CN101936983A - 一种检测磺胺类化合物的方法及其专用量子点荧光免疫试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测磺胺类化合物的方法及其专用量子点荧光免疫试剂盒。本发明提供的检测磺胺类化合物的量子点荧光免疫试剂盒，包括磺胺类化合物特异性抗体、包被原和标准品溶液；所述包被原为磺胺类化合物半抗原与载体蛋白的偶联物。本发明的实验证明，本发明的试剂盒具有样品前处理过程简单、操作简便、费用低廉、特异性高、灵敏度高、精确度高等特点，能够现场监控且适合大量样本的筛查。

Description

一种检测磺胺类化合物的方法及其专用量子点荧光免疫试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测磺胺类化合物的方法及其专用量子点荧光免疫试剂盒。

背景技术

目前其中兽药残留问题是影响动物性食品安全的最主要因素之一，由于动物样本成分复杂，待测物浓度较低，而且大多数取样量很少，这就对分析方法的选择性和灵敏度提出了更高的要求。量子点(Quantum dot，QD)由于具有独特的光学和电学性质，使其荧光免疫分析中得到越来越多的应用，作为荧光探针，QD的光学特性比在免疫荧光分析法中经常采用的传统发色团如罗丹明6G或其它有机染料分子有明显的优越性QD的激发光谱宽，且连续分布，而发射光谱呈对称分布且宽度窄，荧光发射波长可通过改变量子点的大小而加以调节，因而不同大小的半导体量子点能被单一波长的光激发而发出不同颜色的荧光。量子点可持续发光，其荧光寿命可达染料分子的100倍以上，比常规的酶联免疫吸附检测方法的抗背景干扰能力强，自动化程度高，提高了分析方法的精密度，在兽医学、医学、食品分析等方面将会有更广阔的应用前景。

磺胺类化合物(Sulfonamides，SAs)是一类广谱抗菌药，临床上主要用于预防和治疗细菌感染性疾病，还常作为饲料添加剂在动物生产中长期应用。然而，磺胺药会引起人过敏性反应，人体中长期存在磺胺类化合物会导致许多细菌对磺胺类化合物产生耐药性，且可能有致癌性。因此，我国农业部第235号文件规定其残留限量为100μg/kg。但由于磺胺类化合物的成本较低，价格便宜，在畜牧生产中不合理使用现象严重，使其在动物性食品中残留引起生态环境污染和人类健康危害的潜在威胁已倍受关注。动物组织中磺胺类化合物残留的检测方法主要采用液相色谱法、液相色谱-联质谱法、酶联免疫法等。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测磺胺类化合物的量子点荧光免疫试剂盒。

本发明提供的检测磺胺类化合物的量子点荧光免疫试剂盒，包括磺胺类化合物特异性抗体、包被原和标准品溶液；所述包被原为磺胺类化合物半抗原与载体蛋白的偶

所述试剂盒还包括浓缩洗涤液、浓缩复溶液、包被缓冲液、封闭液和酶标抗抗体；

所述试剂盒由磺胺类化合物特异性抗体、包被原、标准品溶液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、包被缓冲液、封闭液和酶标抗抗体组成。

所述磺胺类化合物特异性抗体为磺胺甲恶唑单克隆抗体或磺胺甲恶唑多克隆抗体，所述磺胺甲恶唑单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.3780的对9种磺胺类化合物(磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺甲嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶)都有交叉反应的磺胺甲基异恶唑单克隆杂交瘤细胞株SAs分泌的抗体。

所述标准品溶液中标准品的浓度为0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、22.5μg/L或112.5μg/L，所述标准品为磺胺甲恶唑；

所述浓缩洗涤液是将0.05g叠氮化钠和100mL浓度为0.02M、pH为7.4的磷酸盐缓冲液混合得到溶液；

所述浓缩复溶液是将0.1g牛血清白蛋白和100mL浓度为0.05mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液混合得到的溶液；

