CN114716430A - 一种磺胺甲恶唑荧光探针、制备方法及其应用 - Google Patents

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CN114716430A CN202210571934.5A CN202210571934A CN114716430A CN 114716430 A CN114716430 A CN 114716430A CN 202210571934 A CN202210571934 A CN 202210571934A CN 114716430 A CN114716430 A CN 114716430A
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卢文尊
葛春梅
陈华
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Abstract

本发明公开了一种磺胺甲恶唑荧光探针、制备方法及其应用，包括如下步骤：(1)磺胺甲恶唑(Sulfamethoxazole，SMX)荧光探针储备液的制备；(2)磺胺甲恶唑荧光探针工作液的制备；(3)人结肠腺癌细胞系Caco‑2、人非小细胞肺癌细胞系A549的培养；(4)磺胺甲恶唑荧光探针工作液处理Caco‑2和A549细胞；(5)荧光成像；(6)数据分析。本发明采用荧光标记手段，在生物体细胞内实现对磺胺甲恶唑分布的准确观察，从而为评估磺胺甲恶唑对生物体细胞的影响提供理论支持，该方法操作步骤简单、准确度高、实验周期短、荧光稳定性好、样品穿透性强，能够快速、真实、清楚地评价磺胺甲恶唑在生物体细胞内的分布情况。

Description

一种磺胺甲恶唑荧光探针、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及抗生素检测领域，具体涉及一种磺胺甲恶唑荧光探针、制备方法及其应用。
背景技术
我国是世界上最大的抗生素生产国和使用国，抗生素的肆意滥用导致了我国水体和土壤等环境介质中抗生素含量高于国际平均水平，抗生素污染已成为我国亟待解决的环境问题。残留的抗生素在环境介质中不断迁移和转化，经过食物链的富集和传递，抗生素以游离或结合形式残留在动物组织中，并最终进入人体，从而危害人类健康。作为当前环境中被检测到的一种典型抗生素，磺胺类抗生素磺胺甲恶唑(Sulfamethoxazole，SMX)已被世界卫生组织下属的国际癌症研究机构列入3类致癌物清单。磺胺甲恶唑，化学名为N-(5-甲基-3-异恶唑基)-4-氨基苯磺酰胺，为白色结晶状粉末，无臭，味微苦。近年来，磺胺甲恶唑等磺胺类药物因制造成本低、产量大、价格低等优点，被广泛应用于预防和治疗感染性疾病；此外，磺胺甲恶唑化学性质稳定，不易分解，是具有良好生物体吸收性的广谱抗菌剂，在抵抗葡萄球菌、大肠杆菌和霍乱弧菌等感染的同时，还可以促进畜禽生长，所以一直在我国的畜牧养殖业中广泛使用，导致其在食品中残留的现象愈发严重，进而可能致使人体摄入过量。然而，磺胺甲恶唑不易排出体外，在人体内蓄积会引起过敏反应、造血功能紊乱、消化系统受损以及肾脏损伤等危害，严重影响人的身体健康。
目前，磺胺甲恶唑的常规检测方法主要包括紫外可见分光光度法、高效液相色谱法及与质谱技术联用法、生物检测法等相关检测方法，例如相关申请专利：中国发明专利CN202011402903.4公开了一种利用高效液相色谱-串联质谱检测蔬菜中抗生素残留量的方法，同时分析了磺胺类、喹诺酮类及四环素类等抗生素的浓度。中国发明专利CN202111014349.7公开了一种利用草履虫生物标志物及整合生物标志物分析(IBR)评价磺胺甲恶唑环境风险的方法，通过提取草履虫生物标志物，利用IBR检测方法评估磺胺甲恶唑环境浓度。但是这些技术方法只能实现对磺胺甲恶唑浓度的测定，普遍存在方法繁琐、价格较高、无法实现原位观察等缺点。
除了上述常规检测方法，荧光检测技术也被运用在抗生素的检测中，例如：中国发明专利CN201810121339.5公开了一种近红外抗生素荧光探针检测试剂，利用近红外碳量子点等荧光纳米材料和抗生素之间形成的内滤效应的原理而构建一种荧光纳米探针试剂，用于检测四环素类和喹诺酮类抗生素。中国发明专利CN201710762943.1公开了一种利用多色荧光碳点可视化检测多种抗生素的荧光检测指示卡，通过制备多种性质的荧光碳点检测食品中残留的恩诺沙星、氯霉素以及四环素等抗生素。这些技术虽然实现了对于抗生素的直接观察，但是存在成本较高、操作复杂、实验周期较长等缺点，特别是未应用于观察生物体细胞内抗生素分布的场境中。
鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本发明。
