CN101433824A

CN101433824A - 自动物样品中提取磺胺喹噁啉的方法及其专用免疫亲和吸附剂

Info

Publication number: CN101433824A
Application number: CNA2008102277812A
Authority: CN
Inventors: 沈建忠; 张素霞; 史为民; 李炳玉; 万宇平; 曹兴元; 江海洋; 冯才伟; 李建成; 王战辉; 李存
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2008-12-03
Filing date: 2008-12-03
Publication date: 2009-05-20
Anticipated expiration: 2028-12-03
Also published as: CN101433824B

Abstract

本发明公开了一种自动物样品中提取磺胺喹噁啉的方法及其专用免疫亲和吸附剂。该用于自动物样品中提取磺胺喹噁啉的免疫亲和吸附剂，是由固相载体和与其偶联的磺胺喹噁啉单克隆抗体组成；所述磺胺喹噁啉单克隆抗体是磺胺喹噁啉半抗原与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的。本发明的提纯方法结合色谱法高效检测磺胺喹噁啉药物的含量，弥补了单纯免疫测定技术直接测定样本的信息量太少、定量准确差，或理化方法选择性低等不足，体现了免疫学技术和常规理化技术在分析机制的互补性。

Description

自动物样品中提取磺胺喹噁啉的方法及其专用免疫亲和吸附剂

技术领域

本发明涉及一种自动物样品中提取磺胺喹噁啉的方法及其专用免疫亲和吸附剂。

背景技术

随着生命科学的发展，人们对生物体内的物质及其变化产生了越来越浓厚的兴趣，而生物样本的分析就成为探索和发现生命奥秘的必要手段。由于生物样本成分复杂，待测物浓度较低，而且大多数取样量很少，这就对分析方法的选择性和灵敏度提出了更高的要求。免疫亲和色谱(IAC，immunoaffinity chromatography)是一种将免疫反应与色谱分析方法相结合的分析方法。它的高度选择性和高亲和性无疑使分析过程简化。在兽药残留分析中，IAC最简单而且最有效的应用方式是作为理化测定技术(如HPLC，GC)的样品净化手段，这种联用方法可使免疫学技术和理化技术在选择性、分离能力、速度和灵敏度方面得到互补，并避免了免疫分析法(如ELISA，RIA)直接测定样品的诸多不足。目前，该方法在抗体、激素、多肽、酶、重组蛋白、受体病毒及小分子化合物的分析中被广泛应用。

磺胺喹噁啉(Sulfaquinoxaline，SQX)属磺胺类抗生素(见图1)，兼有抗球虫作用，广泛用于养禽业，其口服后吸收迅速，但排泄缓慢，残留在组织器官及鸡蛋中时间长，人食用后，对人体产生耐药性等副作用。世界卫生组织(WHO)规定动物组织、奶的最高残留限量(MRL)值为100μg/kg。日本等国规定肉鸡中不得检出。因此，为保证产品的安全及对外贸易畅通，加强对动物性食品中磺胺喹噁啉的残留检测是非常必要的。

检测磺胺喹噁啉残留量的化学方法主要有薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、高压液相色谱法(HPLC)、气—质联机(GC-MS)、液—质联机(HPLC/MS)、毛细管电泳(CE)等。这些方法的前处理利用液—液分配，常规的SPE柱净化和分离，都在不同程度地存在着处理过程繁琐、净化效果差、有机溶剂浪费多、所需时间长等缺点。免疫亲和技术是90年代在分析领域得到应用的新技术，但用免疫亲和柱净化基质中的磺胺喹噁啉药物未见报道，更无商品化的IAC柱出售。

发明内容

本发明的目的是提供一种自动物样品中提取磺胺喹噁啉的方法及其专用免疫亲和吸附剂。

本发明所提供的用于自动物样品中提取磺胺喹噁啉的免疫亲和吸附剂，是由固相载体和与其偶联的磺胺喹噁啉单克隆抗体组成；所述磺胺喹噁啉单克隆抗体是磺胺喹噁啉半抗原与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的。

所述磺胺喹噁啉半抗原与载体蛋白的偶联物可通过将磺胺喹噁啉半抗原和载体蛋白用混合酸酐法进行偶联得到；所述磺胺喹噁啉半抗原是将磺胺喹噁啉和琥珀酸酐通过缩合反应得到的。

