CN105039242B - 一种促进Ru(II)金属络合物细胞核摄取的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促进Ru(II)金属络合物细胞核摄取的方法。本发明通过生物化学试剂与Ru(II)络合物形成亲脂性且相对稳定的离子对复合物的方式，促进细胞膜非渗透性的Ru(II)络合物的细胞甚至细胞核的摄取，所述生物化学试剂为卤代酚类、羰基氰类和非甾体类抗炎药。本发明首次通过以形成离子对的方式将Ru(II)络合物转运入活细胞核内，并首次在活细胞内观察到[Ru(bpy)2dppz]2+及[Ru(phen)2dppz]2+的对映异构体表现出荧光强度不同的现象，为研究将其他潜在的具有生物医疗效应的细胞膜不通透的金属络合物转运入细胞内提供了一种新的方法。

Description

一种促进Ru(II)金属络合物细胞核摄取的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种促进Ru(II)金属络合物细胞核摄取的方法。
背景技术
DNA是遗传信息的载体，因此了解DNA在细胞核内的组装和结构具有非常重要的意义。目前，利用荧光显微镜，使用能够与DNA结合的细胞膜通透性良好的有机荧光分子作为DNA标记探针是实现这一目标的主要手段。但是，现有的许多荧光染料存在水溶性低，毒性强及光漂白等的缺点。因此，探索新的生物显像试剂似乎显得尤为重要，而过渡金属络合物为此提供了广阔的应用前景。1990年，Barton和Sauvage研究组报道联吡啶并吩嗪(dppz)金属配体络合物与DNA有着很强的亲和力(结合常数Kb～106M-1)。有趣的是，这些络合物与DNA结合后会发出强烈的MLCT荧光(MLCT指金属到配体的电荷转移)，而未与DNA结合的络合物则没有荧光现象。这一现象被认为是DNA的“光开关效应”，已经被广泛用于研究多种金属多吡啶络合物与DNA之间的相互作用。由于这种“光开关”现象可通过荧光显微镜观察并检测，因此这类金属络合物在细胞显像的应用中可能具有广阔的应用前景，其中又以d 6过渡金属络合物最为显著，这是因为此类络合物具有一系列吸引人的光学显像特性，包括：良好的水溶性、较强的光稳定性、可见光区低MLCT激发能(避免UV损伤作用)、发光寿命长、相对高的Stokes位移(一般大于100nm)。此外，这类络合物除自身具有上述丰富的特性外，其配体的三维空间结构还能使络合物成功地与DNA结合；配体结构的细微修饰能导致络合物与DNA的键合模式、键合位置、键合强度和光物理特性发生微弱或明显的变化，因此可以通过改变配体来调控络合物的细胞摄取状况，以及调节分子疏水性、亲和力及选择性。这为筛选寻找具有不同功能的DNA结构探针提供了良好的方法。
近年来，有关金属络合物探针的研究主要集中于化学体系，而用于活细胞内DNA直接显像的成功的实例却较为少见。大量研究结果表明限制金属络合物在活细胞中显像应用的主要因素是由于它们较低的膜通透性，而DNA作为胞内的主要作用靶点，金属络合物若要与活细胞内的DNA相互作用，则分子不仅要进入细胞内，而且还要进入到细胞核(或线粒体)内。例如，典型的金属钌嵌入剂[Ru(bpy)2(dppz)]2+和[Ru(phen)2(dppz)]2+络合物，因具有较弱的脂溶性而不能透过细胞膜进入细胞内。尽管如此，上述两种络合物都可用于固定细胞条件下的DNA染色或用于区别活细胞显像中的死细胞。但是，如果这些金属络合物能够用于活细胞内的DNA染色，这将具有更重要的生物学意义。
为实现上述活细胞内DNA染色的目的，应增强金属络合物的细胞摄取水平。基于此，人们开始采取多种方法对金属络合物进行改造，如：通过增强络合物的疏水性-即引入疏水配体如苯环或烷基链，使得其在本质上与脂质更类似，从而改变其通过细胞膜的能力。然而，在改变络合物疏水性能从而调控细胞摄取的同时，也可能会影响该络合物的细胞定位，且通常会使其与细胞核结合的靶向性降低。此外，采用共价结合荧光分子如荧光素或罗丹明是研究生物活性分子在细胞内分布的一种普遍方法，而这同样也可用于金属络合物研究。Puckett等的研究表明，标记了荧光素的Ru(dppz)络合物可直接进入细胞核，而未标记的则不能进入。尽管荧光素的荧光发射明确定位出该络合物定位于细胞核，但却不能观察到分子中钌组分自身产生的核内MLCT荧光。这很可能意味着，这些荧光分子改变了Ru(dppz)络合物自身的发光特性。
综上所述，无论是通过增加络合物疏水性的方法还是将金属络合物进行荧光素标记，都不仅需要消耗大量的时间和精力来设计合成，而且所合成的络合物的光物理性能也可能发生改变，使它们不能进入到细胞核或是改变母体络合物产生荧光的特性。因此，一种简单且行之有效的可促进Ru(II)络合物在活细胞内摄取的方法就显得尤为重要。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种促进Ru(II)金属络合物细胞核摄取的方法。
本发明提供的促进Ru(II)金属络合物细胞核摄取的方法包括如下步骤：在含有阳离子Ru(II)金属络合物和生物化学试剂的培养体系中培养细胞，实现所述阳离子Ru(II)金属络合物进入活细胞的细胞核；
