CN114605456B - 一种给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物及在脂滴超分辨成像方面的应用 - Google Patents
一种给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物及在脂滴超分辨成像方面的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物及在脂滴超分辨成像方面的应用。本发明提供了一种给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物及其制备方法与其脂滴超分辨成像中的应用，所述萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物作为脂滴荧光探针，在高极性溶剂水中表现出非常微弱的荧光，但在低极性环境中却显著增加了荧光发射，其荧光量子产率高达99.9％，可以以免洗的方式高选择性和高对比度地点亮脂滴，染色浓度低至10nM，同时能够对细胞质和细胞核中脂滴进行超分辨成像和动态追踪。与现有商用脂滴探针染色比，本发明的荧光探针具有发光强、选择性好、孵育浓度低等、信噪比高等优点。
Description
技术领域
本发明属于脂滴荧光探针技术领域，具体涉及一种给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物、制备方法、相应的脂滴荧光探针及其在脂滴超分辨成像方面的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
脂滴是细胞内富含中性脂质的球形细胞器，是细胞代谢的主要调节者。近年来相关研究表明，脂滴在某些生理活动中，与细胞核有着紧密的联系。荧光成像技术已成为直接成像和监测重要生物分子及其相关过程的有力工具。为了更好的理解胞质和核脂滴在生物学中的作用，人们合成了各种具有蓝色至近红外发射的脂滴荧光探针。然而，由于光衍射极限的限制，大多数探针的分辨率较低(>200nm)，为了克服这一瓶颈，超分辨率成像技术已成为精确显示200nm以下微观结构中不可或缺的手段。但超分辨成像技术对相关荧光探针在荧光量子产率、成像对比度、光稳定性、孵育浓度等关键成像参数上具有更高的要求。此外，荧光探针用于核脂滴超分辨率成像的报道很少，可能是由于其核膜通透性不足。另一方面，发光明亮的脂滴荧光探针可以显著降低孵育浓度，避免对细胞代谢的不必要干扰，并尽量减少非特异性染色，提高超分辨率成像对比度。因此，开发具有超亮发光和高细胞渗透性的探针是实现胞质和核脂滴超分辨率成像的理想工具。
发明内容
本发明提供了一种给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物及其制备方法与其脂滴超分辨成像中的应用。由于其刚性结构的特点，该类荧光探针具有超亮发光，同时具有高渗透性、高成像对比度、低孵育浓度等优点，可实现对胞质和细胞核中脂滴的超分辨成像及动态追踪。
本发明第一方面，提供一种给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物，所述化合物选自下式I所示化合物或药学上可接受的盐或酯或溶剂化物、互变异构体、立体异构体、代谢产物或前药，所述式I结构如下：
其中，R1选自氢、低级烃基、醚基、取代烷基或酰基；R2、R3、R4分别独立的选自氢、甲基、取代烷基、氟、氯、溴、碘、氰基、三卤甲基、甲氨基、硝基、苯基或吡啶基。
上述第一方面提供的给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物具有典型的扭曲分子内电荷转移(TICT)效应。该探针在极性溶剂中具有微弱的荧光，在PBS中几乎无光，荧光量子产率低于0.2％；而在非极性溶剂中，由于TICT效应受到抑制，荧光强度显著增强，在油酸中的荧光量子产率最高可达86.6％。该探针在油酸和PBS两种环境下的荧光对比度(IOA/IPBS)优于商用脂滴探针BODIPY 493/503和Nile Red。因此，该探针可以高选择性定位细胞中的脂滴，并且具有极高的信噪比。
本发明提供的给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物由于其刚性结构的特点，具有超亮发光，其在甲苯溶液中的量子产率最高可达99.9％。因此该探针可以以极低的孵育浓度点亮脂滴。实验结果表明，当染色浓度为10nM时，BBA分子即可点亮脂滴，荧光信号良好；而在相同浓度下，商用脂滴探针BODIPY 493/503和Nile Red几乎无光。另外，即使在较高的孵育浓度500nM下，由于在极性环境和非极性环境中优良的荧光对比度，其仍然可以实现脂滴的特异性染色，具有可忽略的背景荧光。