所述包被缓冲液是pH值为9.6的浓度为0.03mol/L的碳酸盐缓冲液；

所述封闭液是将0.01g叠氮化钠、10g牛血清白蛋白和100mL浓度为0.03mol/L、pH值为7.4磷酸盐溶液混合得到的溶液。

所述包被原是按照如下方法制备得到的：a.将每52mg磺胺类化合物半抗原加入6mL 0.25mol L^-1的硫酸水溶液中，在4℃放置12h得到的溶液称为A液；将每80mg的载体蛋白溶于4mL的碳酸钠水溶液中(其中碳酸钠的浓度为100mg/mL，pH＝10)在4℃放置12h，得到的溶液称为B液；将每20mg亚硝酸钠溶于2mL水得到的溶液称为C液；将C液缓慢加入4℃的A液中得到的混合物置于0℃冷却15min；

b.将冷却后的混合物缓慢加入到B液得到混合液，混合的条件为：先摇动烧杯6min，再磁力搅拌4h，pH保持在9-10之间，再将混合液用生理盐水4℃透析得到包被原；

所述磺胺甲恶唑半抗原的结构式如式II所示：

(式II)。

所述磺胺类化合物半抗原为磺胺甲恶唑。

所述量子点标记抗抗体为量子点DQ56标记羊抗鼠抗抗体；

所述载体蛋白为鼠血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白，优选为卵清蛋白；

所述磺胺类化合物为磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺甲嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺甲氧哒嗪或磺胺对甲氧嘧啶。

本发明的另一个目的是提供一种检测磺胺类化合物的方法。

本发明提供的检测磺胺类化合物的方法包括以下步骤：

1)样品前处理：

将每1g动物组织匀浆后，加入4mL的乙腈-盐酸混合液振荡混合1min，以3000g的速度离心5min，将2mL上清液用氮气吹干，加入1mL复溶液溶解干燥的残留物，再加入1mL正己烷混合，3000g离心5min，取下层溶液用复溶液稀释2倍后获得待测样本溶液，所述乙腈-盐酸混合液是由体积比为84∶16的乙腈和浓度为0.1M盐酸混合得到；所述复溶液为将所述浓缩复溶液用0.05mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液稀释10倍得到的；

2)利用所述的检测磺胺类化合物的量子点荧光免疫试剂盒检测步骤1中的样本溶液；

所述磺胺类化合物为磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺甲嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺甲氧哒嗪或磺胺对甲氧嘧啶。

由保藏号为CGMCC No.3780的对9种磺胺类化合物都有交叉反应的磺胺甲基异恶唑单克隆杂交瘤细胞株SAs分泌的磺胺类化合物单克隆抗体也属于本发明的保护范围。

保藏号为CGMCC No.3780的对9种磺胺类化合物都有交叉反应的磺胺甲基异恶唑单克隆杂交瘤细胞株SAs也属于本发明的保护范围。该细胞株已于2010年4月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.3780。

磺胺甲恶唑通用名称为磺胺甲恶唑，化学名称3-对氨基苯磺酰胺基-5-甲基恶唑。

本发明的实验证明，本发明的量子点荧光免疫试剂盒主要采用间接竞争方法定性或定量检测磺胺类化合物的残留量，该试剂盒的主要内容物采用了方便使用的工作液形式，工作液保存性及稳定性好；利用本发明试剂盒检测磺胺类化合物的残留量的方法，可用于检测动物组织如猪肉、鸡肉等样品中磺胺类化合物的残留量，具有样品前处理过程简单、操作简便、费用低廉、特异性高、灵敏度高、精确度高等特点，能够现场监控且适合大量样本的筛查。因此本发明检测方法及其专用试剂盒将在动物源性食品中磺胺类化合物的残留检测中发挥重要作用。

附图说明

图1为磺胺类化合物标准曲线图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中各试剂盒的检测原理如下：

当在量子点荧光板微孔上预包被磺胺类化合物半抗原与载体蛋白的偶联物时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入磺胺类化合物抗体溶液，样本中残留的磺胺类化合物或磺胺类化合物标准品与量子点荧光板上包被的磺胺类化合物偶联抗原竞争磺胺类化合物抗体，加入量子点标记抗抗体，用荧光酶标仪检测荧光强度，样本荧光强度值与样本中磺胺类化合物的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中磺胺类化合物的残留量。