所述生物化学试剂为卤代酚类、羰基氰类或非甾体类抗炎药。
上述方法中，所述阳离子Ru(II)金属络合物与所述生物化学试剂的物质的摩尔比为(1-5)︰3；
所述阳离子Ru(II)金属络合物为式Ⅰ所示的[Ru(bpy)2dppz]2+、式Ⅱ所示的[Ru(phen)2dppz]2+、式Ⅲ所示的[Ru(DIP)2dppz]2+或式Ⅳ所示的[Ru(bpy)2tpphz Ru(bpy)2]4+；
所述卤代酚类为五氯酚、2,3,5,6-四氯酚、2,3,4,6-四氯酚、2,3,4,5-四氯酚、2,4,5-三氯酚、3,4,5-三氯酚、2,3,4-三氯酚、2,3,5-三氯酚、五溴酚、2,4,6-三溴酚、四氯儿茶酚、2,3,6-三氯酚、2,4,6-三氯酚、2,3-二氯酚、2,4-二氯酚、2,5-二氯酚、2,6-二氯酚、3,4-二氯酚、3,5-二氯酚、2-一氯酚、3-一氯酚或4-一氯酚；
所述羰基氰类为羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼或羰基氰化物间氯苯腙；
所述非甾体类抗炎药为托芬那酸(Tolfenamic acid)、氟芬那酸(Flufenamicacid)、甲芬那酸(Mefenamic acid)、尼氟灭酸(Niflumic acid)、甲氯芬那酸(Meclofenamic acid)或双氯芬酸(Diclofenic acid)；
所述阳离子Ru(II)金属络合物具体为式Ⅰ所示的[Ru(bpy)2dppz]2+或式Ⅱ所示的[Ru(phen)2dppz]2+；
所述卤代酚类具体为五氯酚；
所述羰基氰类具体为羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼；
所述非甾体类抗炎药具体为托芬那酸。
上述方法中，所述细胞为真核细胞或原核细胞；所述真核细胞为QSG-7701细胞、HeLa细胞、HepG-2细胞、HL-7702细胞、MCF-7细胞或PC-12细胞；所述原核细胞为Staphylococcus aureus；
所述细胞具体为QSG-7701细胞。
上述方法中，所述培养体系为含有体积分数为10％胎牛血清(FBS)和体积分数为1％的双抗青-链霉素的RIMP1640培养基；或所述培养体系为含有体积分数为1％的双抗青-链霉素的RIMP1640培养基。
上述方法中，所述培养细胞的时间为1-3h；所述培养细胞的温度为37℃。
本发明的另一个目的是提供上述方法的新用途。
本发明提供了上述方法在促进阳离子Ru(II)金属络合物进入活细胞的细胞核中的应用。
本发明还提供了上述方法在促进阳离子Ru(II)金属络合物进入活细胞中的应用。
本发明还提供了上述方法在增加阳离子Ru(II)金属络合物在细胞内的荧光强度中的应用。
本发明还有一个目的是提供一种活细胞内DNA结构荧光探针的产品。
本发明提供的活细胞内DNA结构荧光探针的产品由阳离子Ru(II)金属络合物和生物化学试剂组成；所述生物化学试剂为卤代酚类、羰基氰类或非甾体类抗炎药。
上述产品中，所述阳离子Ru(II)金属络合物与所述生物化学试剂的物质的摩尔比为(1-5)︰3；
所述阳离子Ru(II)金属络合物为式Ⅰ所示的[Ru(bpy)2dppz]2+、式Ⅱ所示的[Ru(phen)2dppz]2+、式Ⅲ所示的[Ru(DIP)2dppz]2+或式Ⅳ所示的[Ru(bpy)2tpphz Ru(bpy)2]4+；
所述卤代酚类为五氯酚、2,3,5,6-四氯酚、2,3,4,6-四氯酚、2,3,4,5-四氯酚、2,4,5-三氯酚、3,4,5-三氯酚、2,3,4-三氯酚、2,3,5-三氯酚、五溴酚、2,4,6-三溴酚、四氯儿茶酚、2,3,6-三氯酚、2,4,6-三氯酚、2,3-二氯酚、2,4-二氯酚、2,5-二氯酚、2,6-二氯酚、3,4-二氯酚、3,5-二氯酚、2-一氯酚、3-一氯酚或4-一氯酚；
所述羰基氰类为羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼或羰基氰化物间氯苯腙；
所述非甾体类抗炎药为托芬那酸、氟芬那酸、甲芬那酸、尼氟灭酸、甲氯芬那酸或双氯芬酸；
所述阳离子Ru(II)金属络合物具体为式Ⅰ所示的[Ru(bpy)2dppz]2+或式Ⅱ所示的[Ru(phen)2dppz]2+；
所述卤代酚类具体为五氯酚；
所述羰基氰类具体为羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼；
所述非甾体类抗炎药具体为托芬那酸。
上述产品中，所述细胞为真核细胞或原核细胞；所述真核细胞为QSG-7701细胞、HeLa细胞、HepG-2细胞、HL-7702细胞、MCF-7细胞或PC-12细胞；所述原核细胞为Staphylococcus aureus；
所述细胞具体为QSG-7701细胞。
本发明的最后一个目的是提供生物化学试剂的新用途。
本发明提供了生物化学试剂在制备促进阳离子Ru(II)金属络合物进入活细胞的细胞核的产品中的应用。