所述载体蛋白可为牛血清白蛋白或卵清蛋白等常用载体蛋白。

磺胺喹噁啉是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。本发明将磺胺喹噁啉半抗原与载体蛋白偶联得到免疫原。磺胺喹噁啉半抗原与卵清蛋白(OVA)、牛血清蛋白(BSA)的结合摩尔比分别为33:1和25：1。

所述固相载体可为纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶，优选为Sepharose 4B。

所述磺胺喹噁啉单克隆抗体优选为对磺胺喹噁啉的单克隆杂交瘤细胞株C-2-4CGMCC No.2571分泌的单克隆抗体。

所述对磺胺喹噁啉的单克隆杂交瘤细胞株C-2-4已于2008年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏登记号为CGMCC No.2571。

所述免疫亲和吸附剂可装载入柱中制成免疫亲和色谱柱，该免疫亲和色谱柱也属于本发明的保护范围。

含有上述免疫亲和吸附剂或免疫亲和色谱柱的试剂盒也属于本发明的保护范围。

所述试剂盒中还包括洗脱液，所述洗脱液可由甲醇、纯水和冰乙酸组成，所述甲醇、纯水和冰乙酸的体积比为90:9.8:0.2。所述试剂盒中还包括洗涤液和保存液；所述洗涤液可为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液，即1L中含有0.2g KH₂PO₄，0.2gKCl，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，8.8g NaCl的水溶液；所述保存液为在上述洗涤液中添加NaN3至其终浓度为0.02g/L得到的溶液。

该免疫亲和吸附剂以及含有该免疫亲和吸附剂的色谱柱基于免疫反应和色谱反应，适合从生物样品(如肌肉、肝、肺、肾、血浆等)中提取净化磺胺喹噁啉，便于残留分析。在该免疫亲和吸附剂中，单克隆抗体与溴化氰活化的Sepharose 4B的偶联率是92.5％±1％，动态柱容量为2803ng/mL±12ng/mL，使用了15次后柱容量为总柱容量的45％左右，保存期为1年。

本发明所提供的自动物样品中提取磺胺喹噁啉的方法，包括以下步骤：

1)样品的前处理：

取动物组织样品匀浆物，加入提取液进行提取，然后进行离心力是2000g-3000g的离心，取上清液作为样品溶液；所述提取液由甲醇和水组成，所述提取液中甲醇和水的体积比为8：2；所述离心力优选为2400g；

2)将步骤1)得到的样品溶液与所述洗涤液混合，过上述任一种免疫亲和色谱柱，然后依次用权利要求所述洗涤液、水、所述洗脱液进行洗脱，收集得到磺胺喹噁啉溶液。

本发明的免疫亲和吸附剂及色谱柱具有高选择性，使样品前处理过程大大简化，尤其适用于生物样品中微量磺胺喹噁啉的前处理。免疫亲和吸附剂及色谱柱的高选择性使得磺胺喹噁啉分析方法的检测限将主要取决于取样量，这是单纯理化手段难以达到的；本发明的免疫亲和色谱柱对待测组分有很强的保留和浓缩能力，只要加样量不超过柱容量，在实测样品条件下免疫亲和吸附剂对组分的保留能力几乎不受样品体积或组分浓度的影响。本发明的方法对组分净化的同时还可提供定性信息。本发明的方法水相操作，操作简单，净化效果好，免疫亲和色谱柱能重复使用，能节省大量的有机溶剂，降低分析成本和环境污染。本发明的净化方法结合色谱法可高效检测磺胺喹噁啉的含量，弥补了单纯免疫测定技术直接测定样本的信息量太少、定量准确差，或理化方法选择性低等不足，体现了免疫学技术和常规理化技术在分析机制的互补性。

附图说明

图1为磺胺喹噁啉的结构式

图2为磺胺喹噁啉半抗原合成技术路线图

图3为空白鸡肌肉组织、添加鸡肌肉组织和磺胺喹噁啉标准品色谱图

图4为空白猪肌肉组织、添加猪肌肉组织和磺胺喹噁啉标准品色谱图

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的实验材料，如无特别说明，均从商业途径得到。

实施例1、净化磺胺喹噁啉药物的免疫色谱柱的制备

1、磺胺喹噁啉鼠单克隆抗体的制备

(1).免疫原的合成

a.半抗原的合成

如图2所示，将磺胺喹噁啉(美国Sigma公司，商品目录号：967-80-6)和琥珀酸酐通过缩合反应得到具有羧基官能团的半抗原，具体的方法如下：称取100mg磺胺喹噁啉和25mg琥珀酸酐放入圆底烧瓶，向其中加无水吡啶至完全溶解，80℃加热搅拌反应10h；反应结束后，减压蒸馏去溶剂，残余物用丙酮洗涤5次，用乙酸乙酯-正己烷使其结晶，得到磺胺喹噁啉半抗原。

