KR20140020313A - 형광 표지된 l-글루코오스 유도체를 이용한 암세포를 검출하기 위한 방법 및 당해 유도체를 포함하는 암세포의 이미징제 - Google Patents

Abstract

본 발명의 목적은 암세포를 양호한 정밀도로 검출하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은, 형광 표지된 L-글루코오스 유도체를 이용하여 이미징을 행하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 방법 및 이미징제를 이용함으로써, 형광 표지된 D-글루코오스 유도체를 이용하여 이미징을 행하는 경우에 비해, 암세포와 정상 세포의 사이에서 높은 콘트라스트를 얻을 수 있다. 또, 판정에 있어서 절식을 행할 필요가 없기 때문에, 환자에게 부담을 강요하지 않고, 신속하게 실시할 수 있다.

Description

형광 표지된 L-글루코오스 유도체를 이용한 암세포를 검출하기 위한 방법 및 당해 유도체를 포함하는 암세포의 이미징제{METHOD FOR DETECTING CANCER CELL USING FLUORESCENTLY LABELED L-GLUCOSE DERⅣATⅣE, AND CANCER CELL-IMAGING AGENT COMPRISING FLUORESCENTLY LABELED L-GLUCOSE DERⅣATⅣE}

본 발명은, 형광 표지된 L-글루코오스 유도체를 이용하여 암세포 또는 그 우려가 있는 세포를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또, 형광 표지된 L-글루코오스 유도체를 포함하는 암세포 또는 그 우려가 있는 세포의 이미징제에 관한 것이다.

암을 양호한 정밀도로 검출하는 것은, 그 발견이나 치료를 위해 중요하다. 일반적으로, 암조직은 똑같은 성질을 나타내는 세포의 집합이 아니라, 여러 가지의 형태적 혹은 기능적인 특징, 분화의 정도를 나타내는 세포의 집합이다. 또 정상 세포 중에 혼재하여 존재하는 경우도 있다. 그래서, 암 진단에서는, 진단을 확정하기 위해 생검(生檢) 표본의 병리 진단을 행하여, 세포 레벨에서 이상 세포의 평가를 행하는 것이 필요해진다. 그러나, 생검 표본의 병리 진단에 있어서는, 특히 조기암일수록, 암세포 혹은 전암(前癌) 상태에 있는 세포가 간과될 가능성, 즉 잘못하여 음성(False Negative, 위(僞)음성)으로 진단될 가능성이 존재한다. 특히, 내과 진단 시에 조직의 극히 일부만을 취출하는 생검을 행하는 경우, 이와 같은 위음성의 진단이 이루어져 버리고, 그 후에 병상(病狀)이 진행되어 버리고 나서 비로소 알아차릴 위험성을 어떻게 작게 하는지가 과제가 되어 있다. 동일한 문제는, 수술 후의 재발의 유무의 평가에 있어서도 큰 과제가 되어 있어, 증가하기만 하는 암환자에 대응하는 많은 임상과에서는, 담당의의 경험이나 능숙도에 크게 의존하지 않고, 정확하게 진단 가능한 방법이 요구되고 있다.

생검은 외과 수술 시에 확인의 목적으로 행해지는 경우, 내시경, 기관지경, 확대경, 비경(鼻鏡), 이경(耳鏡) 등을 이용한 내과 검사 시에 소화관이나 기관(氣管), 방광, 질, 그 밖의 각종 관강(管腔)의 내측으로부터 행해지는 경우, 혹은 관찰 부위 부근의 신체에 작은 구멍을 열고, 개구부에 복강경이나 흉강경 등을 삽입하여 조직의 외측으로부터 행해지는 경우 등이 있지만, 침습(侵襲)적인 조작이기 때문에, 어느 쪽의 경우에도 정확한 생검 부위의 선정이 극히 중요한 과제이다. 내시경 검사 등에서는, 발적이나 미란, 백색 융기, 미세혈관 구축의 이상을 나타내는 영역을 인지한 경우, 확대 내시경을 병용한 이형(異型) 혈관상(像)의 정밀 조사 등에 의해 생검 부위의 선정이 행하여진다. 그러나, 생검에 수반하는 출혈에 의해, 미소한 암에서는 만약 생검 부위를 잘못하면 병변을 인식할 수 없어지는 경우도 많다. 한편, 정상과 구별이 되지 않는 조직을 광범위로 적출하면 침습도가 높아진다. 암의 수술에 있어서도, 재발이나 재수술을 피하려고 정상 부분을 불필요하게 크게 절제하면, QOL(Quality of Life) 개선과의 균형에 있어서는 마이너스 요인으로서 작용한다. 이 때문에 외과 수술에서는, 적출 범위가 적절한지의 여부를 조사하기 위해, 확실하게 암이 포함되어 있다고 생각되는 부분으로부터 일정 거리 떨어진 부분까지 절제를 행하고는 절단단(端)의 신속 병리 진단을 행한다는 프로세스를, 수술 중에 몇 번인가 반복하고 있다. 그러나, 절단단을 신속 병리 진단으로 제출하여, 그 결과가 얻어지기까지는 1회당 수십분에서 1시간이라고 하는 시간이 필요하기 때문에, 수술 시간 단축의 저해 요인의 하나가 되어 있다. 수술 시에 한정하지 않고, 내시경 등의 검사 시에 생검이 행해지는 경우도, 진단 중, 환자에게는 매우 큰 부담이 짊어지워져 있다. 따라서 검사를 조금이라도 빨리 끝나게 하기 위해, 어디를 정밀 조사하여, 생검해야 하는지를 나타내는 이미징법으로의 의료 현장의 필요성은 절실하다. 또, 담도암이나, 바렛(Barrett) 식도암 등과 같이, 검사로 발견한 시점에서는 이미 때를 놓치게 되어 있는 경우가 많은 암에서는, 조기 발견에 의해 생존율의 개선이 기대되고, 작은 암을 정확, 간편하게 발견할 수 있는 이미징법이 요구되고 있다. 또한, 일단 암이 발견된 경우, 내강(內腔) 표층에 얇게 존재하는 암이 어디까지 퍼져서 존재하는지(측방 진전 혹은 수평 진전 등으로 칭한다)를 정확하게 판정하여, 치료에 활용할 필요가 있지만, 내시경으로 이것을 세포 단위로 행하는 것은 숙련된 전문가여도 곤란하다(비특허문헌 1).

현재, 내시경은, 암의 특징을, 더욱 명료하게 파악하여 관찰할 수 있도록, 고해상도의 것이나, 광의 산란·흡수 변화를 이용하는 Narrow Band Imaging(NBI), 세포의 자가 형광(Autofluorescence)을 이미징하는 것(AFI), Optical Coherence Tomography(OCT)와 같은 새로운 원리를 이용하는 것 등 각종의 개발이 진행되어 있다. 그 중에서도 NBI의 유용성이 인식되어, 급속하게 보급되고 있다. 그러나 NBI는, 주로 혈관 패턴을 가시화함으로써 암의 진행도를 간접적으로 판단하려고 하는 방법으로, 상기에서 예시한 다른 방법과 마찬가지로, 개개의 세포를 직접 관찰하기 위해서는 적합하지 않다. 한편, 공(共)초점 내시경 Confocal Laser Endomicroscopy(비특허문헌 2)는, 플루오레세인 등의 형광 분자를 정맥 주사하여, 조직이 발하는 형광을 이용한 단층상(斷層像)의 취득에 의해 개개의 세포의 형태적 특징을 관찰할 수 있기 때문에, 감도가 향상되면 이형성이나 악성도의 차이의 세포 단위에서의 판정이 기대된다. 수술 시로의 응용도 가능하다. 그러나, 플루오레세인 등의 세포 내 흡수(take up)는 암세포 특이적이 아니기 때문에, 현미경의 시야 범위에서 보면 광대하다고도 말할 수 있는 조직 영역에 포함되는 대략 모든 세포가 형광을 발하는 중에서, 내시경이나 그 밖의 검사 시에 이상을 나타내는 암세포의 형광으로 정밀하게 관찰하려고 하면 방대한 시간을 요한다. 그래서, 암세포나 전암 상태에 있는 바와 같은 세포를 신속하게 발견하여, 염증 등, 암 이외의 원인에 기인하는 세포 이상과의 식별도 가능하게 하는 적절한 콘트라스트제(劑)가 요구되고 있다(비특허문헌 3 및 비특허문헌 4).

암 진단 이미징을 가능하게 하는 콘트라스트제로서 요즘 가장 사용되고 있는 것의 하나로, ¹⁸F로 방사성 표지된 2-디옥시-D-글루코오스의 유도체 [¹⁸F]2-fluoro-2-deoxy-D-glucose(FDG)가 있고, 이것을 양전자 단층법(PET)과 조합한 임상 화상 진단이 널리 행하여져 있다(비특허문헌 5). FDG법은, 암세포가 정상 세포보다 D-글루코오스를 세포 내에 많이 흡수하는 성질을 이용하여 암을 가시화하는 것이지만, 측정 수법 상, 살아있는 단일의 세포가 D-글루코오스를 흡수하는 모습을 실시간으로 연속적으로 관찰할 수 없다는 결점을 가진다(비특허문헌 6). 이것은, 똑같지 않은 형태나 기능, 분화 정도를 나타내면서 정상 세포 중에 혼재하여 존재하는 암의 정확한 진단에 있어서 불리한 점이고, 예를 들면 극히 작은 암세포가 산재되는 경우나 소화기 점막에 얇게 발생하는 암의 조기 발견을 곤란하게 하고 있는 요인의 하나이다. 또, D-글루코오스는 정상 세포에도 흡수되므로, 암조직의 주변이나, 경우에 따라는 암조직 내에 존재하는 정상 세포에의 FDG의 흡수에 의한 백그라운드 신호가 SN비(比)를 저하시킨다는 원리적인 문제가 있다. 또한, 염증을 일으키고 있는 세포에는 FDG가 모이기 쉽기 때문에, 암과의 판별이 어려워진다.

한편 본 발명자들은, 형광기인 7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸기(NBD)로 표지한 2-아미노-2-디옥시-D-글루코오스(2-NBDG)가, 포유동물 세포의 글루코오스 트랜스포터(transporter)를 통과하여, 방사성 표지 D-글루코오스 유도체에 필적하는 키네틱스(kinetics)를 가지고 세포 내에 흡수되는 것을 나타냈다(비특허문헌 6). 이들을 배경으로, 2-NBDG와 같은 형광 표지된 D-글루코오스 유도체를 FDG 대신에 이용하여, 암을 세포 레벨에서 이미징하는 것이 제안되어 있다(비특허문헌 7 및 특허문헌 1). 또, 암조직의 생검 혹은 수술 시 적출 표본에 2-NBDG를 이용한 이미징으로서, 구강암(비특허문헌 8), 유방암(비특허문헌 9) 및 바렛 식도암(비특허문헌 1)에 적용한 예가 보고되어 있다.

그러나, 2-NBDG를 암 진단 이미징에 이용하는 경우, 2-NBDG가 D-글루코오스의 유도체이기 때문에, FDG와 동일하게, 정상 세포에의 흡수에 기인하는 백그라운드 신호가 SN비를 저하시켜, 미소한 암의 조기 발견을 곤란하게 한다. 실제로, D-글루코오스는 혈당 상승에 의해 지방 세포나 근육에 강하게 흡수되는 성질을 나타내고(비특허문헌 10), FDG도 동일한 성질을 나타낸다. 그래서 FDG를 이용한 PET 검사에서는, SN비를 높이기 위해 검사 전에 장시간의 절식(絶食)이 불가결하고, 또 사전의 FDG 흡수 시간 중(약 30분∼1시간 정도) 및 측정 시간 중(20∼30분 정도), 근육을 움직이게 하지 않고 가만히 있을 필요가 있다(회화도 제한된다). 동일하게, 2-NBDG에 의한 암의 이미징에서도 절식 등이 필요해진다(비특허문헌 11). 그러나, 절식을 행하여도, 형광 표지된 D-글루코오스 유도체가 정상 세포에 흡수되는 것을 완전히 억제할 수는 없어, 더욱 정밀도가 높은 검출법이 요구되고 있다. 최근, 인간 조직의 생검 표본에 있어서 비교적 약한 2-NBDG의 흡수를 나타내는 경도(輕度) 이형성 세포와, 2-NBDG를 강하게 흡수하는 고도(高度) 이형성 세포가 있는 것이 보고되었지만(비특허문헌 1), 어느 쪽에도 2-NBDG는 흡수되기 때문에, 양자의 구별은 연속적인 것이 되지 않을 수 없다. 또 2-NBDG의 강한 흡수는 염증 조직에도 인지되어, 암과의 식별이 FDG-PET법과 동일하게 과제가 되어 있다(비특허문헌 1). 따라서, 형광 표지된 D-글루코오스 유도체를 이용하는 한, 종양 세포인지의 여부의 판정을 양호한 정밀도로 행하는 데에는 한계가 있다고 말하지 않을 수 없다. 또한, FDG법은 당뇨병 환자에게는 진단이 곤란하지만, 암 발생 빈도가 높은 연령은 당뇨병 발증 연령과 겹친다는 문제가 있어, 2-NBDG에 의한 이미징에도 동일한 제약이 일어날 가능성이 있다.

또 최근, 형광 분자단(團)을 D형 혹은 L형 글루코오스의 1위치에 링커를 통해 결합한 유도체를 합성하는 방법이 제안되어, 정상 세포 및 특정한 종양 세포에 적용하여 형광에 의한 검출을 행하고 있다(특허문헌 3). 그러나, 특허문헌 3의 실시예에 있어서는, 정상 세포 및 종양 세포 중 어느 쪽에 있어서도, L형 글루코오스 유도체에 의한 충분한 형광 강도의 증가가 검출되는 것이 나타내어져 있다.

미국 특허 제6989140호 명세서 WO 2010/016587 공개 공보 미국 특허출원공개 제20090317829호 공보

Thekkek et al., Technol. Cancer Res. Treat. 10: 431-41, 2011 Hsiung, PL. et al., Nat. Med. 14: 454-8, 2008 Thekkek & Richards-Kortum, Nat. Rev. Cancer 8: 725-31, 2008 Goetz & Wang., Gastroenterol. 138: 828-33, 2010 Jadvar et al., J. Necl. Med. 50: 1820-27, 2009 Yamada et al., J. Biol. Chem. 275: 22278-83, 2000 O'Neil et al., Mol. Imaging Biol. 7: 388-92,2005., Nitin et al., Int. J. Cancer 124: 2634-42, 2009 Langsner et al., Biomed. Optics Express 2: 1514-23, 2011 Foley et al., Biochemistry 50: 3048-61, 2011 Sheth et al., J. Biomed. Optics 14: 064014, 2009 Thompson RJ. et al., Science 312, 924-927, 2006. Cheng et al., Bioconjgate Chem. 17: 662-69, 2006 Etxeberria et al., J. Experimental Botany 56: 1905-12, 2005 Yamamoto et al., Tetrahedron Lett. 49: 6876-78, 2008 Yamada et al., Nat. Protoc. 2: 753-762, 2007

그래서 본 발명은, 이미징에 의해 암세포 또는 그 우려가 있는 세포를 양호한 정밀도로 검출하기 위한 방법, 및 그 방법에 이용하는 이미징제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 상기의 점을 감안하여 예의 연구를 거듭한 결과, 발달한 종양 세포(그 의미하는 바는 예를 들면, 이상한 세포핵을 띠는 세포를 세포 덩어리 중에 다수 포함할 정도까지 발달한 단계의 종양 덩어리를 구성하는 세포이다)가 형광 표지된 L-글루코오스 유도체를 활발하게 흡수하는 것을 발견하여, 본 발명을 완성했다.

본 발명은, 특정한 형광 발색단(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸기)을 분자 내에 가지는 L-글루코오스 유도체를 이용하여 표적 세포가 암세포 또는 그 우려가 있는 것을 검출함과 함께 그 판정을 행하는 방법이다. 더욱 상세하게는 이하와 같은 발명이다.

(1) 암세포 또는 그 우려가 있는 세포를 검출하기 위한 방법으로서,

이하의 공정,

a. 표적 세포(생체의 또는 생체로부터 분리된 세포 또는 조직 중의 세포)에, 형광 분자단으로서 7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸기 또는 그 유도체를 분자 내에 가지는 L-글루코오스 유도체를 함유하는 조성물을 접촉시키는 공정, 및

b. 당해 표적 세포 내에 존재하는 당해 L-글루코오스 유도체를 검출하는 공정

을 포함하는 검출 방법.

(2) 상기 L-글루코오스 유도체가, 7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸기 또는 그 유도체를, L-글루코오스 또는 아미노기 및/또는 불소 원자에 의해 수산기가 치환된 L-글루코오스에 결합한 것인, 상기 (1)에 기재된 검출 방법.

(3) 상기 L-글루코오스 유도체가, 7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸기 또는 그 유도체를, L-글루코오스 또는 아미노기 및/또는 불소 원자에 의해 수산기가 치환된 L-글루코오스의 2위치, 4위치 또는 6위치에 결합한 것인, 상기 (2)에 기재된 검출 방법.

(4) 상기 L-글루코오스 유도체가, 2-[N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노]-2-디옥시-L-글루코오스인 상기 (3)에 기재된 검출 방법.

(5) 상기 공정 a에 있어서의 검출이 표적 세포를 이미징함으로써 행하는 상기 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 검출 방법.

(6) 상기 공정 a에 있어서의 조성물이, 술포로다민을 분자 내에 가지는 L-글루코오스 유도체를 더 포함하고, 또한, 상기 공정 b가, 표적 세포 중에 존재하는 형광 분자단인 7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸기 또는 그 유도체를 분자 내에 가지는 L-글루코오스 유도체를 검출하는 공정인, 상기 (1)에 기재된 검출 방법.

(7) 상기 조성물이, 2-[N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노]-2-디옥시-L-글루코오스 및 2위치에 술포로다민 101 또는 술포로다민 B를 술폰아미드 결합하게 한 2-아미노-2-디옥시-L-글루코오스를 포함하는, 상기 (6)에 기재된 검출 방법.

(8) 상기 공정 b에 있어서의 검출이 이미징된 세포의 형광 색조의 시간 경과에 의한 변화를 지표로 하여 행하는, 상기 (6) 또는 (7)에 기재된 검출 방법.

(9) 이하의 공정,

c. 상기 형광 색조의 변화를 토대로 표적 세포가 암세포 또는 그 우려가 있는 세포인지의 여부를 판정하는 공정

을 더 포함하는, 상기 (5)∼(8) 중 어느 하나에 기재된 검출 방법.

(10) 상기 모든 공정을 30분 이내에 행하는 상기 (1)∼(9) 중 어느 하나에 기재된 검출 방법.

(11) 상기 L-글루코오스 유도체가 방사성 표지된 L-글루코오스 유도체이고, 또한 표적 세포 내에 존재하는 L-글루코오스 유도체를 검출하는 공정이 적어도 PET 이미징을 포함하는, 상기 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 검출 방법.

(12) 상기 조성물이, 형광 발색단을 분자 내에 가지는 형광 표지된 D-글루코오스 유도체를 더 포함하는, 상기 (1)∼(11) 중 어느 하나에 기재된 검출 방법.

(13) 표적 세포(생체의 세포, 또는 생체로부터 분리된 세포 또는 조직 중의 세포) 내로의 형광 표지된 L-글루코오스 유도체의 흡수에 의해서 표적 세포를 이미징하기 위한 이미징제로서, 형광 분자단으로서 7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸기 또는 그 유도체를 분자 내에 가지는 L-글루코오스 유도체를 포함하는 표적 세포의 이미징제.

(14) 암세포 또는 그 우려가 있는 세포를 검출하기 위한 상기 (13)에 기재된 이미징제.

(15) 상기 L-글루코오스 유도체가, 7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸기 또는 그 유도체를, L-글루코오스 또는 아미노기 및/또는 불소 원자에 의해 수산기가 치환된 L-글루코오스에 결합한 것인, 상기 (14)에 기재된 이미징제.

