CN104152529A - 一种金属络合物用作自噬溶酶体标记物 - Google Patents
一种金属络合物用作自噬溶酶体标记物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种金属络合物作为标记物检测自噬溶酶体的方法。此发明制得的金属化合物可用为自噬溶酶体标记物，用于检测自噬过程、药物筛选、细胞实验和组织成像等。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测试剂领域，是一种用于检测自噬溶酶体的标记物。
背景技术
本发明涉及一种由有机化合物配体与金属离子组成的络合物及其作为自噬溶酶体标记物。此发明制得的金属化合物可作为自噬溶酶体标记物，用于检测自噬过程，特别是关于溶酶体疾病，例如检测和监测溶酶体累积疾病进程、监测药物效果或用于治疗疾病；此发明也是关于毒性筛选方法，特别是对于潜在药物和可疑有毒物质的方法和高通量筛选；也可以用于基于荧光显微镜，共聚焦显微镜的实验和组织成像。
细胞自噬是哺乳动物细胞溶酶体降解的主要途径，对维持细胞的自我平衡、发展和能量平衡非常重要。细胞自噬过程的中断与神经退化性紊乱、癌症、心脏病和感染等疾病密切相关。通过研究细胞自噬及其复杂的分子诱导机制，探索自噬在细胞发生、发展中发挥的作用，为疾病治疗提供了新的途径。通过调节细胞自噬活性的治疗已经成为当代肿瘤治疗和帕金森等疾病治疗领域的新靶点和研究热点。无论科研单位还是制药公司对药物诱导细胞自噬在疾病治疗中的应用表现出极大兴趣，期望通过研究自噬和死亡的关系和分子机理，进而利用细胞自噬的调节作用，使其在疾病治疗中发挥作用。
基于细胞的检测由于它们的高生理的相关性，在制药工业中越来越受欢迎。其它优点包括他们预测化合物的用途的能力，评估分子相互作用，确定毒性，区分细胞类型与特异性药物效果，并确定药物渗透。基于细胞的实验是始终相关的药物发现渠道，因为它们能够提供从目标特性到毒理学终端阶段的数据。当前行业发展趋势要求，使用细胞实验进行药物筛选时容易进行监测，且能够非侵入性的报道数据。对新药开发而言，其根本途径是提高效率，降低成本，在更短的时间上市场。为早期阶段失败的化合物提供丰富的信息和准确的数据对早期阶段的决策是必需的。这些数据可能会来自筛选化合物的结果中，即筛选相关的生态系统，而不是经典生化分析。这些筛选系统通常整合在先进的成像平台，如高通量筛选（HCS）工作站。产业化荧光显微镜将导致高通量HCS影像平台的发展。当加上荧光报告技术，HCS提供了信息丰富的药物筛选，以及新类型的药物靶标。因此，开发一种快速有效的自噬探针对于监测细胞自噬过程和诊断相关疾病是非常必要的。
荧光标记的抗体虽然适用于分析细胞表面和透化细胞，但因为它们难以透过细胞，所以很少用于活细胞。近年来，发展可透过细胞的小分子荧光标记物逐渐兴起。可接受的用于细胞成像和分析的小分子荧光标记物需要最低限度的干扰，通用、稳定、易于使用、非破坏性的成像设备检测。从组织学的角度来看传统标记物的一个问题是需要辅助因子或需要固定或染色，仅在静态的死细胞条件下给出结果。操作所需的额外的步骤可能是耗时和昂贵的，并且在固定和染色的情况下缺乏生物学相关性。从分析来看，标记物应该能够在活细胞中能够实时反应实验结果。而对于药物筛选而言，简单易用是关键。
虽然过往已有各种荧光标记物被报道用于活细胞分析，例如JC-1染料可以动态的监控线粒体膜电位的变化，但对于自噬溶酶体还缺乏满意的标记物用于跟踪细胞内细胞器的动态变化以及相关的药物筛选。目前广泛使用的自噬标记物是GFP-LC3，它是一种GFP蛋白和LC3标记物的融合物。GFP-LC3作为自噬溶酶体荧光标记物，在自噬作用初期是非常有效的。但由于其信号会随着降解和酸度影响而逐渐减弱，所以无法用于自噬作用后期和较长的时间段。而且，GFP-LC3存在聚合的问题，容易给出错误的信号。尽管目前也有一些关于监测自噬作用后期的荧光标记物的报道，但都不禁理想。
