CN104819966A - 杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn2+、F-荧光成像的方法 - Google Patents
杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn2+、F-荧光成像的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104819966A CN104819966A CN201510132677.5A CN201510132677A CN104819966A CN 104819966 A CN104819966 A CN 104819966A CN 201510132677 A CN201510132677 A CN 201510132677A CN 104819966 A CN104819966 A CN 104819966A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- probe
- fluorescence
- imaging
- dyeing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- VTJUKNSKBAOEHE-UHFFFAOYSA-N calixarene Chemical compound COC(=O)COC1=C(CC=2C(=C(CC=3C(=C(C4)C=C(C=3)C(C)(C)C)OCC(=O)OC)C=C(C=2)C(C)(C)C)OCC(=O)OC)C=C(C(C)(C)C)C=C1CC1=C(OCC(=O)OC)C4=CC(C(C)(C)C)=C1 VTJUKNSKBAOEHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 21
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 title abstract description 9
- 238000012632 fluorescent imaging Methods 0.000 title abstract 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 173
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 claims abstract description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 226
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 62
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 44
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 43
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims description 38
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 37
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 claims description 24
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 claims description 20
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 claims description 18
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 16
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 16
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 12
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 6
- 241000534944 Thia Species 0.000 claims description 6
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 6
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 4
- 235000004458 antinutrient Nutrition 0.000 claims description 4
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 3
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 abstract description 8
- 239000000975 dye Substances 0.000 abstract description 7
- 230000035699 permeability Effects 0.000 abstract description 3
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 abstract 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 47
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 30
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 11
- 238000011160 research Methods 0.000 description 9
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 7
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 7
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 6
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N Quinoline Chemical compound N1=CC=CC2=CC=CC=C21 SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 4
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- FCPVYOBCFFNJFS-LQDWTQKMSA-M benzylpenicillin sodium Chemical compound [Na+].N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 FCPVYOBCFFNJFS-LQDWTQKMSA-M 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 3