本发明还提供了生物化学试剂在制备促进阳离子Ru(II)金属络合物的活细胞的细胞核摄取的产品中的应用。
本发明还提供了生物化学试剂在制备促进阳离子Ru(II)金属络合物进入活细胞的产品中的应用。
本发明还提供了生物化学试剂在制备促进阳离子Ru(II)金属络合物的活细胞摄取的产品中的应用。
本发明还提供了生物化学试剂在增加阳离子Ru(II)金属络合物在细胞内的荧光强度中的应用。
上述应用中，所述生物化学试剂为卤代酚类、羰基氰类或非甾体类抗炎药；
所述阳离子Ru(II)金属络合物为式Ⅰ所示的[Ru(bpy)2dppz]2+、式Ⅱ所示的[Ru(phen)2dppz]2+、式Ⅲ所示的[Ru(DIP)2dppz]2+或式Ⅳ所示的[Ru(bpy)2tpphz Ru(bpy)2]4+；
所述卤代酚类为五氯酚、2,3,5,6-四氯酚、2,3,4,6-四氯酚、2,3,4,5-四氯酚、2,4,5-三氯酚、3,4,5-三氯酚、2,3,4-三氯酚、2,3,5-三氯酚、五溴酚、2,4,6-三溴酚、四氯儿茶酚、2,3,6-三氯酚、2,4,6-三氯酚、2,3-二氯酚、2,4-二氯酚、2,5-二氯酚、2,6-二氯酚、3,4-二氯酚、3,5-二氯酚、2-一氯酚、3-一氯酚或4-一氯酚；
所述羰基氰类为羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼或羰基氰化物间氯苯腙；
所述非甾体类抗炎药为托芬那酸、氟芬那酸、甲芬那酸、尼氟灭酸、甲氯芬那酸或双氯芬酸；
所述阳离子Ru(II)金属络合物具体为式Ⅰ所示的[Ru(bpy)2dppz]2+或式Ⅱ所示的[Ru(phen)2dppz]2+；
所述卤代酚类具体为五氯酚；
所述羰基氰类具体为羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼；
所述非甾体类抗炎药具体为托芬那酸。
上述产品中，所述细胞为真核细胞或原核细胞；所述真核细胞为QSG-7701细胞、HeLa细胞、HepG-2细胞、HL-7702细胞、MCF-7细胞或PC-12细胞；所述原核细胞为Staphylococcus aureus；
所述细胞具体为QSG-7701细胞。
上述生物化学试剂在增强阳离子Ru(II)金属络合物Δ对映异构体在活细胞内的荧光强度中的应用也属于本发明的保护范围。
上述生物化学试剂在增强阳离子Ru(II)金属络合物Δ对映异构体在细胞核内的荧光强度中的应用也属于本发明的保护范围。
所述阳离子Ru(II)金属络合物Δ对映异构体为式Ⅴ所示的Δ-[Ru(bpy)2dppz]2+或式Ⅵ所示的Δ-[Ru(phen)2dppz]2+；
所述生物化学试剂为卤代酚类或非甾体抗炎药类；所述卤代酚类具体为五氯酚；
本发明具有以下优点：
1)操作简单，易于实行；成本低，不需要消耗大量时间及精力进行复杂的合成；
2)不影响Ru(II)母体络合物自身的光化学物理特性。
本发明提供了一种在保持Ru(II)母体络合物自身特有性质的情况下，促进Ru(II)络合物有效进入活细胞以及活细胞的细胞核的方法。该方法通过将生物化学试剂(卤代酚类，羰基氰类及非甾体类抗炎药)与阳离子Ru(II)络合物形成亲脂性且相对稳定的离子对复合物的方式，不仅可促进细胞膜非通透性的阳离子Ru(II)络合物的细胞摄取，甚至还能促进其细胞核摄取，以及显著增加Δ异构体在细胞核内的荧光强度。本发明首次发现可通过离子对方式将发光Ru(II)阳离子络合物转运入活细胞核内，并首次在活细胞内观察到[Ru(bpy)2dppz]2+及[Ru(phen)2dppz]2+的对映异构体(Δ/Λ)表现出荧光强度不同的现象，为其他具有潜在生物医学效应的细胞膜不通透的金属络合物跨细胞膜转运提供了一种方便简洁的方法。
附图说明
图1为实施例1中的流式细胞仪检测五氯酚(PCP)促进[Ru(bpy)2dppz]2+在细胞内荧光强度增强。
图2为实施例2中的激光共聚焦检测五氯酚(PCP)，羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼(FCCP)和托芬那酸(Tolfenamic acid)促进Ru(II)络合物进入细胞。
图3为实施例3中的PCP/[Ru(bpy)2dppz]2+，PCP/[Ru(bpy)2dppz]2+与Hoechst33342(商业化细胞核染色剂)共染色的荧光显微镜检测结果。其中，Overlay代表前面两个图叠加在一起的结果。
图4为PCP/[Ru(bpy)2dppz]2+在透射电镜下的检测结果。其中，Control为阴性对照；Ru为[Ru(bpy)2dppz]2+在透射电镜下的检测结果；Ru/PCP为PCP/[Ru(bpy)2dppz]2+在透射电镜下的检测结果。
图5为[Ru(bpy)2dppz]2+及[Ru(phen)2dppz]2+的对映异构体在PCP作用下的荧光显微镜检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所用的流式细胞仪型号为BD FACS Calibur；激光共聚焦显微镜型号为Leica TCS SP5；超高分辨率图像用中科院生物物理所仪器平台结构照明显微镜DeltaVision OMX采集；电镜结果采用清华大学生物医学测试中心H-7650B透射电镜仪器采集。