b.免疫原合成

将磺胺喹噁啉半抗原与卵清蛋白采用混合酸酐法进行偶联得到免疫原。

免疫原的制备过程如下：将20mg磺胺喹噁啉半抗原用1mL甲酰胺(DMF)溶解，冷却至10℃，加入氯甲酸异丁酯8ul，10℃搅拌反应30min，即可得到反应液I液；称取卵清蛋白(OVA)40mg，使之充分溶解在2mL50mM碳酸钠溶液中，即可得到反应液II液；将反应液I逐滴缓慢滴加到该反应II溶液中，10℃反应4h，4℃过夜。取最终反应物于pH7.4、0.02M磷酸盐缓冲液中透析纯化36小时后，4000g离心30min，收集上清液，即得到免疫原。

利用紫外吸收光谱对半抗原与载体蛋白进行鉴定，并按下面的公式计算结合比(每分子载体蛋白连接的半抗原数目)。

磺胺喹噁啉半抗原与卵清蛋白的结合摩尔比为33:1。

(2)磺胺喹噁啉鼠单克隆抗体的制备：

动物免疫程序采用Balb/c小鼠作为免疫动物，用(1)制备的免疫原进行免疫，免疫剂量为100μg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2-3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。

细胞融合与克隆化取免疫BALB/c小鼠脾细胞，按5：1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株—对磺胺喹噁啉的单克隆杂交瘤细胞株C-2-4 CGMCC No.2571。

细胞冻存和复苏取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成5×10⁶个/mL的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

单克隆抗体的制备与纯化

增量培养法：将对磺胺喹噁啉的单克隆杂交瘤细胞株C-2-4 CGMCC No.2571置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到抗磺胺喹噁啉的单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠得到的培养基，其中，小牛血清的终浓度为20％(质量百分含量)，碳酸氢钠的终浓度为0.2％(质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7.4。

2、免疫色谱柱(IAC)的制备

基质的准备：取2.0g溴化氰活化的Sepharose 4B干冻粉，在盛有1.0m M HCl的G₃漏斗中膨胀。

偶联反应：将上述膨胀的凝胶用0.1M NaHCO₃溶液平衡后，与20mg的上述纯化抗体(溶于5mL0.1M NaHCO₃溶液)混合，在4℃搅拌20h。

反应液转入G3漏斗中，用100mL 0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液洗涤，收集洗涤液，紫外鉴定，将洗涤液适当稀释分别测其260nm、280nm的紫外吸光度。计算IgG量的公式为：

IgG量＝(1.45×OD_280nm-0.74×OD_260nm)×稀释倍数×溶液的体积

计算偶联率计算公式为：

实验设三次重复，偶联率的检测结果表明，对磺胺喹噁啉的单克隆杂交瘤细胞株C-2-4 CGMCC No.2571分泌的单克隆抗体与溴化氰活化的Sepharose 4B的偶联率是92.2％±1％。

活化位点的封闭：将上述偶联后的凝胶转入盛有0.1M、pH8.0的Tris—HCl缓冲液中，混合，4℃下缓慢搅拌2小时，以封闭未偶联的活化位点。

洗涤：凝胶用5倍体积的0.1M、pH4.0醋酸盐缓冲液和0.1mol/L、pH8.0Tris—HCl缓冲液交替冲洗3次。用0.01M、pH7.4的磷酸盐缓冲液平衡后，抽干的凝胶转入0.01M、pH7.4的含0.1％NaN3磷酸盐缓冲液(1L溶液中含有磷酸二氢钾0.2g，12水合磷酸氢二钠2.9g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g，NaN₃1.0g)中，4℃下存放备用。

装柱：将偶联有对磺胺喹噁啉的单克隆杂交瘤细胞株C-2-4 CGMCC No.2571分泌的单克隆抗体的免疫吸附剂转入到含G₃滤板的玻璃柱(100mm×8mm)里，制成偶联有对磺胺喹噁啉的单克隆杂交瘤细胞株C-2-4 CGMCC No.2571分泌的单克隆抗体的免疫色谱柱(IAC柱)。

