CN114292281A - 一种用于实现细胞内脂滴动态成像的小分子荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开用于实现细胞内脂滴动态成像的小分子荧光探针及其制备方法和应用，该小分子荧光探针结构如(I)式，制备方法是以式(II)荧光素衍生物与式(III)香豆素衍生物通过缩合反应得到式(I)所示化合物。本发明荧光探针具有较高的脂滴选择性、光稳定性以及较好的生物安全性，可以实现不同细胞中的脂滴动态荧光成像以及斑马鱼的体内脂滴成像，在生物检测和脂滴相关疾病诊断方面具有重要的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物探针及制备方法和应用，特别涉及一种用于实现细胞内脂滴动态成像的小分子荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
脂滴(简称LDs)是一种由磷脂单层和中性脂质核心组成的亚细胞器。早期人们普遍认为脂滴仅作为细胞的脂质库，可为细胞的正常生理功能提供必须的能量，同时也可参与胞膜合成以及信号传递等细胞正常生理活动。但是，近期研究表明，脂滴还与肥胖症、糖尿病、脂肪肝以及多种癌症(如：结肠癌、宫颈癌、肝癌和脑癌)息息相关。因此，开发一种能有效检测脂滴动态变化的工具，在脂滴相关疾病的诊断以及机理研究方面具有重要的应用前景。
荧光成像技术近年来发展十分迅速，由于其高分辨率、高选择性和高灵敏度、可实时监测等优点已被广泛应用于脂滴的成像。目前商业化的脂滴检测探针主要有BODIPY493/503、Nile Red以及Oil Red O等，但它们均存在一定的缺陷，例如，BODIPY 493/503的光稳定性较差因而限制了其在在脂滴动态监测方面的应用、Nile Red在生物安全性方面具有一定的缺陷、而Oil Red O仅能用于透化后的细胞内脂滴成像。因此，开发一种光稳定性好、生物安全性高、可同时应用于正常细胞和动物体内的脂滴成像的荧光探针具有重要的生物医学意义。
发明内容
发明目的：本发明提供了一种具有较高生物安全性、较好适应性和光稳定性的用于实现细胞内脂滴动态成像的小分子荧光探针。
本发明的另一目的是提供所述探针的制备方法和用途。
技术方案：所述用于实现细胞内脂滴动态成像的小分子荧光探针，该探针具有式(I)所示的机构式：
其中，上述用于实现细胞内脂滴动态成像的小分子荧光探针(I)的制备方法，包括步骤：
式(II)所示的荧光素类衍生物与式(III)所示的香豆素类衍生物，在缩合剂及缚酸剂的作用下于有机溶剂中0-100℃下反应得到式(I)所示的小分子荧光探针Cou-H；
上述的制备方法中，所述合成步骤中的缩合剂可独立选自：BOP、DCC、PyBOP、HOBT、SOCl2；其中优选于BOP、PyBOP。
上述的制备方法中，所述合成步骤中的缚酸剂可独立选自：三乙胺、无水碳酸钾、氢氧化钠、N，N-二异丙基乙胺、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸铯、咪唑、吡啶、DBU，其中优选于N，N-二异丙基乙胺、三乙胺。
上述的制备方法中，所述合成步骤中的有机溶剂可独立选自：甲醇、乙腈、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃、DMF、DMSO，优选于二氯甲烷、DMF。
上述的制备方法中，所述合成步骤中选用的反应温度可独立选自0-100℃下任意反应温度，其中优选于15-35℃。
所述的用于实现细胞内脂滴动态成像的小分子荧光探针在细胞外源性脂滴和内源性脂滴检测中的应用。
进一步地，所述小分子荧光探针在不同种类细胞内脂滴动态检测中的应用。在活体动物体细胞内脂滴荧光成像中的应用。
有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：
1、本发明中的小分子探针与商业检测脂滴探针Nile Red相比具有较高的生物安全性，更加适用于活细胞和活体动物体内的脂滴成像；
2、本发明中的小分子探针相比于商业探针Oil Red O具有较好的适用性，不需要对细胞进行透化处理，直接可以用于多种细胞内的脂滴成像；
