CN112358873A - 用于脂滴特异性标记的碳量子点荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

用于脂滴特异性标记的碳量子点荧光探针及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于脂滴特异性标记的碳量子点荧光探针及其制备方法与应用，该碳量子点荧光探针以邻苯二胺和硫脲为原料，于170～240℃下经溶剂热反应，得到含有明亮黄橙色荧光组分的产物，最终经过滤、分离、干燥得到碳量子点荧光探针。所制备的碳量子荧光探针在非极性疏水油性介质中具有良好的溶解性和明亮的荧光性能，且相比于在水溶液中展现出的弱荧光性能，荧光强度提高了近140倍，可用于脂滴特异性荧光成像，同时具有较高的信噪比。本发明所提供的碳量子点荧光探针能够实现对细胞内脂滴的特异性靶向，且其性能新颖、并具有荧光量子产率高、光稳定性好、细胞毒性低、生物相容性好等特点，因此其在脂滴特异性生物成像中具有广泛的应用前景。

Description

用于脂滴特异性标记的碳量子点荧光探针及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于荧光生物传感技术领域，涉及碳量子点荧光技术，尤其涉及一种用于脂滴特异性标记的碳量子点荧光探针及应用。
背景技术
脂滴(LDs)又称脂肪小体或脂质体，是细胞内富含脂质的细胞器，调节中性脂质(包括甘油三酯和胆固醇酯)的储存。尽管LDs主要存在于脂肪组织中，但几乎所有细胞都能在这些储脂器中储存脂质，因为储存这种代谢能量源的能力对生存至关重要。已经证明，脂肪细胞以外的细胞可以形成脂滴作为对压力的反应。近年来，脂滴引起了相当大的关注，因为它们被发现参与许多生理过程，包括膜合成和转运，蛋白质降解，炎症及许多疾病，如肥胖、糖尿病和动脉粥样硬化以及癌症。因此，成像和跟踪脂滴至关重要。
目前，可用于脂滴成像和监测的荧光探针主要集中在有机荧光染料，包括有机小分子化合物、聚集诱导发光材料等，但众所周知，这些探针通常光稳定性差，且制备过程复杂，原料成本高昂，产量低。因此，开发性能优异，合成过程简便、成本低，适合大规模生成的脂滴探针具有重要的意义和广阔的应用前景。
碳量子点作为一种新兴的荧光碳纳米材料，因其优异的光学性能、良好的生物相容性及低毒性，且合成简便、原料来源丰富、成本低，在生物成像、传感器、药物传递、发光二极管等领域展现出巨大的应用价值，是传统有机荧光染料、半导体量子点最具潜力的替代物。经过十几年的探索和发展，碳量子点已经被广泛用于生物成像领域，如活细胞，斑马鱼，小鼠等。此外，一些经过特殊设计和改性的碳量子点被证实可以用于活细胞内特定细胞器的特异性成像，比如线粒体，溶酶体，DNA/RNA等。然而，目前，尚没有用于脂滴特异性示踪的碳量子点荧光探针的报道。因此，研发一种可用于脂滴特异性成像的碳量子点荧光探针具有重要意义。
发明内容
针对目前用于脂滴成像荧光探针存在的稳定性差、成本高等问题，本发明的目的旨在提供一种用于脂滴特异性标记的碳量子点荧光探针及其制备方法，所制备的碳量子点荧光探针，能够实现对脂滴的特异性成像，且具有优异的光稳定性、高量子产率，较高的信噪比等。
本发明的另一目的旨在提供上述碳量子点荧光探针在脂滴特异性成像方面的应用。
本发明提供的用于脂滴特异性标记的碳量子点荧光探针制备方法包括以下步骤：
(1)配制前驱体反应液，将邻苯二胺和硫脲按照质量比4:1计量，并溶解于由N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和去离子水组成的混合溶剂中，得到前驱体反应液；
(2)制备碳量子点，将前驱体反应液置于反应容器中，于170～240℃反应8～12h；
(3)获取碳量子点，所得反应液经过滤、柱层析分离、干燥得到碳量子点固体粉末，即为碳量子点荧光探针。