发明内容
本发明的目的在于解决现有的技术在对抗生素进行检测时存在成本较高、操作复杂、实验周期较长、无法实现抗生素在生物体细胞内原位观察的问题，提供了一种磺胺甲恶唑荧光探针、制备方法及其应用。
为了实现上述目的，本发明公开了一种磺胺甲恶唑荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
S1：将4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑溶液和磺胺甲恶唑溶液混合，然后加入硼酸缓冲液得到混合液；
S2：将步骤S1中得到的混合液在75℃下水浴加热30min，冷却至室温后加入浓盐酸，用甲醇定容；
S3：用针孔过滤器对步骤S2中定容后的溶液进行无菌过滤，得到磺胺甲恶唑荧光探针。
所述步骤S1中4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑溶液、磺胺甲恶唑溶液和硼酸缓冲液的体积比为1:1:1。
所述步骤S1中4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑溶液通过向4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑加入甲醇配置得到。
所述S1中磺胺甲恶唑溶液通过向磺胺甲恶唑加入甲醇配置得到。
所述步骤S2中浓盐酸与步骤S1中4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑溶液的体积比为1:5，定容后的溶液体积是步骤S1中4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑溶液体积的10倍。
所述步骤S2中水浴加热温度为75℃，加热时间为30min。
所述步骤S3中针孔过滤器孔径为0.22μm。
本发明公开了采用上述制备方法制得的磺胺甲恶唑荧光探针以及利用这种磺胺甲恶唑荧光探针在生物体细胞内检测磺胺甲恶唑分布的应用。
本发明利用4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑与伯胺基或仲胺基在高温碱性条件下反应可以发出荧光(激发波长450-470nm，发射波长520-540nm)这一特性，对带有伯胺基的磺胺甲恶唑进行荧光标记。
本发明使用荧光显微镜进行生物体细胞内荧光分布及其强度测定。其检测原理为荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，通过调节发射波长，使检测物发出相对应的荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。由于目前方法无法直接检测磺胺甲恶唑在生物体细胞内的分布情况，只能测定抗生素在生物体细胞内的总含量，因此，本发明使用了4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑使磺胺甲恶唑标记上荧光，这样可以通过荧光显微镜直接观察磺胺甲恶唑在生物体细胞内的分布。
与现有技术比较，本发明的有益效果在于：
本发明选用4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(NBD-Cl)标记磺胺甲恶唑，相比于其他荧光内抗生素标记物，4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑成本更低，且满足本实验中所有条件要求；选用4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑标记磺胺甲恶唑使其在470nm激发波长下，发射540nm波长的绿色荧光；本发明可以用于直接观察磺胺甲恶唑在生物体细胞内的分布。
本发明中的磺胺甲恶唑荧光探针，由于其分子的斯托克斯位移大，因而具有荧光稳定性好、背景干扰低、对生物样品的光损伤小、样品穿透性强、检测灵敏度高等优点。
本发明提供的方法简单、易于操作、成本低、实验周期短、可以直观观察到磺胺甲恶唑在生物体细胞内的分布，结果真实、清楚，并且可对各种含有伯胺基或仲胺基的抗生素开展其在生物体细胞内分布情况的研究，适合大规模推广。
附图说明
图1为磺胺甲恶唑荧光探针合成前后对比图(左图是合成前，右图是合成后)；
图2为4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑处理Caco-2细胞的荧光效果图；
图3为未经4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑标记的磺胺甲恶唑处理Caco-2细胞的荧光效果图；.