对研究细胞内的靶向分子与作用区域的相互作用，荧光合作局域化成像是一个功能强大的方法。在这些实验中，不同的荧光物和发光蛋白在特定的检测通道成像。从每个发光物给出的空间和浓度信息在每个通道中都可自由控制。现有的很多用于亚细胞分析的标记物都无法满足这类要求。
发明内容
本发明提供一种高效的荧光标记物，专用于检测自噬作用后期和阳离子诱导的自噬作用。这种标记物是一种小分子化合物，它不同于LC3这种大分子蛋白，不存在聚合问题。它不受酸度影响，在检测活体细胞和固定细胞时均能给出高灵敏的信号。而且，此标记物可以被高穿透性的近红外和长波长激发，对于监测细胞非常重要。
本发明还提供一种基于此标记物的自噬溶酶体检测的方法，包括以下步骤：1）获得样品细胞；2）连接标记物到细胞的自噬溶酶体；3）通过检测标记物以监测细胞自噬。此方法可以运用在如下领域：1）实时监测细胞自噬过程；2）检测与自噬溶酶体相关的药物的作用效果；3）药物筛选。
本发明适合的应用涉及：荧光扫描显微镜、流式细胞仪、共聚焦显微镜、荧光分析仪、基于微孔板的细胞技术、细胞微阵列分析、组织成像等。
发明涉及荧光标记物的制备和应用，例如SN-1的制备方法和在细胞自噬溶酶体检测中的应用。这些标记物是一类小分子有机化合物，通常呈中性。它们的分子结构中包含特定的元素，如N、O、S、P等非金属元素以及Fe、Cu、Pt、Au、Zn、Ru、Os等过渡金属和镧系金属元素。在一定的条件下，这些非金属元素会同金属元素作用，形成特定的化学结构，即通常所称的金属络合物。特别是对于一些特定结构的有机化合物，其本身并无任何生物学活性；只有与特定的金属络合后才表现出与自噬溶酶体的特异性作用，例如实施实例中的化合物SN-1。这类包含特定金属元素的化合物能够选择性的标记无论是固定细胞还是活细胞中的自噬溶酶体，并且随着时间和自噬溶酶体量的增加在细胞器内逐渐累积。
本发明提供的标记物包含以下结构：
其中R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, 各自独立的选自氢、卤素、取代的芳香族集团、取代的杂芳香族基团、取代的芳基、取代的杂芳基或式（III）结构的取代基，R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, 中至少一个为式（III）结构的取代基：
式（III）中Q为含有氮原子的基团，为连接金属化合物与Q的连接基团；
环A具有式（IV）、式（V）、式（VI）结构：
其中R1a, R2a, R3a, R4a, 各自独立的选自氢、卤素、取代的芳香族集团、取代的杂芳香族基团、取代的芳基、取代的杂芳基；
式（IV）中n为1～3的正整数；
Y不存在，或Y为卤素、-NO3、CH3COO-、CCl3COO-、CF3COO-、ClO4-、BF4-、BPh4-、-CN、-N3、对甲基苯甲酸根、对甲基苯磺酸根、邻硝基苯酚氧、对硝基苯酚氧、2,4-二硝基苯酚氧、3,5-二硝基苯酚氧、2,4,6-三硝基苯酚氧、3,5-二氯苯酚氧、3,5-二氟苯酚氧、3，5-二-三氟甲基苯酚或五氟酚氧负离子；
M为过渡金属和镧系金属。
研究表明，本发明提供的自噬溶酶体标记物SN-1可以选择性的指示自噬溶酶体，其结果不受pH影响。其特定检测自噬过程后期的效果可以通过标记自噬过程的后期-“饥饿”显示。生物学实验采用对“饥饿”敏感的HEK293细胞和对“饥饿”不敏感的Hela细胞，同时使用常用的自噬过程标记物EGFP-LC3（增强的GFP-LC3）作对比。结果显示，HEK293细胞在基础阶段，使用EGFP-LC3时细胞显示少量光点，而SN-1几乎无光信号。当“饥饿”被激发，EGFP-LC3和SN-1标记的细胞均显示明亮的光信号。为证明SN-1在细胞自噬过程后期的特定效果，实验使用了强自噬诱导剂Torin 1。结果显示，在Hela细胞实验中，EGFP-LC3标记的细胞在基础和饥饿均显示弱的光信号，而SN-1几乎无明显的光信号，说明Hela细胞对“饥饿”不敏感。当加入强自噬诱导剂Torin 1时，二者均给出明亮的光信号。此结果表明，SN-1对于细胞自噬过程后期检测具有极佳的选择性。