上述碳量子点荧光探针制备方法，所述邻苯二胺与硫脲在高温下反应，生成产物中包含以碳核为中心、表面接枝有(OH、C-H、C＝N/C＝O)等多种小分子官能团的碳量子点化合物，其呈现明亮黄橙色荧光。经研究发现，反应环境和反应温度对最终产物具有十分重要的影响。当所述混合溶剂中，单独使用DMF或水作溶剂时，是不能得到本发明的碳量子点的；当N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和去离子水的体积比为3:1时，所制备的碳量子点纯度较高；改变这两种溶剂的比例过大难以保证能得到本发明所述的碳量子点。而且当反应温度过低时，得到的产物主要是本发明碳量子点的中间产物，不具备相关的荧光性能；当反应温度过高时，所生成的碳量子点会因为高温而过度碳化，从而严重影响其荧光性能。
上述碳量子点荧光探针制备方法，步骤(3)中，所得反应液首先使用孔径为0.22μm的滤膜过滤，除去大颗粒反应物(主要是反应过程中过度碳化的产物)。过滤所得反应液通过柱层析法分离出其中的明亮黄橙色荧光组分，本发明中，采用硅凝胶色谱柱进行柱层析。由于色谱柱是根据产物的极性不同来进行分离，本发明所制备的碳量子点极性相对较大，为了更好的分离提纯，本发明柱层析具体操作为：以二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂，先用纯的二氯甲烷作为洗脱剂，让极性小的产物先流出来，然后通过逐渐增加甲醇，控制二氯甲烷与甲醇的比例从100：1逐渐增至20：1，从而通过调节洗脱剂的极性，更好地分离出明亮黄橙色荧光组分。为了便于对明亮黄橙色荧光组分观察，本发明进一步采用5W的紫外灯照明。收集的明亮黄橙色荧光组分经干燥得到碳量子点粉末；所述干燥方式可以为旋蒸、冻干等干燥方式。
上述碳量子点荧光探针制备方法，所制备的碳量子点荧光探针表现出以下性能：
(1)溶剂化效应，碳量子点在不同极性溶剂中，随着溶剂极性的增加，所产生的荧光发生了高达130nm的红移，说明本发明所制备的碳量子点具有极性敏感特性，能在不同极性溶剂中具有不同的荧光特性；
(2)分子类电荷转移效应，碳量子点在水含量不同的溶剂中，随着溶剂中随着水含量的增加，所产生的荧光逐渐红移，并伴随着荧光强度的急剧降低，说明本发明所制备的碳量子点具有分子间电荷转移效应，在极性改变的情况下，其荧光性能会发生变化，除了荧光红移外，还伴随着荧光强度的降低；
(3)碳量子点在油性介质中具有优异的荧光性能，其发射出明亮的黄色荧光，且荧光强度是水溶液中荧光强度的140倍；
(4)碳量子点在油性介质中具有较高的绝对量子产率，高达51.62％，这将有助于提升成像质量的同时提高信噪比；
(5)碳量子点具有较低的细胞毒性；
(6)碳量子点对细胞内脂滴具有特异性成像；
(7)碳量子点具有优异的光稳定性。
基于碳量子点荧光探针所表现出的以上性能，其可以用于细胞内脂滴特异性成像，包括应用于富含脂滴组织的特异性性成像、用于实时监视富含脂滴组织变化或用于富含脂滴组织的示踪等。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明以邻苯二胺和硫脲为原料，于170～240℃下经溶剂热反应，得到含有明亮黄橙色荧光组分的产物，最终经过滤、分离、干燥得到碳量子点荧光探针；所制备的碳量子荧光探针在非极性疏水油性介质中具有良好的溶解性和明亮的荧光性能，且相比于在水溶液中展现出的弱荧光性能，荧光强度提高了近140倍，可用于荧光成像，同时具有较高的信噪比。
(2)本发明所提供的碳量子点荧光探针能够实现对细胞内脂滴的特异性靶向，且其性能新颖、并具有荧光量子产率高、细胞毒性低、生物相容性好等特点，因此其在富含脂滴的组织成像中具有广泛的应用前景。
(3)本发明碳量子荧光探针制备方法，所使用的原料易于采购且价格低、制备工艺简单，适于量产，在生物医学领域内推广使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，以下描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图所示实施例得到其它的实施例及其附图。
图1为本发明碳量子点荧光探针合成示意图；
图2为实施例1制备的碳量子点荧光探针透射电镜测试图谱；
图3为实施例1制备的碳量子点荧光探针红外图谱；
图4为实施例1制备的碳量子点荧光探针XPS测试结果；其中，(a)为全谱，b为(高分辨碳谱，(c)为高分辨氮谱，(d)为高分辨氧谱；
图5为实施例1制备的碳量子点荧光探针核磁共振测试结果；其中(a)为1H NMR测试结果，(b)为13C NMR测试结果；