下述实施例中的PBS的制备方法：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO41.44g、KH2PO40.2g，调节pH至7.4，定容至1L，灭菌。
下述实施例中的RIMP1640培养基是北京海诚远宏科技有限公司的产品，厂家：HyClone,货号：SH30809.01B。
下述实施例中的QSG-7701细胞来源于中国科学院细胞库，产品目录号：GNHu 7。
下述实施例中的PCP(五氯酚)是SIGMA公司的产品，产品目录号为171301；FCCP(羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼)是SIGMA公司的产品，产品目录号为C2920；Tolfenamic acid(托芬那酸)是SIGMA公司的产品，产品目录号为T0535。
下述实施例中的胰酶是北京海诚远宏科技有限公司的产品，厂家：Poputech，货号：HCCC101-100。
实施例1、卤代酚类促进[Ru(bpy)2dppz]2+进入细胞核的方法及流式细胞仪的检测
1、将QSG-7701细胞接种到六孔板，每孔大约5×105个细胞/ml，于培养箱培养24h(5％二氧化碳，37℃)。
2、分成如下四组对上述培养的细胞进行药物处理：
第一组(Control)：在不含药物的细胞培养基中培养QSG-7701细胞；
第二组(PCP)：在含有0.3mM的PCP(五氯酚)的细胞培养基中培养QSG-7701细胞；
含有0.3mM的PCP的细胞培养基为将PCP溶液(溶质为PCP，溶剂为100mM NaOH水溶液)添加到细胞培养基中获得，使PCP的终浓度为0.3mM。
第三组([Ru(bpy)2dppz]2+)：在含有0.1mM的[Ru(bpy)2dppz]2+(溶剂为Tris-HCl缓冲液)的细胞培养基中培养QSG-7701细胞；
含有0.1mM的[Ru(bpy)2dppz]2+的细胞培养基为将[Ru(bpy)2dppz]2+溶液(溶质为[Ru(bpy)2dppz]2+，溶剂为Tris-HCl缓冲液)添加到细胞培养基中获得，使[Ru(bpy)2dppz]2+的终浓度为0.1mM。
第四组([Ru(bpy)2dppz]2+/PCP)：在含有0.1mM的[Ru(bpy)2dppz]2+和0.3mM的PCP的细胞培养基中培养QSG-7701细胞；
含有0.1mM的[Ru(bpy)2dppz]2+和0.3mM的PCP的细胞培养基为将[Ru(bpy)2dppz]2+溶液(溶质为[Ru(bpy)2dppz]2+，溶剂为Tris-HCl缓冲液)和PCP溶液(溶质为PCP，溶剂为100mM NaOH水溶液)添加到细胞培养基中获得，使[Ru(bpy)2dppz]2+和PCP的终浓度分别为0.1mM和0.3mM。
上述细胞培养基为含有体积分数为10％胎牛血清(FBS)和体积分数为1％的双抗青-链霉素的RIMP1640培养基，将各组药物分别加入细胞培养基中后，置于培养箱培养3h(37℃)。
3、药物处理后用PBS清洗3遍，再加入胰酶消化，收集细胞，离心(1000rmp，5min)，弃上清，加入500μl PBS，轻轻吹散混匀转移至流式管，采用流式细胞仪BD FACS Calibur，在488nm激发波长，600nm-630nm发射波长处检测荧光，样品检测时收集20000个细胞。上样前加入1μM To-Pro-3(分子探针)以排除死细胞，To-Pro-3检测时激发波长为633nm，发射波长为650-670nm。
流式细胞术检测结果如图1所示：第一组和第二组没有荧光；第三组细胞内的荧光强度很低；第四组细胞经PCP和[Ru(bpy)2dppz]2+共暴露后，细胞内的荧光强度明显增强，说明PCP能够促进[Ru(bpy)2dppz]2+进入细胞内。
实施例2、卤代酚类、羰基氰类和非甾体类抗炎药在促进Ru(II)金属络合物进入细胞核的方法及激光共聚焦检测
1、将QSG-7701细胞接种到共聚焦专用的直径为35mm的小皿，接种量约1×105个细胞/ml，于培养箱培养24h(5％二氧化碳，37℃)。
2、分成如下六组对上述培养的细胞进行药物处理：
第一组([Ru(bpy)2dppz]2+/PCP)：在含有0.1mM的[Ru(bpy)2dppz]2+和0.3mM的PCP的细胞培养基中培养QSG-7701细胞；37℃处理3h；
含有0.1mM的[Ru(bpy)2dppz]2+和0.3mM的PCP的细胞培养基为将[Ru(bpy)2dppz]2+溶液(溶质为[Ru(bpy)2dppz]2+，溶剂为Tris-HCl缓冲液)和PCP溶液(溶质为PCP，溶剂为100mM NaOH水溶液)添加到细胞培养基中获得，使[Ru(bpy)2dppz]2+和PCP的终浓度分别为0.1mM和0.3mM。