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- HOKKHZGPKSLGJE-GSVOUGTGSA-N N-Methyl-D-aspartic acid Chemical compound CN[C@@H](C(O)=O)CC(O)=O HOKKHZGPKSLGJE-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MWPLVEDNUUSJAV-UHFFFAOYSA-N anthracene Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3C=C21 MWPLVEDNUUSJAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001492 aromatic hydrocarbon derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 150000001455 metallic ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- -1 oxacalixarenes Chemical class 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium fluoride Chemical compound [F-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- IGHBXJSNZCFXNK-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-7-nitrobenzofurazan Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(Cl)C2=NON=C12 IGHBXJSNZCFXNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910020366 ClO 4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010019196 Head injury Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- FRTNIYVUDIHXPG-UHFFFAOYSA-N acetic acid;ethane-1,2-diamine Chemical class CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.NCCN FRTNIYVUDIHXPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000004715 cellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005595 deprotonation Effects 0.000 description 1
- 238000010537 deprotonation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005485 electric heating Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000003920 environmental process Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002678 macrocyclic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003233 pyrroles Chemical class 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000002504 synaptic vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001428 transition metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明建立了一种杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn2+、F-成像的方法，利用两种选择性键合Zn2+、F-的硫杂杯[4]芳烃荧光探针，化学名称分别为：1,3-交替-5,11,17,23-四叔丁基-25,27-二[（7-羟基-8-香豆素亚氨基）乙氧基]-26,28-二（2-甲氧基乙氧基）硫杂杯[4]和1,3-交替-5,11,17,23-四叔丁基-25,27-二[（7-羟基-8-香豆素亚氨基）乙氧基]-26,28-硫杂杯[4]冠-5，分别作为人体活性癌细胞内微量Zn2+、F-的荧光成像试剂，探针与活性细胞相容，能渗透且无毒性。通过探针1、2分别对细胞内Zn2+、F-染色后，用荧光倒置显微镜检测拍摄到清晰的蓝色荧光细胞图像。
Description
技术领域
本发明属分析化学领域，具体地说是杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn2+、F-成像的方法。
背景技术
活细胞成像技术是生命科学领域重要的研究手段，可以解释活细胞中的多种生命和生理现象。随着生命科学的发展，对细胞内的活性物种、细胞信号传导及细胞凋亡等方面的信息研究越来越深入。美国加州大学戴维斯分校(UC Davis)生物光子学科学技术中心(CBST)的科研人员首次通过荧光标记成功地对活肿瘤细胞内部的纳米尺寸区室的运动进行了成像。研究成果为未来理解癌症和一大批其他疾病的分子原因和生物力学的突破进展带来了希望，还能促进神经科学和干细胞研究。荧光成像分析是目前广泛应用于活细胞分析的一种高灵敏的可视化分析技术。目前用于活细胞成像分析的荧光探针多为有机小分子荧光染料，在实际应用中，这些有机荧光染料分子存在着荧光寿命较短、容易猝灭、生物相容性及稳定性差的缺点。实现长时间、实时、动态连续测定，提高可视化分析的选择性和精确度是迫切需要解决的问题。合适的细胞内荧光探针需要具备：（1）高量子产率的发光信号；（2）长激发波长以，避免紫外线对细胞的损伤；（3）长发射波长，避免自发性荧光干扰，方便使用典型的荧光显微镜滤光设置；（4）被动的和不可逆转地加载到细胞内的性质。
细胞内的小分子物种包括各种活性氧物种（单线态氧、过氧化氢、 超氧负离子自由基等）、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Cu2+及阴离子等是人们研究关注的焦点，它们调控着细胞的诸多功能与性质，在细胞内起着非常重要的作用，因此实现活体细胞内各种生理活性小分子物种的实时在线动态检测对生命科学研究有重要的价值。
