CN114057604A - 一种细胞核荧光染料及其染色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种细胞核荧光染料及其染色方法和应用，提出了一种新的用于细胞核染色的荧光染料。本发明所涉及的细胞核荧光染料有具有良好的膜通透性，高灵敏度，快速的染核效率，良好的光稳定性，良好的生物相容性，波长更长的激发光和发射光，可以应用于细胞核的荧光染色。
Description
技术领域
本发明涉及荧光成像技术领域，特别涉及一种细胞核荧光染料及其染色方法。
背景技术
生物成像通常指对细胞、组织或体内的目标分子或过程进行可视化和记录的方法。生物成像技术包含荧光成像技术、拉曼成像技术、核磁共振技术、光声成像技术、超声成像技术、X射线照相技术和正电子发射断层扫描技术等。其中，包含共聚焦显微镜、双光子显微镜和超分辨显微镜在内的荧光成像技术以其对样品的低损伤、出色的灵敏度和很高的空间-时间分辨率赢得了广泛的研究兴趣。在生物成像中，针对不同的生物分子和生物过程，许多发光生物探针被设计并应用于生物分子检测、细胞成像、细菌成像、细胞追踪、血管成像、体内肿瘤成像与治疗等方面。
细胞是组成生命的最小单位，细胞内主要含有细胞膜、细胞核、线粒体、溶酶体、内质网、高尔基体等细胞器。这些细胞器的功能和细胞的健康状态息息相关，它们的功能缺失或异常通常会导致人类的疾病。因此，可视化观察这些细胞器结构和功能变化对分析疾病的诱因和指导药物开发具有重要意义。考虑到聚集诱导发光探针的低背景、高亮度、高光稳定性的特点，科学家已经开发了靶向到生物分子、脂滴、线粒体、细胞核、细胞膜、溶酶体、细胞内的酶、细胞内的理化性质(pH值、黏度)等的发光探针。
细胞核是细胞中大多数遗传物质贮存的地方，它控制着细胞的代谢、生长、分化。通过简单的偶联反应和强D-π-A电子推拉结构，有研究组制备了对细胞内的微环境变化产生相应的荧光颜色改变的探针(ASCP)。ASCP对细胞的线粒体和核仁具有特异的选择能力，分别表现出黄色和红色荧光。采用不同的荧光采集通道分别可以对细胞内的线粒体和核仁进行成像。与目前商业化探针MitoTracker green和SYTO RNASelect相比，ASCP的光稳定性显著提高，几乎没有细胞毒性。增强分子中正电荷数目，有助于提高分子进入核区。最近，有报道显示具有三个吡啶盐取代的三苯胺衍生物可以选择性地靶向到细胞的核区，而具有两个或一个吡啶盐的三苯胺衍生物对核区的靶向性较差。核定位信号是一种信号肽，一般由四个至八个氨基酸组成，可以帮助亲核蛋白进入细胞。此外，还有利用核定位信号设计的靶向细胞核区的黄色聚集诱导发光探针。该探针由两个靶向多肽，细胞穿透多肽和核定位信号肽和黄色的聚集诱导分子组成。在核定位信号肽的帮助下，探针进入细胞后，最终到达细胞核区点亮细胞核。实验还表明该探针的细胞毒性低、可以稳定地存在于核区并应用于细胞核的长期追踪观察，效果优于商业细胞核蓝色染料Hoechst 33258。基于常用的铜催化点击方法，有研究组还开发出了可用来检测S期DNA合成的聚集诱导发光荧光试剂。利用具有叠氮基团的聚集诱导分子TPE-Py-N3和Cy-Py-N3与参与DNA合成的5-乙炔基-2'-脱氧尿苷的乙炔的生物正交的点击反应，可实现对S期的DNA合成进行检测，对细胞的增殖能力进行评估。实验结果还表明，AIE染料与已经商业化的Alexa647-azide相比，具有更好的光稳定性和更高的灵敏度。
目前细胞核常用荧光染料有以下几大类：吖啶橙、溴化乙锭和碘化丙啶，DAPI、Hoechst染料、EthD III、7-AAD、RedDot1、RedDot2等。目前市场上常用的细胞核荧光染料，透膜的染料如下：