(16) 상기 L-글루코오스 유도체가, 7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸기 또는 그 유도체를, L-글루코오스 또는 아미노기 및/또는 불소 원자에 의해 수산기가 치환된 L-글루코오스의 2위치, 4위치 또는 6위치에 결합한 것인, 상기 (15)에 기재된 이미징제.

(17) 상기 L-글루코오스 유도체가 2-[N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노]-2-디옥시-L-글루코오스인 상기 (16)에 기재된 이미징제.

(18) 상기 이미징제가, 술포로다민을 분자 내에 가지는 L-글루코오스 유도체를 더 포함하는 상기 (14)∼(17) 중 어느 하나에 기재된 이미징제.

(19) 상기 이미징제가, 2위치에 술포로다민 101 또는 술포로다민 B를 술폰아미드 결합하게 한 2-아미노-2-디옥시-L-글루코오스를 더 포함하는 상기 (18)에 기재된 이미징제.

(20) 상기 L-글루코오스 유도체가, 방사성 표지된 L-글루코오스 유도체인 상기 (13)∼(17) 중 어느 하나에 기재된 이미징제.

(21) 형광 발색단을 분자 내에 가지는 형광 표지된 D-글루코오스 유도체를 더 포함하는, 상기 (14)∼(20) 중 어느 하나에 기재된 이미징제.

(22) 상기 (14)∼(20) 중 어느 하나에 기재된 이미징제를 포함하는 암세포 또는 그 우려가 있는 세포를 검출하기 위한 키트(kit).

(23) 상기 (1)∼(12) 중 어느 하나에 기재된 검출 방법을 이용하여 암세포 또는 그 우려가 있는 세포를 검출함으로써, 표적 세포가 유래하는 조직이 암인지, 또는 전암 상태(즉 방치하면 조만간 암이 될 가능성이 높은 상태, 고도 이형성으로 진단되는 상태)에 있다고 진단하는 방법.

본 발명에 의하면, 암세포 또는 그 우려가 있는 세포를 높은 콘트라스트로 식별할 수 있는 방법 및 그를 위한 이미징제를 제공할 수 있다.

도 1은 실시예 2에 있어서 종양 세포(C6 글리오마)를 우측 뒷다리 서혜부의 피하에 이식한 마우스(mouse)에 2-NBDLG를 투여하여 1분 간격으로 이미징을 행한 결과를 나타내는 사진이다. 화살표는, 2-NBDLG를 투여한 시점을 나타낸다.
도 2는 동(同), 2-NBDG를 투여하여 이미징을 행한 결과를 나타내는 사진이다. 화살표는, 2-NBDG를 투여한 시점을 나타낸다.
도 3은 동, 2-NBDLG와 2-NBDG를 각각 투여한 후의 종양 세포의 이식 부분(우측 뒷다리 서혜부의 동그라미, 그래프의 마름모형, Tumor+Glc)과, 목 근처의 등측의 지방 세포가 풍부한 부분(목부의 동그라미, 그래프의 사각, BG+Glc)에 있어서의, 각각의 집적(集積)값의 경시(經時)적 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 실시예 3에 있어서 마우스 인슐린노마 세포(MIN6)로 이루어지는 종양 세포 덩어리에 2-NBDLG를 투여하여 실시간 레이저 스캔 공초점 현미경에 의해 취득한 화상이다.
도 5는 실시예 4에 있어서의 마우스 인슐린노마 세포(MIN6)로 이루어지는 종양 세포 덩어리에, 100 마이크로 몰의 2-NBDLG와 20 마이크로 몰의 2-TRLG로 이루어지는 혼합 용액을 투여하기 전의 실시간 레이저 스캔 공초점 현미경에 의해 취득한 화상이다.
도 6은 동, 투여 종료로부터 2분 경과 후의 취득 화상이다.
도 7은 동, 투여 종료로부터 4분 경과 후의 취득 화상이다.
도 8은 동, 투여 종료로부터 2분 경과 후의 녹색 채널 화상과 적색 채널 화상과 DIC 화상을 겹친 화상이다.
도 9는 동, 투여 종료로부터 4분 경과 후의 녹색 채널 화상과 적색 채널 화상과 DIC 화상을 겹친 화상이다.
도 10은 2-NBDG 및 2-NBDLG의 마우스 인슐린노마(MIN6) 세포 내에의 흡수에 대한 조해제(阻害劑)의 영향을 본 결과이다.
도 11은 실시예 6에 있어서의 마우스 인슐린노마 세포(MIN6)로 이루어지는 종양 세포 덩어리에, 100 마이크로 몰의 2-NBDLM과 20 마이크로 몰의 2-TRLG로 이루어지는 혼합 용액을 투여하기 전의 실시간 레이저 스캔 공초점 현미경에 의해 취득한 화상이다.
도 12는 동, 투여 시의 취득 화상이다.
도 13은 동, 투여 종료로부터 2분 경과 후의 취득 화상이다.
도 14는 동, 투여 종료로부터 10분 경과 후의 취득 화상이다.
도 15는 동, 투여 종료로부터 22분 경과 후의 취득 화상이다.

본 발명은, 형광 표지된 L-글루코오스 유도체를 이용하여 암세포 또는 그 우려가 있는 세포를 검출하기 위한 방법 및 그 방법에 이용하는 이미징제이다. 본 발명에 의하면, 유효량의 형광 표지된 L-글루코오스 유도체(형광 분자단인 7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸기 또는 그 유도체를 분자 내에 가지는 L-글루코오스 유도체)를 포함하는 조성물(이하의, 「본 발명의 조성물」 또는 「본 발명의 이미징제」라고 하는 경우가 있다)을 시약으로서, 표적 세포에 접촉시킴으로써, 표적 세포가 암세포(또는 그 우려가 있는 세포)인지의 여부를 판정할 수 있다. 본 발명에 의하면 또, 표적 세포를 포함하는 조직에, 본 발명의 조성물을 접촉시켜 이미징을 행함으로써, 조직 중의 암세포 또는 그 우려가 있는 세포를 검출할 수 있다. 본 발명에 의하면 또한, 본 발명의 조성물을 생체에 투여하여 이미징을 행함으로써, 암세포(또는 그 우려가 있는 세포) 또는 그들 세포를 포함하는 조직을 검출할 수 있어, 이 방법은 암을 검출하는 방법으로서 유용하다. 형광 표지된 L-글루코오스 유도체는, 매크로파지(macrophage)나 마이크로글리아(microglia)와 같은 식(食)작용을 담당하는 특수한 세포를 제외하고, 정상 세포에는 예를 들면 투여 개시 후 20분 이내와 같은 단시간에서는 흡수되지 않거나 흡수되었다고 해도 조금이므로, 본 발명에 의하면, 단시간(예를 들면, 투여 개시 후 15분 이내 등)에 이미징을 실시 가능하고, 또한 암세포 또는 그 우려가 있는 세포와, 정상 세포 혹은 핵에 이상을 초래할 때까지는 발달하고 있지 않은 종양 세포 덩어리를 구성하는 세포와의 사이에서 높은 콘트라스트를 얻을 수 있다.

형광 표지 D-글루코오스를 투여할 때에는 지방 세포나 근육으로의 흡수를 저하시킬 목적으로 투여 전에 통상 절식이 행하여져 있었지만, 절식을 행하면, 헤미채널(gap junction/hemichannel)이 개구되고, 헤미채널을 통한 D-글루코오스의 흡수가 일어나서, 장기(臟器)에 따라서는 콘트라스트가 저하될 가능성이 있다(비특허문헌 12). 또 절식 시, 근육, 간장, 취장, 신장 등의 정상 세포는, 자식(Autophagy)을 개시한다. 자식은, 정상 세포가 자신을 소화하는 현상으로, 만약 여러 가지의 세포에 자식을 생기게 하면, 그것에 수반하여 형광으로 표지된 D-글루코오스 유도체가, 암세포 이외의 정상 세포에 비특이적으로 흡수될 가능성을 부정할 수 없다. 이와 같이 절식을 행하는 것은, 이미징에 의한 암세포의 특정에 마이너스가 되는 경우도 있다. in vitro에 있어서 살아있는 세포의 평가에 적용하는 경우에 있어서도, 글루코오스와 같은 에너지원이 될 수 있는 당류를 첨가하지 않고 세포를 일정 시간 유지한 경우, 동일한 비특이적 흡수가 일어날 가능성이 있다. 또한, D-글루코오스 혹은 D-글루코오스에 형광기를 결합한 유도체를, 장시간(구체적으로는 30분 이상) 정상 세포에 계속해서 접촉시키면, 정상 세포의 세포막에 존재하는 글루코오스 트랜스포터 혹은 글루코오스 수용체 등의 막(膜) 단백에, 이들 유도체가 결합한 채 세포 내로 이동하는 현상(internalization)이나(비특허문헌 13), 비특이적인 엔도사이토시스(endocytosis)가 일어날 가능성이 있는 것이 시사되어 있다(비특허문헌 14). 이에 대해 본 발명은 생체에서는 절식을 행하지 않고 단시간(예를 들면, 투여 개시 후 15분 이내 등)에 이미징을 실시 가능하여, 본 발명에 의하면, 표지된 D-글루코오스 유도체를 이용하여 이미징을 행하는 경우에 비해, 암세포(또는 그 우려가 있는 세포)와 정상 세포의 사이에서 높은 콘트라스트를 얻을 수 있다. 또, 검출·판정에 있어서 절식을 행할 필요가 없으므로, 환자에게 부담을 강요하지 않고, 즉시 검사를 실시할 수 있다.

본 명세서에서 말하는 「암세포 또는 그 우려가 있는 세포」는, 세포 형태의 이상(구조 이형)을 나타내는 세포, 또는 그와 같은 세포와 종양 덩어리를 구성하는 세포, 핵 형태의 이상(핵 이형)이나 핵분열의 이상을 나타내는 세포, 또는 그와 같은 세포로 발전할 가능성이 높은 세포를 의미하고, 일반적으로는 악성 종양으로 분류되어 암으로 진단되는 세포거나, 그와 같은 세포 집단을 구성하는 세포, 또는 그와 같은 세포 집단으로 발전할 가능성이 높은 세포를 의미한다.

암세포는 아니지만 식작용 등에 의해 비특이적으로 본 발명의 형광 표지된 L-글루코오스 유도체를 세포 내로 흡수할 가능성이 있는 세포, 예를 들면, 매크로파지나 마이크로글리아 등의 세포도 생체 내에는 존재한다. 그들 세포는, 암세포(또는 그 우려가 있는 세포)도 아니고 또 세포막에 파탄을 초래하고 있지 않음에도 불구하고, 형광 표지된 L-글루코오스 유도체를 흡수할 가능성이 있다. 그들 세포는, 형태에 의한 식별 외에, 2-TRLG를 동시에 투여했을 때에 세포 내로 흡수되는 것이나, 특이 마커(marker), 예를 들면 CD14나 CD11b를 이용하여, 본 발명의 방법에 있어서 의양성(擬陽性)으로 판정한 후에, 그들 세포의 종류를 확인할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서 판정할 수 있는 암세포의 종류는 특별히 제한이 없지만, 예를 들면, 눈꺼풀이나 눈물샘 등 안과 영역의 암, 외이(外耳)나 중이 등의 귀의 암, 비강(鼻腔)이나 부(副)비강 등 코의 암, 폐암, 구강 내의 암, 후두암, 인두암, 식도암, 위암, 소장, 대장암 등 소화기의 암, 유방암, 자궁암, 난소암, 난관암 등 부인과 영역의 암, 생식기의 암, 신장암, 방광암, 전립선암, 항문암, 피부암, 뼈의 암, 근육의 암(육종), 백혈병 등 혈액의 암, 악성 림프종, 말초 및 중추 신경의 암, 및, 글리아(glia)의 암 등의 암세포를 들 수 있다.

본 발명에 있어서 이용되는 형광 표지된 L-글루코오스 유도체로서는, 7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸기(NBD) 및 그 유도체를 분자 내에 가지는 L-글루코오스 유도체를 들 수 있다. L-글루코오스 유도체에 있어서의 NBD가 결합하는 위치는 특별히 제한이 없지만, 구체적으로는, L-글루코오스의 1위치, 2위치, 3위치, 4위치 또는 6위치를 들 수 있고, 바람직하게는 2위치, 4위치 또는 6위치이며, 더욱 바람직하게는 2위치 또는 6위치이고, 가장 바람직하게는 2위치이다. 또, NBD의 L-글루코오스로의 결합은, 아민을 통해 직접 결합해도, 스페이서, 예를 들면, -NH-(CH₂)n-NH-(여기서, n은 2∼20 바람직하게는 2∼10이고, 메틸렌의 일부는, O, NH, S 또는 C=O로 치환되어도 된다)를 통해 결합해도 된다. 녹색의 형광을 발하는, 7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸기 및 그 유도체를 분자 내에 가지는 L-글루코오스 유도체의 형광 극대 파장은 530∼580㎚ 근처이다.

본 발명에 있어서 이용하는 형광 표지된 L-글루코오스 유도체는, 형광 발색단을 결합한, L-글루코오스 또는 그 유도체(아미노기 및/또는 불소 원자에 의해 수산기가 치환된 L-글루코오스 등)를 의미하고, 염산염과 같은 염의 형태이더라도 된다. 또, 본 발명에 있어서, 7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸기 및 그 유도체는, 7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸기에 첨가하여, 형광 특성을 해치지 않는 범위에서 치환기를 부가 또는 변경한 것을 포함하는 의미이고, 예를 들면, 7-(N,N-디메틸아미노술포닐)-2-옥사-1,3-디아졸기(DBD기)를 들 수 있다.

본 발명에 이용할 수 있는 형광 표지된 L-글루코오스 유도체는, 구체적으로는, 녹색의 형광을 발하는 7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸기를 분자 내에 가지는 L-글루코오스 유도체(극대 형광 파장은 530㎚∼580㎚ 근처이다), 예를 들면, 2-[N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노]-2-디옥시-L-글루코오스(2-NBDLG), 4-디옥시-4-[N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노]-L-글루코오스(4-NBDLG)나, 6-디옥시-[N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노]-L-글루코오스(6-NBDLG) 등을 들 수 있다. 또, NBD의 유도체인 황색∼황녹색의 형광을 발하는 (N,N-디메틸아미노술포닐)벤즈-2-옥사-1,3-디아졸기를 분자 내에 가지는 L-글루코오스 유도체, 예를 들면, 2-디옥시-2-[N-7-(N',N'-디메틸아미노술포닐)벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노]-L-글루코오스(2-DBDLG) 등을 들 수 있다.

이들 화합물 중 몇 개인가는 본 발명자들의 이전 연구 성과에 관한 WO2010/016587 공개 공보(특허문헌 2)에 기재되어 있다. 이 중 2-NBDLG는, 이하에 나타내는 바와 같이 2-NBDG(2-[N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노]-2-디옥시-D-글루코오스)와 거울상 이성체의 관계에 있고, 글루코오스 트랜스포터인 GLUT를 통과하지 않는다고 생각된다(비특허문헌 15, 특허문헌 2). 2-NBDG는, 살아있는 포유동물 세포의 D-글루코오스의 동적인 흡수 프로세스의 연구를 위해 본 발명자들이 제안한 화합물이고, 이제는, 이 연구 분야에 있어서 빠트릴 수 없는 것으로 자리매김되어 있다(비특허문헌 16). 특허문헌 2에 있어서 제안되어 있는 D-글루코오스의 세포 내에의 특이적인 흡수의 평가 방법에 있어서도, 2-NBDG가 형광 표지된 D-글루코오스 유도체로서 이용되고 있다.

본 발명에 있어서 이용하는 형광 표지된 L-글루코오스 유도체는, NBD를 분자 내에 가지는 L-글루코오스 유도체이지만, 바람직하게는 2-NBDLG 또는 그 유도체, 더욱 바람직하게는 2-NBDLG이다. 2-NBDLG 또는 그 유도체는, 2-NBDLG 또는 2-NBDLG를 본 발명에 있어서의 효과를 해치지 않는 범위에서 본 발명의 용도에 따라 개변한 것을 의미하고, 예를 들면, L-글루코오스 또는 형광 발색단 중 어느 한쪽 또는 양쪽에, 치환기를 부가 또는 변경한 것을 의미한다. 형광 분자인 NBD의 유도체로서는, 예를 들면, DBD를 들 수 있다. L-글루코오스의 유도체로서는, 예를 들면, 아미노기에 의해 수산기가 치환된 L-글루코오스, 아미노기 및 불소 원자에 의해 수산기가 치환된 L-글루코오스, 및 불소 원자에 의해 수산기가 치환된 L-글루코오스, 나아가서는, 예를 들면, L-글루코오스 또는 이들 당의 제2위치, 제3위치, 제4위치, 제6위치 등에 불소를 도입한 분자도 포함하고, 예로서는 2-F-6-NBDLG, 3-F-2-NBDLG, 4-F-2-NBDLG, 및 6-F-2-NBDLG 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 표적 세포는, 특별히 한정되지 않고, 생체로부터 단리된 세포, 생체로부터 단리된 조직 중에 존재하는 세포, 생체의 조직 중에 존재하는 세포, 생체로부터 단리 후의 초대 배양 세포, 또는 주화(株化)된 세포 등, 어떠한 세포이더라도 된다.

본 발명의 방법에 있어서는, 형광 표지된 L-글루코오스 유도체는, 암세포에 흡수되어 세포 내에서 검출된다. 암세포 내에 있어서의 본 발명의 L-글루코오스 유도체의 검출은, 통상 이용되는 형광을 검출하는 방법으로 행할 수 있다. 예를 들면, 이하와 같이 하여 행할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서의, 암세포 내에 존재하는 형광 표지된 L-글루코오스 유도체의 검출은, 미리 표적 세포의 형광을 계측하고, 이어서 표적 세포에 형광 표지한 L-글루코오스 유도체를 일정 시간 접촉시키며, 그런 후에 이것을 씻어내고, 재차 표적 세포의 형광을 계측하여, 접촉 전의 표적 세포의 형광 강도에 대한 형광 강도의 증가로써 평가를 행할 수 있다. 형광 강도를 화상으로서 인식함으로써, 형광 표지된 L-글루코오스 유도체를 세포 내에 가지는 세포를 이미지화하여 암세포 또는 그 우려가 있는 세포의 검출이 가능해진다. 또, 형광 플레이트 리더(plate reader)나 플로 사이트메트리(flow cytometry) 등을 이용하여, 다수의 세포가 나타내는 형광 강도의 총합, 혹은 형광 강도의 분포로써 평가를 행하여도 된다.

형광의 검출은 씻어냄이 종료된 후, 임의의 시간 후에 행할 수 있다. 생체로부터 단리된 조직 또는 세포에 직접 L-글루코오스 유도체를 접촉시킨 경우는, 예를 들면 씻어냄 종료 직후∼20분 후의 사이, 바람직하게는 씻어냄 종료 직후∼10분 후의 사이에 검출할 수 있다. 표적 세포가 조직 중의 세포이고, 관찰 대상인 세포 주위의 세포 바깥 조직 중에 있어서의 L-글루코오스 유도체의 씻어냄에 시간이 걸리는 경우는, 그것이 종료된 후에 검출할 수 있다. 접촉 후, 시간을 둔 후에 콘트라스트 좋게 검출할 수 있지만, 공초점 현미경이나 다(多)광자 현미경 등 세포의 단층상을 취득할 수 있는 검출 장치를 이용하는 경우에는, 접촉 시간 중에 있어서도 표적 세포 내의 형광 강도 혹은 형광 강도의 변화를 검출하고, 접촉 개시 전과 비교하여 평가하고 및/또는 이미지화하는 것도 가능하다. 이와 같이 본 발명에 의하면, 암세포를 검출하기 위한 행정(行程)이, 본 발명의 조성물의 세포에의 접촉을 개시 직후로부터 30분 이내, 바람직하게는 15분 이내 완료한다. 또한 본 발명에 의하면, 많은 경우, 본 발명의 조성물의 세포에의 접촉을 개시하고 나서 단리 세포에서는 몇 분 이내, 조직 중의 세포에서도 10분 이내에 암세포를 검출할 수 있다. 표적 세포가 생체 내의 세포인 경우는, 본 발명의 이미징제를 생체에 직접 국소적으로 접촉시킨 후에 씻어내고, 형광을 검출한다. 혹은 정맥 등의 혈관에 투여하여, 표적 세포 부근에 도달한 후에 검출한다. 혈관에 투여하는 경우에는 특단의 씻어냄 조작은 필요로 하지 않는다. 또한, 본 발명의 형광 표지된 L-글루코오스 유도체는, 정맥 등의 혈관에 투여한 경우는, 전신 이미징을 행하는 것도 가능하다. 이하에, 각각에 대해 구체적으로 기재한다.