锌是继铁之后在人体中含量最丰富的过渡金属，浓度范围从纳摩尔到毫摩尔，在生理功能中的独特作用，对生物样品中锌离子的检测和成像最值得研究。锌对维持正常细胞功能到人体生长发育是必不可少的，同时承担中枢神经系统中信号传输功能，包括高水平的锌离子通过刺激神经末梢大量地局部进入突触囊泡。从暂时性缺血后神经终端持续发作到头部创伤。多离子通道和受体行为，如N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDA）和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体均受锌离子释放影响。然而，关于细胞内的锌的分布、积累和迁移知之甚少，主要的挑战在于将锌探针的体内应用。
高灵敏、高选择的金属离子，特别是重金属/过渡金属离子在细胞环境中的检测探针尤为关注。发光探针应用在生物医学成像上，需要评价其在细胞内的性质并优化其光物理性能。体内外检测锌离子的荧光探针已有了长足发展。然而，一些报道的锌离子探针水溶性差，且受其他金属离子干扰。而且目前大多数的探针建立在蒽、荧光素和喹啉等荧光团基础上，其发射波长小于550 nm，应用在细胞环境中易收到自发荧光的干扰。
阴离子特别是氟离子探针在生物、环境和化学过程中有广泛的研究。氟离子在化学、工业 、食品、卫生保健领域中的重要性无容置疑，但越来越多的氟应用在合成材料和生物催化中导致其有害和不可避免的释放。在阴离子识别中，因氟离子的高水合作用焓而最具挑战性的。在实际应用中，能分析检测氟离子的多模式比色和荧光探针很受重视。已报道的具有去质子化功能基的氟离子探针能够有选择地分辨具有相似碱度和相似表面电荷密度的阴离子基底。此外，大多数阴离子探针对水和电解质的兼容性问题也是需要解决的。各种结构的选择性识别和检测阴离子的探针构建，包括氨基化合物、吡咯、尿素、硫脲、正电荷的咪唑嗡盐，胍盐，吡啶等被用于阴离子识别。但是，具有良好光稳定性、合适的水溶性、对细胞无毒且细胞膜通透性好、在细胞内具有强的荧光发射的氟离子探针，并用于细胞成像的成功例子非常少。
杯芳烃是一类新型大环化合物，以经典杯芳烃为先导已发展出氧杂杯芳烃、硫杂杯芳烃等新型化合物。以杯芳烃为分子平台，研制出各种荧光探针化合物。杯芳烃化合物已应用于很多领域，包括阴/阳离子配合物的传感、污染修复和催化等。杯芳烃应用在生物体系，包括可用于模拟离子通道、模拟酶、蛋白质表面识别，用于核磁共振成像试剂平台、给药系统、固体脂质纳米粒子和抗菌剂等。杯[4]芳烃衍生物在限制细胞活性、致免疫性和毒性等方面已有研究。然而，在细胞摄取及细胞命运过程中没有相关报道。通过杯[4]芳烃荧光衍生物探针可方便地用于研究摄取和定位细胞器，为研究和开发杯[4]芳烃药物和药物传输系统提供有用的信息。
目前报道的杯芳烃荧光探针文献不超过百篇，能应用于细胞中分子/离子荧光成像的仅有6篇。Anja Mueller等在2011年报道了利用一种阳离子荧光标记的杯[4]芳烃，用于细胞中溶酶体成像；Rakesh K. Pathak等在2012年报道了一种含亚氨基的三唑基-杯[4]芳烃结构的Zn2+荧光探针，利用探针-Zn2+配合物实现对活性HeLa细胞中组氨酸和半胱氨酸的荧光成像。同年他们还报道了利用该杯芳烃-Cd2+配合物用于细胞中半胱氨酸的荧光成像，但都是基于荧光猝灭成像，即荧光影像消失；Rakesh Kumar Pathak等于2013年报道了的双喹啉修饰的硫杂杯[4]芳烃荧光探针，应用于细胞中Fe3+荧光成像；2008年Ruth Lalor等报道了4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂恶二唑（NBD-Cl）修饰的杯[4]芳烃荧光探针，研究了探针对仓鼠细胞标记性能。除此之外，在硫杂、氧杂杯芳烃荧光探针中，能用于活性细胞荧光染色的鲜有报道，能同时实现对细胞中微量Zn2+和F-荧光成像的方法未见报道。杯芳烃荧光探针应用于细胞研究的最大挑战在于必须具备很好的水溶稳定性和很好的细胞渗透性，同时对细胞无毒性，才具有应用于细胞成像试剂的基本条件。
发明内容
本发明的目的在于利用两种硫杂杯[4]芳烃荧光探针对Zn2+和F-的选择性、高灵敏荧光增强的检测识别作用，研究出能高选择、高灵敏地对活体细胞中微量Zn2+和F-的荧光染色和成像方法。
本发明杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn2+、F-成像的方法，分别以1,3-交替-5,11,17,23-四叔丁基-25,27-二[（7-羟基-8-香豆素亚氨基）乙氧基]-26,28-二（2-甲氧基乙氧基）硫杂杯[4]或1,3-交替-5,11,17,23-四叔丁基-25,27-二[（7-羟基-8-香豆素亚氨基）乙氧基]-26,28-硫杂杯[4]冠-5，简称探针1、探针2，化学结构式为：
作为细胞内微量Zn2+、F-的荧光成像探针，探针与活性细胞相容，能渗透到细胞内，通过探针1、探针2分别对细胞内Zn2+、F-染色后，用荧光倒置显微镜检测出清晰的蓝色荧光细胞图像，探针1、探针2是活细胞中Zn2+、F-的荧光成像试剂。
上述杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn2+、F-成像的方法，分别用探针1、探针2对细胞内Zn2+进行染色和成像的具体方法为：（1）活性细胞培养：活性细胞经复苏接种于含10%胎牛血清和含1%双抗的培养基（RPMI 1640）中，在37℃，5% CO2及饱和湿度为100%的培养箱中培养、传代，接种于12孔板中，密度约为2×104个/ml；（2）探针对细胞染色：将细胞浸入10 μmol·L-1探针1或探针2的培养基（90%培养基，9% H2O，1% THF，v/v）混合溶液中，培养箱中孵育30 min，用新鲜培养基清洗细胞，荧光显微镜下明场和暗场拍照；（3）细胞内探针对Zn2+染色：将上述步骤（2）中经探针1或探针2染色后的细胞再浸入含10 μmol·L-1 Zn2+的培养基溶液，培养箱中孵育30 min，用新鲜培养基清洗细胞，荧光显微镜下暗场拍照，细胞影像拍照获得清晰的细胞轮廓影像。
上述杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn2+、F-成像的方法，分别用探针1、探针2对细胞内F-进行染色和成像的具体方法为（1）活性细胞培养：活性细胞经复苏接种于含10%胎牛血清和含1%双抗的培养基（RPMI 1640或高糖DMEM）中，在37℃，5% CO2及饱和湿度为100%的培养箱中培养、传代，接种于12孔板中，密度约为2×104个/ml；（2）探针对细胞染色：将步骤（1）细胞浸入10 μmol·L-1探针1或探针2的培养基（90%培养基，9% H2O，1% THF，v/v）混合溶液中，培养箱中孵育30 min，用新鲜培养基清洗细胞，荧光显微镜下明场和暗场拍照；（3）细胞内探针对F-染色：将上述步骤（2）中经探针1或探针2染色后的细胞再浸入含50 μmol·L-1 F-的培养基溶液，培养箱中孵育60 min，用新鲜培养基清洗细胞，荧光显微镜下暗场拍照。
上述杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn2+、F-成像的方法，在对细胞染色成像中，探针1、探针2以及Zn2+、F-都能渗透到活体细胞内，细胞呈圆滑饱满状，与细胞具有良好的相容性，在24小时内未见细胞凋亡，对细胞无毒性；探针与细胞染色后荧光显微镜不能拍到细胞的荧光影像；而经探针染色后再分别与Zn2+或F-离子二次染色后，荧光显微镜检测到清晰的蓝色荧光细胞分布，拍到清晰的细胞轮廓荧光影像。