3、本发明中的小分子探针与商业脂滴成像探针Nile Red具有相似的光稳定性，相比于光稳定性较差的商业探针BODIPY 493/503，本发明探针Cou-H可成功用于细胞中脂滴的动态成像，进而可以跟踪脂滴在细胞内的移动情况，具有十分重要的生物医学意义；
4、本发明所述的探针简单易得，仅通过一步缩合反应就可制备得到。
附图说明
图1是本发明中小分子荧光探针的质谱图；
图2是本发明中小分子荧光探针的核磁氢谱图；
图3是本发明中小分子荧光探针的核磁碳谱图；
图4是本发明中小分子荧光探针在不同溶剂中的紫外-可见光谱图(a)，以及荧光光谱图(b)；
图5是本发明中小分子荧光探针在不同比例乙腈和水的混合溶液中的紫外-可见光谱图(a)，以及荧光光谱图(b)；
图6是本发明中小分子荧光探针在不同pH的PBS溶液中的紫外-可见光谱图(a)，以及荧光光谱图(b)；
图7是本发明小分子探针Cou-H(a)以及对照探针Nile Red(b)对HepG2细胞的细胞毒实验图；
图8是本发明小分子探针Cou-H对HepG2细胞内外源性脂滴染色的共聚焦图(a)，本发明小分子探针Cou-H以及对照探针Nile Red分别对HepG2细胞外源性脂滴染色的共聚焦图(b)；
图9是本发明小分子探针Cou-H和对照探针Nile Red对不同细胞(MDA-MB-231，4T1，MCF-7，MCF-10A，Hela，LO2)的内源性脂滴染色的共聚焦图；
图10是本发明小分子探针在对不同时间点(0-3min)对HepG2细胞中脂滴染色的共聚焦图；
图11是本发明小分子探针Cou-H和对照探针Nile Red对斑马鱼体内荧光成像的共聚焦图。
具体实施方式
实施例1：式(I)所示的荧光探针的制备：
于100mL单口瓶中分别加入式(II)所示的化合物1.0g(1.8mmol，1.0equiv)、式(III)所示的化合物0.74g(1.8mmol，1.0equiv)、BOP0.81g(1.8mmol，1.0equiv)、DIPEA0.8mL(4.6mmol，2.5equiv)以及DMF 30mL。加毕，氩气保护上述反应液，并于25℃下搅拌12h。反应毕，将反应液倒入300mL水中，所得溶液用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，合并有机相。所得有机相用无水硫酸钠干燥过夜，过滤，旋干后得黄色油状物粗品。所得粗品经硅胶柱柱层析(PE/EA＝1/1)制备得到目标探针Cou-H 1.2g，收率为79％。MS(ESI+)：830.3[M+H]+；1H-NMR(CDCl3，400Hz)δ(ppm)：9.37(brs，1H，NH)，8.82(s，1H，Ar-H)，8.48(s，1H，Ar-H)，8.43(brs，1H，NH)，8.21(d，J＝7.80Hz，1H，Ar-H)，8.09(s，1H，Ar-H)，7.52(d，J＝9.00Hz，1H，Ar-H)，7.24(d，J＝8.00Hz，1H，Ar-H)，7.05(d，J＝1.88Hz，2H，Ar-H)，6.78-6.76(m，3H，Ar-H)，6.65(dd，J1＝8.88Hz，J2＝2.24Hz，1H，Ar-H)，6.48(d，J＝2.16Hz，1H，Ar-H)，3.74(dd，J1＝19.04Hz，J2＝3.96Hz，4H，2×CH2)，3.44(dd，J1＝14.16Hz，J2＝7.00Hz，4H，2×CH2)，1.35(s，18H，6×CH3 of Boc)，1.23(t，J＝7.04Hz，6H，2×CH3)；13C-NMR(CDCl3，100Hz)δ(ppm)：176.57，168.49，166.48，166.26，166.07，162.87，157.96，155.22，153.15，152.80，151.65，149.08，136.79，134.82，134.31，131.89，129.57，128.99，126.67，124.50，124.10，117.87，115.75，110.47，108.82，108.55，100.00，96.57，82.04，45.24，39.28，38.98，27.13，12.49.