1，吖啶橙：具有膜通透性，能透过细胞膜，将核DNA和RNA分别染成绿色和红色，因此使细胞核呈绿色或黄绿色荧光。2，溴化乙锭：一种高度灵敏的荧光染色剂，在标准302nm处激发出橙红色信号。3，DAPI：一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，其与DNA结合后可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，而与单链DNA结合无荧光的增强。DAPI对双链DNA的染色灵敏度要高于EB和碘化丙啶(PI)，荧光强度比Hoechst低，但光稳定性高于Hoechst。4，Hoechst染料：一类在显微观察中标记DNA的荧光染料，最常见的两种是Hoechst33342，Hoechst33258。这两种染料都在紫外350nm处被激发，在461nm处最大发射光附近发射青/蓝色荧光。与DAPI相比，Hoechst33342加有乙基，具有更强的亲脂性，因此能更好的透过完整的细胞膜，并且细胞毒性更小。RedDot 1染料：超强的细胞核选择性。RedDot1染料可被几种常见的激光激发并可在远红外区激发荧光。RedDot1的红色近红外荧光有效的与其他常用荧光探针区分开来。不透膜的染料，如下：PI碘化丙啶：不能通过活细胞膜，但却能穿过死细胞膜而对核染色。PI作为红色荧光复染剂首选，PI经常与Calcein-AM或者FDA等荧光探针合用，区分死/活细胞。EthD III、7-AAD、RedDot 2：不能透过活细胞膜，但能将坏死细胞区分开来；更适合凋亡坏死实验的检测。
DAPI系列、Hoechst系列等传统靶向细胞核的染料的最佳激发波长仅为360nm左右，无法被现有的商业化激光器有效激发，且该波长的光能量较高，不仅细胞的光毒性较大，同时也容易造成染料的光漂白现象。这是由于染料被光激发到激发态后，会通过系间窜越的方式进入三线态，处于三线态的分子容易受到空气中氧分子的进攻致使染料结构被破坏，因而将染料分子与氧气隔离可以有效地避免光漂白现象，例如在氮气氛围中进行成像实验、用葫芦脲包裹荧光团等。然而，有一些性能良好的化合物长期应用于其他领域，但是并未曾发现它们可以应用在细胞核荧光染色方面且具有优良的效果。
性能优良细胞核荧光染料应具有好的膜通透性，高灵敏度，快速的染核效率，良好的光稳定性，良好的生物相容性细胞毒性更小，波长更长的激发光和发射光等。仔细分析目前国内外市场上常用的细胞核荧光染料，满足以上要素的化合物体系为数不多，且有些染色程序方法复杂，需要洗涤，不便于操作。探究新的优良的细胞核荧光染料是目前研究人员的共识，便于进一步深层研究细胞核内的生物机制。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种细胞核荧光染料及其染色方法和应用。本发明的细胞核荧光染料具有良好的膜通透性，高灵敏度，快速的染核效率，良好的光稳定性，良好的生物相容性，波长更长的激发光和发射光，可以应用于细胞核的荧光染色。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种细胞核荧光染料，具有如下结构通式：
其中，R1为C0-C30的直链或支链的亚烷基，R2为C0-C30的直链或支链的取代亚烷基，R3为C5-C30的芳香基或取代芳香基，R4为C5-C30的亚烷基芳香基、取代亚烷基芳香基、亚芳香基烷基、取代亚芳香基烷基中的任一种；R5为不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羧基、氨基、磺酸基。
更进一步的，所述的细胞核荧光染料，具有如下结构通式：
所述的结构通式中包含R1-R5的主体部分带正电，带正电对于其细胞核染色功能有重要意义，R6为化合物的负离子部分，带负电，把整个化合物作为一个盐。其中，R1为C0-C30的直链或支链的亚烷基，R2为C0-C30的直链或支链的取代亚烷基，R3为C5-C30的芳香基或取代芳香基，R4为C5-C30的亚烷基芳香基、取代亚烷基芳香基、亚芳香基烷基、取代亚芳香基烷基中的任一种；R5为不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羧基、氨基、磺酸基；R6为PF6 -、BF4 -、SbF5 -、CH3COO-、CF3COO-、CO3 2-、SO4 2-、SO3 2-、CF3SO2 -、TsO-、ClO4 -、F-、Cl-、Br-、I-、(F3CSO2)N-、PO4 3-中的任一种。
更进一步的，所述的细胞核荧光染料，具有如下结构式：
化合物(Ⅲ)为本发明实施例中具体采用的细胞核荧光染料。