本发明第二方面，提供第一方面所述给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物的制备方法，包括按照如下反应路线获得式I所示化合物：
其中，化合物1与化合物2通过亲核反应生成中间产物，所述中间产物在N,N-二异丙基乙胺(i-Pr2NEt)存在下与BF3·OEt2反应得到式I所示化合物。
本发明提供的给体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物作为脂滴荧光探针在细胞上的选择性经过了严格的证明。通过BBA探针与已报道的脂滴探针TTV的共定位成像实验证明BBA探针确实可以特异性染色脂滴，皮尔逊系数为0.78～0.89；通过与商用脂滴探针BODIPY493/503和Nile Red在不同浓度下孵育细胞的对比成像实验证明BBA探针确实可以以超低染色浓度10nM点亮脂滴；并且由于良好的生物相容性以及高膜渗透性，BBA探针可以还可以实现细胞核内脂滴的高信噪比成像，这一结果也通过重构3D成像实验得到证实。
本发明第三方面，提供一种脂滴荧光探针，所述荧光探针具有如式I所示的化合物结构。
本发明第四方面，提供第一方面所述给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物和/或第三方面所述脂滴荧光探针在脂滴超分辨成像方面的应用。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
本发明提供的给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物具有超高亮度、高成像对比度以及良好的光稳定性。该探针细胞毒性低，孵育时间短、浓度低，具有优异的膜渗透性，可用于结构照明显微镜(SIM)超分辨成像。通过SIM超分辨成像，首次观察到了分辨率在142nm的细胞核脂滴，据检索所知，这种核脂滴的分辨率是目前所报道的最低值。并且在SIM成像分辨率下，成功观察到了细胞质中脂滴的动态融合过程。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中BBA探针的合成路线及结构表征图；(A)BBA探针的合成路线；(B)BBA探针的单晶X射线衍射结构。
图2为本发明实施例2中BBA探针的光谱表征图；(A)不同BBA探针分子在甲苯溶液中的吸收光谱；(B)BBA-H、(C)BBA-OMe、(D)BBA-NMe2、(E)BBA-CF3、(F)BBA-CN和(G)BBA-NO2在不同有机溶剂中的荧光光谱；(H)不同BBA探针的归一化固态荧光光谱图；(I)BBA探针、BODIPY 493/503、Nile Red在PBS和油酸(OA)中的荧光强度；(J)BBA探针、BODIPY 493/503和尼罗红在OA中的荧光量子产率。(K)BBA探针、BODIPY 493/503和Nile Red在PBS和OA中的荧光强度比(IOA/IPBS)；浓度:10μM。
图3为本发明实施例2中BBA探针的密度泛函理论计算和单晶堆积图；(A)BBA探针在B3LYP/6-31G(d,p)水平上HOMO和LUMO的空间电子分布。(B)BBA-H、(C)BBA-OMe和(D)BBA-CF3晶体的分子间堆积和相互作用。(E)BBA-CF3晶体中两个相邻分子的萘环之间的距离；单位
图4为本发明实施例2中(A)BBA-NMe2、(B)BBA-CN和(C)BBA-NO2晶体的分子间堆积和相互作用；单位
图5为本发明实施例2中(A)BBA-H、(B)BBA-OMe、(C)BBA-NMe2、(D)BBA-CF3、(E)BBA-CN、(F)BBA-NO2、(G)BODIPY 493/503和(H)Nile Red在PBS和油酸中的荧光谱图。
图6为本发明实施例3中BBA探针的细胞毒性测试结果图。
图7为本发明实施例4中BBA探针与Hoechst 33342在HeLa细胞中的共聚焦成像图。比例尺：10μm。核区亮点用白色箭头表示；浓度：BBA探针(100nM)，Hoechst 33342(2μM)。
图8为本发明实施例4中BBA探针与TTV孵育HeLa细胞的共聚焦成像图。PCC:皮尔逊相关系数。比例尺:10μm；浓度：BBA探针(100nM)，TTV(10μM)。