实施例2：本发明中测定有机小分子荧光探针在不同溶剂中的紫外-可见光谱(图4a)及荧光光谱(图4b)图：
紫外-可见吸收光谱测定所用仪器为岛津UV-2600紫外-可见分光光度计；荧光吸收光谱测定所用仪器为HORIBA Duetta荧光分光光度计。
将探针分别溶于H2O、PBS、乙腈、乙醇以及DMSO配置成浓度为50μM的溶液，通过紫外分光光度计测得探针在不同溶剂中的最大吸收波长为430nm(图4a)。在用荧光分光光度计对上述溶液分别进行检测(激发波长为430nm)，结果发现探针在水溶液(H2O和PBS)中最大发射波长为480nm，紫外灯照射下发出蓝光，而在有机溶液(乙腈、乙醇以及DMSO)中，探针分子的最大发射波长为530nm，紫外灯下发射出黄光(图4b)。这表明探针分子在有机相和水相中可以发出不同波长的光，通过相似相溶原理可以有效的区分含水量较大的细胞质和含脂量较大的脂滴。
实施例3：本发明中测定有机小分子荧光探针在不同乙腈/水的混合溶液中的紫外-可见光谱及荧光光谱图：
以不同梯度的乙腈/水(v/v)作为溶剂，将探针分子分别配置成浓度为50μM的溶液，通过紫外-可见分光光度计检测发现探针在不同比例的乙腈/水的溶液中，最大吸收波长没有显著变化，均为430nm(图5a)。再通过荧光分光光度计进行检测(激发波长为430nm)，结果表明当探针分子所在的溶剂中乙腈含量大于40％时，探针分子的最大吸收波长为480nm，在紫外等下发出蓝光，而当乙腈含量小于20％时，探针分子的最大吸收波长发生明显红移(变为530nm)，紫外灯下发出黄光(图5b)。这表明探针分子的最大发射波长受溶剂中水相的比例影响较大，随着溶剂中水相比例的增加探针分子的最大吸收波长会有一个明显的红移现象，这也进一步说明了探针分子可以很好的对细胞内疏水性较强的脂滴进行染色。
实施例4：本发明中测定有机小分子荧光探针在不同pH值的PBS溶液中的紫外-可见光谱及荧光光谱图：
将探针分子溶于不同pH的PBS溶液中，配置成浓度为50μM的溶液，通过紫外-可见分光光度计以及荧光分光光度计进行检测。结果发现探针分子在不同的pH下，其最大吸收波长(图6a)和发射波长(图6b)均无任何变化。这表明探针分子在正常的生理pH(6.8-7.4)下具有很好的稳定性。
实施例5：本发明的有机小分子荧光探针对细胞活力的影响；
将HepG2细胞在添加了10％FBS的DMEM，5％二氧化碳，37℃下培养。然后将细胞接种到96孔板中，孵育24h使其贴壁。再将不同浓度的探针Cou-H以及对照探针Nile Red分别加入到贴壁的细胞中并孵育24h。最后将MTT溶液(5.0mg/mL，10μL)加入到每个孔中，继续孵育4h。每孔加入150μL的DMSO溶解产生的甲瓒，最后通过酶标仪在570nm处测量吸光度，结果如图7所示。
从图7不难发现，本发明的探针Cou-H在0-100μM浓度范围内的细胞存活率均在90％以上(图7a)，而对照探针Nile Red当浓度大于5μM时细胞存活率小于80％(图7b)，因此，毒性测试结果表明，本发明的荧光探针Cou-H具有低细胞毒性和高生物相容性的特点。
实施例7：为了研究本发明有机小分子探针在细胞内对脂滴的成像效果，首先将HepG2细胞用外源性脂滴促进剂(油酸)预处理，并与10μM的探针Cou-H进行共孵育，而后用PBS洗涤三次，最后通过共聚焦显微镜拍摄图像以观察探针Cou-H对脂滴的荧光成像效果，结果如图8a所示；同时为了进一步对探针的脂滴成像效果进行考察，首先将用油酸预处理后的HepG2细胞分别与本发明的荧光探针Cou-H以及对照探针Nile Red进行共孵育，通过共聚焦显微镜观察它们的共定位情况(图8b)。
从图8a不难看出，探针Cou-H在细胞质中成黄色荧光，而在脂滴中发出明显的蓝色荧光，这表明探针可以在活细胞内对脂滴具有较好的选择性；其次，通过共定位实验结果(图8b)可以看出探针Cou-H与对照探针Nile Red在活细胞中的发光区域高度重合，这进一步说明了探针Cou-H对细胞内的脂滴具有较高的选择性。
