CN109912501B - 一种高选择性且大Stokes位移的脂滴探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高选择性且大Stokes位移的酯滴荧光探针，其特征在于：所述探针化学名称为N,N‑二甲基‑3‑苯基‑6‑(吡啶‑4‑基乙炔基)萘‑1‑胺通过6‑溴‑N,N‑二甲基‑3‑苯基萘‑1‑胺和4‑乙炔基吡啶反应得到。所述荧光探针具有大Stokes位移以及抑制荧光自猝灭性质；探针整体为电中性，对极性敏感，可消除背景干扰。本发明还公开了所述探针在专一性地标记或显示活细胞或组织中的酯滴形态和酯滴生长中的应用。实验证实本发明的探针是一种全新的探针，具有低毒性，良好的光学稳定性，染色速度快，荧光亮度高，以及能在活细胞中专一地成像酯滴的特点，其应用前景广阔。本发明同时提供了该探针的合成方法，步骤简单，操作方便。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种高选择性且大Stokes位移的脂滴探针及其制备方法和应用，属于有机小分子荧光探针领域。
【背景技术】
脂滴(Lipid droplets,LDs)是由磷脂单分子表层和中性脂内核构成，其表面有很多蛋白分布，是细胞内中性脂的主要贮存场所，广泛存在于多种动植物细胞中。长期以来，LDs被认为是一种类似于糖原的惰性球体，作为能量贮存器，当细胞需要能量的时候，用来供给能量。因而，LDs在很长一段时间内并未受到得到人们的广泛关注。最近，有关LDs的研究得到迅速发展。研究表明，脂滴并非是一个简单的“惰性”球体，而是一个复杂并活跃的多功能细胞器，它的异常与肥胖症，糖尿病，脂肪肝，高脂血症和动脉粥样硬化等疾病有着密切的联系(Nat.Rev.Mol.Cell Biol.,2006,7,373-378；BBA-Mol.Cell Biol.L.,2009,1791,441-447)。已经证实LDs是癌症的重要标志物，尤其是LDs的极性作为癌症的一项重要指标。近年来，荧光检测方法以其高灵敏性，高分辨率，操作简单和价格低廉等特点逐渐成为生物医学研究的重要研究手段(Acc.Chem.Res.,2015,48,538-547；Chem.Commun.,2012,48,2331-2333；Chem.Sci.,2017,8,5440-5446；ACS Appl.Mat.Interfaces,2018,10,10706-10717)。荧光探针的使用，可以实现对脂滴的原位可视化，从而荧光探针成为了研究脂滴及其相关活动的重要手段。
目前应用较广的有两个商业化的脂滴荧光探针：尼罗红(Nile Red)和BODIPY493/503，但是，这些荧光探针仍存在着一些重要的缺陷：荧光背景强，选择性差和Stokes位移小。因此，迫切需要发展新的高选择性的脂滴探针，能够专一性地靶向脂滴，大Stokes位移，极性敏感，实现无背景噪音的成像。
【发明内容】
针对现有技术的的不足，本发明要解决的问题是提供一种具有高选择性且大Stokes位移的脂滴荧光探针及其制备方法和在专一性地标记或显示活细胞或组织中脂滴形态和脂滴生长中的应用，以实现对细胞和组织中的脂滴高选择性成像，无背景噪音干扰。
一种高选择性且大Stokes位移的脂滴荧光探针，其特征在于：所述探针化学名称为N,N-二甲基-3-苯基-6-(吡啶-4-基乙炔基)萘-1-胺，具有如式(I)所示的结构：
所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：6-溴-N,N-二甲基-3-苯基萘-1-胺和4-乙炔基吡啶在Pd(PPh3)2Cl2，CuI和有机碱存在下于THF中加热回流，冷却至室温，加入饱和氯化铵溶液洗涤，然后用二氯甲烷萃取，分离纯化得到N,N-二甲基-3-苯基-6-(吡啶-4-基乙炔基)萘-1-胺。