유효량의 형광 표지된 L-글루코오스 유도체를 투여하는 표적이, 생체 내의 세포인 경우는, 예를 들면 사용 시에 표지된 L-글루코오스 유도체를 주사용 생리 식염수 등에 용해함으로써 액상 시약을 조제하고, 정맥 내 주사에 의해서 행하면 된다. 또, 검사 대상 부위가 피부 표면, 혹은 구강이나 소화관, 방광, 질 등 관강의 내표면에 있는 경우에는, 액상 시약을 검사 대상 부위에 직접 도포, 적하 혹은 산포하고, 혹은 겔 형상으로 하여 예를 들면 몇 분간 등 일정 시간 접촉시켜도 된다. 또 방광에 적용하는 경우에는 미리 오줌을 제거한 후, 액상 시약을 거쳐 요도(尿道)적으로 주입함으로써 접촉시켜도 된다. 소화관 내 등에 있어서 점액 등이 효과적인 접촉의 장해가 되는 경우에는, 통상 내시경 검사에서도 행해지는 바와 같이 프로나제(pronase) 등에 의한 점액 처리 및 제거를 행하여, 인디고 카민이나 아세트산 등을 살포하는 경우와 동일한 자체 공지의 방법으로 접촉시키는 것도 가능하다. 이 경우에는 이미징을 행하기 전에 검사 대상 부위에 잔류하고 있는 여분의 액상 시약을 씻어내어, 시약 접촉 전의 검사 대상 부위의 형광 이미지에 대한 형광 강도의 증가로서 세포 내에의 흡수를 평가할 수 있다. 다만, 검사 대상 부위에 여분의 액상 시약이 잔류하고 있는 상태에서도, 이미 기술한 바와 같이, 공초점 효과를 가지는 적절한 형광 현미 관찰 장치(예를 들면 공초점 내시경)를 이용하여, 관찰 대상으로 하는 세포의 초점 심도(深度)에 맞추어 관찰하면, 세포막 상태가 유지된 세포의 내부에, 표지된 L-글루코오스 유도체가 흡수되었는지의 여부를 접촉 시간 중에 있어서 아는 것도 가능하다. 이미징은, 형광 표지된 L-글루코오스 유도체의 표지에 따른 자체 공지의 방법으로 행하면 된다. 본 발명에 의하면, 표지된 L-글루코오스 유도체를 마우스의 정맥에 투여하고 나서 몇 분 후에는, 표지된 D-글루코오스 유도체를 이용하는 경우에 비해, 종양 세포와 정상 세포를 높은 콘트라스트로 식별할 수 있다. 이상에 의해, 이미징에 의한 평가를 행하는 타이밍은, 표지된 L-글루코오스 유도체를 생체에 투여 개시 직후로부터 40분 이내, 바람직하게는 20분 이내, 더욱 바람직하게는 10분 이내에 행할 수 있다. 이미징에 의한 평가는, 특정한 시점에서 1회만 행하여도 되고, 복수의 시점에서 행하여 관찰 대상으로 하는 세포 사이의 콘트라스트의 경시적 변화에 의해서 평가를 행하도록 해도 된다.

또, 표적 세포가 생체로부터 채취한 조직 또는 세포의 경우는, 생검을 행할 때나, 외과적 수술의 개시 시 혹은 수술 중에 채취한 조직·세포를 검체로 하여, 형광 표지된 L-글루코오스 유도체를 주사용 생리 식염수에 용해함으로써 조제한 액상 시약에 검체를 침지하거나, 검체에 액상 시약을 적하하거나, 혹은 액상 시약으로 관류(灌流)한 후, 검체의 세포 바깥에 잔류하고 있는 여분의 액상 시약을 씻어내고 나서 이미징을 행하여, 세포 내의 표지된 L-글루코오스 유도체를 검출한다. 이 방법은, 검체가 생체로부터 취출한 것이라는 점에 있어서 이전의 방법과는 다르고, 예를 들면, 취출한 시점에서 절단면이 상해된 조직을 일정 시간 링거액 중 등으로 회복시키는 자체 공지의 방법을 사이에 둘 필요가 있지만, 이 점을 제외하면, 이용하는 형광 표지된 L-글루코오스 유도체의 종류나 이미징의 원리 등은 이전의 방법과 동일하더라도 된다. 또, 이들 이미징의 공정도, 표지된 L-글루코오스 유도체를 조직 또는 세포에 접촉을 개시 직후로부터 30분 이내, 바람직하게는 15분 이내 완료하고, 많은 경우, 본 발명의 조성물의 세포에의 접촉을 개시하고 나서 단리 세포에서는 몇 분 이내, 조직 중의 세포에서도 10분 이내에 암세포를 검출할 수 있다.

본 발명의 형광 표지된 L-글루코오스 유도체를 체내 진단에 이용하는 경우는, 수술 중 평가나 내시경 등의 진단 시에의 적용이 가능하고, 투여법으로서는, 이미 기술한 바와 같이 정맥 투여 등의 전신 투여법 외에, 환부로의 필요 최소량의 직접 투여가 고려된다. 구체적으로는, 환부 혹은 수술 부위에 직접 도포, 적하 혹은 살포하고, 혹은 내시경 등을 이용하여 검사 시에 살포로 국소에 투여하는 방법이나, 겔 형상으로 하여 접촉시키는 방법 등이 고려된다.

본 발명의 방법 또는 이미징제에 있어서, 형광 표지에 더하여 방사성 표지를 이용하는 경우는, 암세포의 검출은, 형광에 더하여 방사선을 검출함으로써 행할 수 있고, 예를 들면, 감마선을 검출하는 PET를 예시할 수 있다.

본 발명을 체내 진단에 이용하여, 이미징에 의해, 암이나 전암 병변이 의심되는 소견을 인지한 경우, 조직 생검을 실시하여, 포르말린 등으로 고정 후, 병리 검사를 실시하여, 확정 진단으로 할 수 있다. 또, 사전의 이미징에 의해, 생검 부위의 선정의 신뢰도를 높일 수 있다. 또한, 형광 표지된 암 진단용 이미징제는, 내시경이나 그 밖의 형광 관찰 장치 등과 병용하여, 수술 중 평가에의 응용에도 이용할 수 있고, 표지된 L-글루코오스 유도체를, 수술 적출 범위를 적절히 정하는 보조물로서 사용함으로써, 수술 시간의 단축에 의한 환자 부담이나 리스크의 저감, QOL이나 예후의 개선 등의 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 특필해야 할 사항은, 표지된 L-글루코오스 유도체의 세포 내에의 흡수의 정도를 토대로, 종양 세포의 발달의 정도를 알 수 있는 것이다. 구체적으로는, 표지된 L-글루코오스 유도체를 활발하게 흡수하는 종양 세포는, 이상한 세포핵을 띠는 세포를 세포 덩어리 중에 다수 포함할 정도까지 발달한 단계의 종양 덩어리를 구성하는 세포, 즉, 악성 종양을 구성하는 암세포인 것이 본 발명자들에 의해서 확인되었다. 따라서, 표지된 L-글루코오스 유도체가 세포 내로부터 검출된 경우, 그 세포는 발달한 종양 세포 덩어리를 구성하는 암세포거나 또는 그 우려가 있다고 판정할 수 있다.

L-글루코오스 유도체는, L형이므로, GLUT와 같은, 글루코오스에 대한 입체 선택성을 가지는 막 단백이, 그 기질을 올바르게 입체 선택적으로 통과시키는 기구를 유지하고 있는지의 여부를 나타내는 역할을 한다. 또, 암세포와 같이, 글루코오스의 입체 선택적인 막통과 기구(그 의미하는 바는, D형 및 L형의 서로 거울상 이성체의 관계에 있는 글루코오스 중에서 한 쪽을 선택적으로 통과시키는 기구이다)와, 비입체 선택적인 막통과 기구(그 의미하는 바는, 서로 거울상 이성체의 관계에 있는 D형과 L형을 모두 통과시키는 막 단백을 개재한 기구이고, propidium iodide와 같은 막 불투과성 마커의 통과로 대표되는 바와 같은 세포막의 지방질 2중층 구조의 파탄에 의한 통과를 제외한 흡수이다)를 병렬적으로 발현하는 세포에 있어서는, 후자의 경로의 전체의 통과량에 대한 기여의 정도로써, 정상 세포와의 식별, 혹은 동종 암세포여도 악성도나, 미소 환경 요인에 의한 세포 상태의 차이의 식별을 행하는 것이 가능하다.

본 발명의 이미징제는, 본 발명의 형광 표지된 L-글루코오스 유도체에 더하여, 파장이 다른 형광 발색단을 가지는 L-글루코오스 유도체를 더 포함할 수도 있다. 이것에 의해, 다른 파장에서 검출되는, 본 발명의 형광 표지된 L-글루코오스 유도체와 다른 형광 표지된 L-글루코오스 유도체를 세포에 접촉하게 하여, 시간의 경과에 따른 이미징된 세포의 색조의 변화를 지표함으로써, 암세포인지의 여부에 대해 더욱 정확한 판정을 행할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 형광 표지된 L-글루코오스 유도체와 식별 가능한 형광 표지된 L-글루코오스 유도체를 동시에 이용함으로써, 이들 L-글루코오스 유도체의 세포 내에의 흡수의 차이, 및 배출의 시간 경과의 차이에 의거하여, 개별의 암세포의 상태 평가를, 양자의 유도체의 파장 성분의 혼재 비율에 의해서 표현되는 연속적인 형광색으로 나타내는 것이 가능함과 함께, 염증이나 물리적 손상에 의한 세포막 손상에 의거하는 흡수나 매크로파지 등에 의한 비특이적 흡수에 의한 노이즈를 제외할 수 있다. 즉, 상기와 같이 형광 색조의 변화에 의거하여, 표적으로 하는 세포가, 암세포 또는 그 우려가 있는 세포인지의 여부를 양호한 정밀도로 판정할 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 이미징제는, 또한, 본 발명의 형광 표지된 L-글루코오스 유도체와는 파장이 다른 형광 발색단인, 적색의 형광을 발하는 술포로다민(술포로다민 B, 술포로다민 G, 술포로다민 101 등)을 결합하게 한 L-글루코오스 유도체(극대 형광 파장은 580㎚∼630㎚ 근처이다), 예를 들면, 2위치에 술포로다민 101을 술폰아미드 결합하게 한 2-아미노-2-디옥시-L-글루코오스(2-TRLG) 또는 그 유도체를 포함할 수 있다. 2-TRLG 또는 그 유도체는, 2-TRLG 또는 2-TRLG를 본 발명에 있어서의 효과를 해치지 않는 범위에서 본 발명의 용도에 따라 개변한 것을 의미하고, 예를 들면, L-글루코오스 및/또는 술포다민 101에 치환기를 삽입 또는 변경한 유도체를 의미한다. 여기서 말하는 L-글루코오스 또는 그 유도체는, L-글루코오스 그 자체에 첨가하여, 아미노기에 의해 수산기가 치환된 L-글루코오스, 아미노기 및 불소 원자에 의해 수산기가 치환된 L-글루코오스, 스페이서를 통해 아미노기를 가지는 L-글루코오스 및 불소 원자에 의해 수산기가 치환된 L-글루코오스를 포함하고, 나아가서는, 예를 들면 L-글루코오스의 제2위치, 제3위치, 제4위치, 제6위치 등에 불소를 도입한 분자도 고려되고, 예로서는 2-F-6-TRLG, 3-F-2-TRLG, 4-F-2-TRLG, 및 6-F-2-TRLG를 들 수 있다. 적색의 형광을 발하는 유도체로서는, 바람직하게는 2-TRLG 또는 그 유도체, 더욱 바람직하게는 2-TRLG이다.

2-TRLG는, 세포막 상태가 악화된 세포에 흡수되는 것이 본 발명자들에 의해 보고되어 있다(특허문헌 2). 즉, 2-TRLG는 L형 유도체이기 때문에 글루코오스 트랜스포터와의 결합을 통한 세포 내 흡수가 일어나지 않고, 또한 부피가 크고, 지용성이 높은 형광기를 가지므로, 2-TRLG가 세포 내에 침입하는 경우에는, 엔도사이토시스(Endocytosis)에 의한 경우 등을 제외하고, 세포막 기구에 비교적 큰 손상을 받고 있는 경우가 고려된다. 그 손상의 정도가 클수록, 2-TRLG는 일단 세포 내에 침입해도, 씻어냄에 의해, 더욱 빠르게 세포 바깥으로 배출된다. 자주 사용되는 propidium iodide(PI)와 같은 세포사(necrosis) 판정용의 형광 시약은, 세포막의 손상에 의해 세포 내에 침입하면 핵에 불가역적으로 결합하여, 손상이 있던 것을 알리지만, 손상의 정도를 나타내는 것이 어렵다. 또, 형광기를 부여한 덱스트란과 같이, 단순하게 입체적 부피 크기만으로 세포막 통과가 저해되어 있는 분자와는 달리, 2-TRLG는, 세포막의 악화의 정도가 완전한 세포막의 파괴를 수반하는 세포사(necrosis; 괴사)로 간주될 만큼 현저하지 않고, 아직 활동성이 남아있는 세포 내에 침입하면, 세포막 내측에 흡착하여, 세포 내에 더욱 길게 머무르는 성질을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 형광 표지된 L-글루코오스 유도체와 2-TRLG를 조합하여 이용함으로써, 다른 형광 파장에서 검출되는, 본 발명의 형광 표지된 L-글루코오스 유도체와 2-TRLG를 세포에 접촉하게 하여, 시간의 경과에 의한 이미징된 세포의 색조의 변화를 지표함으로써, 암세포 또는 그 우려가 있는지의 여부에 대해 본 발명의 L-글루코오스 유도체를 단독으로 이용하는 경우보다 정확한 판정을 행할 수 있다.

본 발명의 형광 표지된 L-글루코오스 유도체, 예를 들면 2-NBDLG와, 형광 표지된 L-글루코오스 유도체인 2-TRLG를 예로 들어 설명하면, 후자는 발달한 종양 세포 덩어리 중에 있어서 세포막 상태의 다소나마 악화된 종양 세포에 흡수되지만, 2-NBDLG는 이들 종양 세포에 흡수되는 것에 더하여, 발달한 종양 세포 덩어리 중에 있어서 세포막 상태가 전혀 악화되어 있지 않은 세포에도 흡수된다. 2-NBDLG가 이들 종양 세포 내로도 흡수되는 것은, 실시예 4에 의해서도 명백하다. 한편으로, 2-TRLG는, 세포에 일단 흡수되면 2-NBDLG보다 배출되기 어려운 성질을 가진다. 따라서, 예를 들면, 녹색의 형광을 발하는 2-NBDLG와 적색의 형광을 발하는 2-TRLG를 일정(5:1)한 비율로 혼합한 용액을 작성하고, 적절한(488㎚) 여기(勵起)광으로 조사함으로써 양자의 형광 강도가 대략 1:1에 가까워지도록 녹색과 적색의 두 개의 검출기의 검출 감도를 조정한 후에, 본 용액을 세포에 흡수시켜, 이미징을 행하면, 양자를 흡수한 세포는, 2-NBDLG에서 유래하는 녹색의 형광과 2-TRLG에서 유래하는 적색의 형광을 겹침으로써 황색의 형광으로 가시화된다. 그 후, 2-NBDLG가 배출되면, 더욱 배출되기 어려운 2-TRLG가 세포 내에 남아, 세포는 적색의 형광으로 가시화된다. 따라서, 시간의 경과에 수반하는 세포의 황색으로부터 적색으로의 형광 색조의 변화가 확인된 경우, 그 세포는, 일단 2-NBDLG와 2-TRLG를 흡수한 후에 2-NBDLG를 배출한 것을 알 수 있다. 또한, 본 발명자들의 이전의 연구 성과에 관한 WO2010/016587 공보에 의하면, 2-TRLG는 이하에 나타내는 2종류의 이성체(오르토체(體)와 파라체(體))로 존재한다.

이와 같이, 발달한 종양 세포 덩어리를 구성하는 종양 세포에는, 2-NBDLG 및/또는 2-TRLG를 흡수하지만, 하기의 실시예에서 나타내어지는 바와 같이, 동일 종의 종양 세포 덩어리 중에 있어서 2-TRLG를 흡수하지 않고, 2-NBDLG를 흡수하는 종양 세포가 존재하며, 그 세포에 있어서의 2-NBDLG의 흡수는 특정한 수송 경로를 저해하는 물질로 저해된다. 즉, 그들 종양 세포의 2-NBDLG의 흡수는, WO2010/016587 공보에서 나타내어져 있는 바와 같은 세포막 상태의 악화에 의한 2-TRLG의 비특이적인 흡수와는 달리, 특이적 기구(여기서 말하는 특이적은, 서로 거울상 이성체의 관계에 있는 표지된 글루코오스 유도체, 구체적으로는 2-NBDLG와 2-NBDG가 모두 통과 가능한 막 단백을 개재한 기구이고, propidium iodide와 같은 막 불투과성 마커의 통과로 대표되는 바와 같은 세포막의 지방질 2중층 구조의 파탄에 의한 통과를 제외한 흡수라는 의미이다)를 통한 종양 세포 내에의 흡수이다. 따라서, 본 발명의 형광 표지된 L-글루코오스 유도체인 2-NBDLG의 세포 내에의 흡수를 검출함으로써 발달한 종양 세포 덩어리를 구성하는 종양 세포를 검출할 수 있고, 즉 암세포의 검출이 가능해진다.

2-TRLG는, 세포막 상태가 악화된 세포에 흡수된다. 즉, 상기의 발달한 종양 세포 덩어리 중에 있어서 세포막 상태가 다소나마 악화된 종양 세포뿐만 아니라, 염증이나 물리적 영향에 의해 손상된 세포(정상 세포를 포함한다)에도 흡수된다. 따라서, 본 발명의 형광 표지된 L-글루코오스 유도체에 더하여, 예를 들면 2-TRLG를 이용함으로써, 표적 세포 내에서의 본 발명의 형광 표지된 L-글루코오스 유도체의 검출이, 표적 세포의 세포막 손상의 영향인지의 여부의 판단을 할 수 있고, 이것에 의해 암세포를 양호한 정밀도로 검출할 수 있다.

본 발명의 형광 표지된 L-글루코오스 유도체는, 또한 방사성 표지할 수도 있다. 구체예로서는, 6-[¹⁸F]-2-NBDLG나 4-[¹⁸F]-2-NBDLG를 들 수 있다. 형광 표지에 더하여 방사성 표지된 L-글루코오스 유도체를 이용함으로써, 본 발명의 이미징제를 생체에 투여한 후에, PET 등을 이용한 전신 이미징에 의해 암세포의 존재 부위를 확인한 후에, 형광을 검출함으로써 암세포를 세포 레벨에서 검출할 수 있다.

본 발명의 형광 표지된 L-글루코오스 유도체는, 또한, 형광 표지된 D-글루코오스 유도체와 함께 이용할 수도 있다. 종양 세포는 정상 세포보다 D-글루코오스를 세포 내에 많이 흡수하는 성질을 가진다(예를 들면, 비특허문헌 16). 따라서, 본 발명의 형광 표지된 L-글루코오스 유도체를 이용한 암세포 또는 그 우려가 있는 세포의 검출에 더하여, D-글루코오스의 흡수의 정도를 검출함으로써, 더욱 정밀도가 높은 판정이 가능해진다.