图4为磺胺甲恶唑荧光探针处理Caco-2细胞的荧光效果图；
图5为4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑处理A549细胞的荧光效果图；
图6为未经4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑标记的磺胺甲恶唑处理A549细胞的荧光效果图；
图7为磺胺甲恶唑荧光探针处理A549细胞的荧光效果图。
NBD-Cl代表磺胺甲恶唑荧光探针，Hoechst 33342代表细胞核，Merge代表两部分信号的叠加。
具体实施方式
以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
实施例1
一种磺胺甲恶唑荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：磺胺甲恶唑荧光探针的制备：
4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(NBD-Cl)溶液的制备：取10mg 4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑加入1mL甲醇，配置成10mg/mL的4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑溶液。
磺胺甲恶唑溶液的制备：取24mg磺胺甲恶唑加入1mL甲醇，配置成24mg/mL的磺胺甲恶唑溶液。
硼酸缓冲液的制备：取1.237g硼酸加水定容到100mL，配置成0.2mol/mL的硼酸溶液。取3.611g硼砂加水定容到100mL配置成0.05mol/mL的硼砂溶液。取2mL硼酸溶液加入8mL硼砂溶液，配置成pH＝9的硼酸缓冲液。
磺胺甲恶唑荧光探针储备液的制备：取1mL 4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑溶液、1mL磺胺甲恶唑溶液和1mL pH＝9的硼酸缓冲液，在75℃水浴锅中加热30min，冷却至室温后加入0.2mL浓盐酸。用甲醇定容至10mL。
用0.22μm针孔过滤器对磺胺甲恶唑荧光探针储备液进行无菌过滤。
步骤2：Caco-2细胞使用DMEM完全培养基(含20％胎牛血清、1％的非必需氨基酸、1％的青霉素(1×102U/mL)、1％的链霉素(0.1mg/mL))，于37℃，5％CO2条件下进行培养。
步骤3：待细胞生长达到90％满度，吸去旧液，加入胰酶消化液收集细胞并计数。在收集好的细胞内加入DMEM完全培养基，将细胞稀释至10×104个/mL。将稀释后的细胞悬液以每孔2mL接种于6孔板，并将细胞分为三组。分别为处理组1，即4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑处理组；处理组2，即未经4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑标记的磺胺甲恶唑处理组；处理组3，即磺胺甲恶唑荧光探针处理组。
步骤4：含有4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑的DMEM完全培养基的制备：取10μL 4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑溶液加入90μL甲醇后，再加到1900μL DMEM完全培养基中；含有未经4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑标记的磺胺甲恶唑溶液的DMEM完全培养基的制备：取10μL磺胺甲恶唑溶液加入90μL甲醇后，再加到1900μL DMEM完全培养基中；含有磺胺甲恶唑荧光探针的DMEM完全培养基的制备：取100μL磺胺甲恶唑荧光探针储备液加入到1900μL DMEM完全培养基中。
步骤5：待步骤3中的三组细胞生长至对数生长期后，弃去步骤3中处理组1、处理组2和处理组3各孔的培养基后，分别向处理组1加入含有4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑的DMEM完全培养基；处理组2加入含有未经4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑标记的磺胺甲恶唑的DMEM完全培养基；处理组3加入含有磺胺甲恶唑荧光探针的DMEM完全培养基。
步骤6：待各组处理2h结束后用PBS清洗三遍，每遍5min。后用4％的多聚甲醛溶液固定细胞30min，然后去除固定液，用PBS清洗三遍，每遍5min。
步骤7：固定结束后加入Hoechst 33342工作液对细胞核染色。染色20min，然后去除染色液，用PBS清洗三遍，每遍5min。
步骤8：使用荧光显微镜检测，测定磺胺甲恶唑在细胞内的分布。
如图2、3所示，4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑和未经4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑标记的磺胺甲恶唑处理Caco-2细胞，在荧光显微镜下未观察到荧光信号，证明4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑和未经4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑标记的磺胺甲恶唑在细胞内无法发射荧光信号，而如图4所示，磺胺甲恶唑荧光探针处理Caco-2细胞后，在荧光显微镜下可以看到细胞内有清晰的绿色荧光信号。
实施例2
一种磺胺甲恶唑荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：磺胺甲恶唑荧光探针的制备：
4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑溶液的制备：取10mg 4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑加入1mL甲醇，配置成10mg/mL的4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑溶液。
磺胺甲恶唑溶液的制备：取24mg磺胺甲恶唑加入1mL甲醇，配置成24mg/mL的磺胺甲恶唑溶液。
硼酸缓冲液的制备：取1.237g硼酸加水定容到100mL，配置成0.2mol/mL的硼酸溶液。取3.611g硼砂加水定容到100mL配置成0.05mol/mL的硼砂溶液。取2mL硼酸溶液加入8mL硼砂溶液，配置成pH＝9的硼酸缓冲液。