实施例8：为了证明本发明有机小分子荧光探针可适用于不同种类细胞中的内源性脂滴成像。首先，将10μM浓度的探针Cou-H以及对照探针Nile Red与不同种类的细胞进行共孵育15min。然后，通过共聚焦显微镜观察它们对不同细胞中内源性脂滴的成像效果。
从图9可以看出，本发明的探针Cou-H和对照探针Nile Red一样，可以较好的对不同种类细胞中的内源性脂滴进行荧光成像。
实施例10：为了考察本发明有机小分子荧光探针是否能用于活细胞内脂滴的动态观察。首先，将浓度为10μM的探针Cou-H与HepG2细胞共孵育，并用共聚焦显微镜观察0-3min不同时间点被Cou-H染色后的脂滴的位置。
从图10可以直观的看到，探针Cou-H可以很好的用于活细胞内脂滴的动态移动成像。
实施例11：为了考察本发明探针能否在活体动物体内进行脂滴成像。首先，将探针Cou-H以及对照探针Nile Red与斑马鱼进行共孵育，再通过共聚焦显微镜对共孵育后的斑马鱼的荧光成像效果进行观察。
图11的结果表明，探针Cou-H可以在斑马鱼体内实现理想的体内成像。
通过上述实施例及其检测实验的结果可知：本发明的有机小分子荧光探针Cou-H可以在不同种类的细胞内对外源性及内源性脂滴具有较好的荧光成像效果。于此同时，该探针还可用于观察细胞内脂滴的动态移动及体内荧光成像，因此，在脂滴相关疾病的诊断及发病机理研究方面，Cou-H探针具有重要的生物医学意义。
此外，相比于目前商业化的脂滴成像荧光探针，本发明报道的探针Cou-H在生物安全性、光稳定性以及活细胞染色方面都具有显著的优势，在商业领域有着广泛的开发前景。
Claims (9)
1.一种用于实现细胞内脂滴动态成像的小分子荧光探针，其特征在于：该探针具有式(I)所示的结构式：
2.一种如权利要求1所述的用于实现细胞内脂滴动态成像的小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
式(II)所示的荧光素类衍生物与式(III)所示的香豆素类衍生物，在缩合剂及缚酸剂的作用下，于有机溶剂中反应得到式(I)所示的小分子荧光探针Cou-H。
3.根据权利要求2所述的用于实现细胞内脂滴动态成像的小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：所述缩合剂选自：BOP、DCC、PyBOP、HOBT或SOCl2。
4.根据权利要求2所述的用于实现细胞内脂滴动态成像的小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：所述缚酸剂选自：三乙胺、无水碳酸钾、氢氧化钠、N，N-二异丙基乙胺、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸铯、咪唑、吡啶或DBU。
5.根据权利要求2所述的用于实现细胞内脂滴动态成像的小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂选自：甲醇、乙腈、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃、DMF或DMSO。
6.根据权利要求2所述的用于实现细胞内脂滴动态成像的小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：合成步骤中的反应温度选自0-100℃。
7.权利要求1所述的用于实现细胞内脂滴动态成像的小分子荧光探针在细胞外源性脂滴和内源性脂滴检测中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述小分子荧光探针在不同种类细胞内脂滴动态检测中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：在活体动物体细胞内脂滴荧光成像中的应用。
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