CN113583657A - 一种细胞核靶向碳点、制备及应用 - Google Patents

一种细胞核靶向碳点、制备及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种细胞核靶向碳点、制备及应用，以间苯二胺和盐酸氨基脲为原料，无水乙醇为溶剂，通过一步溶剂热法合成细胞核靶向碳点。本发明成功合成了一种新型的具有ROS稳定性的细胞核靶向荧光碳点，同时具有入胞时间快，光稳定性好，化学稳定性高等优点，可用于细胞核的成像以及细胞铁死亡过程中核酸结构的成像，这是首次碳点用于铁死亡过程中核酸结构的动态成像。

Description

一种细胞核靶向碳点、制备及应用
技术领域
本发明涉及荧光纳米材料制造领域，具体涉及一种细胞核靶向碳点、制备及应用。
背景技术
细胞铁死亡是一种铁依赖性的，区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的细胞程序性死亡方式，其在生物化学特征方面主要表现为细胞内活性氧 (ROS) 和脂质过氧化物的异常增加，在细胞核层面上的形态学变化特征主要表现为细胞核保持结构完整性和缺乏染色质的凝集。目前绝大多数研究中都是通过透射电子显微镜（TEM）来表征，但TEM有一些缺点，如制样麻烦，操作复杂，价格昂贵，而且细胞已失去活性。而通过荧光纳米材料可以实时观察活细胞核酸结构在铁死亡过程中的动态变化。但到目前为止，没有任何碳点应用于活细胞铁死亡过程中核酸结构的动态成像，这可能是由于其活性氧（ROS）稳定性差导致的。
近来，碳点作为一种新的荧光纳米材料，具有原料易得，制备方便，细胞毒性低，生物相容性好等优势，在生物医学等研究领域展示出广泛的应用前景。关于碳点靶向细胞核的相关报道不多，且大多存在着入胞时间长，荧光量子产率低，光稳定性差，成像不够清晰等缺陷。并且由于细胞铁死亡过程中会伴随着大量的活性氧（ROS）产生，所以用于细胞铁死亡过程中的细胞核碳点还需具有很强的化学稳定性，不与ROS (H2O2、OH·) 反应。因此，开发新型的核靶向碳点是迫切必要的。
发明内容
本发明提出了一种细胞核靶向碳点、制备及应用，本发明提供的荧光碳点能特异性靶向细胞核，并且具有入胞时间快，光稳定性好，化学稳定性高等优点。更重要的是，碳点对活性氧（ROS）有极高的稳定性，可用于细胞核的成像以及活细胞铁死亡过程中核酸结构的动态成像。这是首次碳点用于活细胞铁死亡过程中核酸结构的动态成像。
实现本发明的技术方案是：
一种细胞核靶向碳点的制备方法，以间苯二胺和盐酸氨基脲为原料，无水乙醇为溶剂，通过一步溶剂热法合成细胞核靶向碳点。
间苯二胺溶于无水乙醇中浓度为52 mM，盐酸氨基脲溶于无水乙醇中浓度为81mM，所述间苯二胺和盐酸氨基脲在无水乙醇中于180 ℃反应12 h制备得到。
其合成路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
所述细胞为HepG2细胞。
本发明是用于细胞核靶向的碳点。
优选地，所述的碳点在细胞核的成像试剂中的应用。
优选地，所述的碳点在细胞铁死亡过程中核酸结构的成像检测试剂中的应用。
上述应用具体包括：
所述碳点对ROS的化学稳定性，具体步骤如下：
（1）将碳点的储备液稀释在PBS缓冲中，使终浓度为10 μg/ mL，得到混合液A；PBS缓冲溶液的浓度为10 mM，pH范围为7.2-7.4；
（2）将各ROS(H2O2、OH·)溶液分别加入到混合液A，得到一系列混合液；各ROS溶液的浓度为100 μM；
（3）将步骤（2）中得到的混合液转移至荧光比色皿中，利用荧光分光光度计，激发波长为455 nm，测量荧光强度。
（4）将DNA溶液加入到混合液A，DNA溶液的浓度为100μg/mL，得到一系列混合液B；
（5）将混合液B转移至荧光比色皿中，利用荧光分光光度计，测量荧光强度；
（6）将各ROS溶液加入到混合液B，得到一系列混合液；
（7）将步骤（6）中得到的混合液转移至荧光比色皿中，利用荧光分光光度计，测量荧光强度。
所述碳点用于细胞核的成像以及细胞铁死亡过程中核酸结构的成像，具体步骤如下：
（1）把4μg/ mL荧光碳点与细胞共同孵育，通过共聚焦显微镜观察观察碳点进入活细胞的时间；