图6为实施例1制备的碳量子点荧光探针在不同极性溶剂中的吸收光谱；其中A为紫外吸收光谱，B为荧光光谱图，C为在365nm紫外灯照射下的荧光图像；
图7为实施例1制备的碳量子点荧光探针在水和1，2-二氧六环形成的混合溶液(水含量分别为0、5％、10％、20％、40％、60％、80％和100％)中的荧光光谱图；其中A为荧光谱图，B为A中示意部分的放大图，C为在365nm紫外灯照射下相应的荧光图像；
图8为实施例1制备的碳量子点荧光探针在油性介质(甘油三酯)和PBS缓冲溶液中的吸收光谱；其中A为紫外吸收光谱，B为荧光光谱图；
图9为实施例1制备的碳量子点荧光探针在甘油三酯中的绝对量子产率图谱；
图10为实施例1制备的碳量子点和商业脂滴染料BODPY493/503在HepG2细胞中共定位激光共聚焦图；其中，A为所述碳量子点在405nm激光照射下的共聚焦图；B为BODPY493/503在488nm激光照射下的共聚焦图；C为A和B的merge图；D为相应的皮尔逊共域化系数；
图11为实施例1制备的碳量子点和其它几种细胞器染料(细胞核染料DAPI，线粒体染料Mitro Tracker Red，溶酶体染料Lyso-Tracker Red及细胞膜染料CM-Dil)在HepG2细胞中的共定位激光共聚焦图谱；其中，R-CDs表示本实施例制备的碳量子点在几种细胞器中的激光聚焦图谱，Channel表示其它细胞器染料的激光聚焦图谱，Merged表示R-CDs和Channel(其它细胞器染料)复合后的激光共聚焦图谱；
图12为实施例1制备的碳量子点和商业脂滴染料BODPY493/503在激光持续照射下的光稳定性对比图；
图13为实施例1制备的碳量子点荧光探针细胞毒性实验结果图；
图14为应用例1中碳量子点荧光探针实时监测Hela细胞在油酸处理后的不同时间内脂滴的含量变化图；
图15为应用例2中碳量子点荧光探针实时监测HepG2细胞在饥饿处理后的不同时间内脂滴的含量变化图；
图16为应用例3中碳量子点荧光探针用于诊断小鼠正常肝组织和脂肪肝组织；
图17为应用例4中碳量子点和商业脂滴染料BODPY493/503用于可视化活体斑马鱼中的富含脂肪组织。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本实施例提供的碳量子点荧光探针制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
(1)配制前驱体反应液，将2g邻苯二胺和0.5g硫脲置于烧杯中，再向其中加入30mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)和10mL去离子水，经磁力搅拌完全溶解，得到前驱体反应液；
(2)制备碳量子点，将前驱体反应液置于转移至100mL反应釜中，然后升温至210℃下反应10h；反应完成后，待反应釜自然冷却至室温；
(3)获取碳量子点，所得反应液先用0.22μm滤膜过滤，除去大颗粒反应产物；然后，将过滤所得反应液经硅凝胶色谱柱进行分离(二氯甲烷和甲醇为洗脱剂)；在分离过程中，用5W的365nm紫外灯观察，收集具有明亮黄橙色荧光组分，同时，调节洗脱剂中二氯甲烷和甲醇的比例(具体见前面给出柱层析具体操作)，以更好地分离出明亮黄橙色荧光组分；最后，将收集的明亮黄橙色荧光组分于40℃旋蒸10min，得到所需的碳量子点固体粉末，即为碳量子点荧光探针。
实施例2
本实施例提供的碳量子点荧光探针制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
(1)配制前驱体反应液，将2g邻苯二胺和0.5g硫脲置于烧杯中，再向其中加入30mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)和10mL去离子水，经磁力搅拌完全溶解，得到前驱体反应液；
(2)制备碳量子点，将前驱体反应液置于转移至100mL反应釜中，然后升温至170℃下反应12h；反应完成后，待反应釜自然冷却至室温；
(3)获取碳量子点，所得反应液先用0.22μm滤膜过滤，除去大颗粒反应产物；然后，将过滤所得反应液经硅凝胶色谱柱进行分离(二氯甲烷和甲醇为洗脱剂)；在分离过程中，用5W的365nm紫外灯观察，收集具有明亮黄橙色荧光组分，同时，调节洗脱剂中二氯甲烷和甲醇的比例(具体见前面给出柱层析具体操作)，以更好地分离出明亮黄橙色荧光组分；最后，将收集的明亮黄橙色荧光组分于30℃旋蒸10min，得到所需的碳量子点固体粉末，即为碳量子点荧光探针。