본 발명의 형광 표지된 L-글루코오스 유도체를 이용한 검출과 형광 표지된 D-글루코오스 유도체의 흡수를 이용한 판별을 조합하는 경우에 이용되는 형광 표지된 D-글루코오스 유도체는, 세포에 흡수되는 D-글루코오스 유도체이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 녹색 또는 청색의 형광 발색단을 분자 내에 가지는 D-글루코오스 유도체이며, 구체적으로는, 7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸기 및 그 유도체를 분자 내에 가지는 D-글루코오스 유도체이다. 이와 같은 D-글루코오스 유도체로서는, 바람직하게는, 2-[N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노]-2-디옥시-D-글루코오스(2-NBDG)를 들 수 있다.

이상의 설명으로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 형광 표지된 L-글루코오스 유도체는, 암세포를 검출하기 위해 유용함과 함께, 예를 들면 암세포를 가시화하기 위한 이미징제의 유효 성분으로서도 유용하다. 형광 표지된 L-글루코오스 유도체는, 이것을 용해하기 위한 용매(주사용 생리 식염수 등)에 용해되어 용액의 형태로 제공되어도 되고, 이것을 용해하기 위한 용매와 조합되어 사용 시에 용해하여 용액을 조제하기 위한 키트의 형태로 제공되어도 된다. 용액 중의 표지된 L-글루코오스 유도체의 농도는, 예를 들면 1nM∼100mM의 범위에서 조정하면 된다. 또한, 암세포의 검출을 위해 본 발명의 표지된 L-글루코오스 유도체를 이용하는 방법에 자체 공지의 방법을 조합하여 이용하여, 판정 정밀도의 향상을 한층 더 도모해도 된다.

실시예

이하에, 본 발명을 실시예에 의해서 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하의 기재에 한정하여 해석되는 것이 아니다.

실시예 1:화합물의 합성

(1) 형광 표지 L-글루코오스 유도체의 합성

(1-1) 2-NBDLG의 합성

2-NBDLG는 이하와 같이 하여 L-글루코오스로부터 합성했다.

3,4,6- Tri -O- acetyl -L- glucal

L-글루코오스(20g)를 피리딘(262ml)에 용해하고, 0℃로 냉각했다. 무수 아세트산(171ml)을 적하하고, 실온에서 밤새 교반했다. 감압 농축 후에 톨루엔으로 공비(共沸)하는 조작을 3회 반복했다. 잔사(殘渣)에 아세트산 에틸을 첨가하여, 포화 중조수와 포화 식염수로 세정하고, 유기층을 황산 나트륨으로 건조했다. 황산 나트륨을 여과 제거하고, 감압 농축에 의해 유기 용매를 제거했다. 얻어진 잔사를 아르곤 분위기 하, 탈수 디클로로메탄(115ml)에 용해하고, 0℃로 냉각했다. 30% 브롬화 수소 아세트산 용액(61ml)을 적하했다. 적하 종료 후, 실온으로 승온하여, 3시간 교반했다. 3시간 후, 감압 농축에 의해 유기 용매를 제거했다. 잔사에 클로로포름(800ml)을 첨가하여, 포화 중조수와 포화 식염수로 세정했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조했다. 황산 나트륨을 여과 제거했다. 감압 농축에 의해 유기 용매를 제거했다. 얻어진 오일상 화합물에 아세트산(72ml)과 물(72ml)을 첨가하여, 0℃로 냉각했다. 아연(71g)을 조금씩 첨가하고, 헥사클로로 백금(Ⅳ)산(135㎎)을 첨가했다. 아세트산(72ml)과 물(72ml)을 더 첨가했다. 1.5시간 후, 클로로포름을 첨가하고, 셀라이트(celite) 여과했다. 여액에 포화 중조수를 첨가하여, 유기층을 포화 중조수와 포화 식염수로 세정했다. 유기층을 황산 마그네슘으로 건조했다. 황산 마그네슘을 여과 제거하고, 감압 농축에 의해 유기 용매를 제거했다. 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제했다. 목적한 획분(劃分)을 모아서, 감압 농축에 의해 오일상 화합물을 얻었다.

수량:21.0g

수율:70%(3공정)

1,3,4,6- Tetra -O- acetyl -2- deoxy -2-(2',2',2'- trichloroethoxysulfonylamino)-L- glucopyranose

3,4,6-Tri-O-acetyl-L-glucal(20g)과 2,2,2-Trichloroethoxysulfonylamine (18.5g)과 산화 마그네슘(6.8g)에 대해 아르곤 분위기 하, 클로로벤젠(73ml)을 첨가하고, 아세트산 로듐(650㎎)을 더 첨가했다. -20℃로 냉각하고, 아이오도벤젠디아세테이트(30.8g)를 첨가했다. 2시간에 걸쳐 실온으로 되돌려서, 밤새 교반했다. 클로로포름으로 희석하고, 셀라이트로 여과했다. 여액을 감압 농축하여 얻어진 갈색 오일상 화합물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제했다. 목적한 획분을 모아서, 백색 고체를 얻었다.

수량:26.0g

수율:63%

1,3,4,6- Tetra -O- acetyl -2- acetamido -2- deoxy -L- glucopyranose

1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-2-deoxy-2-(2',2',2'-trichloroethoxysulfonylamino)-L-glucopyranose(22.9g)를 아르곤 분위기 하, 아세트산(130ml)과 무수 아세트산(130ml)에 용해했다. 실온에서 아연 구리 커플(40g)을 첨가하고, 2시간 교반했다. 감압 농축하고, 얻어진 잔사에 클로로포름을 첨가하여, 포화 중조수와 포화 식염수로 세정했다. 유기층을 황산 마그네슘으로 건조하고, 황산 마그네슘을 여과 제거했다. 감압 농축에 의해 얻어진 잔사를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제했다. 목적한 획분을 모아서, 백색 고체를 얻었다.

수량:12.1g

수율:76%

L- glucosamine hydrochoride

1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-2-acetamido-2-deoxy-L-glucopyranose(3.5g)를 6M-HCL에 현탁시켜, 70℃로 가열했다. 6시간 후에 감압 농축하고, 잔사에 물을 첨가하여 공비했다. 잔사를 물로부터 동결 건조를 행하여, 백색 고체를 얻었다.

수량:1.95g

수율:100%

2-[N-(7- Nitrobenz -2- oxa -1,3- diazol -4- yl ) amino ]-2- deoxy -L-glucose(2- NBDLG )

갈색 플라스크에 NBD-F(227㎎)를 넣고, 메탄올(10ml)에 용해했다. 아르곤 분위기 하, L-glucosamine hydrochoride(100㎎)와 탄산수소나트륨(65.7㎎)을 물(2.0ml)에 용해한 것을 첨가하고, 37℃에서 교반했다. 2시간 후에 감압 농축에 의해 유기 용매를 제거하고, 발생한 침전(NBD-F 유래의 불필요물)을 물로 세정했다. 여액과 세정액을 합쳐서 HPLC로 정제했다. 목적한 획분을 모아서 동결 건조했다.

수량:125㎎

수율:79%

¹H-NMR(400㎒, 중수(重水), ppm):

δ8.52(d, 1H, J=9.1㎐, H6'), δ6.56 and δ6.54(d×2, 0.5H×2, J=9.1㎐ and J=9.1㎐, H5'), δ5.38(d, 0.5H, J=2.8㎐, H-1α), δ4.89(d, 0.5H, J=8.1㎐, H-1β), δ3.50-δ4.02(m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6).

ESI-MS:calcd for C₁₂H₁₅N₄O₈ [M+H]⁺ 343.1, found 343.1

(1-2) 2-DBDLG의 합성

2-DBDLG는, 비특허문헌 5에 기재된 방법에 따라 이하와 같이 하여 합성했다.

2- Deoxy -2-[N-7-( N' , N' - dimethylaminosulfonyl ) benz -2- oxa -1,3- diazol -4- yl ) amino ]-L-glucose(2- DBDLG )

갈색 플라스크에 DBD-F(100㎎)를 넣고, 메탄올(2.00ml) 및 THF(2.00ml)의 혼합 용매에 용해했다. 아르곤 분위기 하, L-GlcNH₂.HCl(49.8㎎)을 0.3 M-NaHCO₃수(1.08ml)에 용해한 것을 첨가하고, 다시 물(1.00ml)로 씻은 후에 실온에서 교반했다. 48시간 후에 감압 농축에 의해 유기 용매를 제거하고, 발생한 침전(DBD-F 유래의 불필요물)을 물로 세정했다. 여액과 세정액을 합쳐서 HPLC로 정제했다. 목적한 획분을 모아서 동결 건조했다.

수량:35.8㎎

수율:38%

¹H-NMR(400㎒, 중수, ppm):

δ7.82 and δ7.84(d×2, 0.5H×2, J=8.3㎐ and 8.3㎐, H-6' of DBD), δ6.42 and δ6.46(d×2, 0.5H×2, J=8.3㎐ and 8.3㎐, H-5' of DBD), δ5.31(br.d, 0.5H, J=2.7㎐, H-1α), δ4.79(br.d, 0.5H, J=8.3㎐, H-1β), δ3.43-δ3.90(m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6), δ2.65(s, 6H, Me₂NSO₂-).

ESI-MS:calcd for C₁₄H₂₁N₄O₈S [M+H]⁺ 405.1, found 405.1

형광 극대 파장:570㎚

(1-3) 2,6-Dideoxy-6-[F]fluoro-2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-L-glucose(6-F-2-NBDLG)의 합성

구조식을 이하에 나타낸다.

다른 본 발명의 형광 표지 L-글루코오스 유도체인, 6-F-2-NBDLG를 이하와 같이 하여 합성했다(합성 방법 1).

2- Benzyloxycarbonylamino -2- deoxy -L- glucopyranose

L-glucosamine hydrochoride(1.65g)를 물(25ml)과 아세톤(25ml)에 용해했다. Z-ONSu(2.1g), 아세톤(25ml), 트리에틸아민(2.8ml)을 순차 첨가하여 실온에서 교반했다. 4시간 후에 감압 농축에 의해 유기 용매 및 물을 제거했다. 발생한 침전(목적물)을 여과하여 취하고, 수세(水洗) 후에 감압 하에서 건조함으로써 백색 고체를 얻었다.

수량:1.75g

수율:73%

2- Benzyloxycarbonylamino -2- deoxy -6-O- triphenylmethyl -L- glucopyranose

2-benzyloxycarbonylamino-2-deoxy-L-glucopyranose(1.35g)를 아르곤 분위기 하, 피리딘(80ml)에 용해하고, 염화 트리틸(5.92g)을 첨가하여 70℃로 가온하고 교반했다. 2시간 후에 방랭하고, 감압 농축에 의해 유기 용매를 제거하여, 톨루엔 공비했다. 얻어진 잔사를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하고, 목적한 획분을 모아서, 감압 농축에 의해 백색 고체를 얻었다.

수량:2.2g

수율:92%

Benzyl 3,4- di -O- benzyl -2- benzyloxycarbonylamino -2- deoxy -6-O- triphenylmethyl -L- glucopyranoside

2-benzyloxycarbonylamino-2-deoxy-6-O-triphenylmethyl-L-glucopyranose(2.1g)를 아르곤 분위기 하, 디메틸포름아미드(36ml)에 용해하고, 브롬화 벤질(713μl)을 첨가하여 교반했다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각하고, 수소화나트륨(60%함량 433㎎)을 첨가하여 교반했다. 1시간 후에 수소화나트륨(60%함량 43㎎)을 추가했다. 2시간 후에 얼음을 첨가한 후에 아세트산 에틸로 추출하여, 포화 식염수로 세정했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조하고, 황산 나트륨을 여과 제거했다. 감압 농축에 의해 얻어진 잔사를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제했다. 목적한 획분을 모아서, 감압 농축에 의해 오일상 화합물을 얻었다.

수량:2.0g

수율:64%

Benzyl 3,4- di -O- benzyl -2- benzyloxycarbonylamino -2- deoxy -L- glucopyranoside

Benzyl 3,4-di-O-benzyl-2-benzyloxycarbonylamino-2-deoxy-6-O-triphenylmethyl-L-glucopyranoside(2.0g)를 메탄올(40ml)과 클로로포름(4ml)에 용해했다. 4.4 M-염화 수소-디옥산 용액(8ml)을 첨가하여 교반했다. 2시간 후에 감압 농축에 의해 얻어진 잔사를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제했다. 목적한 획분을 모아서 감압 농축에 의해 백색 고체를 얻었다.

수량:650㎎

수율:46%

Benzyl 3,4- di -O- benzyl -2- benzyloxycarbonylamino -2,6- dideoxy -6- fluoro -L- glucopyranoside

Benzyl 3,4-di-O-benzyl-2-benzyloxycarbonylamino-2-deoxy-L-glucopyranoside(95㎎)를 아르곤 분위기 하, 디클로로메탄(1.6ml)에 용해하여 교반하고, -20℃로 냉각했다. 3불화 N,N-디에틸아미노 황산(107μl)을 첨가하여 교반하고, 실온으로 승온했다. 2시간 후에 메탄올을 첨가하고, 포화 중조수와 아세트산 에틸로 추출했다. 유기층을 합쳐서 포화 중조수와 포화 식염수로 세정했다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조하고, 황산 나트륨을 여과 제거했다. 감압 농축에 의해 얻어진 잔사를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제했다. 목적한 획분을 모아서, 감압 농축에 의해 백색 고체를 얻었다.

수량:63㎎

수율:66%

2- Amino -2,6- dideoxy -6- fluoro -L- glucopyranose hydrochloride

Benzyl 3,4-di-O-benzyl-2-benzyloxycarbonylamino-2,6-dideoxy-6-fluoro-L-glucopyranoside(62㎎)를 클로로포름/메탄올/1M-HCl=3/6/1(5ml)에 용해하고, 교반했다. 팔라듐-블랙(40㎎)을 첨가하여 교반하고, 수소로 치환했다. 8일 후 팔라듐-블랙을 여과 제거하고, 감압 농축에 의해 오일상 화합물을 얻었다.

수량:23.1㎎

수율:100%

2,6- Dideoxy -6- fluoro -2-[N-(7- nitrobenz -2- oxa -1,3- diazol -4- yl ) amino ]-L-glucopyranose(6-F-2- NBDLG )

2-Amino-2,6-dideoxy-6-fluoro-L-glucopyranose hydrochloride(23.1㎎)를 디메틸포름아미드/물=10/1(2ml)에 용해하고, 교반했다. NBD-F(23.2㎎)를 첨가하고, 트리에틸아민(32.4μl)을 더 첨가하여 37℃로 가온했다. 2시간 후에 아세트산을 넣어 중화하고, 물을 넣어 멤브레인 필터를 통과했다. 여액과 세정액을 합쳐서 HPLC로 정제했다. 목적한 획분을 모아서 동결 건조하여, 적색 고체를 얻었다.

수량:11.5㎎

수율:32%

¹H-NMR(400㎒, 중수, ppm):

δ8.43(d, 1H, J=8.9㎐, H6'), δ6.49 and δ6.45(d×2, 0.5H×2, J=9.2㎐ and J=9.2㎐, H5'), δ5.33(d, 0.5H, J=2.3㎐, H-1α), δ4.89(d, 0.5H, J=7.8㎐, H-1β), δ4.48-δ4.63(m, 1H, H-2), δ3.90-δ4.00(m, 1H, H-3), δ3.52-δ3.71(m, 3H, H-4, H-5, H-6).

ESI-MS:calcd for C₁₂H₁₄FN₄O₇ [M+H]⁺ 345.1, found 345.0

여기 극대 파장:472㎚

형광 극대 파장:538㎚

6-F-2-NBDLG는 또 이하와 같이 해도 합성할 수 있다(합성 방법 2).

여기서 KF 대신에, K¹⁸F를 이용하여, 다른 본 발명의 형광 및 방사성 표지 L-글루코오스 유도체인, 6-¹⁸F-2-NBDLG를 합성할 수 있다.

참고예 1:비교 화합물의 합성

(1) 형광 표지 D-글루코오스 유도체의 합성

(1-1) 2-NBDG의 합성

2-NBDG는 비특허문헌 5에 기재된 방법에 따라 합성했다.

(1-2) 형광 표지 L-만노스의 합성

본 발명에서는 형광기를 결합하는 당의 골격으로서, 자연계에 다량으로 존재하는 천연형의 6탄당인 D-글루코오스의 거울상 이성체이고, 자연계에 보이지 않는 비천연형인 L-글루코오스를 이용하고 있다. 한편, 동일하게 자연계에 다량으로 존재하는 6탄당인 D-만노스 거울상 이성체이고, 비천연형인 L-만노스를 골격으로 하는 형광 표지 L-만노스 유도체로서, 발명자들은, 2-Deoxy-2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-L-mannose(2-NBDLM)를 신규로 합성했다.

Benzyl 4,6-O- benzylidene -α-L- glucopyranoside

L-글루코오스(6g)를 벤질알코올(173ml)에 서스펜드했다. 실온 하, 클로로트리메틸실란(42.3ml)을 적하하고, 60℃에서 교반했다. 5시간 후, 반응 용액에 에테르, 물을 첨가하여 추출했다. 얻어진 수층(水層)을 에테르로 세정하고, 수층을 동결 건조했다. 얻어진 고체를 디메틸포름아미드(150ml)에 용해했다. 아르곤 분위기 하, p-톨루엔술폰산 일수화물(633㎎), 벤즈알데히드 디메틸아세탈(7.5ml)을 순차 첨가하여 70℃에서 교반했다. 3시간 교반 후, 벤즈알데히드 디메틸아세탈(2.5ml)을 추가했다. 6시간 더 교반 후, 실온으로 되돌려서 밤새 교반했다. 밤새 교반 후, 반응 용액에 아세트산 에틸과 포화 중조수를 첨가하여, 추출했다. 얻어진 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수황산 마그네슘으로 건조하고, 여과 제거한 후에 감압 농축했다. 얻어진 고체를 에탄올로부터 재결정했다.

수량:2.50g

수율:21%(2공정)

Benzyl 2- azido -2- deoxy -4,6-O- benzylidene -α-L- mannopyranoside

피리딘(449μl)을 디클로로메탄(150ml)에 용해했다. 아르곤 분위기 하, -30℃에서 트리플루오로메탄술폰산 무수물(257μl)을 적하했다. 10분 후, Benzyl 4,6-O-benzylidene-α-L-glucopyranoside(500㎎)를 첨가하고, -30℃에서 교반했다. 2시간 후, 반응 용액에 클로로포름, 포화 식염수를 첨가하여, 추출했다. 얻어진 유기층을 무수황산 나트륨으로 건조하고, 여과 제거 후에 감압 농축했다. 얻어진 오일상 화합물을 디메틸포름아미드(10ml)에 용해하고, 아르곤 분위기 하, 아자이드화 나트륨(272㎎)을 첨가하여 50℃에서 교반했다. 3시간 후, 아자이드화 나트륨(635㎎)을 추가하여, 실온 교반했다. 다시 46시간 후, 아자이드화 나트륨(906㎎)을 추가하여, 실온 교반했다. 20시간 후, 반응 용액에 에테르, 물을 첨가하여 추출했다. 얻어진 유기층을 물로 세정 후, 무수황산 마그네슘으로 건조하고, 여과 제거 후에 감압 농축했다. 얻어진 잔사를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하고, 목적물을 얻었다.