本发明还提供一种细胞核荧光染料的染色方法，能够使细胞核染上颜色，使用所述的细胞核荧光染料。
所述的细胞核荧光染料的染色方法，包括如下步骤：
将待染色细胞或组织与染色液混合，染色液完全覆盖住待染色细胞或组织，培养1～10分钟。
更进一步的，所述染色液为含有所述细胞核荧光染料的缓冲溶液。
更进一步的，所述染色液中所述细胞核荧光染料的浓度为0.01～10mg/mL。
更进一步的，所述培养1～10分钟后还包括直接在荧光显微镜下观察或封片后在荧光共聚焦显微镜下观察的步骤。所述荧光显微镜或荧光共聚焦显微镜的检测波长为600～900nm。
更进一步的，所述待染色细胞或组织包括活细胞或培养的组织、固定的细胞或组织。
更进一步的，所述待染色细胞或组织为固定的细胞或组织时，与染色液混合之前要先去除固定剂。
更进一步的，所述去除固定剂的步骤和所述与染色液混合的步骤之间可以包括免疫荧光染色的步骤。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
1、本发明提供了一种细胞核荧光染料的新应用，拓展了细胞核荧光染料的种类。
2、本发明所涉及的细胞核荧光染料有具有好的膜通透性，高灵敏度，快速的染核效率，良好的光稳定性，良好的生物相容性，波长更长的激发光和发射光。
3、通过进一步的实验研究了本发明的细胞核荧光染料的细胞核染色过程，为其应用奠定了良好的理论基础。
4、本发明提供的细胞核荧光染料是一种聚集诱导发光染料，具有越聚越亮的优势，染色程序方法简单，无需洗涤，易于操作。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1示本发明的细胞核荧光染料的紫外吸收光谱；
图2示本发明的细胞核荧光染料结合DNA的荧光发射光谱；
图3示Hoechst33342染料的吸收和发射光谱图；
图4示共聚焦显微镜观察本发明的细胞核荧光染料染细胞核的效果图，从左到右依次为Hoechst 33342、本发明的细胞核荧光染料、Hoechst 33342和本发明的细胞核荧光染料的共染叠加、Hoechst 33342和本发明的细胞核荧光染料的共染以及明场叠加的染色效果；
图5示共聚焦显微镜观察本发明的细胞核荧光染料在低浓度下的染细胞核效果图；
图6示本发明的微量细胞核荧光染料检测游离DNA荧光光谱图；
图7示长时间激光照射本发明的细胞核荧光染料的吸收光谱图；
图8示MCF-7活细胞用本发明的细胞核荧光染料染色的结果图；
图9示COS-7死细胞用本发明的细胞核荧光染料染色的结果图；
图10示洋葱表皮细胞用本发明的细胞核荧光染料进行细胞核染色的结果图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
荧光染料会发出荧光，所谓荧光是指物质分子吸收波长较短的可见光后发出的波长较长的可见光荧光。
膜通透性：物质通过生物膜的难易程度。在本发明中特指荧光染料透过细胞膜的难易程度。
灵敏度：低浓度的荧光染料染色的效果。低浓度的荧光染料也有很好的染核效果即为灵敏度高。
染核效率：荧光染料使细胞染上颜色的时间。能快速染色即为染核效率高。
光稳定性：长时间的激光照射对荧光染料的吸收没有影响，说明其光稳定性好。
生物相容性：生物相容性是指细胞对非活性材料产生反应的一种性能，荧光染料进入细胞后，对细胞产生影响和作用，细胞对荧光染料也会产生影响和作用，两者的循环作用一直持续，直到达到平衡。
激发波长：激发波长是用某种波长的光激发出荧光，这种波长的光可以是紫外光或者可见光也可以是其他光。激发波长对于杂散光和信噪比的影响非常显著。
发射波长：某种光发射出来的荧光的波长，一般的可见光的波长用肉眼就能大致判断出来。
波长更长的激发光和发射光：激发光和发射光的波长长，就具有一定带宽的峰，在实际应用的时候，激发波长的范围要小于发射波长，激发波长更长可以获得高激发率的物质形态，间接提高灵敏度，发射波长更长可以直接提高灵敏度，从而可以得到良好的信噪比的结果值。
本发明提供的一种细胞核荧光染料，具有如下结构通式：