5、IAC柱容量的确定

将步骤4制备的偶联有对磺胺喹噁啉单克隆杂交瘤细胞株C-2-4 CGMCC No.2571分泌的单克隆抗体的免疫色谱柱，用保存液(1L水溶液中含有0.2g KH₂PO₄，0.2gKCl，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，8.8g NaCl，0.02g NaN₃的溶液)洗柱，平衡。轻轻上下晃动IAC柱，赶走柱里的气泡。将10mL含有300ng/mL磺胺喹噁啉的洗涤液(洗涤液为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液，即1L中含有0.2g KH₂PO₄，0.2g KCl，2.9gNa₂HPO₄·12H₂O，8.8g NaCl的水溶液)连续加到免疫亲和色谱柱上，自然重力下流出。当柱达到饱和后(流出液中样品浓度和加样液浓度相同)，先后用20mL洗涤液(洗涤液为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液，即1L中含有0.2g KH₂PO₄，0.2g KCl，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，8.8g NaCl的水溶液)，15mL水洗涤免疫亲和色谱柱，除去干扰杂质。最后用4mL洗脱液(甲醇-纯水-冰乙酸，90:9.8:0.2，v:v:v)，将磺胺喹噁啉洗脱，自然重力下流出，收集，吹干，进行HPLC测定。该HPLC色谱条件：C₁₈反相色谱柱，Symmetry C₁₈(4.6mm×250mm，粒径5μm)；流动相为乙腈-0.1％甲酸水溶液(v/v)，乙腈和0.1％甲酸水溶液的体积比为7：3；流速为1mL/min；进样量为100μL；紫外检测器：检测波长278nm)。

根据三次重复实验的结果，计算出动态柱容量和绝对柱容量。动态柱容量(dynamic column capacity)是指每毫升柱床体积对待测物的最大吸收值。绝对柱容量(specific column capacity)是指每毫克固定抗体对待测物的最大结合容量。结果表明偶联有对磺胺喹噁啉的单克隆杂交瘤细胞株C-2-4 CGMCC No.2571分泌的单克隆抗体的免疫色谱柱的动态柱容量和绝对柱容量分别为2803ng/mL±12ng/mL IgG，304ng/mg±2.5ng/mg IgG。

实施例2、含有偶联有鼠单克隆抗体的免疫色谱柱的试剂盒的制备及其对磺胺喹噁啉的提纯净化效果

1、含有免疫色谱柱的试剂盒的制备

该试剂盒主要由盒体，免疫色谱柱(IAC柱)，磺胺喹噁啉标准溶液，洗涤液，洗脱液，保存液，海绵托架所组成，海绵托架上设有孔和凹槽。海绵托架的凹槽内装有分别盛放磺胺喹噁啉药物标准溶液、洗涤液、洗脱液、保存液的试剂瓶，海绵托架的孔内装有IAC柱。其中免疫色谱柱为实施例1制备的偶联有对磺胺喹噁啉的单克隆杂交瘤细胞株C-2-4 CGMCC No.2571分泌的单克隆抗体的免疫色谱柱。

洗脱液为甲醇-纯水-冰乙酸(90:9.8:0.2，v:v:v)。

洗涤液为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液，即1L水溶液中含有0.2g KH₂PO₄，0.2g KCl，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，8.8g NaCl。

保存液为在上述洗涤液中添加NaN₃至其终浓度为0.02g/L得到的溶液。

将含有偶联有对磺胺喹噁啉的单克隆杂交瘤细胞株C-2-4 CGMCC No.2571分泌的单克隆抗体的免疫色谱柱的试剂盒存放在4℃。

2、磺胺喹噁啉提纯净化效果实验

IAC提取原理是，当含磺胺喹噁啉的溶液流过IAC柱时，固定抗体选择性地结合磺胺喹噁啉药物，其它不被识别的样品杂质则不受阻碍地流出IAC柱，经洗涤后，将抗原-抗体复合物解离洗脱，磺胺喹噁啉得到净化。IAC柱经再生处理后可重复使用。

检测样品的处理：分别取生物样品(肌肉、肝、肺、肾和血浆等)匀浆物2.0±0.01g，于50mL塑料离心管中，每个样本按10μg/kg浓度分别添加磺胺喹噁啉标准品，静置15min后，加入提取液(甲醇：水，8：2，v/v)8mL，涡动3min，3500rpm(2400g)离心10min，取上清液，重复提取一次，合并上清液，涡动混匀，取4mL，与20mL的上述洗涤液(0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液，即1L水溶液中含有0.2gKH₂PO₄，0.2g KCl，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，8.8g NaCl)混合，作为样品溶液。同时以未添加磺胺喹噁啉标准品的生物样品作为相应的对照。