第二组([Ru(bpy)2dppz]2+/FCCP)：在含有0.2mM的[Ru(bpy)2dppz]2+和0.5mM的FCCP的细胞培养基中培养QSG-7701细胞；37℃处理1h；
含有0.2mM的[Ru(bpy)2dppz]2+和0.5mM的FCCP的细胞培养基为将[Ru(bpy)2dppz]2+溶液(溶质为[Ru(bpy)2dppz]2+，溶剂为Tris-HCl缓冲液)和FCCP溶液(溶质为FCCP，溶剂为DMSO)添加到细胞培养基中获得，使[Ru(bpy)2dppz]2+和FCCP的终浓度分别为0.2mM和0.5mM。
第三组([Ru(bpy)2dppz]2+/Tolfenamic acid)：在含有0.1mM的[Ru(bpy)2dppz]2+和0.3mM的Tolfenamic acid的细胞培养基中培养QSG-7701细胞；37℃处理1h；
含有0.1mM的[Ru(bpy)2dppz]2+和0.3mM的Tolfenamic acid的细胞培养基为将[Ru(bpy)2dppz]2+溶液(溶质为[Ru(bpy)2dppz]2+，溶剂为Tris-HCl缓冲液)和Tolfenamic acid溶液(溶质为Tolfenamic acid，溶剂为100mM NaOH水溶液)添加到细胞培养基中获得，使[Ru(bpy)2dppz]2+和Tolfenamic acid的终浓度分别为0.1mM和0.3mM。
第四组([Ru(phen)2dppz]2+/PCP)：在含有0.1mM的[Ru(phen)2dppz]2+和0.3mM的PCP的细胞培养基中培养QSG-7701细胞；37℃处理3h；
含有0.1mM的[Ru(phen)2dppz]2+和0.3mM的PCP的细胞培养基为将[Ru(phen)2dppz]2+溶液(溶质为[Ru(phen)2dppz]2+，溶剂为Tris-HCl缓冲液)和PCP溶液(溶质为PCP，溶剂为100mM NaOH水溶液)添加到细胞培养基中获得，使[Ru(phen)2dppz]2+和PCP的终浓度分别为0.1mM和0.3mM。
第五组([Ru(phen)2dppz]2+/FCCP：在含有0.5mM的[Ru(phen)2dppz]2+和0.3mM的FCCP的细胞培养基中培养QSG-7701细胞；37℃处理1h；
含有0.5mM的[Ru(phen)2dppz]2+和0.3mM的FCCP的细胞培养基为将[Ru(phen)2dppz]2+溶液(溶质为[Ru(phen)2dppz]2+，溶剂为Tris-HCl缓冲液)和FCCP溶液(溶质为FCCP，溶剂为DMSO)添加到细胞培养基中获得，使[Ru(phen)2dppz]2+和FCCP的终浓度分别为0.5mM和0.3mM。
第六组([Ru(phen)2dppz]2+/Tolfenamic acid)：在含有0.1mM的[Ru(phen)2dppz]2+和0.3mM的Tolfenamic acid的细胞培养基中培养QSG-7701细胞；37℃处理1h；
含有0.1mM的[Ru(phen)2dppz]2+和0.3mM的Tolfenamic acid的细胞培养基为将[Ru(phen)2dppz]2+溶液(溶质为[Ru(phen)2dppz]2+，溶剂为Tris-HCl缓冲液)和Tolfenamicacid溶液(溶质为Tolfenamic acid，溶剂为100mM NaOH水溶液)添加到细胞培养基中获得，使[Ru(phen)2dppz]2+和Tolfenamic acid的终浓度分别为0.1mM和0.3mM。
第七组([Ru(bpy)2dppz]2+)：在含有0.1mM的[Ru(bpy)2dppz]2+的细胞培养基中培养QSG-7701细胞；37℃处理3h；
含有0.1mM的[Ru(bpy)2dppz]2+的细胞培养基为将[Ru(bpy)2dppz]2+溶液(溶质为[Ru(bpy)2dppz]2+，溶剂为Tris-HCl缓冲液)添加到细胞培养基中获得，使[Ru(bpy)2dppz]2+的终浓度为0.1mM。
第八组([Ru(phen)2dppz]2+)：在含有0.1mM的[Ru(phen)2dppz]2+的细胞培养基中培养QSG-7701细胞；37℃处理3h；
含有0.1mM的[Ru(phen)2dppz]2+的细胞培养基为将[Ru(phen)2dppz]2+溶液(溶质为[Ru(bpy)2dppz]2+，溶剂为DMSO)添加到细胞培养基中获得，使[Ru(phen)2dppz]2+的终浓度为0.1mM。
上述第一组、第四组、第七组和第八组细胞培养基均为含有体积分数为10％胎牛血清(FBS)和体积分数为1％的双抗青-链霉素的RIMP1640完全培养基，上述第二组、第三组、第五组和第六组的细胞培养基均为含有体积分数为1％的双抗青-链霉素的RIMP1640无血清培养基；将各组药物分别加入细胞培养基中后，置于培养箱进行培养。
3、药物处理后用PBS清洗3遍，加入新鲜的细胞培养基，采用Leica TCS SP5型激光共聚焦显微镜在488nm激发波长，600nm-630nm发射波长的条件下进行检测。检测前加入1μMTo-Pro-3(分子探针)以检测细胞活性，To-Pro-3检测激发波长为633nm，发射波长为650-670nm。