수량:172㎎

수율:32%

2- Deoxy -2-[N-(7- nitrobenz -2- oxa -1,3- diazol -4- yl ) amino ]-L-mannose(2- NBDLM )

Benzyl 2-azido-2-deoxy-4,6-O-benzylidene-α-L-mannopyranoside(172㎎)를 메탄올(5ml), 2M-HCl수(449μl)에 용해했다. 아르곤 분위기 하, 10% Pd(OH)₂/C(43㎎)를 첨가하고, 수소를 첨가하여, 교반했다. 20시간 후, 10% Pd(OH)₂/C를 여과 제거하고, 감압 농축했다. 얻어진 오일상 화합물을 물로 용해 후, 에테르로 세정하고, 수층을 감압 농축했다. 얻어진 오일상 화합물을 디메틸포름아미드(2ml), 물(387μl)에 용해했다. 실온 하, NBD-F(82㎎), 트리에틸아민(124μl)을 차례로 첨가하여 교반했다. 1.5시간 후, 아세트산(80μl)으로 퀀치(quench)하고, HPLC로 정제했다. 목적한 획분을 모아서 동결 건조했다.

수량:37㎎

수율:24%

¹H-NMR(400㎒, 중수, ppm):

δ8.44(d, 1H, J=9.1㎐, H6'), δ6.55 and δ6.51(d×2, 0.5H×2, J=9.1㎐ and J=9.1㎐, H5'), δ5.24 and δ5.09(0.5H×2, H-1), δ3.35-δ4.14(m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6).

ESI-MS:calcd for C₁₂H₁₅N₄O₈ [M+H]⁺ 343.1, found 343.0

여기 극대 파장:472㎚

형광 극대 파장:539㎚

실시예 2:종양 세포(C6 글리오마)를 이식한 마우스를 이용한 검토

(실험 방법)

(1) 이식용 래트(rat) 글리오마 세포(C6)의 조제

통상의 방법에 따라 세포수가 2×10⁷cells/mL이 되도록 C6 세포를 조제했다.

(1-1) C6 세포의 배양

C6 세포는 10㎝ 샬레에 뿌려, CO₂ 인큐베이터 중에 정치(靜置)하고, 37℃에서 배양했다. 2일에 1회 배양액의 교환을 행하였다.

(1-2) C6 세포의 배양에 이용한 배양액의 조성

1g/L 글루코오스 함유 Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM)(Nacalai No. 08456-65)에, Fetal Bovine Serum(Equitech-Bio SFBM)을 최종 농도 10%가 되도록, 또 페니실린-스트렙토마이신(Nacalai No. 26253-84)을 최종 농도 1%가 되도록 첨가한 것을 이용했다.

(2) 종양 모델 마우스의 제조

5∼6주 연령의 흉선 결손 누드 마우스(BALB/cAJcl-nu/nu)에 이소플루란 마취 하에 있어서, 2×10⁷cells/mL로 조제한 세포 현탁액 50μL를 우측 뒷다리 서혜부 부근의 피하에 이식했다. 이식한 종양 세포가 대략 200∼300㎣ 정도로 성장할 때까지 관찰하고, 생체 형광 이미징의 촬상에 사용했다.

(3) C6 종양 모델 마우스를 이용한 생체 형광 이미징

C6 종양 모델 마우스를 이소플루란 마취 하에서, 생체 형광 이미징 장치 IVIS(등록 상표) Kinetics(Caliper Life sciences)에 정치하여 마우스 피부의 자가 형광을 측정하고, 그 직후에, 생리적 식염수에 녹인 2-NBDLG 또는 2-NBDG 400nmol(100μL)을 미정맥(尾靜脈)으로부터 30초에 걸쳐 투여하고, 투여 개시 1분 후로부터 재차 형광 이미징의 측정을 개시했다. 생체 형광 이미징은, 여기 파장 465㎚, GFP 필터(투과 형광 파장 515-575㎚)를 이용하여 측정을 행하였다. 측정은 45분간 행하고, 최초의 20분간은 1분마다, 20∼45분까지는 5분마다 촬상을 행하여, 총계 25장의 화상을 얻었다. 2-NBDLG 또는 2-NBDG를 투여한 후에 촬상한 25장의 화상으로부터 각각의 자가 형광의 화상을 빼는 것에 의해서, 관심 영역에 있어서의 2-NBDLG 및 2-NBDG의 집적값(형광값)을 구했다.

(3-1) 2-NBDLG 및 2-NBDG 용액의 조제

실험 직전에, 0.5㎎ 2-NBDLG 또는 2-NBDG의 바이알(vial)을 생리적 식염수 400μL에 용해함으로써, 최종 농도 400nmol/100μL의 용액을 조제했다.

(실험 결과)

도 1은, 우측 뒷다리 서혜부에 종양 세포(C6 글리오마)를 이식한 누드 마우스에, 2-NBDLG를 투여 후, 1분 간격으로 취득한 형광 화상이다. 숫자는 투여 후의 시간을 나타낸다. 2-NBDLG는, 화살표로 나타낸 부분에서 400nmol/100μL의 농도로, 미정맥에서 30초간에 걸쳐 투여했다. 2-NBDG(도 2)를 투여한 경우와 비교하여, 2-NBDLG는 종양 이식부에 강한 집적을 인지하고, 정상 조직에는 거의 흡수되어 있지 않기 때문에, 단시간에 우수한 콘트라스트가 얻어진다. 여기서는, 절식시키고 있지 않은 마우스를 사용하고 있다. 도 2는, 2-NBDLG 투여와 동일 조건에서, 2-NBDG를 투여 후 1분 간격으로 취득한 형광 화상이다. 2-NBDG(황색으로 표시)의 강한 집적이 등이나 등뼈의 사이의 지방 조직, 근육 등에 인지되어, 종양 이식부와의 콘트라스트에 어려움이 있는 상태를 알 수 있다.

또, 관심 영역으로서 설정한 우측 뒷다리 서혜부 부근의 종양 세포의 이식 부분(Tumor+Glc)과 목 근처의 등측의 지방 세포가 풍부한 부분(BG+Glc)에 있어서의 2-NBDLG와 2-NBDG의 각각의 집적값의 경시적 변화를 도 3에 나타낸다. 도 2로부터 명백한 바와 같이, 2-NBDG를 투여한 경우, 투여 후 즉시 목 근처의 등측의 지방 세포가 풍부한 부분 등에 집적이 인지되었다. 투여로부터 5분 후 이후 경부터는 종양 세포를 이식한 부분으로의 집적이 인지되었지만, 목 근처의 등측의 지방 세포가 풍부한 부분과의 사이의 콘트라스트는 충분하지 않았다. 이에 대해, 2-NBDLG를 투여한 경우, 도 1로부터 명백한 바와 같이, 투여로부터 5분 후 이후 경부터는 종양 세포를 이식한 부분으로의 특이적인 집적이 인지되어, 목 근처의 등측의 지방 세포가 풍부한 부분과의 사이에서 높은 콘트라스트가 얻어졌다. 이 결과는 도 3에 나타내는 결과로부터도 지지되었다. 즉, 2-NBDG 투여예에서는 정상 조직(적색 사각, BG)에 있어서의 형광값이 종양 이식부(청색 마름모형, Tumor)보다 큰 것에 대해, 2-NBDLG 투여예에서는 종양 이식부(청색 마름모형, Tumor) 쪽이 정상 조직(BG)보다 일관하게 밝은 것을 알 수 있다. 전체 6예에서 동일한 결과가 얻어졌다. 이상의 결과로부터, 종양 세포인지의 여부의 판정을 행할 때에 있어서의 2-NBDLG의 유효성이 명백해졌다.

실시예 3:마우스 인슐린노마 세포(MIN6)로 이루어지는 종양 세포 덩어리의 2-NBDLG를 이용한 이미징

(실험 방법)

(1) 마우스 인슐린노마 세포(MIN6)의 조제

MIN6 세포를 10×10⁴cells/mL의 비율로 현탁시킨 배양액을, 피펫팅(pipetting)에 의해 분산하여, 유리 커버 슬립 상에 적하한 후, 5%CO₂ 인큐베이터 중에서 20분간 정치함으로써 유리면에 부착시키고, 배양액을 3mL 첨가하여 배양했다. 배양액은 2일에 1회 절반량을 교환했다.

(1-1) MIN6 세포의 배양

MIN6 세포(오사카 대학의 미야자키 준이치 교수로부터 공여를 받아 6-9회 계대(繼代)한 세포)를 10㎝ 샬레에 뿌려, CO₂ 인큐베이터 중에 정치하고, 37℃에서 배양했다. 배양액은 2일에 1회 절반량을 교환했다.

(1-2) MIN6 세포의 배양에 이용한 배양액의 조성

고(高)글루코오스 함유 Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM-HG)(SIGMA #D5648) 13.4g, NaHCO₃(Wako, No. 191-01305) 3.4g, 2-Mercaptoethanol(Wako, No. 135-14352) 5μL를 1L의 초순수(Mili Q)에 용해하여, 외기(外氣)와 평형화시켰다. 다음으로 1N의 HCl을 이용하여, 37℃의 CO₂ 인큐베이터 중에서 pH 7.3-7.35가 되도록 pH를 조정하고, 흡인 여과에 의해 멸균했다. 사용 직전에 Hyclone Fetal Bovine Serum(Cat# SH30070.03)을 최종 농도 10%가 되도록, 또 페니실린-스트렙토마이신(Gibco #15140)을 최종 농도 0.5%가 되도록 첨가했다.

(1-3) MIN6 세포를 10×10⁴cells/mL의 비율로 현탁시킨 배양액

MIN6 세포를, 세포수가 10×10⁴cells/mL가 되도록 배양액을 이용하여 조정했다.

(2) 2-NBDLG 용액의 조제

0.5㎎ 2-NBDLG 바이알 1개 전량을 화상 취득용 HEPES 용액 14.6mL에 용해함으로써, 최종 농도 100μM의 2-NBDLG 용액으로 했다.

(2-1) 화상 취득용 HEPES 용액

NaCl 131.8mM, KCl 4.75mM, KH₂PO₄ 1.19mM MgCl₂ 1.2mM, CaCl₂ 1mM, NaHCO₃ 5.0mM, 2.8mM D-Glucose, HEPES 10mM(1M NaOH로 pH 7.35로 조정). 또한 gap junction/hemichannel을 경유하는 형광 표지 글루코오스의 출입을 저해할 목적으로 0.1mM Carbenoxolone(SIGMA #C4790)을 첨가했다. 또한 본 화상 취득용 HEPES 용액은, 2-NBDLG 용액을 작성하기 위한 용액으로서, 또 2-NBDLG/2-TRLG 용액을 작성하기 위한 용액으로서 사용했다.

(3) MIN6 세포에의 DAPI 용액의 투여

MIN6 세포를 부착시켜 10-13일간 배양한 유리 커버 슬립을, 35㎜ 디시에 채운 D-글루코오스 5.6mM을 함유하는 DAPI 용액 중에 옮겨, 37℃로 가온하면서 45분에서 1시간 정치하고 세포에 DAPI를 흡수시켰다. 다른 실험에서, 공초점 현미경 상에서 계시(繼時)적으로 관찰하면서 DAPI를 투여하는 실험을 행하고, 실험 시간 내에 DAPI 투여 및 405㎚의 레이저광 조사에 의한 세포의 형태 변화는 인지되지 않는 것을 확인했다.

(3-1) DAPI 용액의 조제

4',6-Diamidino-2-phenylindole DAPI(No. 049-18801, Wako Pure Chemical Industries, Osaka)를 100㎎/mL의 비율로 DMSO를 10% 함유하는 수용액에 녹인 것을 냉장 보존해 두고, 사용 시는 DAPI 조정용으로서 5.6mM의 D-Glucose를 함유하는 HEPES 용액으로 100배로 희석하여 이용했다.

(4) MIN6 세포를 배양한 유리 커버 슬립의 형광 계측용 관류 챔버 내로의 금속 가이드를 이용한 고정법

레이저 스캔 공초점 현미경(라이카사 TCS SP5) 상의 유니버셜 스테이지(Leica 11600234) 상에 세트된 관류 챔버 내의 화상 취득용 HEPES 용액 중에, MIN6 세포를 배양한 유리 커버 슬립을 옮겨, 챔버 바닥부의 유리면 상에 가볍게 밀착시켰다. 정치 후, 커버 슬립의 양측을 좌우로부터 커버 슬립의 장축에 평행으로 2장의 직사각형의 금속 가이드(길이 10㎜, 폭 2㎜, 두께 0.7㎜, 은 제품)를 이용하여 누르고, 신중하게 꽉 누름으로써, 흐름 중에서도 커버 슬립이 움직이지 않도록 했다. 또 이 2장의 금속 가이드에 끼워진 공간 내에서는, 관류액이 층류가 되어 원활하게 흘러서, 신속한 액 교환이 가능해진다는 우수한 효과가 있다.

(4-1) 레이저 스캔 공초점 현미경 스테이지 상의 형광 측정용 관류 챔버

바닥부에 대물 렌즈용의 원구멍(직경 18㎜)이 열린 알루미늄제 가온 제어 플랫폼(PH1, Warner Instruments, USA, 온도 제어 장치 TC-324에 의해 37℃로 가온, Warner Instruments) 상에, 실리콘 그리스(HIVAC-G, Shin-Etsu Silicone, Tokyo)를 이용하여, 커버 유리(폭 24㎜×길이 50㎜, 두께 No. 1, Warner Instruments No. CS-24/50)를 플랫폼 중앙의 원구멍 이외의 부분에 밀착시켰다. 이어서 커버 유리 상에, 중앙에 유선형으로 천공 가공(유리 바닥면에 접하는 측은 폭 10㎜×길이 35㎜, 곡률 반경 33㎜, 유리면에 접하지 않는 측, 즉 상방이 조금 넓어지도록 가공한)을 실시한 두께 1㎜의 실리콘판(폭 20㎜×길이 50㎜)을 얹고, 실리콘 그리스를 이용하지 않고 커버 유리와 밀착시켰다.

실리콘 판 상의 유선형 구멍의 상류 모퉁이에, 선단(先端)을 평평하게 한 굵기 20게이지의 카텔란 바늘(Cattelan needle)을 세트하여, 인렛(inlet)으로서 이용했다.

관류액의 배출용 스테인리스관(아웃렛(outlet))은, 비특허문헌 16에 기재된 방법에 준하여 선단부를 평평하게 찌그러트린 후에 비스듬히 자른 것을 이용하고(가공이 어려우면, Warner사의 RC-24N 등의 플라스틱제 관류 챔버에 부속되는 스테인리스 아웃렛을 직선으로 편 것을 유용해도 된다), 진공 흡인 시, 공기와 용액의 양자를 동시에 흡인함으로써 안정시키는 방식으로 했다.

(5) 관류 챔버에의 관류액 공급 시스템

(a) 관류액의 가온과 관류 챔버에의 공급

관류액 공급 시스템은, 컨트롤 용액용의 60mL 주사통 1개와, 약제 공급용의 10mL 주사통 5개를 구비하고, 전자 밸브에서 수시 전환하여 관류할 수 있다. 본 발명에 관련된 실험에서는, 60mL 주사통을 이용하여 2.8mM 글루코오스 함유 화상 취득용 HEPES 용액을, 5계통 있는 10mL 주사통 중 1개를 이용하여 2-NBDLG와 2-TRLG의 혼합 용액을 투여했다. 이하에 기술한 바와 같이, 양자는 관류 챔버 내에서 거품을 생기게 하지 않도록, 미리 가온된 후, 관류 챔버에 유도되기 전에 1개의 튜브로 합동(合同)하고, 유량 조절기에 의해 속도 조절되고 나서, 재차 인라인 히터로 가온하여 공초점 현미경 상의 관류 챔버에 공급되었다.

화상 취득용 HEPES 용액은, 알루미늄제 시린지 히터(Model SW-61, 온도 제어 유닛은 No. TC-324B, Warner Instruments) 중에서 따뜻하게 한 60mL 주사통으로부터, 용액 공급 라인의 튜브 내를 플래시하기 위한 3방 밸브에 접속되고, 계속해서 가늘고 가스 투과성도 낮은 소프트 튜브(Pharmed 튜브, AY242409, Saint-Gobain Performance Plastics, Ohio)를 통해 초소형 전자 밸브(EXAK-3, 3 way clean valve, Takasago Electric, Nagoya)의 normally open측에 접속했다. 전자 밸브의 개폐는 펄스 발생 장치(Master 8, AMPI사, Israel)로 제어했다. 화상 취득용 HEPES 용액에 대해서는 페리스탈틱 펌프(MCP 펌프 12 rollers, Ismatec)를 이용하여 미디움 병(medium bottle)으로부터 60mL 주사통 내에 지속적으로 공급하고, 실험 중에 주사통 내의 용액 상면의 높이가 변화하지 않도록, 용액 낙하 속도와 같아지도록 펌프의 용액 공급 스피드를 정밀하게 조정했다. 페리스탈틱 펌프의 용액 공급 속도는 디지털 표시되기 때문에, 만약 관류 챔버에의 용액 공급 속도에 실험 중에 변화가 있으면 용액면의 높이가 바뀜으로써 즉시 알 수 있다. 이와 같이 본 용액은 상시 갱신되기 때문에, 액온 유지를 위해 시린지 히터(syringe heater) SW-61은 38.5℃로 설정했다.

한편, 2-NBDLG와 2-TRLG 혼합 용액은, 시린지 히터(Model SW-6, 온도 제어 유닛은 No. TC-324, Warner Instruments)에 세트되어 37.5℃로 가온된 10mL 주사통으로부터 공급했다. 본 주사통은 3방 밸브를 통해, 화상 취득용 HEPES 용액과는 별개인 전자 밸브의 normally closed측에 접속되어 있어, 펄스 발생 장치의 제어에 의해 컨트롤 용액과 수시 전환하여 공급할 수 있다. 시린지 히터 SW-6에는 6개의 10mL 주사통을 세트할 수 있고, 1개에는 증류수를 넣어 가온 블록의 온도 모니터용 프로브(probe)를 삽입했다.

컨트롤 용액인 화상 취득용 HEPES 용액과, 2-NBDLG와 2-TRLG의 혼합 용액은, 전자 밸브의 아웃렛을 나온 후, 6포트의 소형 매니폴드(MPP-6, Warner Instruments)에 의해 1개로 모아졌다. MPP-6 매니폴드의 아웃렛은 짧은 Pharmed 튜브에 접속하고, 이 튜브를 스크루에 의해 개도(開度)를 증감할 수 있는 유량 조절기에 끼워 넣어, 개도의 조정에 의해 유량을 1.2±0.2mL/분으로 조정했다. 본 Pharmed 튜브는, 최단 거리에서 인라인 히터(Multi-Line In-Line Solution Heater SHM-8, 온도 제어 유닛은 TC-324B, Warner Instruments)에 접속했다. 이것은 관류 챔버에 도입하는 용액 온도를, 도입 직전에 가온하기 위해서이다. SHM-8 인라인 히터의 온도는 관류 속도에 맞추어, 챔버 중에서의 관류액의 실측 온도가, 커버 슬립이 존재하는 영역에서 36-37℃가 되도록 조정했다. 가온된 용액은 짧은 타이곤 튜브(Tygon tube)(R-3603, inner diameter 1/32 inch)를 통해 최단 거리로 관류 챔버 상류에 배치된 스테인리스 파이프(인렛)에 접속하여, 관류 챔버 내에 공급했다.

주사통으로부터의 용액 공급은 정수압을 이용하여 공급 압력을 정하기 때문에, 높이의 차이가 관류 속도의 차이가 되어 챔버 내의 수면 높이의 변화를 가져오지 않도록, 2-NBDLG 용액에 대해서는 투여 시간이 짧기 때문에 1회의 실험에서는 실험 중에 액 공급은 행하지 않고, 각 실험이 종료될 때마다 액의 상면이 형광 글루코오스를 함유하지 않는 HEPES 용액과 대략 동일한 높이가 되도록 용액을 추가했다. 또 주사통에 접속된 튜브의 길이와 굵기의 조정에 의해, 컨트롤 용액인 화상 취득용 HEPES 용액의 관류 속도와 동일한 속도로 배출되도록 신중하게 조정함으로써, 액 교환에 의한 액면의 변동을 피할 수 있다. 또 실험 종료 후 및 개시 전에는 튜브 내부를 충분히 플래시하여 원활한 흐름을 확보했다.