上述杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn2+、F-成像的方法，所用的细胞为活性人体癌细胞：PC3细胞为人体前列腺癌细胞，HeLa细胞为人体子宫颈癌细胞；试剂为分析纯和生化试剂，水为二次蒸馏水或生理盐水；拍照设备为荧光倒置相差显微镜，拍照设备为荧光倒置相差显微镜，在激发波长范围为330~385nm的蓝色通道激发下，观察到细胞呈现清晰的蓝色荧光影像。
本发明首次利用两种硫杂杯[4]芳烃衍生物作为活性人体癌细胞细胞中Zn2+、F-的荧光成像探针，说明该探针具有（1）良好的水溶性；（2）在生理条件下良好的热稳定性；（3）良好的膜穿透性，并且对细胞是无毒的；（4）与Zn2+、F-有选择性、高灵敏的荧光增强作用，有较高的发光产率。利用杯芳烃探针在活体细胞内与金属离子和阴离子的染色作用，用荧光倒置显微镜能清晰获得发射蓝色荧光的细胞图像。成像方法简便、快速、灵敏。发明了一种新颖的活体细胞的荧光成像技术。
附图说明
图1 探针1对PC3细胞中Zn2+的荧光显微成像照片。用IX-71型荧光倒置显微镜拍照。
1-1经浓度为10 μmol·L-1探针1孵育后的PC3细胞明场显微照片，细胞呈饱满状态，证明探针1在实验条件下对PC3细胞没有毒性；
1-2经浓度为10 μmol·L-1的探针1孵育后的PC3细胞暗场荧光显微照片，无荧光影像显示。波长范围为330~385nm的蓝色通道激发。
1-3经浓度为10 μmol·L-1的探针1孵育后的PC3细胞，再经浓度为10 μmol·L-1的Zn2+孵育后的PC3细胞暗场荧光显微照片，微镜观测到清晰的细胞蓝色荧光分布，证明探针1与Zn2+离子在细胞内实现了染色，呈现细胞染色荧光成像。波长范围为330~385nm的蓝色通道激发。
图2 探针1对PC3细胞中F-的荧光显微成像照片。用IX-71型荧光倒置显微镜拍照。暗场拍摄时用波长范围为330~385nm的蓝色通道激发。
2-1经浓度为10 μmol·L-1的探针1孵育后的PC3细胞明场显微照片，细胞呈饱满状态，证明探针1在实验浓度内对PC3细胞没有毒性；2-2经浓度为10 μmol·L-1的探针1孵育后的PC3细胞的暗场荧光显微照片，显无荧光影像显示；
2-3经浓度为10 μmol·L-1的探针1孵育后的PC3细胞，再经浓度为50 μmol·L-1的F-孵育后的暗场荧光显微照片，显微镜观测到清晰的细胞蓝色荧光分布，证明探针1与F-离子在细胞内实现了染色，呈现细胞染色荧光成像。
图3 探针2对PC3细胞中Zn2+的荧光显微成像照片。用IX-71型荧光倒置显微镜拍照。暗场拍摄时用波长范围为330~385nm的蓝色通道激发。
3-1经浓度为10 μmol·L-1探针2孵育后的PC3细胞明场显微照片，细胞呈饱满状态，证明探针2在实验条件下对PC3细胞没有毒性；
3-2经浓度为10 μmol·L-1的探针2孵育后的PC3细胞暗场荧光显微照片，无荧光影像显示；
3-3经浓度为10 μmol·L-1的探针2孵育后的PC3细胞，再经浓度为10 μmol·L-1的Zn2+孵育后的PC3细胞暗场荧光显微照片，微镜观测到清晰的细胞蓝色荧光分布，证明探针2与Zn2+离子在细胞内实现了染色，呈现细胞染色荧光成像。
图4 探针3对PC3细胞中F-的荧光显微成像照片。用IX-71型荧光倒置显微镜拍照。暗场拍摄时用波长范围为330~385nm的蓝色通道激发。
4-1经浓度为10 μmol·L-1的探针2孵育后的PC3细胞明场显微照片，细胞呈饱满状态，证明探针2在实验浓度内对PC3细胞没有毒性；4-2经浓度为10 μmol·L-1的探针2孵育后的PC3细胞的暗场荧光显微照片，显无荧光影像显示；
4-3经浓度为10 μmol·L-1的探针2孵育后的PC3细胞，再经浓度为50 μmol·L-1的F-孵育后的暗场荧光显微照片，显微镜观测到清晰的细胞蓝色荧光分布，证明探针2与F-离子在细胞内实现了染色，呈现细胞染色荧光成像。
图5 探针1对PC3细胞中Zn2+的荧光显微成像照片。用Ti型荧光倒置显微镜拍照。暗场拍摄时用波长范围为330~385nm的蓝色通道激发。
5-1经浓度为10 μmol·L-1探针1孵育后的PC3细胞明场显微照片，细胞呈饱满状态，证明探针1在实验条件下对PC3细胞没有毒性；
5-2经浓度为10 μmol·L-1的探针1孵育后的PC3细胞暗场荧光显微照片，无荧光影像显示；
5-3经浓度为10 μmol·L-1的探针1孵育后的PC3细胞，再经浓度为10 μmol·L-1的Zn2+孵育后的PC3细胞暗场荧光显微照片，微镜观测到清晰的细胞蓝色荧光分布，证明探针1与Zn2+离子在细胞内实现了染色，呈现细胞染色荧光成像；
图6 探针1对HeLa细胞中Zn2+的荧光显微成像照片。用Ti型荧光倒置显微镜拍照。暗场拍摄时用波长范围为330~385nm的蓝色通道激发。
6-1经浓度为10 μmol·L-1探针1孵育后的HeLa细胞明场显微照片，细胞呈饱满状态，证明探针1在实验条件下对HeLa细胞没有毒性；
6-2经浓度为10 μmol·L-1的探针1孵育后的HeLa细胞暗场荧光显微照片，无荧光影像显示；
6-3经浓度为10 μmol·L-1的探针1孵育后的HeLa细胞，再经浓度为10 μmol·L-1的Zn2+孵育后的HeLa细胞暗场荧光显微照片，微镜观测到清晰的细胞蓝色荧光分布，证明探针1与Zn2+离子在细胞内实现了染色，呈现细胞染色荧光成像。
具体实施方式
实施例一：本发明中各溶液、试剂的配制方法
（1）探针1、探针2溶液的配制方法：称取13mg的探针1和或探针2，均用THF/H2O（THF体积占10%）溶解，配制成100mL溶液，浓度为1.00×10-4mol·L-1；
（2）Zn2+标准溶液：称取37mg分析纯Zn(ClO4)2，用生理盐水溶解，配制成100mL溶液，浓度为1.00×10-3 mol·L-1；根据需要用生理盐水逐级稀释到适宜的浓度；
（3）F-标准溶液：称取26mg分析纯四丁基氟化铵，用生理盐水溶解，配制成100mL溶液，浓度为1.00×10-3 mol·L-1；根据需要用生理盐水逐级稀释到适宜的浓度；
（4）75%的乙醇溶液：无水乙醇75mL加蒸馏水至100mL，混匀，室温保存备用。
（5）平衡盐磷酸盐缓冲溶液（D-hanks溶液）：0.4gKCl、0.06g KH2PO4、8.0gNaCl、1.0g C6H12O6、0.35gNaHCO3、0.152g Na2HPO4·12H2O、10万IU双抗，调整pH为7.2~7.4，去离子水定容至1000mL，针式滤器（0.22um微孔滤膜）过滤除菌，分装备用。
（6）1万单位（IU）/mL双抗溶液：将青霉素钠（80万单位）溶于40mL D-hanks（平衡盐缓冲液）溶液中，配成终浓度2万单位/mL；将硫酸链霉素（160万单位）溶于80mL D-hanks溶液中，配成浓度2万单位/mL。分别取等体积的青霉素钠溶液和硫酸链霉素溶液混合，得到青霉素钠和硫酸链霉素的浓度均为1万单位/mL的溶液；针式滤器（0.22um微孔滤膜）过滤除菌，分装1mL/支，-20℃保存备用。
（7）0.25%胰蛋白酶：称取0.25g胰蛋白酶，溶解于100mL的D-hanks液中，针式滤器（0.22um微孔滤膜）过滤除菌，分装1mL/支，-20℃保存备用。