图9为本发明实施例5探针BBA-CF3对细胞核脂滴的共聚焦成像图。(A)经200μM油酸不同时间预处理的HeLa细胞用BBA-CF3与Hoechst 33342染色的共聚焦成像图；(B)油酸预处理的HeLa细胞用BBA-CF3沿不同轴向染色的三维重建图像；比例尺:10μm；浓度：BBA-CF3(100nM)，Hoechst 33342(2μM)。
图10为本发明实施例6不同浓度的BBA-CF3、BBA-CN、BODIPY 493/503和Nile Red对油酸预处理的HeLa细胞的共聚焦成像图；三角形表示细胞质中的非特异性染色；比例尺:10μm。
图11为本发明实施例7探针BBA-CF3染色HeLa细胞的SIM超分辨成像图。HeLa细胞中BBA-CF3染色的胞质脂滴的(A)CLSM和(B)SIM图像；比例尺：10μm。(C)放大的(A)和(B)ROI1的CLSM和SIM图像。比例尺:1μm；(D)沿(C)白色虚线归一化的荧光强度剖面图；(E)放大的(A)和(B)ROI 2的CLSM和SIM图像；比例尺:1μm；(F)沿图(E)中白色虚线归一化的荧光强度分布图；(G)在HeLa细胞中经BBA-CF3染色的核脂滴的CLSM和SIM图像；比例尺:10μm。(H)放大的(G)ROI 3的CLSM和SIM图像，比例尺:1μm；(I)沿图(H)中白色虚线归一化的荧光强度分布图。
图12为本发明实施例8探针BBA-CF3在超分辨成像动态追踪过程中的应用；融合的脂滴用白色箭头表示；浓度：50nM；比例尺:1μm。
图13为本发明实施例1制备的探针BBA-H在DMSO-d6中的氢谱。
图14为本发明实施例1制备的探针BBA-H在DMSO-d6中的碳谱。
图15为本发明实施例1制备的探针BBA-OMe在DMSO-d6中的氢谱。
图16为本发明实施例1制备的探针BBA-OMe在DMSO-d6中的碳谱。
图17为本发明实施例1制备的探针BBA-NMe2在DMSO-d6中的氢谱。
图18为本发明实施例1制备的探针BBA-CF3在DMSO-d6中的氢谱。
图19为本发明实施例1制备的探针BBA-CF3在CD3CN中的碳谱。
图20为本发明实施例1制备的探针BBA-CN在DMSO-d6中的氢谱。
图21为本发明实施例1制备的探针BBA-CN在DMSO-d6中的碳谱。
图22为本发明实施例1制备的探针BBA-NO2在DMSO-d6中的氢谱。
图23为本发明实施例1制备的探针BBA-NO2在DMSO-d6中的碳谱。
图24为本发明实施例1制备的探针BBA-H的高分辨质谱。
图25为本发明实施例1制备的探针BBA-OMe的高分辨质谱。
图26为本发明实施例1制备的探针BBA-NMe2的高分辨质谱。
图27为本发明实施例1制备的探针BBA-CF3的高分辨质谱。
图28为本发明实施例1制备的探针BBA-CN的高分辨质谱。
图29为本发明实施例1制备的探针BBA-NO2的高分辨质谱。
图30为本发明中所述BBA探针的发光原理示意图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，鉴于现有的大多数脂滴荧光探针在在荧光量子产率、成像对比度、光稳定性、孵育浓度等关键成像参数仍有不足，不能满足超分辨成像的要求。本发明提供了一种给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物，该化合物可作为一种细胞质或细胞核中脂滴荧光探针，并应用于超分辨成像。
本发明第一方面，提供一种给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物，所述化合物选自下式I所示化合物或药学上可接受的盐或酯或溶剂化物、互变异构体、立体异构体、代谢产物或前药，所述式I结构如下：
其中，R1选自氢、低级烃基、醚基、取代烷基或酰基；R2、R3、R4分别独立的选自氢、甲基、取代烷基、氟、氯、溴、碘、氰基、三卤甲基、甲氨基、硝基、苯基或吡啶基。
优选的，所述低级烃基为C1-C8的直链或支链烷基，所述取代烷基选自烷氧基或卤代烃。
进一步的，所述R1为C1-C6的直链或支链烷基，如甲基、乙基、丙基、正丁基或异丁基；具体的实例中，所述R1为甲基。
进一步的，所述R2选自氢或卤代烃；更进一步的，所述卤代烃为-CF3.
进一步的，所述R3选自氢、烷氧基、硝基、氰基或甲氨基；更进一步的，所述甲氨基为-NMe2.
进一步的，所述R4选自氢、卤代烃；更进一步的，所述卤代烃为-CF3.