磺胺甲恶唑荧光探针储备液的制备：取1mL 4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑溶液、1mL磺胺甲恶唑溶液和1mL pH＝9的硼酸缓冲液。在75℃水浴锅中加入30min。冷却至室温后加入0.2mL浓盐酸。用甲醇定容至10mL。
用0.22μm针孔过滤器对磺胺甲恶唑荧光探针储备液进行无菌过滤。
步骤2：A549细胞使用DMEM完全培养基(含10％胎牛血清、1％的青霉素(1×102U/mL)、1％的链霉素(0.1mg/mL))，于37℃，5％CO2条件下进行培养。
步骤3：待细胞生长达到90％满度，吸去旧液，加入胰酶消化液收集细胞并计数。在收集好的细胞内加入DMEM完全培养基，将细胞稀释至10×104个/mL。将稀释后的细胞悬液以每孔2mL接种于6孔板，并将细胞分为三组。分别为处理组1，即4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑处理组；处理组2，即未经4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑标记的磺胺甲恶唑处理组；处理组3，即磺胺甲恶唑荧光探针处理组。
步骤4：含有4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑的DMEM完全培养基的制备：取10μL 4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑溶液加入90μL甲醇后，再加到1900μL DMEM完全培养基中；含有未经4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑标记的磺胺甲恶唑溶液的DMEM完全培养基的制备：取10μL磺胺甲恶唑溶液加入90μL甲醇后，再加到1900μL DMEM完全培养基中；含有磺胺甲恶唑荧光探针的DMEM完全培养基的制备：取100μL磺胺甲恶唑荧光探针储备液加入到1900μL DMEM完全培养基中。
步骤5：待步骤3中的三组细胞生长至对数生长期后，弃去步骤3中处理组1、处理组2和处理组3各孔的培养基后，分别向处理组1加入含有4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑的DMEM完全培养基；处理组2加入含有未经4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑标记的磺胺甲恶唑的DMEM完全培养基；处理组3加入含有磺胺甲恶唑荧光探针的DMEM完全培养基。
步骤6：待各组染毒处理2h结束后用PBS清洗三遍，每遍5min。后用4％的多聚甲醛溶液固定细胞30min，然后去除固定液，用PBS清洗三遍，每遍5min。
步骤7：固定结束后加入Hoechst 33342工作液对细胞核染色。染色20min，然后去除染色液，用PBS清洗三遍，每遍5min。
步骤8：使用荧光显微镜检测，测定磺胺甲恶唑在细胞内的分布。
如图5、6所示，4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑和未经4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑标记的磺胺甲恶唑处理A549细胞，在荧光显微镜下未观察到荧光信号，证明4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑和未经4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑标记的磺胺甲恶唑在细胞内无法发射荧光信号，而如图7所示，磺胺甲恶唑荧光探针处理A549细胞后，在荧光显微镜下可以看到细胞内有清晰的绿色荧光信号。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种磺胺甲恶唑荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑溶液和磺胺甲恶唑溶液混合，然后加入硼酸缓冲液得到混合液；
S2：将步骤S1中得到的混合液水浴加热，冷却至室温后加入浓盐酸，用甲醇定容；
S3：用针孔过滤器对步骤S2中定容后的溶液进行无菌过滤，得到磺胺甲恶唑荧光探针。
2.如权利要求1所述的一种磺胺甲恶唑荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑溶液、磺胺甲恶唑溶液和硼酸缓冲液的体积比为1:1:1。
3.如权利要求1所述的一种磺胺甲恶唑荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑溶液通过向10mg 4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑加入1mL甲醇配置得到。
4.如权利要求1所述的一种磺胺甲恶唑荧光探针的制备方法，其特征在于，所述S1中磺胺甲恶唑溶液通过向24mg磺胺甲恶唑加入1mL甲醇配置得到。
5.如权利要求1所述的一种磺胺甲恶唑荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中浓盐酸与步骤S1中4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑溶液的体积比为1:5，定容后的溶液体积是步骤S1中4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑溶液体积的10倍。
6.如权利要求1所述的一种磺胺甲恶唑荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中水浴加热温度为75℃，加热时间为30min。
7.如权利要求1所述的一种磺胺甲恶唑荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中针孔过滤器孔径为0.22μm。
8.一种采用如权利要求1～7任一项所述的制备方法制得的磺胺甲恶唑荧光探针。
9.一种如权利要求8所述的磺胺甲恶唑荧光探针在抗生素检测领域中的应用。
CN202210571934.5A 2022-05-24 2022-05-24 一种磺胺甲恶唑荧光探针、制备方法及其应用 Pending CN114716430A (zh)

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