实施例3
本实施例提供的碳量子点荧光探针制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
(1)配制前驱体反应液，将2g邻苯二胺和0.5g硫脲置于烧杯中，再向其中加入30mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)和10mL去离子水，经磁力搅拌完全溶解，得到前驱体反应液；
(2)制备碳量子点，将前驱体反应液置于转移至100mL反应釜中，然后升温至240℃下反应8h；反应完成后，待反应釜自然冷却至室温；
(3)获取碳量子点，所得反应液先用0.22μm滤膜过滤，除去大颗粒反应产物；然后，将过滤所得反应液经硅凝胶色谱柱进行分离(二氯甲烷和甲醇为洗脱剂)；在分离过程中，用5W的365nm紫外灯观察，收集具有明亮黄橙色荧光组分，同时，调节洗脱剂中二氯甲烷和甲醇的比例(具体见前面给出柱层析具体操作)，以更好地分离出明亮黄橙色荧光组分；最后，将收集的明亮黄橙色荧光组分于50℃经旋蒸10min，得到所需的碳量子点固体粉末，即为碳量子点荧光探针。
碳量子点结构性能、光学性能及细胞毒性表征
(一)结构性能
对实施例1制备的碳量子点荧光探针进行透射电镜测试，测试结果如图2所示。从图中可以看出，实施例1所制备的碳量子点荧光探针均为类球形纳米颗粒，其平均粒径约为10nm。
对实施例1制备的碳量子点荧光探针进行红外测试，测试结果如图3所示。从图中可以看出，实施例1所制备的碳量子点荧光探针的碳核表面含有O-H、C-H、C＝O/C＝N、C＝C、C-N及C-O-C等多种官能团，碳核及其表面基团共同决定了碳量子点的光学性能。碳量子点表面含有OH，C-N等供电子基团与C＝O等吸电子基团两种类型基团的存在构成了分子间电荷转移的结构基础，从而使本实施例制备的碳量子点具有明显的溶剂极化效应。
对实施例1制备的碳量子点荧光探针进行XPS测试，测试结果如图4所示。从图中可以看出，本实施例所制备的碳量子点主要由C、H、O、N和S等元素组成，高分辨XPS测试结果仍表明碳量子点含有多种官能团，包括C＝O、C＝N、C-N和C-O。
对实施例1制备的碳量子点荧光探针进行NMR测试(包括1H NMR和13C NMR)，测试结果如图5所示。从图中可以看出，本实施例所制备的碳量子点含有sp2碳原子组成的共轭体系充当碳核。
(二)光学性能
1、溶剂化效应
将实施例1制备的碳量子点荧光探针溶解在不同极性的溶剂(浓度为10μg mL-1)(溶剂包括正己烷(Hexane)、甲苯(Toluene)、二氯甲烷(DCM)、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯(EA)、丙酮(Acetone)、乙醇(Ethanol)、甲醇(Methanol)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈(CAN)、二甲基亚砜(DMSO)和水(Water))，然后测量相应的紫外吸收光谱和荧光光谱，测试结果如图6所示。从图6中可以看出，虽然碳量子点随着溶剂极性的增加，紫外吸收光谱仅表现出较小的红移，但其荧光光谱发生了高达130nm的红移，荧光从正己烷中的绿色红移到水溶液中的远红色。测试中所使用的激发波长为480nm。
2、分子类电荷转移效应
将实施例1制备的碳量子点荧光探针溶解在不同水含量的1，2-Dioxane/Water(v/v)溶液中(浓度为10μg mL-1)，然后测量相应的荧光光谱，测试结果如图7所示。从图中可以看出，随着混合体系中水含量增加，荧光逐渐红移并伴随着荧光强度的急剧降低，表明本实施例制备的碳量子点具有分子类电荷转移效应。
3、在油性介质中的光学性能
将实施例1制备的碳量子点荧光探针分别溶解在甘油三酯和PBS缓冲溶液中(浓度为10μg mL-1)，然后测试荧光光谱，测试结果如图8所示。从图中可以看出，本实施例制备的碳量子点荧光探针在紫外吸收光谱表现差不多，但是其在油性介质中能够发射明亮的黄色荧光，且其荧光强度是在水性溶液(这里是PBS缓冲溶液)中荧光强度的140倍。
4、在油性介质中的量子产率