本发明提供的一种具体的实施方式中，式I所示化合物具体结构如下：
本发明第二方面，提供第一方面所述给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物的制备方法，包括按照如下反应路线获得式I所示化合物：
其中，化合物1与化合物2通过亲核反应生成中间产物，所述中间产物在N,N-二异丙基乙胺(i-Pr2NEt)存在下与BF3·OEt2反应得到式I所示化合物。
优选的，所述反应步骤如下：
化合物1和化合物2在氮气保护条件下加热回流得到中间产物，将中间产物加入有机溶剂中加热回流，并依次加入三氟化硼乙醚溶液和N,N-二异丙基乙胺进行反应制得。
进一步的，所述化合物1及化合物2加入无水乙醇中进行加热回流，所述回流温度为90～100℃，回流时间为20～25h；更进一步的，回流结束后，收集析出物，用无水乙醇及正己烷洗涤并干燥后得到所述中间产物。
进一步的，所述有机溶剂为无水乙醇或无水二氯甲烷。
进一步的，所述化合物1、化合物2、三氟化硼乙醚及N,N-二异丙基乙胺的当量比为0.8～1.2：0.8～1.2：2～4：2～4.
上述式I所示化合物的反应进程可通过薄层层析法进行检测，反应完成后，还通过硅胶柱层析的方式对式I所示化合物进行分离和提纯，所述硅胶柱层析的洗脱试剂为正己烷和乙酸乙酯混合溶液，其中正己烷和乙酸乙酯的体积比为20～30:1.
本发明第三方面，提供一种脂滴荧光探针，所述荧光探针具有如式I所示的化合物结构。
上述第三方面所述的脂滴荧光探针，其具体的实例为BBA-H、BBA-OMe、BBA-NMe2、BBA-CF3、BBA-CN、BBA-NO2所示结构中的一种或几种的组合。经验证，上述六种结构的化合物中，BBA-H、BBA-OMe和BBA-CF3具有相对更高的固态荧光量子产率，因此，上述第三方面进一步优选的方案中，所述脂滴荧光探针选自BBA-H、BBA-OMe、BBA-CF3中的一种或几种的组合。
本发明第四方面，提供第一方面所述给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物和/或第三方面所述脂滴荧光探针在脂滴超分辨成像方面的应用。
上述脂滴超分辨成像方面的应用主要应用于细胞器互作研究，将第一方面所述受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物和/或第三方面所述脂滴荧光探针作为荧光染料指示细胞中脂滴变化情况，包括胞质脂滴及核脂滴。
所述细胞为包括但不限于人体正常细胞、病变细胞及微生物细胞中的一种；本发明提供一种具体的应用方式，将所述受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物和/或脂滴荧光探针采用DMSO溶解加入待测细胞中孵育，观察并记录荧光亮度的变化。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
下述实施例中，除非另有说明，否则所有的反应都是在干燥的氮气气氛中进行的。所有的化学物质都可以在市场上买到，所有的溶剂在使用前都是新鲜蒸馏的。在BrukerAVANCE III波谱仪上记录1H NMR(400MHz)和13C NMR(101MHz)谱。在Bruker Impact II上采用ESI模式记录DART高分辨率质谱。用U2910紫外分光光度计和Hitachi F-2700荧光光谱仪分别记录紫外-可见吸收光谱和荧光光谱。在爱丁堡FLS920/LP 920上用积分球测定了探针的绝对量子产率，在Olympus FV 1200和Leica TCS SP8上获得共聚焦成像数据，在DeltaVision OMX Flex上获得超分辨成像数据。
实施例1：BBA探针的合成
化合物1和化合物2发生亲核反应得到探针BBA(图1A)。化合物1(1eq.)，化合物2(1.2eq.)和10ml无水乙醇在氮气保护下于95℃回流24h,冷却至室温。将析出沉淀物收集起来，用无水乙醇和正己烷洗涤并在真空下干燥得到中间产物(亚胺衍生物)。将所得中间产物和无水二氯甲烷于85℃加热回流，并向混合物中依次加入三氟化硼乙醚溶液(3eq.)和N,N-二异丙基乙胺(3eq.)，用薄层层析法监测反应至完全，冷却至室温，减压除去溶剂，以正己烷和乙酸乙酯(体积比为30:1)为洗脱剂，用硅胶柱层析法提纯混合物，得到最终产物BBA，产率43％～76％。该探针的结构通过X-射线单晶衍射得到验证(图1B)。1H NMR谱、13CNMR谱和高分辨质谱分别如图13-29所示。
详细表征数据如下：BBA-H:Yellow solid(Yield:74％).1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):8.97(s,1H),8.19(d,J＝9.3Hz,1H),7.64(d,J＝7.8Hz,2H),7.58-7.52(m,2H),7.49-7.43(m,2H),7.26-7.20(m,2H),6.94(d,J＝2.4Hz,1H),3.14(s,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ(ppm):163.30,159.67,152.69,142.99,141.38,129.87,128.48,127.56,126.26,123.80,119.32,115.24,115.10,108.13,106.13,40.27.HRMS(ESI)m/zcalcd for[C19H18BF2N2O+]339.1475([M+H]+),found 339.1453.