(b) 관류 챔버 내의 층류의 확보 및 관류액의 제거

관류 챔버 상으로부터의 관류액의 순조롭고 신속한 제거는 재현성이 높은 결과를 얻음에 있어서 가장 중요한 포인트이다. 관류액의 배출용의 스테인리스관(아웃렛)을 타이곤 튜브로 두 개의 대형 유리 트랩에 순차 유도하여, 진공 펌프(DAP-15, ULVAC KIKO, Inc)로 완만하게 흡인했다. 흡인압(壓)은 두 개의 대형 유리 트랩의 중간에서 흡인 라인으로부터 갈라져 나오게 한 라인에 설치한 압력계로 모니터하여, 3방 밸브의 개폐도의 제어에 의해 35㎪이 되도록 조정했다.

관류 챔버 내의 층류의 확보는, 먼저 청색 색소(Pontamine sky blue, 1% 이하의 농도로 희석하여 이용한다) 용액을 인렛 부근에 적하하여, 흐름의 좌우 대칭성, 균일성과 재현성을 확보했다.

챔버 내 관류 용액 중의 각 부의 온도의 확인은 극세 서미스터 프로브(Physitemp사 IT-23)를 이용했다(비특허문헌 16). 또 아웃렛 선단부에는 실험 중에 HEPES 용액 유래의 염이 부착됨으로써 흡인압이 변화하는 것을 막기 위해, 챔버 상에 설치된 오퍼레이션 현미경(POM-50II, KONAN MEDICAL, 니시노미야)으로 실험마다 확인하여, 클리닝을 행하였다. 본 현미경은, 그 밖의 챔버에의 커버 슬립의 설치 시나, 흐름의 상황, 챔버의 이상의 확인 등에 유용하다.

(6) 화상 취득 조건

레이저 스캔 공초점 현미경(Leica 제 TCS-SP5 시스템, 현미경 본체는 DMI6000 CS trino 전동 도립 현미경)을 컨벤셔널(conventional) 모드에서 사용했다. 사용 레이저는, 핵 염색에 사용한 DAPI는 405㎚ 다이오드 레이저를 이용하여 음향 광학 편광 소자(Acoustic Optical Tunable Filter, AOTF) 20%로 여기, 2-NBDLG 및 2-TRLG는 488㎚를 이용하여 Argon laser main power 30-60%, AOTF 20-60%로 여기했다. 스캔 스피드는 200㎐ 혹은 400㎐를 이용했다.

형광 검출은, DAPI에 의한 청색 형광의 검출용으로 photomultiplier 검출기(PMT)1을 415-500㎚의 파장 검출 범위(검출 감도 750V)에서, 2-NBDLG에 의한 녹색 형광의 검출용으로 PMT2(녹색 채널로 명명했다, 이하 동일)를 500-580㎚의 파장 검출 범위에서 사용했다(검출 감도 670V). 이상의 청색(415-478㎚), 녹색(500-580㎚)의 형광 검출 파장 영역의 선별은 통상 이용되는 Emission 필터 방식에 따르지 않고, 프리즘 분광과 슬릿을 조합한 방식(Leica, TCS-SP5의 표준)에 의해 취득했다. 빔 스플리터(beam splitter)는 500㎚(RSP500)를 사용했다. 405㎚용의 빔 스플리터는 SP5 시스템에서는 상기와 독립하여 415㎚의 고정식으로 된다. 이 실험에서는, 형광 여기에 있어서, 최초에 488㎚ 여기를 사용하여 2-NBDLG 투여 프로토콜의 시간 경과에 따른 화상 취득을 행한 후, 다시 405㎚ 여기에 의해 z축 방향의 깊이에서 다른 핵의 양태를 xyz 모드에서 취득했다.

입체적인 종양 세포 덩어리의 구조적 특징을 파악하기 위해 이용한 미분 간섭(DIC) 화상의 취득은, 488㎚ 여기 시에 투과광용 검출기 PMT Trans를 동시에 사용하여 검출(전형적인 검출 감도는 145-200V)한 것을 이용했다. 미분 간섭 방식(DIC)의 화상 취득에 필요한 폴러라이저(polarizer)나 애널라이저(analyzer)를 광로에 넣기 위한 전환 시간이나 전환 쇼크의 문제를 회피하기 위해, 405㎚ 여기에 의한 화상 취득 시에도 DIC용 폴러라이저와 애널라이저는 광로에 넣은 채로 했다.

본 법에서는, xy축으로의 높은 해상력과 세포 덩어리의 전체를 시야 내에 포함하는 화각(畵角)을 구하여 대물 렌즈는 고해상력의 ×40 oil 렌즈(HCX PL APO CS 40.0×1.25 OIL UV, NA1.25)를 조리개 개방으로 사용했다. 취득 형광 강도를 벌기 위해 Pinhole 사이즈는 3 airy unit으로 했다. 이 pinhole size에서도 z축 방향으로 세포 내의 핵과 세포질을 실용적으로 구별할 수 있는 것이 취득 화상에서 확인되었다. 줌(zoom)은 사용하지 않고(1배), 1024×1024의 화소수에서, 노이즈를 줄이기 위해 2회의 스캔을 행하고, 그 평균 화상(Line average)을 12bit의 깊이에서 화상 취득했다.

또한 이상의 용액의 투여 및 모든 화상 취득은 24시간 일정 실온(24℃)으로 유지된 암실 내에서 행하였다.

(실험 결과)

도 4에, 형광 표지 L-글루코오스 유도체 2-NBDLG의 인슐린 생산 종양 세포(MIN6)로의 투여의 결과를 나타낸다. 2-NBDLG는 다수의 세포가 입체적으로 집적하여, 이상(異常) 핵을 띠는 세포 덩어리에 흡수된다. A는, 2-NBDLG 투여 전의 형광상(像)(Excitation 488nm, Emission 500-580㎚)이다. 세포의 존재는 희미한 자가 형광에 의해 확인된다. B는, 100μM의 2-NBDLG 함유 HEPES 용액으로 3분간 세포를 관류하고, 계속해서 2-NBDLG를 포함하지 않는 HEPES 용액에 의한 씻어냄이 종료된 직후의 형광상이다. 화면 상의 세포 덩어리 (a)에서, 2-NBDLG의 강한 흡수를 인지한다. C는, 미분 간섭 현미경(DIC)상(像)과, 형광상 B의 겹침이다. 세포 덩어리 a의 아래에 점재(點在)하는 두 개의 세포는, DIC상으로부터 상태 악화가 확인된다. D는, DAPI를 이용한 핵 염색상(像)이다. DIC상에서는 매우 닮아 보이는 세포 덩어리 a와 b 중, 세포 덩어리 b의 세포는 정상의 핵 양태를 나타내는 것에 대해, 세포 덩어리 a에는 강하게 빛나 이상한 핵 양태를 나타내는 세포가 존재한다. 2-NBDLG의 현저한 흡수는 a에서만 인지된다. A-D는, 공초점 현미경상(像)이다. 이하에 더욱 자세하게 기재한다.

세포 덩어리 a와 세포 덩어리 b는 모두 11일간 배양한 마우스 인슐린노마 세포(MIN6)의 다수의 세포의 집합체이다. 이들 세포에 공급하고 있던 관류액을, 2.8 mM의 글루코오스를 함유하는 화상 취득용 HEPES 용액으로부터 전자 밸브의 조작에 의해 동일한 용액에 2-NBDLG(100μM)를 함유시킨 용액으로 전환하여, 3분간 세포 바깥으로부터 투여한 후, 화상 취득용 HEPES 용액으로 되돌려서, 2-NBDLG 용액을 씻어내었다. 2-NBDLG가 세포 내에 흡수된 경우는, 투여 전후의 형광 강도의 차에 반영된다. 화상 A와 화상 B는, 2-NBDLG가 발하는 녹색의 형광을 포착한 녹색 채널 화상(검출 파장 영역 500-580㎚)이다. 화상 A(투여 직전의 형광상)에서는, 세포는 플라빈 단백질 등에서 유래하는 자가 형광을 가지기 때문에, 희미하게 녹색으로 빛나고 있다. 그 강약은 세포에 따라 다르고, 세포 덩어리 c에서는 자가 형광이 약간 강하여, 상태가 별로 좋지 않은 것이 엿보인다. 화상 B(투여 직후의 형광상)에서는, 세포 덩어리 a에는, 2-NBDLG를 매우 강하게 흡수하는 세포가 인지된다. 형광 글루코오스 유도체는 통상 핵 내에는 침입하지 않기 때문에, 이들 세포의 핵은 깨끗하게 빠져 있다. 한편, 세포 덩어리 b에 보이는 바와 같이, 완전히 동일 종류의 종양 세포이고, 또한 3차원적 집적을 개시하고 있는 세포 덩어리이더라도, 2-NBDLG의 흡수가 조금밖에 인지되지 않는다. 세포 덩어리 c에 대해서는, 투여 전부터 자가 형광이 약간 강했지만, 투여 후도 거의 형광 강도의 증가는 인지되지 않는다. 화상 C는, 투여 직후의 녹색 채널 화상에 미분 간섭(DIC) 화상을 겹친 것이다. 세포 덩어리 a와 세포 덩어리 b에서는, 2-NBDLG의 흡수의 모습이 크게 다른 것을 알 수 있다. 화상 D는, 실험 종료 후, 세포에 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride(DAPI)를 투여하여, 핵 염색을 행한 상(像)이다. 화상 B와 화상 D를 비교해 보면, 중심부에 이상 핵이 출현하고 있지 않고 정상 세포와 동일한 핵 양태를 나타내고 있는 세포 덩어리(세포 덩어리 b)나, 2차원적·평면적인 집적 단계에 있는 세포 덩어리(세포 덩어리 c)에는, 2-NBDLG의 흡수가 거의 보이지 않는 것을 알 수 있다. 한편, 중심부에 이상 핵을 생기게 하는 단계까지 발달한 세포 덩어리 a의 세포에는, 2-NBDLG를 강하게 흡수하는 것이 출현하고 있는 것을 알 수 있다. 여기서, 화상 D에 있어서의 공초점 현미경의 초점 심도는, 이상 핵으로의 DAPI의 흡수가 가장 큰 초점 심도에 맞추어 사진 촬영하고 있기 때문에, 화상 A-C에서 보고 있는 초점 심도와는 다른 단면의 단층 사진으로 되어 있다. 즉, 종양 세포 덩어리 중에서, 이상 핵이 출현하고 있는 층과, 2-NBDLG의 흡수가 큰 층은 동일하지 않은 것이 xyz 스캔에 의해 시사되었다. 이것은 다음의 실시예 4에 있어서, 한층 명료해진다. 또한, 화상 A,B,D에 있어서의 세포 덩어리 c는, 공초점 현미경의 초점 심도 외(外)로 되어 있지만, 세포 덩어리 c에 대한 상기의 기술은 별도의 초점 심도에 있어서 확인하고 있다.

이들의 것에서 이하의 것을 알 수 있다. 종양 세포의 악성도에 대해 알 목적으로 투여한 DAPI에 의해 가시화된 핵 염색상으로부터, 2-NBDLG를 흡수한 종양 세포 덩어리 (a)에는, 거대 핵 등 악성도가 높은 핵 양태를 나타내는 암세포가 다수 포함되어 있었지만, 완전히 동일 종의 종양 세포이면서 2-NBDLG를 거의 흡수하지 않은 종양 세포 덩어리 (b)에는, 이와 같은 이상 핵 양태를 나타내는 암세포가 인지되지 않았다(도 4B와 4D의 비교). 따라서, 적절하게 설계한 형광으로 표지된 L-글루코오스 유도체를 이용하면, 동일 종의 암세포로 구성되는 암조직 중에 있는 세포의 상태의 차이를, L-글루코오스 유도체의 흡수의 차이에 의해 가시화하여, 평가하는 것이 가능해진다.

실시예 4:마우스 인슐린노마 세포(MIN6)로 이루어지는 종양 세포 덩어리의 2-NBDLG와 2-TRLG를 이용한 이미징

(실험 방법)

(1) 마우스 인슐린노마 세포(MIN6)의 조제

실시예 3과 동일하게 하여 행하였다.

(2) 2-NBDLG 용액 및 2-NBDLG+2-TRLG 혼합 용액의 조제

2-NBDLG+2-TRLG 혼합 용액의 제조

0.1㎎ 2-TRLG 바이알을 데시케이터 내로 옮겨 실온으로 되돌렸다. 2-TRLG는 물에 난용성이기 때문에, 어두운 곳에서 이 2-TRLG 바이알 전량을 65μL의 개봉 직후의 dimethyl sulfoxide(DMSO, Nacalai Tesque No. 13408-64)를 이용하여 용해했다. 2-NBDLG 용액은 실시예 3에 기술한 것과 동일한 방법으로, 실험 직전에 최종 농도 100μM가 되도록 제조하고, 이것에 상기 2-TRLG/DMSO 용액을 비특허문헌 16에 준한 방법으로 첨가함으로써, 2-TRLG 농도가 20μM가 되도록 했다. 구체적으로는, 미리 상기 2-NBDLG 용액을 6.5mL 취하여, 격렬하게 교반해 둔다. 이어서 40μL DMSO를, 칩 벽으로의 부착을 무시할 수 있는 RAININ제 칩(Mettler Toledo)을 이용하여 2-TRLG 바이알병에 첨가하고, 바이알마다 믹서로 교반하여 용해시킨다. 스핀 다운에 의해 벽에 부착한 2-TRLG를 바닥부에 모아서, 동(同) 칩을 사용하여 피펫맨(PIPETMAN)으로 전량 취하여, 교반 중의 2-NBDLG 용액에 용해했다. 2-TRLG 바이알병 중에 조금 남은 2-TRLG는, 상기와 동일한 방법으로 25μL DMSO를 이용하여 회수하고, 2-NBDLG 용액에 더 용해했다. 이상의 방법에 의해, 재현성 좋으며, 최종 농도 100μM 2-NBDLG+20μM 2-TRLG 혼합 용액을 제조할 수 있었다.

(3) 2-NBDLG+2-TRLG 혼합 용액의 투여법 및 화상 취득 프로토콜

(a) 100μM 2-NBDLG+20μM 2-TRLG 혼합 용액의 투여

100μM 2-NBDLG+20μM 2-TRLG 혼합 용액을, 종양 세포 덩어리 전체를 완전히 덮도록 3분간 투여했다. 투여액이 세포 덩어리 전체에 가해져 있는 것은 투여 중의 녹색, 적색의 각 파장 영역의 형광상, 및 투과광상의 취득에 의해 매회 반드시 확인했다. 형광 글루코오스 혼합 용액의 공급을 중지함과 동시에 형광 글루코오스 불포함 HEPES 용액으로 전환하면, 1분 후에는 배경의 형광은 무시할 수 있는 정도가 되었다.

(b) 화상 취득 조건의 상세

화상 취득은 실시예 3에 준한 방법으로, 실험 개시 후 즉시 혼합 용액 투여 전의 화상 취득을 개시하고, 이후 2분 간격으로 실험 종료까지 청색, 녹색, 적색의 각 파장 영역의 형광상, 및 투과광상을 취득했다. 사용 레이저는, 핵 염색에 사용한 DAPI는 405㎚ 다이오드 레이저를 이용하여 (AOTF 20%)로 여기, 2-NBDLG 및 2-TRLG는 488㎚ 아르곤 레이저를 이용하여 (출력50%, AOTF 28%)로 여기했다. 스캔 스피드는 400㎐를 이용했다.

형광 검출에는, 세 개의 형광 검출기를 이하와 같이 이용했다. DAPI에 의한 청색 형광의 검출용으로 photomultiplier 검출기(PMT)1을 415-500㎚의 파장 검출 범위(검출 감도 750V)에서, 2-NBDLG에 의한 녹색 형광의 검출용으로 PMT2를 500-580㎚의 파장 검출 범위(검출 감도 670V)에서, 또한 적색 형광의 검출용으로 PMT3를 580-740㎚의 파장 검출 범위에서 사용했다(검출 감도 670V). 여기서 2-TRLG의 형광은 대부분이 580㎚ 이상으로 존재하고, 580㎚ 이하에는 거의 형광 성분을 가지고 있지 않기 때문에, PMT2의 500-580㎚의 형광 강도에는 거의 영향을 주지 않는다. 이 때문에 2-TRLG의 세포 내에 있어서의 검출량이 증가하는 경우에는, 그 효과는 주로 PMT3의 580-740㎚에 있어서의 형광 강도의 증가로서 나타난다. 이에 대해 2-NBDLG는, 형광 강도의 피크는 540-550㎚ 부근에 있지만, 580-740㎚ 영역에도 형광을 가지고 있다. 이 때문에 2-NBDLG의 세포 내에 있어서의 검출량이 증가하는 경우에는, PMT2에서 검출되는 500-580㎚에 있어서의 형광 강도의 증가에 더하여, PMT3에서 검출되는 580-740㎚에 있어서의 형광 강도도 증가한다. 그 때, 예를 들면 오로지 2-NBDLG의 세포 내에 있어서의 검출량만이 증가하고 2-TRLG는 세포 내에 침입하고 있지 않은 경우, PMT2에서 검출되는 500-580㎚의 형광 파장 영역에 있어서의 2-NBDLG의 형광 강도에 대한 PMT3에서 검출되는 580-740㎚의 형광 파장 영역에 있어서의 2-NBDLG의 형광 강도의 비는, 2-NBDLG의 농도, 검출기 등의 감도 특성, 및 여기광 강도에 의존하여 일정한 관계가 된다. 한편, 세포 내에 2-NBDLG가 흡수되었을 때에, 이것에 더하여 만약 2-TRLG도 세포 내에 침입한 경우에는, PMT3에서 검출되는 580-740㎚의 형광 파장 영역에 있어서의 2-NBDLG의 형광 강도에 대해 상기 관계로부터 예측되는 투여 전에 비교한 형광 강도의 증가에 더하여, 한층 더 형광 강도의 증가로서 검출된다. 그 형광 강도 증가의 상한은, 투여한 100μM 2-NBDLG+20μM 2-TRLG 혼합 용액의 500-580㎚에 있어서의 형광 강도와 580-740㎚에 있어서의 형광 강도의 비로부터 알 수 있고, 하한은 세포 내에 2-NBDLG만이 흡수된 경우에 있어서의 500-580㎚에 있어서의 형광 강도와 580-740㎚에 있어서의 형광 강도의 비이며, 실제로는 이 하한과 상한의 사이에서 세포 내에의 2-TRLG의 침입의 정도에 따라 변화된다. 실제의 프로토콜에 있어서는, PMT3의 580-740㎚에 있어서의 형광 취득의 장치 설정(즉 여기광 강도 및 검출기 감도)을, 오로지 2-NBDLG만이 세포 내에 흡수되고 2-TRLG가 세포 내에 침입하지 않은 경우에는 거의 형광 강도의 증가로서 검출할 수 없는 정도로 조정해 둔다. 이것에 의해, 2-TRLG가 조금이라도 세포 내에 침입한 경우에는 즉시 그 침입을 검출할 수 있다.

이상의 청색(415-478㎚), 녹색(500-580㎚), 적색(580-740㎚)의 형광 검출 파장 영역의 선별에는 2-NBDLG의 녹색 형광과 2-TRLG의 적색 형광의 동시 취득이 가능한 500㎚(RSP500)의 빔 스플리터를 사용했다. 405㎚용의 빔 스플리터는 사용한 Leica SP5 시스템에서는 415㎚의 고정식이다. 형광 여기에 있어서는, 최초에 405㎚ 여기에 의한 DAPI 화상을 검출기 PMT1에서 취득한 후에 488㎚ 여기에 의한 화상을 취득하는 sequential scan(between frame scan)을 이용했지만, 488㎚ 여기 시에는 PMT2와 PMT3의 양쪽 검출기를 동시에 액티브로 함으로써 2-NBDLG의 녹색 형광과 2-TRLG의 적색 형광 화상을 동시 취득했다.