上述制备方法中，其特征在于，反应温度为80～100℃，反应时间为24～36h。
上述制备方法中，其特征在于，所述有机碱为三乙胺或二异丙胺。
上述制备方法中，其特征在于，所述分离提纯步骤为：减压蒸馏旋干溶剂得到粗产物后，经柱色谱分离得到提纯产物，柱色谱分离的流动相为体积比为1：5的石油醚和乙酸乙酯。
上述荧光探针的制备路线如下：
上述的荧光探针在专一性地标记或显示活细胞或组织中的脂滴形态和脂滴生长中的应用。
上述荧光探针的识别机理如下：
本发明中的探针以N,N-二甲基-1-萘胺部分为荧光团，N,N-二甲基为极性敏感基团。由于共轭炔基取代的1-萘胺增强了分子内电荷转移(ICT)，吡啶是一种强吸电子基团，在二氯甲烷溶剂中观察到强荧光，在其它极性溶剂(乙腈，乙醇和水)，由于存在探针与溶剂的耦极-耦相互作用，使一部分能量通过非辐射的形式消失，以辐射的形式发出的荧光强度变弱；在激发态时电子离域更加完全，处于更加稳定的状态，电势差少，使波长红移。由于正常细胞中的脂滴极性比癌细胞的脂滴极性大，故而，极性溶剂中的低荧光成为脂滴成像的优势，因为它带来非常弱的背景干扰。由于探针呈现电中性，所以能在脂溶性脂滴中进行很好的定位。
本发明具有以下优点：
本发明提供了一种高选择性且Stokes位移大的脂滴荧光探针，具有发光强和极性敏感荧光性质，由于探针整体呈电中性可以很好的定位不同极性的脂滴。该探针具有低毒性，良好的光学稳定性，染色速度快以及对极性特异性响应；并且实现了专一性地标记或显示活细胞或组织中的脂滴形态和脂滴生长中的应用。本发明同时提供了该探针的制备方法，步骤简单，操作方便。
【附图简要说明】
附图1探针的1H NMR图。
附图2探针的13C NMR图。
附图3探针在不同溶剂中的吸收与发射光谱。
附图4探针与商业化脂滴探针的共定位。
附图5探针的细胞成像应用。
【具体实施方式】
下面结合本发明的实施例对本发明作进一步说明，需要说明的是，实施例并不构成对本发明要求保护范围的限制。
实施例1
探针N,N-二甲基-3-苯基-6-(吡啶-4-基乙炔基)萘-1-胺的合成
在反应器中加入0.20mmol 6-溴-N,N-二甲基-3-苯基萘-1-胺，0.40mmol 4-乙炔基吡啶，0.01mmol Pd(PPh)3Cl2，0.01mmol CuI，0.40mmol二异丙胺，1.0mL THF。在氮气氛围下，加热到100℃，持续搅拌30h，停止反应，冷却至室温，加入饱和氯化铵溶液洗涤，然后用二氯甲烷萃取，干燥，减压蒸馏除去溶剂，粗产品经柱色谱分离即得荧光探针，产率88％。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.62(s,2H),8.22(d,J＝8.4Hz,1H),8.11(s,1H),7.71–7.68(m,3H),7.58(d,J＝8.1Hz,1H),7.50(d,J＝6.5Hz,2H),7.43–7.40(m,3H),7.34(s,1H),2.96(s,6H)；13C NMR(100MHz,CDCl3):δ151.3,149.8,141.1,139.6,134.5,132.8,131.5,128.9,127.7,127.6,127.4,125.6,124.5,120.6,119.6,115.2,94.4,86.9,45.2。
实施例2
荧光探针在不同溶剂中的发射光谱
配制浓度为1mM的实施例1合成的荧光探针N,N-二甲基-3-苯基-6-(吡啶-4-基乙炔基)萘-1-胺的二氯甲烷(DCM)的测试母液待用。