实施例1、以磺胺类化合物半抗原与载体蛋白的偶联物为包被原的量子点荧光免疫试剂盒的制备及其检测方法

一、量子点荧光免疫试剂盒包括：

(1)包被原溶液：将包被原溶解于包被缓冲液中得到的，其中包被原在包被原溶液中的浓度为0.08μg/mL；包被原为磺胺甲恶唑半抗原与牛血清白蛋白的偶联物。

(2)量子点标记的羊抗鼠抗抗体工作液：

用稀释液稀释量子点标记的羊抗鼠抗抗体得到的，稀释度为1∶500；

稀释液为50mL牛血清白蛋白和950mL磷酸盐缓冲液混合得到；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.02M，pH值为7.4。

羊抗鼠抗抗体购自北京博奥森，产品目录号为bs-0295G。

(3)磺胺甲恶唑标准品溶液：将标准品溶于稀释液中得到的，其中标准品在磺胺甲恶唑标准品溶液的浓度分别为0μg/L，0.5μg/L，1.5μg/L，4.5μg/L，22.5μg/L，112.5μg/L，稀释液为pH7.4、0.05M的磷酸盐缓冲液。

磺胺甲恶唑标准品为磺胺甲恶唑，购自Sigma，产品目录号为S-7505

(4)磺胺类化合物单克隆抗体工作液：

将单抗溶于稀释液中得到的，单抗与稀释液的配比为1∶1000；单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.3780的对9种磺胺类化合物都有交叉反应的磺胺甲基异恶唑单克隆杂交瘤细胞株SAs产生。

稀释液为25g酪蛋白、0.03g叠氮化钠和1000mL磷酸盐缓冲液混合得到。

(6)浓缩洗涤液：将0.05g叠氮钠化钠与100mL浓度为0.02M、pH为7.4的磷酸盐缓冲液混合得到。

(7)浓缩复溶液：将0.1g牛血清白蛋白与100mL浓度为0.05mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液混合而成。400mL/瓶，1瓶。

(8)包被缓冲液：pH值为9.6的浓度为0.03mol/L的碳酸盐缓冲液。

(9)封闭液：将0.01g叠氮化钠、10g牛血清白蛋白和100mL浓度为0.03mol/L、pH值为7.4的磷酸盐溶液混合而成。

二、试剂盒的制备

1、量子点荧光板的制备：

(1)磺胺类化合物半抗原的合成：

以磺胺甲恶唑为半抗原，其结构中含有氨基，可以与载体蛋白质直接偶联，因此不用进行结构改造，可以直接作为半抗原。

所述磺胺甲恶唑半抗原的结构式如式II所示：

                                                    (式II)。

(2)包被原的制备：采用重氮化法将磺胺甲恶唑半抗原和卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原。

a.将52mg磺胺甲恶唑加入6mL 0.25mol L^-1的硫酸水溶液中，在4℃放置12h得到的溶液称为A液；将80mg的OVA溶于4mL的碳酸钠水溶液中(其中碳酸钠的浓度为100mg/mL，pH＝10)在4℃放置12h，得到的溶液称为B液；将20mg亚硝酸钠溶于2mL水得到的溶液称为C液；将C液缓慢加入4℃的A液中得到的混合物置于0℃冷却15min；

b.将冷却后的混合物缓慢加入到B液得到混合液，混合的条件为：先摇动烧杯6min，再磁力搅拌4h，pH保持在9-10之间，再将混合液用生理盐水4℃透析得到包被原。所述包被原为磺胺类化合物半抗原与载体蛋白的偶联物；其结构式如式I所示：

(式I)。

(3)量子点荧光板的制备：

用包被缓冲液将步骤(2)得到的包被原(即磺胺甲恶唑半抗原和卵清蛋白偶联物)稀释成0.08μg/mL，每孔加入100μl，37℃温育2h，倾去包被液，用稀释20倍的洗涤液洗涤2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150μl封闭液，37℃温育1h，倾去孔内液体，干燥后获得包被有包被原的量子点荧光板，用铝膜真空密封保存。

2、磺胺类化合物单克隆抗体的制备：

(1)免疫原合成：

将磺胺甲恶唑半抗原和牛血清白蛋白通过重氮化法偶联得到免疫原。

具体制备过程如下：与包被原的制备方法相同，不同的是将卵清蛋白(OVA)替换为牛血清白蛋白BSA。

(2)动物免疫与细胞融合

采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以步骤2的(1)获得的免疫原进行免疫，免疫剂量为100μg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2-3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。