（8）0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）：将0.02g EDTA，溶解于100mL的D-hanks液中，针式滤器（0.22um进口微孔滤膜）过滤除菌，分装1mL/支，-20℃保存备用。
（9）培养液：用无菌移液管量取10mL已灭活的胎牛血清、90mL培养基（改良型RPMI-1640或高塘DMEM）以及1mL双抗液混合于100mL的无菌培养瓶中，2~8℃保存备用。
本发明所用ThermoFisher 8000储水型CO2细胞培养箱（中国赛默飞世尔科技有限公司）；IX-71型荧光倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；Ti型号的倒置荧光相差显微镜及成像系统（日本Nikon公司）；暗场拍摄时用激发波长范围为330~385nm的蓝色通道激发。LS-B75立式压力蒸汽灭菌器（美国Corning公司）；DHG-9230A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。
实施例二：PC3细胞和HeLa细胞的培养
（1）复苏细胞
从-80℃冰箱内取出PC3细胞和HeLa细胞，置于37℃的水中快速晃动细胞冻存管，于1-2分钟内完全解冻，在无菌操作台内，将其吸入离心管内，加约11ml实施例一中配制的培养液（PC3细胞中加改良型RPMI-1640培养液，HeLa细胞加高塘DMEM培养液）混均，并将此细胞悬液于1000r/min离心机上离心5min，去除上层清液，将底部沉淀的细胞加培养液轻吹打散混均转移到培养瓶内，使培养瓶中培养液体积在5-7mL内，并置入37℃，含5% CO2的培养箱内进行培养。
（2）观察—传代—接板
每日更换一次培养液，并在显微镜下观察细胞生长情况，直至PC3细胞和HeLa细胞贴壁长满于整个培养瓶壁上，即可传代，在无菌操作台内倒掉旧培养液，加入1mL的EDTA液侵入细胞30s后倒掉，再加入1mL的胰蛋白酶液进行消化，在显微镜下观察直至细胞缩小变圆后，拍打培养瓶使细胞脱落并立即加入适量培养液阻止消化，将它一分为二培养于2个培养瓶中，待传代后的细胞贴壁铺满于整个培养瓶壁上时，与传代操作相同，加入EDTA和胰蛋白酶后使细胞消化脱落并立即加入3mL的培养液阻止消化，准备接种于12孔板内。在每个孔板内加入200mL的已阻止消化的细胞液，再加适量新培养液混均后将孔板置入37℃，含5% CO2的培养箱内进行培养。次日观察孔板内的细胞生长状况，待细胞贴壁生成，弃去旧培养液，用新培养液洗涤2次，备用。
实施例三：探针1对活体PC3细胞的Zn2+、F-荧光显微成像
A组：往细胞培养板的3个孔内加入10 μmol·L-1的探针1溶液（90%培养基，9% H2O，1% THF，v/v）混合溶液中；再往细胞培养板的另3个孔内加入20 μmol·L-1的探针1溶液（90%培养基，9% H2O，1% THF，v/v）混合溶液中，在37℃，含5%CO2的培养箱内孵育30分钟，用新鲜的改良型RPMI-1640培养基洗两次，置于IX-71型荧光倒置显微镜下进行明场和暗场成像拍照，细胞并无荧光显示。（附图1-1、1-2）。经探针1孵育过的上述6个孔的PC3细胞，一一对应分别浸入浓度为10 μmol·L-1的Zn2+溶液（90%培养基，10% H2O，v/v）混合溶液中、50 μmol·L-1的Zn2+溶液（90%培养基，10% H2O，v/v）混合溶液中、100 μmol·L-1的Zn2+溶液（90%培养基，10% H2O，v/v）混合溶液中，在37℃，含5% CO2的培养箱内孵育30分钟后，吸出培养液，所得细胞用新鲜的改良型RPMI-1640培养基洗两次，置于荧光倒置显微镜下进行暗场荧光成像拍照，结果表明，在Zn2+浓度为10~100 μmol·L-1范围，探针1浓度在10~20 μmol·L-1范围内对细胞进行染色后，均能通过IX-71型荧光倒置显微镜观察到蓝色荧光细胞图像。经10 μmol·L-1的探针1溶液和10 μmol·L-1 的Zn2+溶液染色过的细胞呈现清晰的蓝色荧光图像（附图1-3）。说明探针1对PC3细胞内的Zn2+染色成功。
B组：往细胞培养板的3个孔内加入10 μmol·L-1的探针1溶液；再往细胞培养板的另3个孔内加入2×10-5 mol·L-1的探针1，在37℃，含5%CO2的培养箱内孵育30分钟，用新鲜的改良型RPMI-1640培养基洗两次，置于IX-71型荧光倒置显微镜下进行明场和暗场成像拍照，细胞并无荧光显示（附图2-1、2-2）。经探针1孵育过的上述6个孔的PC3细胞，一一对应分别浸入浓度为10 μmol·L-1的F-溶液（90%培养基，10% H2O，v/v）混合溶液中、50 μmol·L-1 的F-溶液（90%培养基，10% H2O，v/v）混合溶液中、100 μmol·L-1 的F-溶液（90%培养基，10% H2O，v/v）混合溶液中，在37℃，含5% CO2的培养箱内孵育60分钟后，吸出培养液，所得细胞用新鲜的改良型RPMI-1640培养基洗两次，置于IX-71型荧光倒置显微镜下进行暗场荧光成像拍照，结果表明，在F-浓度为10~100 μmol·L-1范围，探针1浓度在10~20 μmol·L-1范围内对细胞进行染色后，均能通过荧光倒置显微镜观察到蓝色荧光细胞图像。经10 μmol·L-1的探针1溶液和50 μmol·L-1 的F-溶液染色过的细胞呈现清晰的蓝色荧光图像（附图2-3）。说明探针1对PC3细胞内的F-染色成功。
实施例四：探针2对活体PC3细胞的Zn2+、F-荧光显微成像
A组：往细胞培养板的3个孔内加入10 μmol·L-1的探针2溶液(配制同探针1溶液）；再往细胞培养板的另3个孔内加入20 μmol·L-1的探针2溶液(配制同探针1溶液），在37℃，含5%CO2的培养箱内孵育30分钟，用新鲜的改良型RPMI-1640培养基洗两次，置于IX-71型荧光倒置显微镜下进行明场和暗场成像拍照，细胞并无荧光显示（附图3-1、3-2）。经探针2孵育过的上述6个孔的PC3细胞，一一对应分别浸入浓度为10 μmol·L-1、50 μmol·L-1和100 μmol·L-1的Zn2+溶液中，在37℃，含5% CO2的培养箱内孵育30分钟后，吸出培养液，所得细胞用新鲜的改良型RPMI-1640培养基洗两次，置于IX-71型荧光倒置显微镜下进行暗场荧光成像拍照，结果表明，在Zn2+浓度为10~100 μmol·L-1范围，探针2浓度在10~20 μmol·L-1范围内对细胞进行染色后，均能通过荧光倒置显微镜观察到蓝色荧光细胞图像。经10 μmol·L-1的探针2溶液和10 μmol·L-1 的Zn2+溶液染色过的细胞呈现清晰的蓝色荧光图像（附图3-3）。说明探针2对PC3细胞内的Zn2+染色成功。
B组：往细胞培养板的3个孔内加入10 μmol·L-1的探针2溶液；再往细胞培养板的另3个孔内加入20 μmol·L-1的探针2溶液，在37℃，含5%CO2的培养箱内孵育30分钟，用新鲜的改良型RPMI-1640培养基洗两次，置于IX-71型荧光倒置显微镜下进行明场和暗场成像拍照，细胞并无荧光显示（附图4-1、4-2）。经探针2孵育过的上述6个孔的PC3细胞，一一对应分别浸入浓度为10 μmol·L-1、50 μmol·L-1和100 μmol·L-1 的F-溶液中，在37℃，含5% CO2的培养箱内孵育60分钟后，吸出培养液，所得细胞用新鲜的改良型RPMI-1640培养基洗两次，置于IX-71型荧光倒置显微镜下进行暗场荧光成像拍照，结果表明，在F-浓度为10~100 μmol·L-1范围，探针2浓度在10~20 μmol·L-1范围内对细胞进行染色后，均能通过荧光倒置显微镜观察到蓝色荧光细胞图像。经10 μmol·L-1的探针2溶液和50 μmol·L-1 的F-溶液染色过的细胞呈现清晰的蓝色荧光图像（附图4-3）。说明探针2对PC3细胞内的F-染色成功。