其中，R1为C0-C30的直链或支链的亚烷基，R2为C0-C30的直链或支链的取代亚烷基，R3为C5-C30的芳香基或取代芳香基，R4为C5-C30的亚烷基芳香基、取代亚烷基芳香基、亚芳香基烷基、取代亚芳香基烷基中的任一种；R5为不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羧基、氨基、磺酸基。
更进一步的，所述的细胞核荧光染料，具有如下结构通式：
所述的结构通式中包含R1-R5的主体部分带正电，带正电对于其细胞核染色功能有重要意义，带正电的化合物可以与带负电的负离子部分结合，结合之后从而使细胞核更好的染上颜色。其中，R1为C0-C30的直链或支链的亚烷基，R2为C0-C30的直链或支链的取代亚烷基，R3为C5-C30的芳香基或取代芳香基，R4为C5-C30的亚烷基芳香基、取代亚烷基芳香基、亚芳香基烷基、取代亚芳香基烷基中的任一种；R5为不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羧基、氨基、磺酸基；R6为化合物的负离子部分，带负电，把整个化合物作为一个盐，R6为PF6 -、BF4 -、SbF5 -、CH3COO-、CF3COO-、CO3 2-、SO4 2-、SO3 2-、CF3SO2 -、TsO-、ClO4 -、F-、Cl-、Br-、I-、(F3CSO2)N-、PO4 3-中的任一种。
更进一步的，所述的细胞核荧光染料，具有如下结构式：
本发明的细胞核荧光染料既能对活细胞或培养的组织进行染色，也可以对固定的细胞或组织进行染色，对于活细胞和死细胞具有不同的染色方法：
1.对于固定的细胞或组织：
a.细胞或组织样品，固定后，适当洗涤去除固定剂。随后如果需要进行免疫荧光染色，则先进行免疫荧光染色，染色完毕后再按后续步骤进行细胞核染色。如果不需要进行其它染色，则直接进行后续的细胞核染色。
b.对于贴壁细胞或组织切片，加入少量染色液，覆盖住样品即可。染色液中细胞核荧光染料的浓度为0.01～10mg/mL，用缓冲溶液稀释。对于悬浮细胞，至少加入待染色样品体积3倍的染色液，混匀。室温放置3-5min。
c.不需洗涤，直接在荧光显微镜下观察或封片后荧光共聚焦显微镜下观察，检测波长为600～900nm。
2.对于活细胞或培养的组织：
a.加入适量染色液，必须充分覆盖住待染色的样品，通常对于6孔板一个孔需加入1mL染色液，对于96孔板一个孔需加入100μL染色液。染色液中细胞核荧光染料的浓度为0.01～10mg/mL，用缓冲溶液稀释。
b.在适宜于细胞培养的温度培养1-10min，不需洗涤，直接在荧光显微镜下观察或封片后荧光共聚焦显微镜下观察，检测波长为600～900nm。
本发明提供的细胞核荧光染料的应用及细胞核的染色方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明，实施例中采用的细胞核荧光染料的化合物结构为上述结构式(Ⅲ)。
实施例1 对于固定的细胞或组织的染色
染色方法为：
配制母液为1mg/mL的本发明的细胞核荧光染料的PBS缓冲溶液。
a.细胞或组织样品，固定后，适当洗涤去除固定剂。加入浓度为100μg/mL的本发明的细胞核荧光染料的染色液，覆盖住样品即可。室温放置3-5min。不需洗涤，直接在荧光显微镜下观察或封片后荧光共聚焦显微镜下观察。
b.对于贴壁细胞或组织切片，加入浓度为100μg/mL的本发明的细胞核荧光染料的染色液，覆盖住样品即可。对于悬浮细胞，至少加入待染色样品体积3倍的染色液，混匀。室温放置3-5min。不需洗涤，直接在荧光显微镜下观察或封片后荧光共聚焦显微镜下观察。
实施例2 对于活细胞或培养的组织的染色
a.加入浓度为100μg/mL的本发明的细胞核荧光染料的染色液，必须充分覆盖住待染色的样品，通常对于6孔板一个孔需加入1mL染色液，对于96孔板一个孔需加入100μL染色液。
b.在适宜于细胞培养的温度培养5min，即可进行荧光检测。
试验例1 本发明的细胞核荧光染料的吸收光谱和发射光谱检测