取免疫BALB/c小鼠脾细胞，按5∶1比例(数量配比)与SP2/0骨髓瘤细胞融合。采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将此细胞株命名SAs。

经筛选得到对9种磺胺类化合物(磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺甲嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶)都有交叉反应的磺胺甲基异恶唑单克隆杂交瘤细胞株SAs，该细胞株已于2010年4月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.3780。

(3)细胞冻存和复苏：上述单克隆杂交瘤细胞株SAsCGMCC No.3780用冻存液制成5×10⁶个/mL的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

(4)单克隆抗体的制备与纯化

增量培养法：将上述培养的杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，获得细胞培养液，用下述辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠得到的细胞培养基，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(体积百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7.4。

辛酸-饱和硫酸铵法1)50％饱和度盐析：取上述细胞培养液5mL，加等量0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g)混匀，然后逐渐滴加等体积的饱和硫酸铵(pH7.4)溶液(使硫酸铵溶液的饱和度达到50％)，边加边搅拌，室温放置30min，3000g离心30min，弃上清液留沉淀。2)33％饱和度盐析：在步骤1)得到的沉淀中分别加入5mL 0.01mol/LPBS(1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g)溶解沉淀，再加饱和硫酸铵溶液达到33％饱和度，边加边搅拌，室温放置30min，弃上清液留沉淀。重复操作2次。3)脱盐：取0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g)溶解步骤2)得到的沉淀，装于透析袋中，悬于盛有0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g)的烧杯中脱盐，放置于4℃，每天换液3-4次，1％BaCl₂检测直至透析液中无硫酸根离子为止。4)透析完毕，3000g离心5min，取上清液得到纯化的磺胺甲恶唑单克隆抗体，-20℃冰箱保存。

3、量子点与羊抗鼠抗体的制备：

表面氨基(-NH₂)修饰的水溶性量子点QD650购自北京中科物源，产品目录号为W-4007-650；羊抗鼠抗体购自北京博奥森，产品目录号为bs-0259G；

(1)活化量子点：表面氨基(-NH₂)修饰的水溶性QD6502mL经20μl偶联剂SMCC(琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷)活化，形成活性表面，得到活化的量子点。凝胶柱去除过量的SMCC。

(2)还原羊抗鼠抗体：羊抗鼠抗体2mL中加入还原剂DTT 25μl(dithiothreitol，二硫苏糖醇)，断开二硫键形成的巯基。凝胶柱去除DTT。

(3)将活化的量子点和还原的羊抗鼠抗体混合，37℃反应1小时，10μl beta-巯基乙醇终止反应，形成量子点标记的羊抗鼠抗体。

三、用步骤一所述试剂盒检测样品中残留的磺胺类化合物的方法

方法如下：

1、样品前处理

样品为猪肉、鸡肉等组织样本。

将1g动物组织匀浆后，加入4mL的乙腈-盐酸混合液(所述乙腈-盐酸混合液是由体积比为84∶16的乙腈和浓度为0.1M盐酸混合得到。)振荡混合1min，以3000g的速度离心5min，将2mL上清液用氮气吹干，加入1mL复溶液溶解干燥的残留物，再加入1mL正己烷混合，3000g离心5min，取下层溶液用复溶液稀释2倍后获得待测样本溶液，进行试验分析；所述复溶液为将所述浓缩复溶液用0.05mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液稀释10倍得到的。

2、检测

向步骤一获得包被有包被原(磺胺甲恶唑半抗原与卵清蛋白偶联物)的量子点荧光板微孔中加入磺胺甲恶唑标准品溶液或样本溶液50μl，再加入磺胺甲恶唑单克隆抗体工作液50μl，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min；倒出孔中液体，每孔加入250μl洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干；每孔加入量子点标记的羊抗鼠抗抗体工作液100mL，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，重复洗涤步骤；用荧光酶标仪，测定每孔荧光强度值。