BBA-OMe:Yellow solid(Yield:76％).1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):8.91(s,1H),8.18(d,J＝9.3Hz,1H),7.61-7.54(m,2H),7.46(d,J＝8.8Hz,1H),7.22(dd,J1＝9.2Hz,J2＝2.9Hz,2H),7.13-7.06(m,2H),6.93(d,J＝2.8Hz,1H),3.82(s,3H),3.13(s,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ(ppm):162.39,159.39,159.22,152.53,141.17,136.05,127.47,126.11,124.91,119.18,115.23,114.99,106.10,56.00,40.26.HRMS(ESI)m/zcalcd for[C20H20BF2N2O2 +]369.1580([M+H]+),found 369.1569.
BBA-NMe2:Reddish brown solid(Yield:66％).1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):8.86(s,1H),8.17(d,J＝9.3Hz,1H),7.46(dd,J1＝8.8Hz,J2＝3.6Hz,3H),7.25-7.19(m,2H),6.93(d,J＝2.4Hz,1H),6.85-6.79(m,2H),3.12(s,6H),2.97(s,6H).HRMS(ESI)m/zcalcd for[C21H23BF2N3O+]382.1897([M+H]+),found 382.1884.
BBA-CF3:Red solid(Yield:52％).1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):9.13(s,1H),8.36(s,2H),8.26-8.19(m,2H),7.46(d,J＝8.8Hz,1H),7.28-7.20(m,2H),6.96(d,J＝2.5Hz,1H),3.16(s,6H).13C NMR(100MHz,CD3CN),δ(ppm):163.71,162.23,154.29,145.30,143.08,133.21(q,J＝33.67Hz),127.69,127.50,125.48,125.11,122.78,122.39(m),120.82,115.70,106.96,40.47.HRMS(ESI)m/z calcd for[C21H16BF8N2O+]475.1222([M+H]+),found 475.1194.
BBA-CN:Dark purple solid(Yield:43％).1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):9.05(s,1H),8.20(d,J＝9.3Hz,1H),8.07-8.02(m,2H),7.85(d,J＝8.6Hz,2H),7.44(d,J＝8.8Hz,1H),7.26-7.19(m,2H),6.95(d,J＝2.4Hz,1H),3.15(s,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ(ppm):163.48,160.53,153.13,146.48,141.83,134.12,127.66,126.65,124.57,119.78,118.82,115.28,114.79,110.68,108.39,106.29,40.27.HRMS(ESI)m/z calcd for[C20H17BF2N3O+]364.1427([M+H]+),found 364.1427.
BBA-NO2:Red solid(Yield:49％).1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):9.10(s,1H),8.45-8.38(m,2H),8.21(d,J＝9.4Hz,1H),7.96-7.90(m,2H),7.46(d,J＝8.8Hz,1H),7.27-7.20(m,2H),6.95(d,J＝2.4Hz,1H),3.16(s,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ(ppm):195.33,163.49,153.23,146.65,141.93,127.69,126.86,126.76,125.42,124.67,119.91,118.29,115.29,112.83,106.35,40.29.HRMS(ESI)m/z calcd for[C19H17BF2N3O3 +]384.1326([M+H]+),found 384.1308.