在本发明中，用紫外-可见光谱仪检测了本发明的细胞核荧光染料的吸收光谱，如图1所示，本发明的细胞核荧光染料的吸收光波长范围在250-850nm，一般的核染料吸收光波长范围在250-450nm。同时用荧光光谱仪检测了本发明的细胞核荧光染料结合DNA后的荧光发射光谱，如图2所示，本发明的细胞核荧光染料结合DNA后的荧光发射光波长范围在600-900nm，一般的核染料范围在300-600nm。图3所示为传统细胞核染料Hoechst33342的光谱图，左边是吸收光谱，右边是荧光发射光谱。传统染料的光谱是偏蓝光，而本发明的本发明的细胞核荧光染料的光谱偏红光。Hoechst33342最佳激发波长偏蓝光，激发波长短，无法被现有的商业化激光器有效激发，且该波长的光能量较高，不仅细胞的光毒性较大，同时也容易造成染料的光漂白现象，而本发明的细胞核荧光染料很好的克服了这一缺点，在成像中不会造成严重的细胞损伤。
试验例2 染色效果检测
参照实施例1的方法对MCF-7细胞加入母液浓度为1mg/mL的本发明的细胞核荧光染料的PBS缓冲液，使其细胞培养液的细胞核荧光染料的终浓度为100μg/mL，室温放置5min，随即进行荧光共聚焦成像，并同时使用商业化的染核染料Hoechst33342处理染核。染色效果如图4所示。
试验结果显示：从左至右，第1张图为Hoechst33342的染核效果图，第2张图为本发明的细胞核荧光染料的染核效果图，第3张图为Hoechst和本发明的细胞核荧光染料共染染核效果图，第4张图是两者的染核效果和明场的叠加。从图中可以看出，本发明的细胞核荧光染料的染核效果和商业化的染核染料Hoechst33342的染核效果荧光叠加非常明显，重合高度一致。说明本发明的细胞核荧光染料和商业化的染核染料相比有同等甚至更好的染核效果。
试验例3 灵敏度检测
参照实施例1的方法对MCF-7细胞加入母液浓度为1mg/mL的本发明的细胞核荧光染料的PBS缓冲液，使其细胞培养液的细胞核荧光染料的终浓度为5μg/ml，相比100μg/mL的工作液浓度又稀释了20倍，室温放置5min，随即进行荧光共聚焦成像，染色效果如图5所示。
试验结果显示，MCF-7细胞的细胞核呈现红色荧光，细胞结构完整，荧光边缘清晰且亮度很高，说明极低浓度的本发明细胞核荧光染料也有非常好的染核效果。
此外，用微量的本发明的细胞核荧光染料，浓度分别为1，2，5，10，20，50μM结合游离的DNA可以看到有很好的荧光峰型和线性规律，如图6所示，说明本发明的细胞核荧光染料有很高的灵敏度。
试验例4 光稳定性检测
通过对本发明的细胞核荧光染料长时间660nm激光照射(0、10、20、30、60、120s)，测出本发明的细胞核荧光染料的吸收光谱的结果所示，本发明的细胞核荧光染料的光学稳定性检测如图7，橫坐标为波长，纵坐标为紫外吸收值。
结果显示，长时间的激光照射对本发明的细胞核荧光染料的吸收没有影响，即使照射时间长达120s，本发明的细胞核荧光染料的紫外吸收峰也没有明显的降低，说明本发明的细胞核荧光染料的光学稳定性好。
试验例5 MCF-7活细胞用本发明的细胞核荧光染料染色的结果
MCF-7活细胞的染色。MCF-7细胞培养后，用浓度为1mg/mL的本发明的细胞核荧光染料的PBS缓冲液染色，使其细胞培养液的细胞核荧光染料的终浓度为5μg/mL，室温放置5min，随即进行荧光共聚焦成像。
结果如图8所示，最左边一列是荧光通道，细胞核呈现红色荧光，中间一列为明场通道，最右边的一列为荧光通道和明场通道的叠加，下面的一行是上面一行的局部放大图。通过本发明的细胞核荧光染料染色，可以看到活细胞的核，还能看到核的有丝分裂过程。染色体聚集，然后细胞核分裂，染色体一分为二的整个过程都可以通过染料的染色清晰看到，以上结果说明本发明的细胞核荧光染料对于活细胞的细胞核染色具有良好效果。
试验例6 COS-7死细胞用本发明的细胞核荧光染料染色的结果
COS-7细胞培养后用多聚甲醛固定，然后使用浓度为1mg/mL的本发明的细胞核荧光染料的PBS缓冲液染色，使其细胞培养液的细胞核荧光染料的终浓度为5μg/ml，室温放置5min，随即进行荧光共聚焦成像。
结果如图9所示，可以观察到COS-7的细胞核呈现出边缘清晰的红色，图中以灰度表示，以上结果说明本发明的细胞核荧光染料对于死细胞的细胞核染色同样具有良好效果。
试验例7 洋葱表皮细胞用本发明的细胞核荧光染料进行细胞核染色的结果
取洋葱表皮细胞用本发明的细胞核荧光染料进行细胞核染色的步骤如下：