실제의 화상 취득에 있어서는, 입체적인 종양 세포 덩어리의 각각의 깊이에 있어서의 세포의 형광 변화를, 시간 경과를 따라 포착할 목적으로, 이상의 xy 스캔을, 공초점 현미경의 갈바노(galvano) 스테이지를 z축 방향으로 일정 거리 움직여서는 반복하는 xyz 스캔 동작을 형광 표지 글루코오스 유도체 투여 개시 전 3분 전부터 시작하여, 투여 프로토콜 종료까지 2분마다 반복하는 xyzt 스캔을 실시했다. 그 때, 레이저의 반복 조사에 의한 형광 퇴색을 최소한으로 하면서 세포 덩어리 중의 깊이의 차이에 의한 세포 응답의 차이를 알기 위해, z축 방향의 스테이지 이동 거리는 8-10㎛ 간격으로 했다. 구체적으로 도 6의 예에서는, 대략 유리면의 바로 위에 닿는 Z위치부터 시작하여 z축 방향으로 8-10㎛씩 어긋나게 하여 다른 깊이에서 한 장씩, 합계 2장 혹은 3장의 xy 스캔을 행하고, 이 조작을 2분, 혹은 4분에 한 번씩 반복했다. 본 법에서는 ×40배 oil 대물 렌즈를 사용하고, 또한 신속한 액 교환과 샘플 교환을 가능하게 하는 관류 챔버를 이용하여, 도립(倒立) 현미경 스테이지 상의 유리면 상에 세포를 부착시킨 커버 슬립을 밀착시킨 후에 하측으로부터 샘플을 관찰하는 방식을 취하고 있다. 이 때문에 working distance가 짧은 고해상도 대물 렌즈가 유리면에 접촉하는 것에 의한 한계 때문에, 두께가 있는 종양 덩어리의 z축 방향의 상부 구조에 핀트를 맞추는 것에는 한계가 있다. 상기 z축 방향의 스테이지 이동 거리는 이 점에 대해서도 고려하여 결정하고 있다. 종양 덩어리의 전체의 구조는, 투여 프로토콜 개시 전 혹은 다른 실험에서 렌즈를 저배율 렌즈로 변경함으로써 확인하는 것이 가능하다.

(실험 결과)

100μM 2-NBDLG+20μM 2-TRLG 혼합액을, 발달한 인슐린 생산 종양 세포 덩어리(MIN6)에 3분간 투여하고, 레이저 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 도 5-9에 나타낸다.

(도 5∼도 7) 각각 100μM 2-NBDLG+20μM 2-TRLG 혼합액 투여 전, 투여 후 2분 경과한 시점, 투여 후 4분 경과한 시점에서의 형광 화상 및 DIC 화상을 나타낸다. 화상 A(DAPI에 의한 핵 염색상)에서는, 좌우의 종양 덩어리의 각각 중앙부에 DAPI의 이상 축적을 나타내는 세포핵의 존재를 인지한다. 화상 B는, 2-NBDLG의 세포 내에의 흡수를 반영하는 녹색 채널 화상(500-580㎚)이다. 공초점 현미경에 의해 촬영된 종양 덩어리 내부의 일단면(一斷面)의 형광상이 표시되어 있다. 이하에 상세하게 기재한다.

도 5는, 인슐린 생산 종양(MIN6)이 다수 집적된 세포 덩어리의 투여 전의 공초점 현미경 단층상이다. A는, DAPI에 의한 핵 염색상이다. 좌측 상부 및 우측 하부의 세포 집단의 각각 중앙 부근에 매우 강한 핵 염색상이 보인다. B는, 녹색 채널(500-580㎚)의 투여 전 형광상이다. 자가 형광을 인지한다. C는, 적색 채널(580-740㎚)의 형광상이다. 이 파장대에서는 통상 자가 형광은 극히 작다. D는, 미분 간섭(DIC)상이다. E는, A-D의 겹침 화상이다.

도 6은, 100μM 2-NBDLG+20μM 2-TRLG 용액 투여 종료 후 2 min 경과 시의 화상이다. A는, DAPI에 의한 핵 염색상이다. B는, 2-NBDLG 흡수를 반영하는 녹색 채널의 형광상이다. 세포 덩어리 중심부에 강한 흡수를 인지하고, 그 외측에는 다양한 정도의 흡수를 보이는 세포가 점재한다. 중심부의 바로 주변에는 흡수가 거의 없는 세포도 보인다. C는, 2-TRLG의 흡수를 강하게 반영하는 적색 채널의 형광상이다(적색 채널에서 검출되는 형광 강도에 대한 2-TRLG와 2-NBDLG의 기여의 비율은, 2-TRLG와 2-NBDG의 적색 채널로의 기여의 비율과 동일하게 이해된다). 중심부의 강한 흡수를 제외하면, 주변부에서는 강하게 물들거나, 혹은 매우 약하거나 이극화되어 있다. D는, DIC상이다. 좌측의 세포 덩어리에서는 중심부가 도넛 형상으로 움푹 패여 있다. E는, 겹침상이다. 형광 L-글루코오스 유도체를 흡수하지 않는 세포, 2-NBDLG만 흡수한 녹색 세포, 2-NBDLG와 2-TRLG를 흡수한 황색 세포, 2-TRLG에 의한 형광이 남는 적색 세포를 인지한다.

도 7은, 100μM 2-NBDLG+20μM 2-TRLG 용액 투여 종료 후 4 min 경과 시의 화상이다. 이상 핵 양태를 나타내는 세포 덩어리 중심부에서는, 이미 2-NBDLG가 상당 정도 배출되어 형광 강도는 약해져 있지만(B), 일단 흡수된 2-TRLG의 형광은 아직 감쇠하고 있지 않다(C). 그 결과, 중심부의 색조가 도 6과 다르다. DAPI에 의한 강한 청색을 띠는 세포 (A)는 2-NBDLG를 잘 흡수하는 녹색의 세포와 세포 덩어리 중심부에서는 겹치지만, 주변부에서는 반드시 겹치지는 않는다. 녹색 채널과 적색 채널의 변화의 상세는 도 8∼도 9를 참조한다.

상기와 같이, 2-NBDLG를 이용함으로써, 동일한 세포 덩어리 중에 있어서도, 세포 덩어리 중심부의 바로 외측에 존재하고 있는 세포와 같이 2-NBDLG를 거의 흡수하지 않는 세포로부터, 그 외측에 있는 2-NBDLG를 매우 잘 흡수하는 것, 중간 정도로 흡수하는 것 등, 다양한 2-NBDLG의 흡수 상태를 나타내는 종양 세포를 식별하여 가시화할 수 있는 것을 알 수 있었다. 도 7에 있어서 흰색 화살표로 나타낸 세포는, 이 도면에서는, 주변에 있는 동일 정도로 녹색으로 희미하게 빛나는 세포와, 2-NBDLG의 흡수만에 의해서는 구별할 수 없지만, 동시 투여한 2-TRLG의 흡수의 모습을 보면(도 8과 도 9를 참조), 주위의 세포와 명료하게 다른 성질을 가지는 것이 식별된다. 화상 C는, 2-TRLG의 세포 내에의 흡수를 주로 반영하는 적색 채널 화상(580-740㎚)이다. 화상 D는, 3차원적으로 고도로 집적한 종양 덩어리의 DIC(미분 간섭) 화상이다. 좌측의 종양 세포 덩어리에서는, 세포 덩어리가 부풀어오르고, 중심부가 크레이터 형상으로 약간 함몰된 상태로 되어 있다. 우측의 세포 덩어리는, 좌측의 세포 덩어리와 비교하면 약간 높이가 낮은 상태에 있다. 핀 홀을 이용하는 형광상과는 달리, DIC 화상에서는 다른 초점면에 존재하는 세포도, 조금 초점이 흐려진 상태는 되지만, 관찰할 수 있다. 화상 E는, A-D의 겹침 화상이다.

(도 8과 도 9)

도 8은, 100μM 2-NBDLG+20μM 2-TRLG 혼합액을 투여 종료로부터 2분 경과한 시점에서의 녹색과 적색 채널의 형광상을 발출(拔出)하여 DIC상과 겹친 것이다. 세포 덩어리 중심부는, 2-NBDLG와 2-TRLG의 양자를 잘 흡수하여 황색을 띈다. 그 바로 외측에는 양자 모두 흡수하지 않은 어두운 세포가 존재한다. 또한 그 외측을 다양한 정도로 2-NBDLG를 흡수하는 세포가 둘러싼다. 적색만 띠는 세포는 2-NBDLG와 2-TRLG를 흡수하여, 전자(前者)를 씻어냄에 의해 조속히 배출한 세포이다. 세포 덩어리 주변의 초점 심도가 다른 세포는, 형광상에서는 공초점 효과에 의해 본 도면의 초점 심도에서는 화상화되어 있지 않다. 이와 같이, 도 6에서 본 녹색의 형광을 발하는 2-NBDLG를 다양한 정도로 흡수하는 세포가 존재하는 것이 가시화되는 것에 더하여, 2-TRLG도 흡수하여 황색이 되어 있는 세포가 인지된다. 이들 황색을 띠는 세포의 거의 전부는, 도 9에 나타낸 투여 종료로부터 4분 경과한 시점을 보면 알 수 있는 바와 같이, 적색 계통의 색으로 형광 색조가 변화되어 있다.

그 설명으로서, 단일 신경 세포를 이용한 다른 실험으로부터, 다음과 같은 것이 고려된다. 2-TRLG가 2-NBDLG와 함께 세포 상태가 완전히 죽어 있지는 않지만 중간 정도로 악화된 것을 알고 있는 신경 세포 내에 흡수된 경우, 2-TRLG의 흡수의 시간 경과는 2-NBDLG의 흡수의 시간 경과보다 늦고, 즉 천천히 들어가며, 반대로 일단 세포 내에 들어간 2-TRLG는, 만약 그 양이 2-NBDLG보다 적었던 경우여도, 씻어냄을 개시하고 나서 세포 바깥으로 유출하는데에, 2-NBDLG보다 장시간을 요했다. 따라서, 2-TRLG를 2-NBDLG의 양자를 세포 내로 흡수하여 황색이 된 종양 세포는, 씻어냄을 개시하고 나서는 녹색의 2-NBDLG가 먼저 배출되고, 적색의 2-TRLG가 세포 내에 남은 것이다. 실제로, 도 8에서는, 이미 다양한 정도로 적색의 2-TRLG를 흡수한 세포가 인지되지만, 이들 세포의 색을 2-NBDLG+2-TRLG 혼합 용액 투여 중, 혹은 투여 종료하고 나서 최초의 화상 취득의 2회의 에버리징 스캔이 종료되기 전에 조사하면, 그 대부분이 황색으로 보인다.

투여 종료로부터 2분 경과한 시점의 도 8에 있어서 흰색 화살표로 나타낸 세포는, 아직 강한 황색을 띠고 있고, 주변의 세포와는 달리 2-NBDLG에 더하여 적색의 2-TRLG를 흡수한 것을 알 수 있지만, 투여 종료로부터 4분 경과한 시점의 도 9에서 동일하게 흰색 화살표로 나타낸 세포의 색으로 명백한 바와 같이, 이 2분의 사이에 녹색의 2-NBDLG가 세포 바깥으로 신속하게 유출하고, 2-TRLG가 많이 세포 내에 남은 결과, 적색을 띠고 있다. 즉 2-TRLG는, 과거에 2-NBDLG가 대량으로 들어간 것을 메모리와 같이 잠시 동안 알려 주는 역할을 할 수 있다. 만약 2-TRLG를 2-NBDLG와 동시에 사용하지 않으면, 도 7에 있어서 흰색 화살표로 나타내어진 세포가, 동일하게 희미한 녹색을 띠는 주변의 세포와 다른 흡수 패턴을 나타내는 세포인 것은 알 수 없다. 이 세포는, 동시 투여한 2-TRLG의 흡수의 상태와 맞추어 봄으로써, 비로소 주위의 세포와 명료하게 다른 세포 상태에 있는 것을 알 수 있는 것이다.

실험실 이외의 실제의 여러 가지의 조건 하에서 형광 표지 글루코오스를 종양 세포에 접촉시키고 그 흡수의 상태를 조사할 때에는, 엄밀한 시간 경과를 따라 조사하는 것은 곤란한 경우도 많다고 생각되기 때문에, 적색의 2-TRLG를 녹색의 2-NBDLG와 동시에 이용하는 것은 다양성을 나타내는 종양 세포의 세포 상태의 식별에 있어서 장점이 된다.

도 9는, 100μM 2-NBDLG+20μM 2-TRLG 혼합액을 투여 종료로부터 4분 경과한 시점에서의 녹색과 적색 채널의 형광상을 발출하여 DIC상과 겹친 것이다. 세포 덩어리 중심부나 흰색 화살표의 세포는, 도 8의 시점에서는 녹색의 2-NBDLG와 적색의 2-TRLG에 의해 황색을 띠고 있었지만, 그로부터 2 min 경과한 본 도면에서는 녹색의 2-NBDLG가 세포 바깥으로 배출되어 있어, 상대적으로 적색의 2-TRLG의 배출이 늦은 결과, 도 8보다 적색이 강해져 있다. 또 세포 덩어리 외연(外緣)에 보이는 바와 같이, 도 8에서 이미 적색이었던 세포의 몇 개인가에 대해서는, 본 도면에서는 적색의 2-TRLG도 배출되어 있다. 도 9에 있어서, 종양 세포 덩어리 중심부의 세포군은 적색 계통(도 7에서는 DAPI의 청색이 섞여 핑크색)의 색을 띠고, 이들 세포군은 도 8에서는 황색을 띠고 있던 것으로부터, 적색의 2-TRLG도 녹색의 2-NBDLG도 흡수한 후, 녹색의 2-NBDLG를 2분 이내로 조속히 배출하는 세포 상태에 있는 것을 알 수 있다. 한편, 도 8에 있어서 이미 적색을 띠고 있던 세포, 예를 들면 세포 덩어리의 가장 외주에 존재하는 구형(球形)의 세포의 일부 등은, 투여 종료 후 2분 이내라는 빠른 스피드로 2-NBDLG가 세포 바깥으로 유출한 것으로 추정되고, 이들 세포의 적색은 도 9에 있어서는 이미 소실되어 있는 것도 많다. 즉 2-TRLG도 4분 이내에 세포 바깥으로 유출한 것이 된다. 이것은, 이들 세포의 막투과성이 극히 높아져 있는 것을 강하게 시사하고 있고, 세포 상태로서는 죽음에 가까운 말기적 상태에 있는 것이 추정된다.

또 이러한 세포와 비교하면, 도 9에 있어서, 종양 세포 덩어리 중심부에 있어서 적색 계통의 색을 띠고 있는 세포군은, 아직 치명적인 상태라고는 말할 수 없고, 완전히 사멸하고 있는 것은 아니라고 추정된다. 이 추정은 이들 세포의 핵 염색 양태와 대조하는 것으로도 지지된다.

한편, 도 8과 도 9에서는, L-글루코오스를 모핵(母核)으로 하는 형광 표지 글루코오스 유도체, 즉 적색의 2-TRLG도 녹색의 2-NBDLG도, 거의 흡수하지 않는 어두운 세포가, 세포 덩어리 중심부의 바로 외측의 부분을 둘러싸도록 존재하고 있는 모습을 명료하게 알 수 있다(미분 간섭 콘트라스트(DIC) 화상을 겹치고 있지 않은 도 6B 및 도 7B에서는 검게 보이는 부분이 된다). DIC 화상으로부터 알 수 있는 바와 같이, 이 부분에는 세포가 존재하고 있지 않은 것은 아니다. 즉 이들 세포는, 정상 세포와 동일하게 세포막이 글루코오스 흡수에 대해 입체 선택성을 유지한 상태에 있다. 이와 같은 정상 세포에 필적하는 세포막의 상태를 유지하고 있는 종양 세포의 존재를 가시화할 수 있는 것은, 항암제나 치료의 효과를 조사할 때에 도움이 되는 것으로 기대된다. 이와 같이 본 발명은, L-글루코오스를 모핵으로 하는 형광 표지 글루코오스 유도체를, 발달한 종양 덩어리를 포함하는 세포군에 투여하고, 그 개개의 세포 내에의 흡수의 정도에 따라 적극적으로 개개의 종양 세포의 세포 상태의 차이를 평가할 수 있는 것에 더하여, 세포 내에 L-글루코오스를 모핵으로 하는 형광 표지 글루코오스 유도체를 흡수하지 않음으로써 그와 같은 세포를 부각시켜, 약제나 방사선 치료의 효과 판정 등을 위한 마커로서 넓은 응용의 가능성을 가지는 것으로 기대된다.

실시예 5:

2-NBDLG(200μM) 및 2-NBDG(200μM)를 마우스 인슐린노마 세포(MIN6)에 각각 5분간 흡수시켰을 때의 각종 조해제의 유무에 의한 차이를, 형광 마이크로플레이트 리더 Flex Station(Molecular Device Japan(주))을 이용하여 정량적으로 해석했다.

(1) 세포의 조제

측정에 이용한 웰(well)은, 세로 A-H의 8행, 가로 1-12의 12열의 웰을 가지는 96 구멍 클리어 바닥 웰 플레이트μCLEAR-PLATE(Greiner bio-one, BLACK, 96 well, #655090)에서, 이 3열째와 5열째의 B행으로부터 G행의 웰에, MIN6 세포를 6×10⁵ cells/mL의 비율로 조제한 세포 용액을 각각 15μL씩 균일하게 뿌렸다. 배지(培地) 교환은, 0-4 DⅣ(days in vitro)에서는 2일에 1회 절반량 교환, 5 DⅣ 이후는 매일 교환하고, 배양 10-13일째(10-13 DⅣ)에서 실험에 제공했다. A행 및 H행은, 세포를 뿌리지 않고, 씻어냄이 정확하게 행해졌는지의 여부를 체크하기 위한 컨트롤로서 이용했다. 또, 4열째에는 세포는 없고, 크레브스 링거 버퍼 용액(KRB, 갭 결합 조해제 carbenoxolone 0.1mM, 글루코오스 5.6mM을 포함한다)만의 블랭크(blank)로서 사용했다.

(2) 흡수 계측

8련(連)의 PCR 튜브의 각각에, 2-NBDLG 또는 2-NBDG를 넣고, 8련 피펫을 이용하여 빨아들이고, 웰에 동시에 적하하는 방법으로 평가했다. 이것에 의해, 2-NBDLG를 투여하는 웰과, 2-NBDG를 투여하는 웰에, 동시에 투여하는 것이 가능해져서, 신뢰성 좋게 평가할 수 있다. 상기한 바와 같이 3열째와 5열째의 두 개의 열에 있어서 세포가 있는 웰은 12개이고, 이들 중 2-NBDLG와 2-NBDG의 차이와 조해제의 유무의 차이로 각 3웰씩 4군에 배정했다. 구체적으로, 2-NBDLG(200μM) 및 2-NBDG(200μM)의 흡수에 대한 GLUT 조해제 사이토칼라신 B(10μM)의 유무에 의한 영향을 보는 경우, 먼저 사이토칼라신 B 존재 하에서 계측할 예정의 웰에는, 형광 표지된 글루코오스 유도체 투여의 5분 전부터 미리 사이토칼라신 B를 전(前)투여했다. 또, 형광 표지된 글루코오스 유도체 투여 전에, 각 웰의 자가 형광을 계측했다. Flex Station의 측정 조건은, Well Scan Mode, Bottom Read에서, Ex 470㎚, Em 540㎚, Cut off 495㎚, Averaging 3, Photomultiplier 감도 high에서 행하였다. 형광 마이크로플레이트 리더 Flex Station의 Well Scan Mode에서는, 하나의 웰 안을 9개의 관찰 영역(에어리어)으로 분할하여, 각각 독립적으로 계측한다. 9분할된 각각의 에어리어에는, 대략 5000개의 세포가 존재하는 것을 실시간 디콘볼루션(deconvolution) 현미경의 Z section 계측에 의해 별도 확인했다.