将实施例1制备的碳量子点荧光探针溶解在甘油三酯中(浓度为10μg mL-1)，然后测试绝对量子产率。如图9所示，在最佳激发波长480nm下，本实施例制备的的碳量子点在甘油三酯中的绝对量子产率高达51.62％。
5、在油性介质中对活细胞内脂滴的特异性标记成像
将实施例1制备的的碳量子点荧光探针与商业脂滴染料BODPY493/503进行共定位成像。将HepG2细胞(5×105个每孔)接种于玻底皿(直径：35mm培养皿，底部孔为14mm)，将细胞在1mL含有10％胎牛血清和1％抗生素DMEM中在37℃，5％CO2培养箱中培养24h，之后加入碳量子点，使最终溶液浓度为10μg mL-1，并将细胞培养1小时。随后，吸出含有材料的培养基，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS缓冲液)洗细胞三次，以去除未被细胞摄取的碳量子点。接着，加入1mL含有BODIPY 493/503的培养基(浓度1μM)，再孵育10分钟，然后吸出培养基，用PBS缓冲液进一步洗涤细胞三次，并向玻底皿中添加1.0mL PBS缓冲液。采用徕卡TCS-SP5激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)进行细胞荧光成像，成像结果如图10所示，碳量子点的荧光图像是在405nm激光的激发下记录的，BODIPY493/503的荧光图像是在488nm激光的激发下记录的。
成像结果表明，本发明提供的碳量子点荧光探针在HepG2细胞内能够实现对脂滴的特异性标记成像，且具有较高的荧光强度。从得到的相应的皮尔逊共域化系数，表明本实施例所制备的碳量子点可以很好地特异性靶向细胞内的脂滴，与商业脂滴染料有很高地重合度。
6、不能靶向活细胞内其它细胞器
将实施例1制备的碳量子点与细胞核染料DAPI、线粒体染料Mitro Tracker Red、溶酶体染料Lyso-Tracker Red、细胞膜染料CM-Dil进行共定位成像。将HepG2细胞(5×105个)接种于玻底皿(直径：35mm培养皿，底部孔为14mm)，将细胞在1mL含有10％胎牛血清和1％抗生素DMEM中在37℃，5％CO2培养箱中培养24h，之后加入碳量子点，使最终溶液浓度为10μg mL-1，并将细胞培养1小时。随后，吸出含有材料的培养基，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS缓冲液)洗细胞三次，以去除未被细胞摄取的碳量子点。接着，加入1mL含有上述不同细胞器探针的培养基(浓度：DAPI：5μgmL-1；Mitro Tracker Red:2μM；Lyso Tracker Red:2μM；CM-Dil:2μgmL-1)，再孵育，然后吸出培养基，用PBS缓冲液进一步洗涤细胞三次，并向玻底皿中添加1.0mL PBS缓冲液。采用徕卡TCS-SP5激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)进行细胞荧光成像，成像结果如图11所示，DAPI的荧光图像在405nm激光的激发下记录，碳量子点的荧光图像是在488nm激光的激发下记录，Mitro Tracker Red、Lyso Tracker Red、CM-Dil:的荧光图像在543nm的激发下记录。
成像结果表明，碳量子点的荧光与细胞内核，线粒体，溶酶体和膜的荧光均不重叠，证明本发明提供的碳量子点不能靶向这些细胞器，仅对脂滴具有特异性。
7、光稳定性
将HepG2细胞(5×105个每孔)接种于玻底皿(直径：35mm培养皿，底部孔为14mm)，将细胞在1mL含有10％胎牛血清和1％抗生素DMEM中在37℃，5％CO2培养箱中培养24h，之后加入碳量子点，使最终溶液浓度为10μg mL-1，并将细胞培养1小时。随后，吸出含有材料的培养基，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS缓冲液)洗细胞三次，以去除未被细胞摄取的碳量子点。接着，加入1mL含有BODIPY 493/503的培养基(浓度1μM)，再孵育10分钟，然后吸出培养基，用PBS缓冲液进一步洗涤细胞三次，并向玻底皿中添加1.0mL PBS缓冲液。采用徕卡TCS-SP5激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)测试实施例1制备的碳量子点和商业染料BODIPY 493/503的荧光在激光(激光强度为30％)持续照射下的光稳定性，成像结果如图12所示，碳量子点的荧光图像在405nm激光的激发下记录，BODIPY 493/503的荧光图像在488nm激光的激发下记录。