(1)用洁净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干净。
(2)把载玻片放在实验台上，用滴管在载玻片的中央滴一滴PBS缓冲液。
(3)用镊子从洋葱鳞片内侧撕取一小块透明薄膜——内表皮。
(4)把撕下的内表皮浸入载玻片上的水滴中，用镊子把它展平。
(5)用镊子夹起盖玻片，使它的一边先接触载玻片上的水滴，然后缓缓地放下，盖在要观察的材料上，避免盖玻片下面出现气泡影响观察。
(6)把一滴本发明的细胞核荧光染料滴在盖玻片的一侧。
(7)用吸水纸从盖玻片的另一侧吸引，使染液浸润标本的全部。
(8)制作好的样本用荧光显微镜观察并拍照。
试验结果如图10所示，洋葱表皮细胞的细胞核被清晰的染上红色，与明场所观察到的细胞核位置完全吻合，说明本发明的细胞核荧光染料不仅可以应用于动物细胞或组织，对植物细胞或组织同样适用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种细胞核荧光染料，其特征在于，具有如下结构通式：
其中，R1为C0-C30的直链或支链的亚烷基，R2为C0-C30的直链或支链的取代亚烷基，R3为C5-C30的芳香基或取代芳香基，R4为C5-C30的亚烷基芳香基、取代亚烷基芳香基、亚芳香基烷基、取代亚芳香基烷基中的任一种；R5为不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羧基、氨基、磺酸基。
2.根据权利要求1所述的细胞核荧光染料，其特征在于，具有如下结构通式：
所述的结构通式中包含R1-R5的主体部分带正电，其中，R1为C0-C30的直链或支链的亚烷基，R2为C0-C30的直链或支链的取代亚烷基，R3为C5-C30的芳香基或取代芳香基，R4为C5-C30的亚烷基芳香基、取代亚烷基芳香基、亚芳香基烷基、取代亚芳香基烷基中的任一种；R5为不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羧基、氨基、磺酸基；R6为化合物的负离子部分，R6为PF6 -、BF4 -、SbF5 -、CH3COO-、CF3COO-、CO3 2-、SO4 2-、SO3 2-、CF3SO2 -、TsO-、ClO4 -、F-、Cl-、Br-、I-、(F3CSO2)N-、PO4 3-中的任一种。
3.根据权利要求2所述的细胞核荧光染料，其特征在于，具有如下结构式：
4.一种细胞核荧光染料的染色方法，能够使细胞核染上颜色，其特征在于，使用权利要求1-3任一项所述的细胞核荧光染料。
5.根据权利要求4所述的染色方法，其特征在于，包括如下步骤：
将待染色细胞或组织与染色液混合，培养1～10分钟。
6.根据权利要求5所述的染色方法，其特征在于，所述染色液为含有所述细胞核荧光染料的缓冲溶液。
7.根据权利要求5或6任一项所述的染色方法，其特征在于，所述染色液中所述细胞核荧光染料的浓度为0.01～10mg/mL。
8.根据权利要求5所述的染色方法，其特征在于，所述培养1～10分钟后还包括直接在荧光显微镜下观察或封片后在荧光共聚焦显微镜下观察的步骤，所述荧光显微镜或荧光共聚焦显微镜的检测波长为600～900nm。
9.根据权利要求5所述的染色方法，其特征在于，所述待染色细胞或组织包括活细胞或培养的组织、固定的细胞或组织。
10.根据权利要求5所述的染色方法，其特征在于，所述待染色细胞或组织为固定的细胞或组织时，与染色液混合之前要先去除固定剂。
11.根据权利要求10所述的染色方法，其特征在于，所述去除固定剂的步骤和所述与染色液混合的步骤之间可以包括免疫荧光染色的步骤。
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| CN116400068A (zh) * | 2023-02-13 | 2023-07-07 | 泉州圣源警用侦察设备有限公司 | 一种用于含dna的潜在生物痕迹显现的试剂及显现方法 |
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2020
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