测试液中，分别取3mL不同极性的溶剂：二氯甲烷(DCM)，乙腈，乙醇，PBS缓冲液，然后加入30uL的探针母液，使得测试液中，探针的浓度为10uL,进行荧光扫描(激发波长405nm，检测波段400–650nm)，得各体系中的荧光强度，如图3所示，随着极性溶剂的增加，光谱红移，荧光明显减弱。
实施例3
荧光探针与商业化脂滴探针的共定位
配制浓度为1mM的实施例1合成的荧光探针的N,N-二甲基-3-苯基-6-(吡啶-4-基乙炔基)萘-1-胺的二氯甲烷(DCM)的测试母液待用；配制浓度为1mM的市售的尼罗红(脂滴的专用定位剂)的二氯甲烷(DCM)的测试母液待用。
已培养好的HepG2细胞，待细胞贴壁后，分别加入本发明所述极性敏感的荧光探针N,N-二甲基-3-苯基-6-(吡啶-4-基乙炔基)萘-1-胺10uL和市售的尼罗红(脂滴的专用定位剂)溶液5uL，弃掉培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，随后进行荧光成像(探针的激发波长：405nm，发射波段：450–550nm；尼罗红的激发波长：560nm，发射波段：580–680nm)，结果如图4所示，a)为探针在绿色通道收集的光；b)为尼罗红在近红外通道的光；c)是a)和b)的叠加图；d)是明视野和c)的叠加图。图c)表面该探针与尼罗红的成像位置高度吻合，探针N,N-二甲基-3-苯基-6-(吡啶-4-基乙炔基)萘-1-胺具有特异性脂滴，高亮度且不标记其它细胞器，这表明该探针对脂滴成像的高效率和高选择性。
实施例4
荧光探针的细胞成像实时检测细胞脂滴的生长
配制浓度为1mM的实施例1合成的荧光探针的N,N-二甲基-3-苯基-6-(吡啶-4-基乙炔基)萘-1-胺的二氯甲烷(DCM)的测试母液待用。
已培养好的HeLa细胞，待细胞贴壁后，加入本发明所述的荧光探针N,N-二甲基-3-苯基-6-(吡啶-4-基乙炔基)萘-1-胺10uL，当用油酸1mM进一步刺激探针标记的细胞时，随后进行荧光成像(探针的激发波长：405nm，发射波段：450–550nm)，如图5所示，随着时间的延长，HeLa细胞中脂滴的大小和数量逐渐增加，油酸是诱导细胞产生脂滴的已知试剂；这表明这种新开发的探针可以快速标记新合成的脂滴，并能将脂滴成像更好的应用于相关疾病检测。
Claims (6)
1.一种高选择性且大Stokes位移的脂滴荧光探针，其特征在于：所述探针化学名称为N,N-二甲基-3-苯基-6-(吡啶-4-基乙炔基)萘-1-胺，具有如式(I)所示的结构：
2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：6-溴-N,N-二甲基-3-苯基萘-1-胺和4-乙炔基吡啶在Pd(PPh3)2Cl2，CuI和有机碱存在下于THF中加热回流，冷却至室温，加入饱和氯化铵溶液洗涤，然后用二氯甲烷萃取，分离纯化得到N,N-二甲基-3-苯基-6-(吡啶-4-基乙炔基)萘-1-胺。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述反应温度为80～100℃，反应时间为24～36h。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述有机碱为三乙胺或二异丙胺。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述分离提纯步骤为：减压蒸馏旋干溶剂得到粗产物后，经柱色谱分离得到提纯产物，柱色谱分离的流动相为体积比为1：5的石油醚和乙酸乙酯。
6.一种如权利要求1所述的荧光探针在非疾病诊断和治疗中专一性地标记或显示活细胞或组织中的脂滴形态和脂滴生长中的应用。
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