实施例五：探针1对PC3细胞中Zn2+荧光显微成像
往细胞培养板的3个孔内加入10 μmol·L-1的探针1溶液；再往细胞培养板的另3个孔内加入20 μmol·L-1的探针1溶液，在37℃，含5%CO2的培养箱内孵育30分钟，用新鲜的改良型RPMI-1640培养基洗两次，置于Ti型荧光倒置显微镜下进行明场和暗场成像拍照，细胞并无荧光显示（附图5-1、5-2）。经探针1孵育过的上述6个孔的PC3细胞，一一对应分别浸入浓度为10 μmol·L-1、50 μmol·L-1和100 μmol·L-1的Zn2+溶液中，在37℃，含5% CO2的培养箱内孵育30分钟后，吸出培养液，所得细胞用新鲜的改良型RPMI-1640培养基洗两次，置于Ti型荧光倒置显微镜下进行暗场荧光成像拍照，结果表明，在Zn2+浓度为10~100 μmol·L-1范围，探针1浓度在10~20 μmol·L-1范围内对细胞进行染色后，均能通过荧光倒置显微镜观察到蓝色荧光细胞图像。经10 μmol·L-1的探针1溶液和10 μmol·L-1 的Zn2+溶液染色过的细胞呈现清晰的蓝色荧光图像（附图5-3）。说明探针1对PC3细胞内的Zn2+染色成功。
实施例六：探针1对HeLa细胞中Zn2+荧光显微成像
往HeLa细胞培养板的3个孔内加入10 μmol·L-1的探针1溶液；再往细胞培养板的另3个孔内加入20 μmol·L-1的探针1，在37℃，含5%CO2的培养箱内孵育30分钟，用新鲜的高糖DMEM培养基洗两次，置于Ti型荧光倒置显微镜下进行明场和暗场成像拍照，细胞并无荧光显示（附图6-1、6-2）。经探针1孵育过的上述6个孔的HeLa细胞，一一对应分别浸入浓度为10 μmol·L-1、50 μmol·L-1和100 μmol·L-1的Zn2+溶液中，在37℃，含5% CO2的培养箱内孵育30分钟后，吸出培养液，所得细胞用新鲜的高糖DMEM培养基洗两次，置于Ti型荧光倒置显微镜下进行暗场荧光成像拍照，结果表明，在Zn2+浓度为10~100 μmol·L-1范围，探针1浓度在10~20 μmol·L-1范围内对细胞进行染色后，均能通过荧光倒置显微镜观察到蓝色荧光细胞图像。经10 μmol·L-1的探针1溶液和10 μmol·L-1 的Zn2+溶液染色过的细胞呈现清晰的蓝色荧光图像（附图6-3）。说明探针1对HeLa细胞内的Zn2+染色成功。
Claims (5)
1.杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn2+、F-成像的方法，其特征是分别以1,3-交替-5,11,17,23-四叔丁基-25,27-二[（7-羟基-8-香豆素亚氨基）乙氧基]-26,28-二（2-甲氧基乙氧基）硫杂杯[4]或1,3-交替-5,11,17,23-四叔丁基-25,27-二[（7-羟基-8-香豆素亚氨基）乙氧基]-26,28-硫杂杯[4]冠-5，简称探针1、2，化学结构式为：
作为细胞内微量Zn2+、F-的荧光成像探针，探针与活性细胞相容，能渗透到细胞内，通过探针1、探针2分别对细胞内Zn2+或F-染色后，用荧光倒置显微镜检测出清晰的蓝色荧光细胞图像，探针1、探针2是活细胞中Zn2+、F-的荧光成像试剂。
2.根据权利要求1所述的杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn2+、F-成像的方法，其特征是分别用探针1、探针2对细胞内Zn2+进行染色和成像的具体方法为：（1）活性细胞培养：活性细胞经复苏接种于含10%胎牛血清和含1%双抗的培养基（RPMI 1640）中，在37℃，5% CO2及饱和湿度为100%的培养箱中培养、传代，接种于12孔板中，密度约为2×104个/ml；（2）探针对细胞染色：将步骤（1）细胞浸入10 μmol·L-1探针1或2的培养基（90%培养基，9% H2O，1% THF，v/v）混合溶液中，培养箱中孵育30 min，用新鲜培养基清洗细胞，荧光显微镜下明场和暗场拍照；（3）细胞内探针对Zn2+染色：将上述步骤（2）中经探针1或2染色后的细胞再浸入含10 μmol·L-1 Zn2+的培养基溶液，培养箱中孵育30 min，用新鲜培养基清洗细胞，荧光显微镜下暗场拍照，细胞影像拍照获得清晰的细胞轮廓影像。
3.根据权利要求1所述的杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn2+、F-成像的方法，其特征是分别用探针1、探针2对细胞内F-进行染色和成像的具体方法为（1）活性细胞培养：活性细胞经复苏接种于含10%胎牛血清和含1%双抗的培养基（RPMI 1640或高糖DMEM）中，在37℃，5% CO2及饱和湿度为100%的培养箱中培养、传代，接种于12孔板中，密度约为2×104个/ml；（2）探针对细胞染色：将步骤（1）细胞浸入10 μmol·L-1探针1或2的培养基（90%培养基，9% H2O，1% THF，v/v）混合溶液中，培养箱中孵育30 min，用新鲜培养基清洗细胞，荧光显微镜下明场和暗场拍照；（3）细胞内探针对F-染色：将上述步骤（2）中经探针1或2染色后的细胞再浸入含50 μmol·L-1 F-的培养基溶液，培养箱中孵育60 min，用新鲜培养基清洗细胞，荧光显微镜下暗场拍照。
4.按照权利要求1、2或3所述的杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn2+、F-成像的方法，其特征是在对细胞染色成像中，探针1、探针2以及Zn2+、F-都能渗透到活体细胞内，细胞呈圆滑饱满状，与细胞具有良好的相容性，在24小时内未见细胞凋亡，对细胞无毒性；探针与细胞染色后荧光显微镜不能拍到细胞的荧光影像；而经探针染色后再分别与Zn2+或F-离子二次染色后，荧光显微镜检测到清晰的蓝色荧光细胞分布，拍到清晰的细胞轮廓荧光影像。
5.按照权利要求2或3所述的杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn2+、F-成像的方法，其特征是所用的细胞为活性人体癌细胞：PC3细胞为人体前列腺癌细胞，HeLa细胞为人体子宫颈癌细胞；试剂为分析纯和生化试剂，水为二次蒸馏水或生理盐水；拍照设备为荧光倒置相差显微镜，在激发波长范围为330~385nm的蓝色通道激发下，观察到细胞呈现清晰的蓝色荧光影像。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510132677.5A CN104819966B (zh) | 2015-03-25 | 2015-03-25 | 杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn2+、F-荧光成像的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510132677.5A CN104819966B (zh) | 2015-03-25 | 2015-03-25 | 杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn2+、F-荧光成像的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104819966A true CN104819966A (zh) | 2015-08-05 |