pH对检测效果的影响通过固定细胞和不同浓度氯化铵处理的细胞来确定。在这两种细胞中，均能准确地显示出点状结果。这样的结果说明SN-1可以不受pH影响，揭示自噬溶酶体的形成。研究中我们完成了不同Torin 1浓度下SN-1发光强度试验。结果显示，随着Torin 1浓度的增加，发光强度相应增加。通过对比LC3抗体免疫印迹试验，我们绘制LC3-I/LC3-II比率并与发光强度/Torin 1浓度图对比，发现二者非常相似。据此可知，SN-1完全可用作量化的自噬过程探针。
接下来，我们验证了此标记物在高通量筛选方面的应用。根据报道，除了Zn2+, Co2+和Mn2+都可以通过mTOR信号诱导自噬过程。我们选用6种生物可用的金属（Co2+， Mn2+, Zn2+, Ca2+, Ni2+, Hg2+）和3种稀有金属（Gd3+, Er3+, La3+）建立了一个平台进行高通量筛选试验。共聚焦试验证实，在HeLa细胞自噬活性中，在Co2+, Mn2+,和Zn2+离子存在下显示强烈的发光。此方法易于操作，而且是非破坏性的，非常适合高通量筛选。
自噬作用在降解大量细胞成分，包括长寿命蛋白、蛋白聚集、脂质体、细胞器和细胞内病原体中扮演重要角色。其中，自噬溶酶体吞食部分细胞质以输送到溶酶体形成自噬溶酶体。为此，我们开发的此类高荧光标记物，它们的荧光强度与饥饿或阳离子诱导的自噬过程特定相关。更重要的是此类高荧光标记物不仅可用于定量检测自噬活性以及高通量筛选，而且可作为单光子或双光子荧光标记物用于活体研究。
本发明的优点和积极效果：
本发明试剂能有效快速检测细胞自噬溶酶体。该自噬溶酶体试剂生产工艺简单，与国外类似产品相比生产成本十分低廉，且具有灵敏性高，检测不受pH影响等优点。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明：
附图：
图1. SN-1在DMSO和水相中的光物理学性质
图2. SN-1在DMSO中的光谱图
其中1: UV-vis, 2: One-photon Emission, 3: Two-photon Emission
图3. SN-1在混合溶剂中的发射光谱（H2O/DMSO，0~100%）
图4. SN-1与LC3在HEK293细胞和HeLa细胞中的自噬实验对比
图5. 在活细胞、固定细胞和氯化铵条件下自噬实验中SN-1发光强度对比
图6. 不同浓度的自噬诱导剂条件下SN-1发光强度曲线
图7. LC3免疫印迹实验与SN-1自噬实验结果对比
图8. SN-1高通量筛选实验结果
具体实施方式：
实施实例1
化合物SN-1的制备：
3-（糖基取代氨基）-水杨醛（210.0mg，0.4mmol），二氨基马来腈（16mg, 0.2mmol），四氯铂酸钾（83mg, 0.2mmol）溶解在100mL甲醇中，加热回流12小时。反应完毕，将反应液冷却至室温，减压浓缩，过滤得固体（200mg, 66%）。1HNMR（d6-DMSO, 400MHz）：δ3.22 (t, 4H), 3.39 (d, 4H), 3.68 (d, 4H), 3.80 (t, 4H), 4.74 (s, 8H), 5.54 (d, 2H), 6.11 (s, 2H), 8.45 (d, 2H), 7.14 (d, 2H), 8.11 (s, 2H), 8.25 (s, 4H)。 MS (ESI) : 1511 [M+H]+。IR (KBr, cm-1): ν=1614 (C=N), ν=2214 (C≡N)。