激光共聚焦检测结果如图2所示：第七组和第八组中的单独的0.1mM Ru几乎不能进入细胞；而第一组、第二组、第三组、第四组、第五组和第六组中的Ru络合物分别在PCP，FCCP及Tolfenamic的作用进入了细胞，且很可能是进入了细胞核内。
实施例3、五氯酚促进[Ru(bpy)2dppz]2+进入细胞核的方法及激光共聚焦和结构照明显微镜检测
1、将QSG-7701细胞接种到共聚焦专用的直径为35mm的小皿，接种量约1×105个细胞/ml，于培养箱培养24h(5％二氧化碳，37℃)。
2、分成如下两组对上述培养的细胞进行药物处理：
第一组([Ru(bpy)2dppz]2+，简称Ru)：在含有0.5mM的[Ru(bpy)2dppz]2+的细胞培养基中培养QSG-7701细胞；37℃处理24h；
含有0.5mM的[Ru(bpy)2dppz]2+的细胞培养基为将[Ru(bpy)2dppz]2+溶液(溶质为[Ru(bpy)2dppz]2+，溶剂为Tris-HCl缓冲液)添加到细胞培养基中获得，使[Ru(bpy)2dppz]2+的终浓度为0.5mM。
第二组([Ru(bpy)2dppz]2+/PCP，简称Ru/PCP)：在含有0.1mM的[Ru(bpy)2dppz]2+和0.3mM的PCP的细胞培养基中培养QSG-7701细胞；37℃处理3h；
含有0.1mM的[Ru(bpy)2dppz]2+和0.3mM的PCP的细胞培养基为将[Ru(bpy)2dppz]2+溶液(溶质为[Ru(bpy)2dppz]2+，溶剂为Tris-HCl缓冲液)和PCP溶液(溶质为PCP，溶剂为100mM NaOH水溶液)添加到细胞培养基中获得，使[Ru(bpy)2dppz]2+和PCP的终浓度分别为0.1mM和0.3mM。
上述细胞培养基为含有体积分数为10％胎牛血清(FBS)和体积分数为1％的双抗青-链霉素的RIMP1640完全培养基，将各组药物分别加入细胞培养基中后，置于培养箱培养。
3、药物处理后用PBS清洗3遍，加入新鲜的细胞培养基，采用激光共聚焦显微镜采集图像。在样品检测前用1μg/ml Hoechst33342(商业化细胞核染色剂)处理细胞10min后进行检测。Hoechst33342检测以405nm为激发波长，450-480nm为发射波长。细胞内Ru荧光以488nm激发，600nm-630nm发射波长检测。
结果如图3A所示：从共聚焦显微检测结果可以观察到，Ru/PCP在细胞内发出红色荧光和Hoechst的蓝色荧光几乎完全重叠，而单独高浓度的Ru长时间作用于细胞后，尽管进入了细胞(红色)，但也仅只是在胞浆中，而未进入到细胞核内(Hoechst蓝色)。
为了进一步证实Ru/PCP在细胞核内的分布，又采用了分辨率更高的结构照明显微镜对Ru/PCP(红色)组进行观察，同样采用了商业化的细胞核染料Hoechst(蓝色)对其进行共染色，从叠加图(Overlay)的结果可以看到两者几乎完全重叠，进一步证实Ru在PCP作用下确实进入了细胞核(图3B)。
实施例4、五氯酚促进[Ru(bpy)2dppz]2+进入细胞核的方法及透射电镜检测
1、将QSG-7701细胞接种到六孔板，每孔大约5×105个细胞/ml，于培养箱培养24h(5％二氧化碳，37℃)。
2、分成如下三组对上述培养的细胞进行药物处理：
第一组(Control)：在不含药物的细胞培养基中培养QSG-7701细胞；
第二组([Ru(bpy)2dppz]2+，简称Ru)：在含有1mM的[Ru(bpy)2dppz]2+的细胞培养基中培养QSG-7701细胞；
含有1mM的[Ru(bpy)2dppz]2+的细胞培养基为将[Ru(bpy)2dppz]2+溶液(溶质为[Ru(bpy)2dppz]2+，溶剂为Tris-HCl缓冲液)添加到细胞培养基中获得，使[Ru(bpy)2dppz]2+的终浓度为1mM。
第三组([Ru(bpy)2dppz]2+/PCP，简称Ru/PCP)：在含有0.3mM的[Ru(bpy)2dppz]2+和0.3mM的PCP的细胞培养基中培养QSG-7701细胞；
含有0.3mM的[Ru(bpy)2dppz]2+和0.3mM的PCP的细胞培养基为将[Ru(bpy)2dppz]2+溶液(溶质为[Ru(bpy)2dppz]2+，溶剂为Tris-HCl缓冲液)和PCP溶液(溶质为PCP，溶剂为100mM NaOH水溶液)添加到细胞培养基中获得，使[Ru(bpy)2dppz]2+和PCP的终浓度均为0.3mM。
上述细胞培养基为含有体积分数为10％胎牛血清(FBS)和体积分数为1％的双抗青-链霉素的RIMP1640完全培养基，将各组药物分别加入细胞培养基中后，置于培养箱培养3h(37℃)。
3、透射电镜检测
药物处理后用PBS清洗3遍，再加入胰酶消化，收集细胞，离心(1000rmp，5min)，弃上清，加入2.5％的戊二醛4℃固定过夜，用0.1M的PBS漂洗3次，每次15分钟，然后加入1％的锇酸后固定2-3小时(第二组未用锇酸固定，其他组均用锇酸固定)，再用0.1M的PBS漂洗3次，每次15分钟，然后用乙醇进行梯度脱水，脱水完后树脂包埋过夜，最后切片(50-70nm)，转移到钢网利用H-7650B电镜在80KV观察检测。