实施例2：基本光物理性质
该探针具有给受体型结构，首先测试了其在不同极性溶剂(甲苯、乙醚、四氢呋喃、丙酮、二甲基亚砜)中的光物理性质。吸收光谱和荧光光谱如图2A～H所示，相关光物理数据如下表1所示。
表1 BBA探针在固态和液态中的光物理数据
在甲苯中，BBA探针的最大吸收波长范围是444～474nm(图2A)。苯胺部分带有强给电子或吸电子基团的BBA-NMe2、BBA-CF3、BBA-CN、和BBA-NO2的最大吸收峰比BBA-H和BBA-OMe的最大吸收峰发生了红移。这种红移现象也存在于BBA分子的最大发射光谱中。另外，随着溶剂极性的增大，BBA分子的最大发射波长逐渐红移，荧光强度显著降低(图B～G)，这是典型的扭曲分子内电荷转移(TICT)效应。并且从低极性溶剂到高极性溶剂中BBA的Stokes位移也相应增大。除此之外，该探针具有极高的量子产率，在低极性溶剂如甲苯中的量子产率最高可达99.9％。
为了更好地理解光物理性能，本实施例通过密度泛函理论计算了探针BBA的HOMO和LUMO电子云分布(图3A)。BBA-H、BBA-OMe、BBA-NMe2等分子的HOMO轨道上的电子一般都离域在整个分子上，而LUMO轨道的电子主要分布在萘环和O-B-N杂环上；苯环部分连有强吸电子基团的分子BBA-CF3、BBA-CN和BBA-NO2的HOMO轨道上的电子主要分布在萘环上，而LUMO轨道上的电子分布在O-B-N杂环和苯胺部分。这种明显的电荷分离显示了强的电子转移效应。此外，还计算了HOMO轨道和LUMO轨道的能极差，其中，具有给体-受体(D-A)结构的分子BBA-H的能极差最大，给体-受体-给体(D-A-D)结构的分子BBA-OMe和BBA-NMe2能带隙比BBA-H的窄，这是由于连接在苯胺部分的给电子基团提高了HOMO能级。由于强吸电子基团可以降低LUMO轨道的能级，因此，给体-受体-受体(D-A-A)型分子BBA-CF3、BBA-CN和BBA-NO2的能带隙明显减小。BBA分子能带隙的逐渐减小导致了其在溶液中吸收和发射的红移现象。
BBA分子在固态时也具有较强的荧光(图2H)，且其在固态时的荧光相比于液态时发生了红移(表1)。BBA-H和BBA-OMe的最大发射峰(λem)分别为610nm和582nm。而其他在苯胺部分连有强给电子或吸电子基团的BBA探针在630nm～637nm范围内发射深红色荧光。BBA-H、BBA-OMe和BBA-CF3的固态荧光量子产率(QYs)分别高达21.3％、13.4％和22.6％。其他BBA探针，特别是BBA-NMe2和BBA-NO2的固态荧光量子产率(QYs)则很低(低于2.3％)。接着，本实施例分析了BBA分子在晶体状态下分子间的相互作用和堆积方式(图3B～E和图4)。结果表明，BBA-NMe2、BBA-CN和BBA-NO2晶体中存在强烈的π-π相互作用，从而在固态时具有微弱的发射。而其他BBA探针则表现出较弱的分子内π-π相互作用，使得固体荧光很强。
由于脂滴中甘油三酯和胆固醇酯的含量很高，所以脂滴是一种低极性的亚细胞器，油酸(OA)能刺激脂滴的生成。本实施例用油酸模拟脂滴内的低极性环境，用PBS溶液模拟胞质内的高极性环境，在体外分别测试了BBA探针和商用脂滴探针BODIPY 493/503、NileRed的荧光数据(图2I～J和图5)。BBA分子在油酸中具有强烈的荧光发射，QY最高可达86.6％；在PBS中几乎无光，QY低于0.2％。商用脂滴探针BODIPY 493/503在油酸中也具有较强的荧光(QY为28.51％)，但其在PBS中的荧光也不容忽略(QY为9.53％)，两种环境下的荧光对比度(IOA/IPBS)远不如BBA探针分子(图2K)。
综合以上数据，BBA探针具有良好的溶致变色效应和TICT效应以及极高的荧光量子产率，能以极低的染色浓度以及较高的成像对比度来实现亚细胞中脂滴的特异性成像。
实施例3：探针BBA的毒性测试
在进行生物成像之前，首先用标准MTT法测定BBA探针在活细胞中的细胞毒性。将HeLa细胞接种于96孔板(约1×104个细胞/孔)中，置于37℃，5％CO2培养箱内孵育24h。然后将0.1、0.25、0.5、1、2μM浓度的BBA加入到孔中作为实验组；将不含BBA的新鲜的DMEM培养液作为对照组。细胞在37℃，5％CO2下孵育24小时。然后每孔加入100μL新鲜培养基和20μLMTT(5mg/mL)。37℃下继续孵育4h后，加入100μL的DMSO。最后使用酶标仪测试每个孔在570nm处的吸光度，细胞毒性实验重复3次。结果如图6所示，细胞经处理后存活率仍在80％以上，BBA探针的细胞毒性可忽略。
实施例4：探针BBA的共聚焦显微成像实验