实施实例2：活细胞自噬活性实验
1、 HeLa细胞装入培养皿中，加入1mL培养基培养，直至培养皿中细胞覆盖率达到70~80%；
2、 取荧光标记物溶液1uL，加入无血清培养基1mL中混合均匀；
3、 把培养皿中的原培养基去除，替换为步骤2培养基，继续培养24小时；
4、 取自噬诱导溶液1uL，加入无血清培养基中1mL混合均匀；
5、 把培养皿中的原培养基去除，替换为步骤4培养基，继续培养2小时；
6、 把培养皿中的原培养基去除，使用缓冲溶液洗涤1~2次。置于激光扫描共聚焦显微镜下实验；
7、 激光扫描共聚焦显微镜实验使用奥林巴斯FV1200系统。实验参数设定：60X油浸物镜，分辨率512X512，激发波长543nm。结果使用奥林巴斯FluoView 4.0分析。
实施实例3：固定细胞自噬活性实验
1、 HeLa细胞装入培养皿中，加入1mL培养基培养，直至培养皿中细胞覆盖率达到70~80%；
2、 取荧光标记物溶液1uL，加入无血清培养基1mL中混合均匀；
3、 把培养皿中的原培养基去除，替换为步骤2培养基，继续培养24小时；
4、 取自噬诱导溶液1uL，加入无血清培养基中1mL混合均匀；
5、 把培养皿中的原培养基去除，替换为步骤4培养基，继续培养2小时；
6、 把培养皿中的原培养基去除，使用缓冲溶液洗涤1~2次。置于激光扫描共聚焦显微镜下实验；
7、 激光扫描共聚焦显微镜实验使用奥林巴斯FV1200系统。实验参数设定：60X油浸物镜，分辨率512X512，激发波长543nm。结果使用奥林巴斯FluoView 4.0分析。
实施实例4：检测灵敏度实验
1、 HeLa细胞装入培养皿中，加入1mL培养基培养，直至培养皿中细胞覆盖率达到70~80%；
2、 取荧光标记物溶液0.5uL、1uL、1.5uL、2.0uL、2.5uL、3.0uL，加入无血清培养基1mL中混合均匀；
3、 把培养皿中的原培养基去除，替换为步骤2培养基，继续培养24小时；
4、 取自噬诱导溶液1uL，加入无血清培养基中1mL混合均匀；
5、 把培养皿中的原培养基去除，替换为步骤4培养基，继续培养2小时；
6、 把培养皿中的原培养基去除，使用缓冲溶液洗涤1~2次。置于激光扫描共聚焦显微镜下实验；
7、 激光扫描共聚焦显微镜实验使用奥林巴斯FV1200系统。实验参数设定：60X油浸物镜，分辨率512X512，激发波长543nm。结果使用奥林巴斯FluoView 4.0分析。
实施实例5：pH影响实验
1、 HeLa细胞装入培养皿中，加入1mL培养基培养，直至培养皿中细胞覆盖率达到70~80%；
2、 取荧光标记物溶液1uL，加入无血清培养基1mL中混合均匀；
3、 把培养皿中的原培养基去除，替换为步骤2培养基，继续培养24小时；
4、 取自噬诱导溶液1uL，加入无血清培养基中1mL混合均匀；
5、 把培养皿中的原培养基去除，替换为步骤4培养基，继续培养2小时；
6、 把培养皿中的原培养基去除，使用1uM、10uM、20uM、40uM、80uM氯化铵溶液洗涤1~2次。置于激光扫描共聚焦显微镜下实验；
7、 激光扫描共聚焦显微镜实验使用奥林巴斯FV1200系统。实验参数设定：60X油浸物镜，分辨率512X512，激发波长543nm。结果使用奥林巴斯FluoView 4.0分析。
实施实例5：近红外激发实验
1、 HeLa细胞装入培养皿中，加入1mL培养基培养，直至培养皿中细胞覆盖率达到70~80%；
2、 取荧光标记物溶液1uL，加入无血清培养基1mL中混合均匀；
3、 把培养皿中的原培养基去除，替换为步骤2培养基，继续培养24小时；
4、 取自噬诱导溶液1uL，加入无血清培养基中1mL混合均匀；
5、 把培养皿中的原培养基去除，替换为步骤4培养基，继续培养2小时；
6、 把培养皿中的原培养基去除，使用缓冲溶液洗涤1~2次。置于激光扫描共聚焦显微镜下实验；