结果如图4所示：Ru络合物是含有高电子密度的Ⅷ族过渡金属中心离子的络合物，可以采用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy)对其在细胞内的定位进行观察。透射电镜以电子束为光源，穿过试样的电子束，被散射偏离原来方向的叫散射电子束，未被散射的叫透射电子束，这两类电子束皆可用于成像。Ru通过散射电子束形成暗影像增加对比度得以观察。从图中可以看到：Ru(bpy)2dppz2+在PCP存在的情况下(Ru/PCP)，细胞核内比较明显的暗区域即为Ru(bpy)2dppz2+富集的区域，而单独的Ru(bpy)2dppz2+(Ru)则几乎观察不到在核内的分布，空白组(Control)因为没有衬度差故而观察不到细胞核内外对比。
实施例5、五氯酚促进Δ-[Ru(bpy)2dppz]2+、Λ-[Ru(bpy)2dppz]2+及Δ-[Ru(phen)2dppz]2+、Λ-[Ru(phen)2dppz]2+在细胞内荧光强度的结构照明显微镜检测
1、将QSG-7701细胞接种到共聚焦专用的直径为35mm的小皿，接种量约1×105个细胞/ml，于培养箱培养24h(5％二氧化碳，37℃)。
2、分成如下四组对上述培养的细胞进行药物处理：
第一组(Λ-[Ru(bpy)2dppz]2+/PCP)：在含有0.1mM的Λ-[Ru(bpy)2dppz]2+和0.3mM的PCP的细胞培养基中培养QSG-7701细胞；37℃处理3h；
含有0.1mM的Λ-[Ru(bpy)2dppz]2+和0.3mM的PCP的细胞培养基为将Λ-[Ru(bpy)2dppz]2+溶液(溶质为Λ-[Ru(bpy)2dppz]2+，溶剂为Tris-HCl缓冲液)和PCP溶液(溶质为PCP，溶剂为100mM NaOH水溶液)添加到细胞培养基中获得，使Λ-[Ru(bpy)2dppz]2+和PCP的终浓度分别为0.1mM和0.3mM。
第二组(Δ-[Ru(bpy)2dppz]2+/PCP)：在含有0.1mM的Δ-[Ru(bpy)2dppz]2+和0.3mM的PCP的细胞培养基中培养QSG-7701细胞；37℃处理3h；
含有0.1mM的Δ-[Ru(bpy)2dppz]2+和0.3mM的PCP的细胞培养基为将Δ-[Ru(bpy)2dppz]2+溶液(溶质为Δ-[Ru(bpy)2dppz]2+，溶剂为Tris-HCl缓冲液)和PCP溶液(溶质为PCP，溶剂为100mM NaOH水溶液)添加到细胞培养基中获得，使Δ-[Ru(bpy)2dppz]2+和PCP的终浓度分别为0.1mM和0.3mM。
第三组(Λ-[Ru(phen)2dppz]2+/PCP)：在含有0.1mM的Λ-[Ru(phen)2dppz]2+和0.3mM的PCP的细胞培养基中培养QSG-7701细胞；37℃处理3h；
含有0.1mM的Λ-[Ru(phen)2dppz]2+和0.3mM的PCP的细胞培养基为将Λ-[Ru(phen)2dppz]2+溶液(溶质为Λ-[Ru(phen)2dppz]2+，溶剂为Tris-HCl缓冲液)和PCP溶液(溶质为PCP，溶剂为100mM NaOH水溶液)添加到细胞培养基中获得，使Λ-[Ru(phen)2dppz]2+和PCP的终浓度分别为0.1mM和0.3mM。
第四组(Δ-[Ru(phen)2dppz]2+/PCP)：在含有0.1mM的Δ-[Ru(phen)2dppz]2+和0.3mM的PCP的细胞培养基中培养QSG-7701细胞；37℃处理3h；
含有0.1mM的Δ-[Ru(phen)2dppz]2+和0.3mM的PCP的细胞培养基为将Δ-[Ru(phen)2dppz]2+溶液(溶质为Δ-[Ru(phen)2dppz]2+，溶剂为Tris-HCl缓冲液)和PCP溶液(溶质为PCP，溶剂为100mM NaOH水溶液)添加到细胞培养基中获得，使Δ-[Ru(phen)2dppz]2+和PCP的终浓度分别为0.1mM和0.3mM。
上述细胞培养基为含有体积分数为10％胎牛血清(FBS)和体积分数为1％的双抗青-链霉素的RIMP1640完全培养基，将各组药物分别加入细胞培养基中后，置于培养箱培养。
3、药物处理后用PBS清洗3遍，加入新鲜的细胞培养基，采用结构照明显微镜采集图像。细胞内Ru的荧光在488nm激发波长，600nm-630nm发射波长处检测。
结果如图5所示：从结构照明显微镜检测结果可以观察到，Λ-[Ru(bpy)2dppz]2+、Δ-[Ru(bpy)2dppz]2+及Λ-[Ru(phen)2dppz]2+、Δ-[Ru(phen)2dppz]2+在PCP的作用下，都进入了细胞核，且第二组的荧光强度明显高于第一组，第四组的荧光强度明显高于第三组，这表明PCP可以增强Δ异构体在细胞核内的荧光强度。

Claims (14)