3、结果分析

用所获得的每个浓度的标准品溶液的荧光强度平均值(B)除以第一个标准溶液(0标准)的荧光强度值(B0)再乘以100％，即百分荧光值。计算公式为：

百分荧光值(％)＝(B/B0)×100％

以磺胺甲恶唑标准品溶液的浓度(μg/L)的半对数值为X轴，百分荧光值为Y轴，绘制标准曲线图(图1)。用同样的办法计算样品溶液的百分荧光值，相对应每一个样品的浓度则可从标准曲线上读出样本中磺胺类化合物的残留量。本发明中检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。本发明中检测结果的分析还可以利用计算机专业软件，此法更便于大量样品的快速分析，整个检测过程只需1.5小时可以完成。

按照上述方法获得三批试剂盒(01批、02批、03批)。

实施例2、试剂盒灵敏度、准确度和保存期试验

一、试剂盒灵敏度实验

对零标准溶液(即稀释液为pH7.4、0.05M的磷酸盐缓冲液)进行20次检测，测定结果的平均值加上3倍标准差作为试剂盒的最低检测限。

表1零标准测定结果统计表        μg/L

由表1可知，试剂盒的最低检测限为0.5μg/L。

二、标准品精密度试验：

从实施例1中所述的三批试剂盒(01批、02批、03批)中每批抽取10个试剂盒，测定4.5μg/L标准品溶液的荧光强度值，计算变异系数。检测方法与实施例1中实验三所述一致。

实验设3次重复，结果如表2所示，表明变异系数范围在4.7％～16.3％之间，符合精密度小于或等于20％的规定。

表2标准可重复性试验(CV％)

三、样本精密度和准确度试验

1、样品精密度试验：

将不含磺胺类化合物的猪肉、鸡肉按照实施例1的方法进行样品前处理后，添加磺胺甲恶唑标准品，使其终浓度为20μg/kg。从实施例1中所述的三批试剂盒(01批、02批、03批)中每批抽取3个试剂盒，进行实验，每个实验重复5次，分别计算变异系数，结果如表3-4所示(各表中的数值为5次重复的平均值)。结果表明猪肉、鸡肉样本的变异系数均小于20％，符合了《农业部文件》农医发【2005】17号附件2试剂盒备案参考评判标准中第四点精密度和准确度的精密度标准。

表3猪肉样本可重复性试验

表4鸡肉样本可重复性试验

2、样本准确度试验

将不含磺胺类化合物的猪肉、鸡肉按照实施例1中所述的样品前处理方法进行处理，然后向每种组织中加入磺胺甲恶唑，使其终浓度分别为50μg/kg(L)和100μg/kg(L)；然后用实施例1中所述的试剂盒检测猪肉、鸡肉中磺胺甲恶唑，每个浓度做4个平行，分别计算准确度(准确度＝实测值/添加值)。结果如表6所示，表明各样本以50μg/kg(L)、100μg/kg(L)磺胺甲恶唑添加回收率均在76.5％-99.2％之间。

表5试剂盒的准确度

四、交叉反应率试验

选择与磺胺类化合物有类似结构和类似功能的11种药物测定交叉反应率。通过各种药物的标准曲线分别得到其50％抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它药物的交叉反应率。交叉反应越小，那么此试剂盒对磺胺类化合物的检测特异性就越好。

交叉反应率(％)＝(抑制50％磺胺甲恶唑)的浓度/抑制50％的磺胺类化合物类似物浓度)*100％

表6试剂盒的特异性

实验结果表明，本发明所研制的试剂盒对磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺甲嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶的特异性好。

五、试剂盒保存期试验

试剂盒保存条件为2-8℃，保存6个月后，测定试剂盒的50％抑制浓度、磺胺类化合物实际添加测定，结果表明试剂盒的50％抑制浓度均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置6天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃至少可以保存6个月以上。

Claims (10)

1.一种检测磺胺类化合物的量子点荧光免疫试剂盒，包括磺胺类化合物特异性抗体、包被原和标准品溶液；所述包被原为磺胺类化合物半抗原与载体蛋白的偶联物；其结构式如式I所示：

                                                    (式I)。

2.根据权利要求1所述的量子点荧光免疫试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括浓缩洗涤液、浓缩复溶液、包被缓冲液、封闭液和量子点标记的抗抗体；

所述试剂盒由磺胺类化合物特异性抗体、包被原、标准品溶液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、包被缓冲液、封闭液和量子点标记抗抗体组成。

