记Biotin和HRP的抗体两两配对，一共25组，检测过程中抗体对的作用体积均保持一致。检测完毕后，对检测信号进行归一化处理，以Mab1-B和Mab2-H所组成抗体对为例，归一化处理前检测信号为S’12，归一化处理后的检测信号为S12，检测过程所用Mab1-B和Mab2-H的浓度分别为CMab1-B和CMab2-H，那么S12=S’12/(CMab1-B×CMab2-H)。

将两两配对共25组检测结果利用方阵的形式表现出来，见表3（归一化处理前）和表4（归一化处理后），根据“+”的数量表示相对大小。从下表可以看出归一化处理前后抗体对检测信号值的相对高低是有区别的，归一化处理消除了浓度的影响，即比较的是单位浓度的抗体对的实验条件下的检测值。

表3抗体对筛选归一化处理前检测结果

S’信号	Mab1-H	Mab2-H	Mab3-H	Mab5-H	Mab6-H
						Mab1-B	+	+	-	+	+
Mab2-B	+	+	-	+	+
						Mab3-B	-	+	-	+	-
Mab5-B	+	++	-	++	++
						Mab6-B	+	+	-	++	+

表4抗体对筛选归一化处理后检测结果

S信号	Mab1-H	Mab2-H	Mab3-H	Mab5-H	Mab6-H
						Mab1-B	+	+	-	+	+
Mab2-B	+	++	-	+	+
						Mab3-B	-	-	-	-	-
Mab5-B	++	++	-	++	++
						Mab6-B	+	+	-	++	+

（4）确定最优抗体对：

将经过浓度归一化处理后的检测信号S做进一步的分析处理，确定哪2个抗体分子间所组成的抗体对是最优的。以Mab1和Mab2之间的分析为例，以Mab1-B为捕获抗体，Mab2-H为检测抗体，经归一化处理后的检测信号记为S12；以Mab1-B为捕获抗体，Mab1-H为检测抗体，经归一化处理后的检测信号记为S11；以Mab2-B为捕获抗体，Mab1-H为检测抗体，经归一化处理后的检测信号记为S21；以Mab2-B为捕获抗体，Mab2-H为检测抗体，经归一化处理后的检测信号记为S22。计算B=(S12*S21)/(S11*S22)，根据B值来判断用于待测蛋白药物ELISA检测的最优抗体对。

检测结果见表5，根据“+”的数量表示相对大小。从结果可以很明显的看出Mab5与Mab6所组成的抗体对的B值较大，说明这对抗体与待测抗原之间的亲和力较强，更适合用于ELISA方法的建立。因为B值是在排除了偶联标记效率影响的情况下得到的，更能反映出抗体对在进行ELISA夹心法检测时的优劣。

表5抗体对筛选归一化处理后检测结果

B值	Mab1	Mab2	Mab3	Mab5	Mab6
						Mab1	+	-	-	++	-
Mab2	-	+	-	++	+
						Mab3	-	-	+	-	-
Mab5	++	++	-	+	+++
						Mab6	-	+	-	+++	+

（5）筛选确认：

在确认了Mab5和Mab6是最佳的抗体对之后，分别用Mab5-B和Mab6-H以及用Mab6-B和Mab5-H进行配对组合，建立ELISA夹心法，对系列浓度的待测蛋白药物进行检测，考察方法的检测限和检测范围，并考察检测范围内的信噪比（S/N）。与此同时，也对根据表5分析得出的次优抗体对，包括（Mab5-B与Mab1-H）、（Mab5-B与Mab2-H）和（Mab6-B与Mab2-H），进行组合，对它们在实际蛋白药物检测时的方法检测限和检测范围进行考察。统计结果见表6，根据“+”的数量表示相对优劣。

结果发现利用本发明筛选得到的抗体对所构建的ELISA夹心法具有最佳的检测灵敏度和检测范围，利用（Mab5-B与Mab6-H）及（Mab6-B与Mab5-H）这2对组合的检测下限的数量级均达到0.1ng，而检测上限的数量级则超过了100ng，并且在0.1ng检测下限附近，信噪比（S/N）均满足>3。说明筛选得到的由Mab5和Mab6所组成的抗体对能够用于建立ELISA夹心法，具备较优的检测范围和检测限，能够满足待测蛋白药物实际定量检测的需要。

表6抗体对实际蛋白药物ELISA检测方法考察

由上述实施例可以看出，在ELISA检测用特异性抗体对的筛选过程中，直接根据筛选ELISA信号值进行比较，而不通过实验设计来排除其他各个因素的影响，如ELISA实验条件、待筛选抗体作用浓度、待测抗原加入量、标记物偶联效率等，是很容易出现误判或选择不完全的情况的，利用本发明的方法，能够克服这些困难，使得筛选过程更加系统和全面，提高筛选效率。

综上所述，本发明建立了一种针对ELISA检测用特异性抗体对的筛选方法，利用该方法进行筛选，更加系统，全面和高效。基于该方法筛选抗体对所建立的ELISA夹心法具有较优的检测范围和检测限，能够满足生物大分子药物、病毒、病原菌、细胞因子等待测抗原的定性及定量分析。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (7)

1.针对ELISA检测用特异性抗体对的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：将待筛选的至少两个抗体分子分别标记生物素和显色化合物，成为标记生物素抗体分子和标记显色化合物抗体分子；

步骤二：检测所述标记生物素抗体分子和所述标记显色化合物抗体分子是否成功标记；

步骤三：分别将选自所述标记生物素抗体分子中的单个标记生物素抗体分子和选自所述标记显色化合物抗体分子的单个标记显色化合物抗体分子两两配对成抗体对，利用包被亲和素的ELISA板，以所述单个标记生物素抗体分子作为捕获抗体，所述单个标记显色化合物抗体分子作为检测抗体，对待测抗原进行ELISA检测，采集抗体对检测信号；

步骤四：根据同一抗体分子所组成的抗体对的检测信号不强于该抗体分子与另一抗体分子所组成的抗体对的检测信号这一原则，根据所述抗体对检测信号强弱对所述待筛选的至少两个抗体分子对进行筛选。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述ELISA检测包括固相反应或液相反应。

3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述待筛选的至少两个抗体分子均为单克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述显色化合物为酶标记物、荧光染料、化学发光染料以及放射性标记中的一种。

5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记物或碱性磷酸酶标记物。

6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述待测抗原包括生物大分子药物、病毒、病原菌以及细胞因子。

7.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述的采集抗体对检测信号的步骤之后还包括以下步骤：

对所述的抗体对检测信号进行归一化处理。