2-NBDG 및 2-NBDLG, 사이토칼라신 B 유 또는 무의 투여를 행하고(37℃, 5분간), 투여 종료 후는, 형광 표지 글루코오스를 포함하지 않는 KRB 용액 250μL를, 웰 중의 50μL의 용액에 첨가하는 조작을 스톱 워치로 재면서 7회 반복함으로써, 대조군으로서 설정한 A행 및 H행의 웰이 나타내는 형광 강도가, 세포가 없는 블랭크의 웰의 형광 강도와 같아질 때까지 씻어냄을 행하였다. 이 과정은 7분을 요하고, 세포막 상태의 파탄을 초래한 세포가 2-NBDG 및 2-NBDLG에 접촉 후, 이들의 화합물을 일단 세포 내로 흡수했다고 해도, 계측 시점에서는 이미 세포 바깥으로 유출되어 씻어내어져 있기 때문에, 관찰 에어리어 전체의 형광 강도의 증가에 대한 기여는 무시할 수 있는 정도로 판단되었다. 이것은 별도 약리학적 저해 실험에서, 조해제 존재 하에 형광 강도의 증가가 대부분 소실됨으로써 뒷받침되었다. 상기의 방법은, 다른 조해제의 경우에도 동일하게 실시했다. Na⁺-free의 KRB액은 Na⁺를 choline으로 치환하여 침투압의 변화가 없는 것을 확인했다.

(실험 결과)

도 10에, 마우스 인슐린노마(MIN6) 세포 내에의 2-NBDG 및 2-NBDLG의 흡수에 대한 조해제의 영향을 형광 플레이트 리더에 의해 정량적으로 평가한 결과를 나타낸다.

A, 2-NBDG의 흡수는 GLUT 조해제 Cytochalasin B(10mM, CB) 첨가에 의해 유의(有意)한 감소를 나타내고, 글루코오스 트랜스포터 GLUT를 통한 흡수의 존재를 알 수 있다. 한편, 2-NBDLG의 흡수는 Cytochalasin B에 의해 유의한 저하를 나타내지 않고(N.S.), GLUT를 통하지 않는 흡수인 것이 시사된다. ＊는, 2-NBDG 투여에 의한 형광 강도의 증가에 대해, 유의하게 낮은 것을 나타낸다(p<0.0001, ANOVA, Bonferroni/Dunn).

B, 2-NBDG 및 2-NBDLG가, Na⁺ 이온과 글루코오스를 모두 수송하는 글루코오스 트랜스포터인 SGLT를 통하는지의 여부를 조사한 것이다. 형광 글루코오스를, Na⁺ 이온을 포함하는 버퍼에 녹여서 투여한 경우와, Na⁺ 이온을 포함하지 않는 버퍼(Na(-))에 녹여서 투여한 경우에서, 2-NBDG와 2-NBDLG의 양자 모두 세포 내 흡수에는 유의한 차가 인지되지 않았다. SGLT는 Na⁺ 이온 비존재 하에서는 기능하지 않기 때문에, MIN6 세포의 NBDLG 흡수에 SGLT는 거의 기여하고 있지 않은 것이 시사된다.

C, 2-NBDG와 2-NBDLG의 양자 모두, GLUT 및 수(水) 채널의 공통 조해제인 Phloretin(150μM, PHT)에 의해 MIN6 세포에의 흡수가 저해되었다. 2-NBDLG의 세포 내 흡수는, PHT에서 저해되는 선택적 경로를 통하는 것이 시사된다.

또한, 다른 실험에 의해 PHT에 의한 2-TRLG의 세포 내에의 흡수 저해를 확인했지만, 저해되지 않았다.

실시예 6:급성 단리 신경 세포에의 2-NBDLM과 2-TRLG 혼합 용액 투여에 의한 이미징

(실험 방법)

(A) 이하의 조성의 용액과 재료를 이용했다.

(공초점 화상 취득용 HEPES 용액의 조성)

NaCl 150mM, KCl 5mM, MgCl₂ 1mM, CaCl₂ 2mM, HEPES 10mM, 1M Tris(2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol) 용액에서 pH 7.4로 조정. Glucose 농도는 10mM로 했다. 또한 gap junction/hemichannel을 경유하는 형광 표지 만노스의 출입을 저해할 목적으로 0.1mM Carbenoxolone(SIGMA #C4790)을 첨가했다.

(단리용 링거액의 조성)

NaCl 124mM, NaHCO₃ 26mM, KCl 5mM, KH₂PO₄ 1.24mM, CaCl₂ 2.4mM, MgSO₄·7H₂O 1.3mM, Glucose 10mM, 95%O₂-5%CO₂ 통기에 의해 pH 7.4로 유지했다.

(커버 슬립의 poly-L-lysine 코트(신경 세포용))

5㎎의 poly-L-lysine hydrobromide(SIGMA P6282)를 50mL의 0.15M 붕산(NaOH로 pH 8.4로 조정)에 용해한 것을 스톡(stock)하고, 냉장 보존한다. 본 스톡 용액을 0.15M 붕산에서 1/500∼1/1000로 희석한 것에 커버 슬립(13㎜×22㎜ 마츠나미 No.0 유리)을 가라앉히고, 실온에서 20분 방치한 후, 증류수로 헹구어, 자연 건조시켰다.

(B) 2-NBDLM 용액 및 2-NBDLM+2-TRLG 혼합 용액의 조제

2-NBDLM은 2-NBDLG의 입체 이성체이고, 양자의 분자량은 동일하기 때문에, 본 발명자들에 의한 이전의 WO2010/016587 공보에 상술한 2-NBDLG액 및 2-NBDLG+2-TRLG 혼합 용액의 조제와 기본적으로 동일한 방법으로 조제했다. 투여 용액의 농도는, 0.5㎎의 바이알의 전량을, 화상 취득용 HEPES 용액 14.6mL에 용해함으로써, 최종 농도 100μM의 2-NBDLM 용액으로 했다. 용해법은 실시예 3에 있어서의 2-NBDLG 용액의 조제와 동일하게 실시했다. 2-TRLG는 물에 난용성이기 때문에, 1㎎의 2-TRLG를 dimethyl sulfoxide(DMSO)액에 용해하여 먼저 2mM 2-TRLG 용액으로 한 후, 이 2mM 용액을, 미리 100μM의 2-NBDG를 함유하도록 조제한 하기 조성의 화상 취득용 HEPES 용액으로 100배로 희석하고, 100μM 2-NBDLM+20μM 2-TRLG 혼합 용액을 얻었다.

(B) 급성 단리 신경 세포의 조제

본 발명자들에 의한 이전의 WO2010/016587 공보에 기재한 것과 동일한 방법으로, 이하와 같이 실시했다.

(1) 마우스 뇌 슬라이스의 제조

생후 13-17일령(유약기(幼若期))의 C57BL/6J 마우스에 우레탄 심(深)마취(i.p.1.6g/㎏)를 시행하고, 통상의 방법에 따라 단두 후, 단리용의 냉 링거액(0℃)을 가하면서 뇌를 취출하여, 빙냉한 샬레 상에 얹어서 즉시 트리밍을 행한 후, 리니어 슬라이서(도사카 Pro7)로 냉 링거액(0℃) 중에서 두께 400 혹은 500㎛의 관상 단뇌(斷腦) 슬라이스를 제조했다. 이어서 95%O₂-5%CO₂를 통기한 상기 링거액이 순환하는 챔버(하버드사 제 아크릴 인큐베이션 챔버) 중에서 실온에서 1시간 회복시켰다.

(2) 뇌 슬라이스의 효소 처리

단백 분해 효소 Pronase(10㎎/60mL)를 상기 링거액에 용해하여 제조한 효소액(31℃;95%O₂-5%CO₂ 통기에 의해 pH7.4로 유지한 것)에 뇌 슬라이스를 침지하여 효소 처리를 행하였다. 소정 시간 경과 후, 즉시 실온에서 50-100mL의 10mM glucose 함유 HEPES 용액에 뇌 슬라이스를 침지하여 효소 반응을 정지시켰다.

(3) 중뇌 흑질 망상부(substantia nigra pars reticulata)의 분리

바닥부에 실리콘을 부착한 60 내지 100㎜ 플라스틱 디시에 10 mM glucose 함유 HEPES 용액(실온, 공초점 화상 취득용 HEPES 용액으로부터 Carbenoxolon을 제거한 것)을 채워 두고, 상기 뇌 슬라이스를 액 중에 침지했다. 2개의 27G 주사 바늘로 뇌 슬라이스를 고정한 후, 현미경 하에서 좌우의 중뇌 흑질 망상부를 18G 주사 바늘의 선단을 타원형으로 한 것으로 펀치아웃(punched out)하고, 실온에서 상기 HEPES 용액(35㎜ 컬처 디시) 중에 보존했다.

(4) 흑질 망상부 신경 세포의 단리

각종 선단 직경으로 조정한 유리 피펫으로 trituration에 의해 신경 세포를 단리하여, poly-L-lysine 코트한 유리 커버 슬립에 부착시켰다.

(C) 실시간 레이저 스캔 공초점 현미경을 사용한 경우의 2-NBDLM+2-TRLG 혼합 용액의 투여법 및 화상 취득 프로토콜

혼합 용액의 투여는, 실시예 3(4)∼(6)에 기재한 MIN6 세포에의 투여법과 동일하게 실시했다.

(실험 결과)

100μM 2-NBDLM+20μM 2-TRLG 혼합액을, 급성 단리 신경 세포에 5분간 투여하고, 레이저 공초점 현미경에서 관찰한 결과를 도 11∼15에 나타낸다.

(도 11∼도 15)

각각 100μM 2-NBDLM+20μM 2-TRLG 혼합액 투여 전, 투여 중, 투여 종료 후 2분 경과한 시점, 투여 후 10분 경과한 시점, 투여 후 22분 경과한 시점에서의, 녹색 채널(500-580㎚)에 있어서의 형광 화상 A, 적색 채널(580-740㎚)에 있어서의 형광 화상 B, 미분 간섭(DIC) 화상 C, 및 ABC의 겹침 화상 D를 나타낸다.

도 11은, 마우스의 중뇌 흑질 망상부로부터 급성 단리된 신경 세포에, 2-NBDLM(100μM)+2-TRLG(20μM)를 투여하기 직전의 녹색 채널 (A) 및 적색 채널 (B)에 있어서의 자가 형광상, 미분 간섭(DIC)상 (C), 및 이들 겹침 화상(Overlay, D)이다.

도 12는, 2-NBDLM(100μM)+2-TRLG(20μM) 투여 중의 녹색 채널 및 적색 채널의 형광상, 미분 간섭상 및 겹침 화상(모두 원(原)화상 그대로)이다. 화살표로 나타내어진 건전(健全)한 세포에서는, 투여 중에 2-TRLG가 세포 내에 침입하지 않기 때문에, 2-TRLG의 형광을 강하게 반영하는 적색 채널의 형광상 (B)에서는 세포체 부분이 그림자로 되어 있다. 한편, 2-NBDLM의 흡수를 반영하는 녹색 채널의 형광상 (A)를 보면, 투여 중에 2-NBDLM이 세포 내에 흡수되어, 세포체의 그림자가 적색 채널의 그것보다 작다. 또 D의 겹침상에 있어서, 화살표의 세포는, 중심부의 세포핵을 제외하는 세포질 부분이 2-NBDLM의 형광을 반영하여 녹색으로 되어 있는 모습을 알 수 있다. 이에 대해, 화살표 머리로 나타낸 상태가 악화되어 있는 두 개의 세포에서는, 녹색 채널, 적색 채널 모두 투여 중에 세포체의 그림자가 인지되지 않아, 2-NBDLM과 2-TRLG의 양자 모두에 투여 중에 세포 내로 완전히 침입하고 있는 모습이 나타내어져 있다.

도 13은, 2-NBDLM(100μM)+2-TRLG(20μM) 투여 종료 후 2분 경과한 시점의 이미지(녹색 채널과 적색 채널을 동일 레벨로 강조하여, 형광 변화를 보기 쉽게 표현하고 있다)를 나타내고 있다. A의 녹색 채널에서 보면, 어느 쪽의 세포도 2-NBDLM을 흡수하고 있다. 그러나 B의 적색 채널을 보면, 화살표로 나타내어진 건전한 세포에서는 2-TRLG가 흡수되어 있지 않고 세포막이 건전한 것이 나타내어지는 것에 대해, 화살표 머리로 나타내어진 두 개의 세포는 2-TRLG의 다량의 흡수를 나타내어, 세포막이 파탄을 초래하고 있는 모습을 알 수 있다. 결과적으로, D의 겹침 화상에 있어서, 화살표의 세포에서는 세포체가 녹색 형광을 나타내고 있는 것에 대해, 화살표 머리의 세포에서는 녹색과 적색이 섞여 등색(橙色)을 띠고 있다. 또한 화살표로 나타내어진 세포에서 적색 채널의 형광 강도가 투여 전에 비해 조금 증가되어 보이는 것은, 2-NBDLM의 적색 채널에 있어서의 형광 성분의 증가가 화상 강조에 의해서 가시화된 것이다(상세는 <0268>∼<0273>).

도 14는, 2-NBDLM(100μM)+2-TRLG(20μM) 투여 종료 후 10분 경과한 시점의 이미지를 나타내고 있다. A의 녹색 채널 및 D의 겹침 화상을 보면, 화살표의 건전한 세포에서는, 녹색 형광으로 나타내어지는 2-NBDLM이 투여 종료 후 10분 경과해도 세포 내에 유지되어 있는 모습을 알 수 있다. 한편, 화살표 머리의 두 개의 세포에서는, 투여 후 2분 경과한 시점의 화상에서는 세포 내에 보여져 있던 녹색 채널 및 적색 채널의 형광이 이미 크게 감쇠되어 있고, 세포막 파탄에 의해 세포 내에 일단(一端) 침입한 2-NBDLM 및 2-TRLG가 씻어냄의 시간 경과와 함께 세포 바깥으로 유출한 모습을 알 수 있다.

도 15는, 2-NBDLM(100μM)+2-TRLG(20μM) 투여 종료 후 22분 경과한 시점의 이미지를 나타내고 있다. A 및 D에 명백한 바와 같이, 2-NBDLM에 의한 녹색 형광은, 투여 종료 후 22분을 경과해도 세포 내에 유지되어 있다. 도 13, 14, 15는 모두 완전히 동일한 화상 처리 조건으로 표시하고 있다.

이상의 결과는, 2-NBDLM이, 정상의 마우스 신경 세포 내에 흡수되는 것을 나타내고 있다.

상기의 상세한 기재는, 본 발명의 목적 및 대상을 단지 설명하는 것이고, 첨부한 특허청구의 범위를 한정하는 것이 아니다. 첨부한 특허청구의 범위로부터 멀어지지 않고, 기재된 실시양태에 대한, 다양한 변경 및 치환은, 본 명세서에 기재된 교시로부터 당업자에게 있어서 명백하다.

[산업상의 이용 가능성]

본 발명은, 종양 세포인지의 여부의 판정을 양호한 정밀도로 행하기 위한 방법을 제공할 수 있는 점에 있어서 산업상의 이용 가능성을 가진다.

Claims (23)

1. 암세포 또는 그 우려가 있는 세포를 검출하기 위한 방법으로서, 이하의 공정,
   a. 표적 세포에, 형광 분자단으로서 7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸기 또는 그 유도체를 분자 내에 가지는 L-글루코오스 유도체를 함유하는 조성물을 접촉시키는 공정, 및
   b. 당해 표적 세포 내에 존재하는 당해 L-글루코오스 유도체를 검출하는 공정
   을 포함하는 검출 방법.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 L-글루코오스 유도체가, 7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸기 또는 그 유도체를, L-글루코오스 또는 아미노기 및/또는 불소 원자에 의해 수산기가 치환된 L-글루코오스에 결합한 것인, 검출 방법.
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 L-글루코오스 유도체가, 7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸기 또는 그 유도체를, L-글루코오스 또는 아미노기 및/또는 불소 원자에 의해 수산기가 치환된 L-글루코오스의 2위치, 4위치 또는 6위치에 결합한 것인, 암세포의 검출 방법.
4. 제 3 항에 있어서,
   상기 L-글루코오스 유도체가, 2-[N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노]-2-디옥시-L-글루코오스인 암세포의 검출 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 공정 a에 있어서의 검출이 표적 세포를 이미징함으로써 행하는 검출 방법.
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 공정 a에 있어서의 조성물이, 술포로다민을 분자 내에 가지는 L-글루코오스 유도체를 더 포함하고, 또한, 상기 공정 b가, 표적 세포 중에 존재하는 형광 분자단인 7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸기 또는 그 유도체를 분자 내에 가지는 L-글루코오스 유도체를 검출하는 공정인, 검출 방법.
7. 제 6 항에 있어서,
   상기 조성물이, 2-[N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노]-2-디옥시-L-글루코오스 및 2위치에 술포로다민 101 또는 술포로다민 B를 술폰아미드 결합하게 한 2-아미노-2-디옥시-L-글루코오스를 포함하는, 검출 방법.
8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
   상기 공정 b에 있어서의 검출이 이미징된 세포의 형광 색조의 시간 경과에 따른 변화를 지표로 하여 행하는, 검출 방법.
9. 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
   이하의 공정,
   c. 상기 형광 색조의 변화를 토대로 표적 세포가 암세포인지 손상 세포인지를 판정하는 공정
   을 더 포함하는, 검출 방법.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 모든 공정을 30분 이내에 행하는 검출 방법.
11. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 L-글루코오스 유도체가 방사성 표지된 L-글루코오스 유도체이고, 또한 표적 세포 내에 존재하는 L-글루코오스 유도체를 검출하는 공정이 적어도 PET 이미징을 포함하는, 검출 방법.
12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이, 형광 발색단을 분자 내에 가지는 형광 표지된 D-글루코오스 유도체를 더 포함하는, 검출 방법.
13. 표적 세포 내로의 표지된 L-글루코오스 유도체의 흡수에 의해 표적 세포를 이미징하기 위한 이미징제로서, 형광 분자단인 7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸기 또는 그 유도체를 분자 내에 가지는 L-글루코오스 유도체를 포함하는 표적 세포의 이미징제.
14. 제 13 항에 있어서,
    암세포를 검출하기 위한 이미징제.
15. 제 14 항에 있어서,
    상기 L-글루코오스 유도체가, 7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸기 또는 그 유도체를, L-글루코오스 또는 아미노기 및/또는 불소 원자에 의해 수산기가 치환된 L-글루코오스에 결합한 것인, 이미징제.
16. 제 15 항에 있어서,
    상기 L-글루코오스 유도체가, 7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸기 또는 그 유도체를, L-글루코오스 또는 아미노기 및/또는 불소 원자에 의해 수산기가 치환된 L-글루코오스의 2위치, 4위치 또는 6위치에 결합한 것인, 이미징제.
17. 제 16 항에 있어서,
    상기 L-글루코오스 유도체가 2-[N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노]-2-디옥시-L-글루코오스인 이미징제.
18. 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이미징제가, 술포로다민을 분자 내에 가지는 L-글루코오스 유도체를 더 포함하는 이미징제.
19. 제 18 항에 있어서,
    상기 이미징제가, 2위치에 술포로다민 101 또는 술포로다민 B를 술폰아미드 결합하게 한 2-아미노-2-디옥시-L-글루코오스를 더 포함하는 이미징제.
20. 제 13 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 L-글루코오스 유도체가, 방사성 표지된 L-글루코오스 유도체인 이미징제.
21. 제 14 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    형광 발색단을 분자 내에 가지는 형광 표지된 D-글루코오스 유도체를 더 포함하는, 이미징제.
22. 제 14 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 이미징제를 포함하는 암세포를 검출하기 위한 키트.
23. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 검출 방법을 이용하여 암세포를 검출함으로써, 표적 세포가 유래하는 조직이 암이라고 진단하는 방법.

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