3.根据权利要求1或2所述的量子点荧光免疫试剂盒，其特征在于：所述磺胺类化合物特异性抗体为磺胺甲恶唑单克隆抗体或磺胺甲恶唑多克隆抗体，所述磺胺甲恶唑单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.3780的对9种磺胺类化合物(磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺甲嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶)都有交叉反应的磺胺甲基异恶唑单克隆杂交瘤细胞株SAs分泌的抗体；

所述量子点标记的抗抗体中所述量子点为QD650。

4.根据权利要求1-3中任一所述的量子点荧光免疫试剂盒，其特征在于：所述标准品溶液中标准品的浓度为0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、22.5μg/L或112.5μg/L，所述标准品为磺胺甲恶唑；

所述浓缩洗涤液是将0.05g叠氮化钠和100mL浓度为0.02M、pH为7.4的磷酸盐缓冲液混合得到溶液；

所述浓缩复溶液是将0.1g牛血清白蛋白和100mL浓度为0.05mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液混合得到的溶液；

所述包被缓冲液是pH值为9.6的浓度为0.03mol/L的碳酸盐缓冲液；

所述封闭液是将0.01g叠氮化钠、10g牛血清白蛋白和100mL浓度为0.03mol/L、pH值为7.4磷酸盐溶液混合得到的溶液。

5.根据权利要求1-4中任一所述的量子点荧光免疫试剂盒，其特征在于：

所述包被原是按照如下方法制备得到的：a、将每52mg磺胺类化合物半抗原加入6mL 0.25M的硫酸水溶液中，得到的溶液称为A液；将每80mg的载体蛋白溶于4mL浓度为100mg/mL、pH值为10的碳酸钠水溶液中，得到的溶液称为B液；将每20mg亚硝酸钠溶于2mL水得到的溶液称为C液；在0℃条件下，将C液加入到A液中得到的混合物称为D液；

b、将D液逐滴加入到B液中，得到D液和B液的混合液；逐滴加入的方式为从开始加入时计起，6min后开始搅拌混合液，并使混合液的pH保持在9-10之间，滴加完毕后，继续搅拌反应4h，将得到的产物透析，得到所述包被原；

所述磺胺甲恶唑半抗原的结构式如式II所示：

(式II)。

6.根据权利要求1-5中任一所述的量子点荧光免疫试剂盒，其特征在于：

所述磺胺类化合物半抗原为磺胺甲恶唑。

7.根据权利要求1-6中任一所述的量子点荧光免疫试剂盒，其特征在于：

所述量子点标记抗抗体为量子点QD650标记的羊抗鼠抗抗体；

所述载体蛋白为鼠血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白，优选为卵清蛋白；

所述磺胺类化合物为磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺甲嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺甲氧哒嗪或磺胺对甲氧嘧啶。

8.一种检测磺胺类化合物的方法，包括以下步骤：

1)样品前处理：

将每1g动物组织匀浆后，加入4mL的乙腈-盐酸混合液振荡混合1min，以3000g的速度离心5min，将2mL上清液用氮气吹干，加入1mL复溶液溶解干燥的残留物，再加入1mL正己烷混合，3000g离心5min，取下层溶液用复溶液稀释2倍后获得待测样本溶液，所述乙腈-盐酸混合液是由体积比为84∶16的乙腈和浓度为0.1M盐酸水溶液混合得到；所述动物组织为猪肉或鸡肉；所述复溶液为将所述浓缩复溶液用0.05mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液稀释10倍得到的；

2)利用权利要求1-7中任一所述的检测磺胺类化合物的量子点荧光免疫试剂盒检测步骤1)中的样本溶液；

所述磺胺类化合物为磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺甲嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺甲氧哒嗪或磺胺对甲氧嘧啶。

9.由保藏号为CGMCC No.3780的对9种磺胺类化合物都有交叉反应的磺胺甲基异恶唑单克隆杂交瘤细胞株SAs分泌的磺胺类化合物单克隆抗体。

10.保藏号为CGMCC No.3780的对9种磺胺类化合物都有交叉反应的磺胺甲基异恶唑单克隆杂交瘤细胞株SAs。

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