| CN104819966B CN104819966B (zh) | 2018-09-11 |
Family
ID=53730322
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510132677.5A Active CN104819966B (zh) | 2015-03-25 | 2015-03-25 | 杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn2+、F-荧光成像的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104819966B (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105039242A (zh) * | 2015-08-26 | 2015-11-11 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种促进Ru(II)金属络合物细胞核摄取的方法 |
| CN107219209A (zh) * | 2017-07-21 | 2017-09-29 | 贵州大学 | 一种双通道荧光成像检测活细胞中微量Al3+的方法 |
| CN108586502A (zh) * | 2018-03-15 | 2018-09-28 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物及其合成方法和应用 |
| CN111057034A (zh) * | 2019-12-02 | 2020-04-24 | 西北师范大学 | 香豆素功能化的柱[5]芳烃及其合成和应用 |
| CN113831911A (zh) * | 2021-08-19 | 2021-12-24 | 南开大学 | 一种基于细胞外囊泡的缺氧响应共组装体系及其制备方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103342699A (zh) * | 2013-07-16 | 2013-10-09 | 贵州大学 | 一种香豆素-硫杂杯[4]芳烃荧光试剂及其制备方法和应用 |
| CN104101577A (zh) * | 2014-08-05 | 2014-10-15 | 贵州大学 | 一种比率吸收光度法测定Ag+或F-的方法 |
| CN104122222A (zh) * | 2014-08-07 | 2014-10-29 | 贵州大学 | 一种检测微量Zn2+或F-的紫外比率吸收光谱分析法 |
| CN104198449A (zh) * | 2014-08-08 | 2014-12-10 | 贵州大学 | 一种用于活细胞成像的荧光探针方法 |
-
2015
- 2015-03-25 CN CN201510132677.5A patent/CN104819966B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103342699A (zh) * | 2013-07-16 | 2013-10-09 | 贵州大学 | 一种香豆素-硫杂杯[4]芳烃荧光试剂及其制备方法和应用 |
| CN104101577A (zh) * | 2014-08-05 | 2014-10-15 | 贵州大学 | 一种比率吸收光度法测定Ag+或F-的方法 |
| CN104122222A (zh) * | 2014-08-07 | 2014-10-29 | 贵州大学 | 一种检测微量Zn2+或F-的紫外比率吸收光谱分析法 |
| CN104198449A (zh) * | 2014-08-08 | 2014-12-10 | 贵州大学 | 一种用于活细胞成像的荧光探针方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| YU FU等: "Use of a new thiacalix[4]arene derivative bearing two 4-chloro-7-nitrobenzofurazan groups as a colorimetric and fluorescent chemosensor for Ag+ and AcO−", 《SENSORS AND ACTUATORS B 》 * |
| 王鹤文等: "键合香豆素席夫碱基的杯［４］芳烃的合成及其对金属离子的荧光识别作用", 《应用化学》 * |
| 赵江林等: "硫杂杯[4]-冠-5稠杂环类荧光探针的合成", 《全国第十五届大环化学暨第七届超分子化学学术讨论会摘要集》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105039242A (zh) * | 2015-08-26 | 2015-11-11 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种促进Ru(II)金属络合物细胞核摄取的方法 |
| CN105039242B (zh) * | 2015-08-26 | 2018-08-31 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种促进Ru(II)金属络合物细胞核摄取的方法 |
| CN107219209A (zh) * | 2017-07-21 | 2017-09-29 | 贵州大学 | 一种双通道荧光成像检测活细胞中微量Al3+的方法 |
| CN108586502A (zh) * | 2018-03-15 | 2018-09-28 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物及其合成方法和应用 |
| CN108586502B (zh) * | 2018-03-15 | 2019-12-27 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物及其合成方法和应用 |
| CN111057034A (zh) * | 2019-12-02 | 2020-04-24 | 西北师范大学 | 香豆素功能化的柱[5]芳烃及其合成和应用 |
| CN113831911A (zh) * | 2021-08-19 | 2021-12-24 | 南开大学 | 一种基于细胞外囊泡的缺氧响应共组装体系及其制备方法 |
| CN113831911B (zh) * | 2021-08-19 | 2022-07-22 | 南开大学 | 一种基于细胞外囊泡的缺氧响应共组装体系及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104819966B (zh) | 2018-09-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104819966A (zh) | 杯芳烃荧光探针应用于活细胞中Zn2+、F-荧光成像的方法 | |