（2）把4μg/ mL荧光碳点与细胞共同孵育25min后，使用458nm激光持续扫描30次，观察荧光强度的变化；
（3）把4μg/ mL荧光碳点与细胞共同孵育25min，然后加入细胞核商染NucRed™Live 647，通过共聚焦显微镜观察碳点在细胞中的分布情况；
（4）将细胞分别用DNAse和RNAse消化后，把4μg/ mL荧光碳点与细胞共同孵育25min，通过共聚焦显微镜观察碳点在细胞中的分布情况；
（5）将细胞用铁死亡诱导剂Erastin孵育后，把4μg/ mL荧光碳点与细胞共同孵育25min，通过共聚焦显微镜观察碳点在细胞中的分布情况。
本发明提供的荧光碳点能特异性靶向细胞核，并且具有入胞时间快，光稳定性好，化学稳定性高等优点，更重要的是，碳点对活性氧（ROS）有极高的稳定性，可用于细胞核的成像以及细胞铁死亡过程中核酸结构的成像。这是首次碳点用于铁死亡过程中核酸结构的成像。
本发明的有益效果是：本发明细胞核靶向碳点，(1)具有入胞时间快，光稳定性好，化学稳定性高，ROS稳定性等优点。（2）能够特异性靶向细胞核。（3）首次用于细胞铁死亡过程中核酸结构的成像。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是在455nm激发下，碳点在不同金属离子和氨基酸溶液中的荧光强度变化图。
图2是在455nm激发下，分别加入各种ROS物质后碳点荧光强度的变化（a），以及碳点与DNA结合后再加入各种ROS物质时荧光强度的变化（b）。
图3是4μg/mL荧光碳点进入细胞的时间和荧光强度随时间变化的曲线图。
图4是4μg/mL荧光碳点与细胞共同孵育25min后，使用458nm激光持续扫描30次前后的成像图（b）以及荧光强度的变化（a）。
图5是4μg/ mL荧光碳点和两滴细胞核商染NucRed™ Live 647的共定位图：（a）碳点共聚焦成像的荧光场（激发波长是458nm，收集波段是480nm-580nm）（b）商染共聚焦成像的荧光场（激发波长是638nm，收集波段是650nm-720nm）（c）共聚焦成像的明场和荧光场的叠加图（d）共染散点图。
图6是细胞经过DNAse和RNAse消化后，4μg/ mL荧光碳点进入细胞的成像图。
图7是细胞用铁死亡诱导剂（Erastin）孵育后，4μg/ mL荧光碳点进入细胞的成像图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
碳点的制备方法，具体步骤如下：
将盐酸氨基脲（0.0270 g）和间苯二胺（0.0170 g）溶解在无水乙醇（3ml）中，配制成前体混合液 超声处理五分钟后，将混合物转移至聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中。 随后，将高压反应釜置于烘箱中在180℃条件下加热回流12小时。 等待反应釜自然冷却至室温后得到棕色溶液，然后以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，使用硅胶柱层析法纯化获得的溶液。用旋转蒸发仪将得到的碳点溶液中的有机溶剂去除，得到碳点固体。将碳点固体溶解在DMSO中，得到浓度为2 mg / mL的碳点储备液。
实施例 2
碳点对细胞中常见金属离子和氨基酸的稳定性研究，具体步骤如下：
将一定量的碳点储备液加入PBS缓冲溶液中，使其浓度为10 μg/ mL，分别加入一定量的金属离子和氨基酸，使金属离子和氨基酸的浓度为100μM和1mM。将所得溶液转移至荧光比色皿中，用荧光分光光度计测量荧光强度。如图1所示，加入金属离子或者氨基酸后，碳点的荧光强度没有明显变化，说明碳点对细胞中常见的金属离子和氨基酸有良好的稳定性。
碳点对细胞铁死亡过程中中常见ROS的稳定性研究，具体步骤如下：
将一定量的碳点储备液加入PBS缓冲溶液中，使其浓度为10 μg/ mL，加入一定量的ROS，使ROS的浓度为100μM。将所得溶液A转移至荧光比色皿中，用荧光分光光度计测量荧光强度。为了进一步证明即使碳点与DNA结合后仍然对ROS稳定，将一定量的碳点储备液加入PBS缓冲溶液中，使其浓度为10 μg/ mL，加入一定量的DNA，使DNA的浓度为100μg/ml，将所得溶液B转移至荧光比色皿中，用荧光分光光度计测量荧光强度。向B溶液加入一定量的ROS，使ROS的浓度为100μM，用荧光分光光度计测量荧光强度。如图2所示，不论是碳点还是碳点与DNA结合后，加入ROS后，荧光强度都几乎不变。说明碳点对ROS具有很强的稳定性。