HeLa细胞在含有10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素的DMEM培养基中，于37℃、5％CO2/空气的共聚焦皿中孵育24h。
将BBA探针溶于DMSO中配制浓度为1mM的探针母液。利用激光共聚焦显微镜(CLSM)进行荧光成像实验。首先，用含100nM BBA探针与2μM商用核染色剂Hoechst33342的培养基共同孵育HeLa细胞10min，进行对比染色(图7)。实验结果显示，在473nm激光下，在绿色通道可观察到细胞质中明亮的圆点，而细胞质中其他区域几乎无光。原位光谱与低极性溶剂相似。这些明亮圆点与明场中的黑点高度重合，并且在用BBA-CF3探针染色时，在细胞核区域也观察到亮点。根据经验和BBA探针的亲脂性，推测其染色脂滴。接着本实施例进行了共定位实验。先用10μM的脂滴探针TTV孵育HeLa细胞20min，再加入100nM的BBA探针继续孵育10min。如图8所示，BBA与TTV的染色具有很好的重叠，皮尔逊系数为0.78～0.89。以上数据证明，由于良好的细胞通透性、超高的荧光亮度以及合适的亲脂性，BBA探针可以在低浓度下，以超高的信噪比对脂滴进行特异性染色。
实施例5：BBA-CF3对细胞核中脂滴的成像实验
用200μM油酸对HeLa细胞进行不同时间的预处理，然后以BBA-CF3为例对细胞进行染色，用Hoechst 33342进行复染。如图9A所示，在对照组中，观察到几个胞质脂滴和很少的核脂滴(白色箭头所示)。随着油酸处理时间的延长，HeLa细胞胞质和核中脂滴的荧光增强，胞质和细胞核中脂滴的数量明显增加。为了更好地确认细胞核脂滴，获得了经过油酸处理4h的HeLa细胞的重建3D图像(图9B)，三维图像沿不同的轴向显示。结果清楚地显示，亮点是嵌在核内而非核周围，这表明了BBA-CF3标记的位置是核脂滴。这些数据也表明，BBA探针可以监测外部刺激下细胞质和细胞核内脂滴的积累。
实施例6：不同浓度的BBA探针的细胞成像实验
接下来，以BBA-CF3和BBA-CN为例，研究了BBA探针在低浓度下染色的潜力。HeLa细胞染色前经油酸预处理诱导脂滴形成。然后将HeLa细胞与BBA-CF3、BBA-CN、BODIPY493/503和Nile Red分别以10nM、20nM、50nM、100nM和500nM不同浓度孵育。在特定浓度下，除发射采集范围外，其他成像设置均相同。由图10可以看出，染色浓度为10nM时，BBA探针分子可以点亮脂滴，荧光信号良好，而在相同浓度下，商用脂滴探针BODIPY493/503和Nile Red几乎无光。据了解，10nM的孵育浓度在所有报道的脂滴探针中是最低的。随着浓度增加，BBA-CF3和BBA-CN染色的脂滴的荧光明显增强；BODIPY 493/503在小于50nM的浓度下荧光强度均较弱。在100nM下的成像性能与BBA-CF3或BBA-CN在20nM下的成像性能相当；在相同的成像设置下，Nile Red在100nM处仍然显示微弱的荧光。值得注意的是，BBA探针在500nM的高浓度下仍可以特异性染色脂滴，而商用脂滴探针BODIPY 493/503和Nile Red在细胞质中具有非特异性染色(图10中的白色三角形表示)。BBA探针在亮度、孵育浓度和染色特异性方面优于商用脂滴探针BODIPY 493/503和Nile Red，显示出在细胞质和细胞核中脂滴成像和跟踪方面的巨大潜力。
实施例7：超分辨成像实验
以BBA-CF3为例，在结构照明显微镜(SIM)下进行超分辨成像。HeLa细胞被200μM油酸预处理3h后，用50nM BBA-CF3探针孵育10min，再经4％多聚甲醛固定。在结构化照明显微镜下的超分辨成像结果如图11所示，与普通共聚焦显微镜(CLSM)相比，SIM捕获的脂滴空间分辨率明显提高。仔细观察图11A和图11B中ROI 1部分的细胞质中脂滴，可以看到SIM图像显示一个尖锐的信号，而CLSM图像显示一个模糊的信号(图11C)。图11C中沿着白色虚线的荧光强度分布图显示，相同脂滴在SIM成像中的最大半峰宽(FWHM)值为157nm，而在CLSM成像中的FWHM值为573nm(图11D)。此外，在ROI 2区域，两个相邻的细胞质脂滴在SIM超分辨成像中可以被清晰地区分开，荧光信号采集到两个窄峰，分别为211nm和217nm，而在CLSM成像中仅表现为一个宽峰，FWHM值为770nm(图11F)。另外，通过SIM超分辨成像，本实施例首次观察到了分辨率在142nm的细胞核脂滴(图11H～I)，据发明人所知，这种核脂滴的分辨率是目前所报道的最低值。以上结果表明，BBA探针具有较高的信噪比及优越的核膜渗透性。