| Trouillon et al. | Chemical analysis of single cells | |
| CN104198449B (zh) | 一种用于活细胞成像的荧光探针方法 | |
| O'Riordan et al. | Sensing intracellular oxygen using near-infrared phosphorescent probes and live-cell fluorescence imaging | |
| CN110982513B (zh) | 一种荧光碳点的制备方法及其在细胞成像中的应用 | |
| US10351707B2 (en) | Water-soluble iron ion fluorescent probe and preparation method thereof | |
| Wang et al. | Imaging of cellular oxygen via two-photon excitation of fluorescent sensor nanoparticles | |
| CN108117544A (zh) | 一种可逆二氧化硫/亚硫酸（氢）盐的荧光探针 | |
| JP6817610B2 (ja) | 三次元培養表皮モデル及びその製造方法、ならびに三次元培養表皮モデルの使用方法 | |
| CN107601455A (zh) | 长时间靶向成像活细胞内rna荧光碳点的制备方法及其产品和应用 | |
| CN105017196A (zh) | 一种检测肼的近红外比率荧光探针及其应用 | |
| CN107325814A (zh) | 一种荧光硅纳米点及其制备方法与应用 | |
| CN110243794A (zh) | 一种基于石墨烯量子点的检测二氧化硫的荧光探针及其应用 | |
| CN104792756A (zh) | 四-对-磺酸基-苯基卟啉衍生物作为荧光探针在检测锌离子方面的应用 | |
| CN112500386A (zh) | 基于吡啰红肟的近红外HClO荧光探针、制备及其应用 | |
| CN113698379B (zh) | 一种用于检测多硫化氢的荧光探针及其制备方法和应用 | |
| CN104962279B (zh) | 一种no3‑离子的检测试剂及应用 | |
| CN105548097B (zh) | 一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞成像方法 | |
| CN104498579B (zh) | 一种用于癌细胞中Zn2+监测的荧光探针方法 | |
| CN111286323B (zh) | 一种自靶向细胞核的荧光碳点及其制备方法和应用 | |
| CN111072011B (zh) | 一种线粒体-核仁可逆迁移荧光碳点的制备及在监测细胞活性中的应用 | |
| CN107290197A (zh) | 一种活细胞线粒体数量染色检测方法 | |
| CN114057604A (zh) | 一种细胞核荧光染料及其染色方法 | |
| CN104833664B (zh) | 一种活细胞中稀土离子La3+、Lu3+的荧光成像方法 | |
| NL2032008B1 (en) | Fluorescent labeling kit for a tumor cell nucleus and labeling method thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210909 Address after: Room 501, 5 / F, building 90, guangqumennei street, Dongcheng District, Beijing 100062 Patentee after: Hundred Foundation (Beijing) International Business Management Consulting Co.,Ltd. Address before: 550025 science and Technology Department, Guizhou University, Huaxi District, Guizhou, Guiyang Patentee before: Guizhou University |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20220117 Address after: 300304 room 1-2050, Block E, No. 6, Huafeng Road, Huaming high tech Industrial Zone, Dongli District, Tianjin Patentee after: Zhongzhi online Co.,Ltd. Address before: Room 501, 5 / F, building 90, guangqumennei street, Dongcheng District, Beijing 100062 Patentee before: Hundred Foundation (Beijing) International Business Management Consulting Co.,Ltd. |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20150805 Assignee: Tianjin Hezheng measurement and Testing Co.,Ltd. Assignor: Zhongzhi online Co.,Ltd. Contract record no.: X2023980040389 Denomination of invention: Application of Calixarene Fluorescence Probe in Fluorescence Imaging of Zn2+, F-in Living Cells Granted publication date: 20180911 License type: Common License Record date: 20230825 |
|
| OL01 | Intention to license declared | ||
| OL01 | Intention to license declared | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20150805 Assignee: Tianjin Xiehe Bojing Medical Diagnostic Technology Co.,Ltd. Assignor: Zhongzhi online Co.,Ltd. Contract record no.: X2024980004474 Denomination of invention: Application of calixarenes fluorescent probes in fluorescent imaging of Zn2+and F-in living cells Granted publication date: 20180911 License type: Common License Record date: 20240416 |