实施例 3
碳点的快速细胞成像研究，具体步骤如下：
将HepG2细胞接种于共聚焦培养皿中，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h（细胞培养液包含DMEM高糖培养基、10%体积分数的gibco血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素组成）；将碳点溶液加入到共聚焦培养皿中，使终浓度为 4μg/mL，用激发波长为458nm的光源激发，进行共聚焦成像，观察碳点进入细胞的时间。如图3所示，将碳点与细胞共孵育5分钟后，整个细胞核已显示出绿色荧光，这表明碳点已经轻松穿透细胞膜并进入细胞核中，随着时间的增加，细胞核的荧光逐渐增强并在25分钟左右达到平台期，这表明碳点具有快速细胞核成像的能力。
实施例 4
碳点的光稳定性研究，具体步骤如下：
将HepG2细胞接种于共聚焦培养皿中，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h（细胞培养液包含DMEM高糖培养基、10%体积分数的gibco血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素组成）；将碳点溶液加入到共聚焦培养皿中，使终浓度为 4μg/mL，共孵育25分钟后，用激发波长为458nm的光源激发，进行共聚焦成像，使用458nm激光持续扫描30次，观察荧光强度的变化。如图4所示，使用458nm激光持续扫描30次后，荧光强度仍然保持在90％以上，说明碳点在细胞内具有卓越的光稳定性。
实施例5
碳点的细胞核成像研究，具体步骤如下：
将HepG2细胞接种于共聚焦培养皿中，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h（细胞培养液包含DMEM高糖培养基、10%体积分数的gibco血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素组成）；为了考察碳点对细胞核的靶向功能，将碳点溶液加入到共聚焦培养皿中，使终浓度为 4μg/mL。共孵育25分钟后，在共聚焦培养皿中加入两滴细胞核商染NucRed™ Live 647，孵育15 min，用PBS缓冲液冲洗细胞3遍，之后加入新鲜的不含酚红的细胞培养液，用激光共聚焦显微镜成像系统进行拍摄成像。波长为458 nm的激光器照射，收取480-580 nm范围内的荧光图像，对应为碳点染色区域；用波长为638 nm的激光器照射，收取650-720 nm范围内的荧光图像，对应为细胞核商染NucRed™ Live 647染色区域。
如图5所示，碳点染色区域与细胞核商染染色区域高度重叠，说明碳点有出色的细胞核靶向能力。
实施例6
碳点细胞核靶向的机理研究，具体步骤如下：
将HepG2细胞接种于共聚焦培养皿中，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h（细胞培养液包含DMEM高糖培养基、10%体积分数的gibco血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素组成）；之后将细胞用预冷冻的甲醇处理15分钟，用PBS缓冲液冲洗细胞3遍，接下来，将细胞用5 U/mL DNase或25g/mL RNase处理，并在培养箱中孵育2小时。随后，将HepG2细胞与碳点孵育25分钟，用PBS缓冲液冲洗细胞3遍，之后加入新鲜的不含酚红的细胞培养液，用激光共聚焦显微镜成像系统进行拍摄成像。
如图6所示，与对照组相比（a），细胞经RNase消化后（b），核仁和细胞质中的荧光消失。相反，在DNase消化组（c）中，仅在核仁和细胞质中观察到微弱的荧光。此外，用DNase和RNase消化后（d），整个细胞变暗，无法观察到荧光。说明碳点靶向细胞核主要是由于碳点与细胞核内的DNA和RNA的结合，其中DNA起主要作用。