1.一种促进Ru(II)金属络合物细胞核摄取的方法，包括如下步骤：在含有阳离子Ru(II)金属络合物和生物化学试剂的培养体系中培养细胞，实现所述阳离子Ru(II)金属络合物进入活细胞的细胞核；
所述阳离子Ru(II)金属络合物为式Ⅰ所示的[Ru(bpy)2dppz]2+或式Ⅱ所示的[Ru(phen)2dppz]2+；
所述生物化学试剂为卤代酚类、羰基氰类或非甾体类抗炎药；
所述卤代酚类为五氯酚；
所述羰基氰类为羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼；
所述非甾体类抗炎药为托芬那酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述阳离子Ru(II)金属络合物与所述生物化学试剂的物质的摩尔比为(1-5)︰3。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述细胞为真核细胞或原核细胞；所述真核细胞为QSG-7701细胞、HeLa细胞、HepG-2细胞、HL-7702细胞、MCF-7细胞或PC-12细胞；所述原核细胞为Staphylococcus aureus。
4.权利要求1-3中任一所述的方法在促进阳离子Ru(II)金属络合物进入活细胞的细胞核中的应用。
5.权利要求1-3中任一所述的方法在促进阳离子Ru(II)金属络合物进入活细胞中的应用。
6.权利要求1-3中任一所述的方法在增加阳离子Ru(II)金属络合物在细胞内的荧光强度中的应用。
7.一种活细胞内DNA结构荧光探针的产品，由阳离子Ru(II)金属络合物和生物化学试剂组成；
所述阳离子Ru(II)金属络合物为权利要求1中式Ⅰ所示的[Ru(bpy)2dppz]2+或式Ⅱ所示的[Ru(phen)2dppz]2+；
所述生物化学试剂为卤代酚类、羰基氰类或非甾体类抗炎药；
所述卤代酚类为五氯酚；
所述羰基氰类为羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼；
所述非甾体类抗炎药为托芬那酸。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于：所述阳离子Ru(II)金属络合物与所述生物化学试剂的物质的摩尔比为(1-5)︰3。
9.根据权利要求7或8所述的产品，其特征在于：所述细胞为真核细胞或原核细胞；所述真核细胞为QSG-7701细胞、HeLa细胞、HepG-2细胞、HL-7702细胞、MCF-7细胞或PC-12细胞；所述原核细胞为Staphylococcus aureus。
10.生物化学试剂在制备促进阳离子Ru(II)金属络合物进入活细胞的细胞核的产品中的应用；所述生物化学试剂为卤代酚类、羰基氰类或非甾体类抗炎药；所述卤代酚类为五氯酚；所述羰基氰类为羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼；所述非甾体类抗炎药为托芬那酸；所述阳离子Ru(II)金属络合物为权利要求1中式Ⅰ所示的[Ru(bpy)2dppz]2+或式Ⅱ所示的[Ru(phen)2dppz]2+。
11.生物化学试剂在制备促进阳离子Ru(II)金属络合物进入活细胞的产品中的应用；所述生物化学试剂为卤代酚类、羰基氰类或非甾体类抗炎药；所述卤代酚类为五氯酚；所述羰基氰类为羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼；所述非甾体类抗炎药为托芬那酸；所述阳离子Ru(II)金属络合物为权利要求1中式Ⅰ所示的[Ru(bpy)2dppz]2+或式Ⅱ所示的[Ru(phen)2dppz]2+。
12.生物化学试剂在增加阳离子Ru(II)金属络合物在细胞内的荧光强度中的应用；所述生物化学试剂为卤代酚类、羰基氰类或非甾体类抗炎药；所述卤代酚类为五氯酚；所述羰基氰类为羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼；所述非甾体类抗炎药为托芬那酸；所述阳离子Ru(II)金属络合物为权利要求1中式Ⅰ所示的[Ru(bpy)2dppz]2+或式Ⅱ所示的[Ru(phen)2dppz]2+。
13.生物化学试剂在增强阳离子Ru(II)金属络合物Δ对映异构体在细胞核内的荧光强度中的应用；
所述阳离子Ru(II)金属络合物Δ对映异构体为式Ⅴ所示的Δ-[Ru(bpy)2dppz]2+或式Ⅵ所示的Δ-[Ru(phen)2dppz]2+；
所述生物化学试剂为卤代酚类或非甾体抗炎药类；所述卤代酚类为五氯酚；所述非甾体类抗炎药为托芬那酸。
14.生物化学试剂在增强阳离子Ru(II)金属络合物Δ对映异构体在活细胞内的荧光强度中的应用；
所述阳离子Ru(II)金属络合物Δ对映异构体为权利要求13中式Ⅴ所示的Δ-[Ru(bpy)2dppz]2+或式Ⅵ所示的Δ-[Ru(phen)2dppz]2+；
所述生物化学试剂为卤代酚类或非甾体抗炎药类；所述卤代酚类为五氯酚；所述非甾体类抗炎药为托芬那酸。
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