成像结果表明，本发明的碳量子点具有更加优异的光稳定性。
(三)细胞毒性
采用MTT法(5-二甲基噻唑-2-基-2,5-二苯基四唑溴化铵)检测实施例1制备的的碳量子点荧光探针对HepG2细胞、Hela细胞和MC3T3细胞的细胞毒性。将三种细胞按照密度为1×104个每孔的密度接种于96孔细胞培养板中，在37℃和5％CO2的培养箱中培养24小时。将DMEM或α-MEM吸出，加入含有不同碳量子点浓度(分别为0、20、50、100和200μg mL-1)的新鲜DMEM或α-MEM，再培养24h。随后，吸出培养基，用5mg mL-1MTT(20μL每孔)处理细胞并再培养4小时(37℃，5％CO2)。接着，加入二甲基亚砜(200μL每孔)溶解紫色甲氧氮盐。最后，用酶标仪(美国Bio-Teklnstru-ments公司)在490nm处记录MTT的吸光度。根据实验组与对照组的OD值，计算3种细胞对碳量子点的存活率，结果如图13所示。
从图中可以看出，当实施例1制备的碳量子点的工作浓度高达200ug/mL时，细胞的存活率仍然在80％以上，表明该碳量子点具有较低的细胞毒性。
应用例1碳量子点实时监测油酸刺激下Hela细胞内脂滴含量变化。
将Hela细胞(5×105个每孔)接种于玻底皿(直径：35mm培养皿，底部孔为14mm)，将细胞在1mL含有10％胎牛血清和1％抗生素DMEM中在37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。接着，吸出培养基，用PBS缓冲液洗涤三次，再加入含有油酸((0.1mM)的新鲜培养基，分别培养细胞0，2，4，6h；然后，吸出含油酸的培养基，之后用PBS缓冲液洗涤三次，接着加入含碳量子点荧光探针(10μg mL-1)的培养基，并将细胞培养1小时。随后，吸出含有材料的培养基，并用PBS缓冲液洗涤细胞三次，以去除未被细胞摄取的碳量子点，并向玻底皿中添加1.0mL PBS缓冲液。采用徕卡TCS-SP5激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)进行细胞荧光成像，成像结果如图14所示，荧光图像在488nm激光的激发下记录。
成像结果表明，加入油酸后，随着培养时间的增加，细胞内荧光分布变多，脂滴在细胞内聚集。由此可见，本发明提供的碳量子点能够实时监测油酸刺激下Hela细胞内脂滴含量的变化。
应用例2碳量子点实时监测饥饿刺激下HepG2细胞内脂滴含量变化
将HepG2细胞(5×105个每孔)接种于玻底皿(直径：35mm培养皿，底部孔为14mm)，将细胞在1mL含有10％胎牛血清和1％抗生素DMEM中在37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。接着，吸出培养基，用PBS缓冲液洗涤三次，之后加入l mL无营养的HBSS，分别培养细胞2，4，8h，再加入DMEM的细胞作为对照组；然后，吸出培养基，用PBS缓冲液洗涤三次，继后加入含碳量子点荧光探针(10μg mL-1)的培养基，并将细胞培养1小时。随后，吸出含有材料的培养基，并用PBS缓冲液洗涤细胞三次，以去除未被细胞摄取的碳量子点；接着加入含有MitroTracker Red(2μM)的培养基，培养30min，吸出培养基，并用PBS缓冲液洗涤三次，然后向玻底皿中添加1.0mL PBS缓冲液。采用徕卡TCS-SP5激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)进行细胞荧光成像，成像结果如图15所示，碳量子点的荧光图像是在488nm激光的激发下记录，MitroTracker Red荧光图像在543nm激光的激发下记录。
成像结果表明，随着饥饿时间的延长，细胞内荧光分布变多，脂滴在细胞内聚集。由此可见，本发明提供的碳量子点能够实时监测饥饿状态下HepG2细胞内脂滴含量的变化。