实施例7
碳点对细胞铁死亡过程中染色质变化的成像研究，具体步骤如下：
将HepG2细胞接种于共聚焦培养皿中，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h（细胞培养液包含DMEM高糖培养基、10%体积分数的gibco血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素组成）；之后将细胞用10μM铁死亡诱导剂（Erastin）孵育16h后，将HepG2细胞与碳点孵育25分钟，用PBS缓冲液冲洗细胞3遍，之后加入新鲜的不含酚红的细胞培养液，用激光共聚焦显微镜成像系统进行拍摄成像。
如图7所示，从对照组的图像可以看出细胞核显示出明亮的荧光，而用Erastin诱导细胞发生铁死亡后，细胞核的形态和边界仍然清晰可见，且能够清晰的看到核酸的结构。有趣的是，与对照组相比，Erastin组的细胞核核染色质略显疏松，这可能是由于在铁死亡期间染色质缺乏凝集所致。说明碳点可用于对HepG2细胞铁死亡过程中核酸结构的动态成像。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种细胞核靶向碳点的制备方法，其特征在于：以间苯二胺和盐酸氨基脲为原料，无水乙醇为溶剂，通过一步溶剂热法合成细胞核靶向碳点。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：间苯二胺溶于无水乙醇中浓度为52mM，盐酸氨基脲溶于无水乙醇中浓度为81 mM。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：反应温度为180 ℃，反应12 h。
4.权利要求1-3任一项所述的制备方法制备的碳点。
5.权利要求4所述的碳点在细胞核的成像试剂中的应用。
6.权利要求4所述的碳点在细胞铁死亡过程中核酸结构的成像检测试剂中的应用。
7.权利要求4所述的碳点在对ROS稳定性研究中的应用。
8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，具体步骤如下：
（1）把4μg/ mL荧光碳点与细胞共同孵育，通过共聚焦显微镜观察观察碳点进入活细胞的时间；
（2）把4μg/ mL荧光碳点与细胞共同孵育25min后，使用458nm激光持续扫描30次，观察荧光强度的变化；
（3）把4μg/ mL荧光碳点与细胞共同孵育25min，然后加入细胞核商染NucRed™ Live647，通过共聚焦显微镜观察碳点在细胞中的分布情况；
（4）将细胞分别用DNAse和RNAse消化后，把4μg/ mL荧光碳点与细胞共同孵育25min，通过共聚焦显微镜观察碳点在细胞中的分布情况；
（5）将细胞用铁死亡诱导剂Erastin孵育后，把4μg/ mL荧光碳点与细胞共同孵育25min，通过共聚焦显微镜观察碳点在细胞中的分布情况。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，具体步骤如下：
（1）将碳点的储备液稀释在PBS缓冲中，使终浓度为10 μg/ mL，得到混合液A；
（2）将各ROS溶液分别加入到混合液A，得到一系列混合液；
（3）将步骤（2）中得到的混合液转移至荧光比色皿中，利用荧光分光光度计，测量荧光强度；
（4）将DNA溶液加入到混合液A，得到一系列混合液B；
（5）将混合液B转移至荧光比色皿中，利用荧光分光光度计，测量荧光强度；
（6）将各ROS溶液加入到混合液B，得到一系列混合液；
（7）将步骤（6）中得到的混合液转移至荧光比色皿中，利用荧光分光光度计，测量荧光强度。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述步骤（1）中PBS缓冲溶液的浓度为10mM，pH范围为7.2-7.4；步骤（2）中各ROS溶液的浓度为100 μM，步骤（3）中所用激发波长为455 nm，步骤（4）中DNA溶液的浓度为100μg/ml。
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