实施例8：脂滴超分辨成像动态追踪
以BBA-CF3为例，在SIM超分辨成像下追踪胞质脂滴的融合过程。HeLa细胞经油酸预处理及BBA-CF3染色后，由SIM每隔6s采集一次图像。如图12所示，用白色箭头表示的三个相邻的脂滴快速地相互靠近。其中两个脂滴在6秒内融合成一个新的脂滴。然后，融合后的新脂滴与第三个脂滴在接下来的6秒内迅速融合成另一个新的脂滴。似乎在这个阶段，融合过程已经完成。然而，在SIM成像分辨率下，本实施例发现新脂滴在接下来的18秒内再次分离。需要指出的是，这种分离过程在传统的CLSM成像中很难观察到。大约30秒后，融合过程最终完成。以上数据表明，BBA-CF3探针在某些生物过程中的脂滴动态超分辨率跟踪方面具有很大的应用前景。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物，其特征在于，所述化合物的结构如式I所示：
2.如权利要求1所述给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物，其特征在于，所述R1选自甲基、乙基、丙基、正丁基或异丁基。
3.一种给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物，其特征在于，所述化合物的结构如式I所示：
，R1为C1-C6的直链或支链烷基；R2和R4为三氟甲基，R3为氢。
4.一种给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物，其特征在于，所述化合物选自如下任一种结构:
5.权利要求1-3任一项所述给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物的制备方法，其特征在于，包括按照如下反应路线获得式I所示化合物，
其中，化合物1与化合物2通过亲核反应生成中间产物，所述中间产物在N,N-二异丙基乙胺存在下与BF3•OEt2反应得到式I所示化合物。
6.权利要求5所述给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物的制备方法，其特征在于，所述反应步骤如下：化合物1和化合物2在氮气保护条件下加热回流得到中间产物，将中间产物加入有机溶剂中加热回流，并依次加入三氟化硼乙醚溶液和N,N-二异丙基乙胺进行反应制得式I所示化合物。
7.权利要求6所述给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物1及化合物2加入无水乙醇中进行加热回流，所述回流温度为90～100℃，回流时间为20～25h；回流结束后，收集析出物，用无水乙醇及正己烷洗涤并干燥后得到所述中间产物。
8.权利要求7所述给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物1、化合物2、三氟化硼乙醚及N,N-二异丙基乙胺的当量比为0.8～1.2：0.8～1.2：2～4：2～4。
9.权利要求5所述给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物的制备方法，其特征在于，所述式I所示化合物的反应进程通过薄层层析法进行检测，反应完成后，还通过硅胶柱层析的方式对式I所示化合物进行分离和提纯，所述硅胶柱层析的洗脱试剂为正己烷和乙酸乙酯混合溶液，其中正己烷和乙酸乙酯的体积比为20～30:1。
10.权利要求1-4任一项所述给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物在脂滴超分辨成像方面的应用。
11.权利要求10所述的应用，其特征在于，所述脂滴超分辨成像方面的应用为：所述给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物作为荧光染料指示细胞中脂滴变化情况，所述细胞中脂滴包括胞质脂滴及核脂滴；所述细胞为人体正常细胞、病变细胞及微生物细胞中的一种。
12.权利要求11所述的应用，其特征在于，所述应用的具体操作方法为：将所述给受体型萘水杨醛亚胺二氟化硼类化合物采用DMSO溶解，加入待测细胞中孵育，观察并记录荧光亮度的变化。
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|---|---|---|---|
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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