应用例3碳量子点诊断小鼠正常肝组织和脂肪肝组织
首先，建立小鼠正常肝组织模型和脂肪肝组织模型。将小鼠随机分为两组，其中一组按照正常饮食进行喂养，另一组按照高脂饮食进行喂养，持续一个月。从刚杀死的小鼠身上取出肝组织切片，在加有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素和链霉素的H-DMEM中室温保存(使用的时候取出来即可)。之后用实施例1制备的碳量子点荧光探针对肝组织切片进行染色处理(10μg mL-1)，然后用PBS缓冲液洗涤两次。接着，在徕卡TCS-SP5激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)下观察这些组织，成像结果如图16所示，使用的激发光为488nm激光。
成像结果表明，相较于正常肝组织切片，在脂肪肝组织切片中观察到明亮的黄色荧光团簇，表明脂肪肝中脂滴的聚集。由此可见，本发明提供的碳量子点荧光探针能够有效地诊断脂肪肝。
应用例4碳量子点可视化活体斑马鱼内富含脂肪组织
购买刚孵育的斑马鱼，将斑马鱼在蒸馏水中进行培养，然后，将两组斑马鱼分别放入含有实施例1制备的碳量子点(浓度为10μg mL-1)的水溶液和含有商业脂滴染料BODIPY493/503的(浓度为10μg mL-1)的水溶液中，染色1h；其中，商业脂滴染料BODIPY493/503用作对照。染色后，吸出含有碳量子点以及商业染料的水溶液，加入新鲜蒸馏水，在徕卡TCS-SP5激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)下观察斑马鱼，成像结果如图17所示，使用的激发光为488nm激光。
成像结果表明，本发明的碳量子点可以有效地成像活体斑马鱼体内地富含脂肪组织，而且可以看出碳量子点并没有造成活体斑马鱼的死亡，说明碳量子点的毒性很低。
本领域的普通技术人员将会意识到，这里的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种用于脂滴特异性标记的碳量子点荧光探针制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)配制前驱体反应液，将邻苯二胺和硫脲按照质量比4:1计量，并溶解于由N,N-二甲基甲酰胺和去离子水组成的混合溶剂中，得到前驱体反应液；
(2)制备碳量子点，将前驱体反应液置于反应容器中，于170～240℃反应8-12h；
(3)获取碳量子点，所得反应液经过滤、柱层析分离、干燥得到碳量子点固体粉末，即为碳量子点荧光探针。
2.根据权利要求1所述用于脂滴特异性标记的碳量子点荧光探针制备方法，其特征在于所述N,N-二甲基甲酰胺和去离子水的体积比为3:1。
3.根据权利要求1所述用于脂滴特异性标记的碳量子点荧光探针制备方法，其特征在于步骤(3)中，所得反应液首先使用孔径为0.22μm的滤膜过滤，除去大颗粒反应物；过滤所得反应液通过柱层析法分离出其中的明亮黄橙色荧光组分，收集的明亮黄橙色荧光组分经干燥得到碳量子点粉末。
4.根据权利要求3所述用于脂滴特异性标记的碳量子点荧光探针制备方法，其特征在于采用硅凝胶色谱柱进行柱层析操作，以二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂。
5.根据权利要求4所述用于脂滴特异性标记的碳量子点荧光探针制备方法，其特征在于在分离过程中，先用纯的二氯甲烷作为洗脱剂，让极性小的产物先流出来，然后通过逐渐增加甲醇，控制二氯甲烷与甲醇的比例从100：1逐渐增至20：1，通过调节洗脱剂的极性，分离出明亮黄橙色荧光组分。
6.根据权利要求1至5任一所述用于脂滴特异性标记的碳量子点荧光探针制备方法，其特征在于所述干燥方式可以为旋蒸或冻干。
7.权利要求1至6任一方法制备的用于脂滴特异性标记的碳量子点荧光探针。
8.权利要求7所述碳量子点荧光探针在细胞内脂滴特异性成像中的应用。
9.根据权利要求8所述碳量子点荧光探针在细胞内脂滴特异性成像中的应用，其特征在于用于富含脂滴组织的特异性性成像、用于实时监视富含脂滴组织变化或用于富含脂滴组织示踪。
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