将偶联有磺胺喹噁啉的单克隆杂交瘤细胞株C-2-4 CGMCC No.2571分泌的单克隆抗体的免疫亲和色谱柱平衡到室温，然后将上述的样品溶液过柱，自然重力下流出，先后用20mL洗涤液(0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液，即1L水溶液中含有0.2g KH₂PO₄，0.2g KCl，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，8.8g NaCl)，15mL水，最后用4mL洗脱液(甲醇-纯水-冰乙酸，90:9.8:0.2，v:v:v)洗脱，收集洗脱液，氮气吹干。用上述洗涤液定容至1mL，过0.45μm针筒滤膜，进HPLC分析。其中，色谱条件：C₁₈反相色谱柱，Symmetry C₁₈(4.6mm×250mm，粒径5μm)；流动相为乙腈-0.1％甲酸水溶液(v/v)，乙腈和0.1％甲酸水溶液的体积比为7：3；流速为1mL/min；进样量为100μL；紫外检测器：检测波长278nm。用完的IAC柱用20mL的保存液平衡保存在4℃冰箱里备用。结果如图3和图4所示，表明用IAC进行样品净化，不干扰药物色谱峰，能够完全分离，说明本发明制备的IAC非特异性吸附极小。

图3中，A为磺胺喹噁啉(SQX)标准品，B为添加磺胺喹噁啉的鸡肌肉组织，C为未添加磺胺喹噁啉的空白鸡肌肉组织。

图4中，D为磺胺喹噁啉(SQX)标准品、E为添加磺胺喹噁啉的猪肌肉组织、F为未添加磺胺喹噁啉的空白猪肌肉组织。

Claims

1、一种用于自动物样品中提取磺胺喹噁啉的免疫亲和吸附剂，是由固相载体和与其偶联的磺胺喹噁啉单克隆抗体组成；所述磺胺喹噁啉单克隆抗体是以磺胺喹噁啉半抗原与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的抗体。

2、根据权利要求1所述的吸附剂，其特征在于：所述磺胺喹噁啉半抗原是将磺胺喹噁啉和琥珀酸酐通过缩合反应得到；所述磺胺喹噁啉单克隆抗体为磺胺喹噁啉鼠单克隆抗体。

3、根据权利要求2所述的吸附剂，其特征在于：所述磺胺喹噁啉鼠单克隆抗体为对磺胺喹噁啉的单克隆杂交瘤细胞株C-2-4CGMCC No.2571分泌的单克隆抗体。

4、以权利要求1-3中任一所述的免疫亲和吸附剂为填料的免疫亲和色谱柱。

5、含有权利要求1-3中任一所述的免疫亲和吸附剂的试剂盒或含有权利要求4所述的免疫亲和色谱柱的试剂盒。

6、根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括洗脱液、洗涤液和保存液；

所述洗脱液由甲醇、纯水和冰乙酸组成，所述洗脱液中，甲醇、纯水和冰乙酸的体积比为90:9.8:0.2；

所述洗涤液为0.01M、pH7.4的磷酸盐缓冲液；

所述保存液为在所述洗涤液中添加NaN₃得到的溶液。

7、一种自动物样品中提取磺胺喹噁啉的方法，包括以下步骤：

1)样品的前处理：

取动物组织样品匀浆物，加入提取液进行提取，然后进行离心力是2000g-3000g的离心，取上清液作为样品溶液；所述提取液由甲醇和水组成，所述提取液中甲醇和水的体积比为8：2；所述离心力优选为2400-2500g；

2)将步骤1)得到的样品溶液与权利要求6所述的洗涤液混合，过权利要求4所述的免疫亲和色谱柱，然后依次用权利要求6所述的洗涤液、水、权利要求6所述的洗脱液进行洗脱，收集得到磺胺喹噁啉溶液。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述动物组织样品包括肌肉、肝、肺、肾和血浆。

9、对磺胺喹噁啉的单克隆杂交瘤细胞株C-2-4，其保藏号为CGMCC No.2571或对磺胺喹噁啉的单克隆杂交瘤细胞株CGMCC No.2571分泌的抗磺胺喹噁啉的单克隆抗体。

10、一种检测动物样品中磺胺喹噁啉的方法，是用权利要求7或8所述的方法从动物样品中提取得到磺胺喹噁啉后，再对磺胺喹噁啉进行定量检测。