7、 激光扫描共聚焦显微镜实验使用奥林巴斯FV1200系统。实验参数设定：60X油浸物镜，分辨率512X512，激发波长800nm。结果使用奥林巴斯FluoView 4.0分析。
实施实例6：高通量筛选实验
1、 HeLa细胞装入培养皿中，加入1mL培养基培养，直至培养皿中细胞覆盖率达到70~80%；
2、 取荧光标记物溶液1uL，加入无血清培养基1mL中混合均匀；
3、 把培养皿中的原培养基去除，替换为步骤2培养基，继续培养24小时；
4、 取不同浓度金属离子溶液1uL，加入无血清培养基中1mL混合均匀；
5、 把培养皿中的原培养基去除，替换为步骤4培养基，继续培养2小时；
6、 把培养皿中的原培养基去除，使用缓冲溶液洗涤1~2次。置于激光扫描共聚焦显微镜下实验；
7、 激光扫描共聚焦显微镜实验使用奥林巴斯FV1200系统。实验参数设定：60X油浸物镜，分辨率512X512，激发波长800nm。结果使用奥林巴斯FluoView 4.0分析。
Claims (6)
1.一种使用金属络合物作为荧光标记物检测自噬溶酶体的方法，该方法包括如下步骤：
第一步、获得样品实验所需的细胞；
第二步、连接荧光标记物到细胞器；
第三步、通过检测荧光标记物以确定自噬溶酶体。
2.根据权利要求1所述的荧光标记物，其结构式为：
其中R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, 各自独立的选自氢、卤素、取代的芳香族集团、取代的杂芳香族基团、取代的芳基、取代的杂芳基或式（III）结构的取代基，R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, 中至少一个为式（III）结构的取代基：
式（III）中Q为含有氮原子的基团，为连接金属化合物与Q的连接基团；
环A具有式（IV）、式（V）、式（VI）结构：
其中R1a, R2a, R3a, R4a, 各自独立的选自氢、卤素、取代的芳香族集团、取代的杂芳香族基团、取代的芳基、取代的杂芳基；
式（IV）中n为1～3的正整数；
Y不存在，或Y为卤素、-NO3、CH3COO-、CCl3COO-、CF3COO-、ClO4-、BF4-、BPh4-、-CN、-N3、对甲基苯甲酸根、对甲基苯磺酸根、邻硝基苯酚氧、对硝基苯酚氧、2,4-二硝基苯酚氧、3,5-二硝基苯酚氧、2,4,6-三硝基苯酚氧、3,5-二氯苯酚氧、3,5-二氟苯酚氧、3，5-二-三氟甲基苯酚或五氟酚氧负离子；
M为过渡金属和镧系金属。
3.根据权利要求1所述的细胞器，包括溶酶体、吞噬泡、自噬体、自噬溶酶体或它们的组合。
4.根据权利要求 1所述的方法，其特征是作为药物筛选的方法。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是作为检测试剂用于细胞实验、荧光共聚焦实验、高通量筛选、组织学实验。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是制备检测试剂盒。
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| CN201310174229.2A CN104152529A (zh) | 2013-05-13 | 2013-05-13 | 一种金属络合物用作自噬溶酶体标记物 |
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-
2013
- 2013-05-13 CN CN201310174229.2A patent/CN104152529A/zh active Pending
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