CN110938040B - 三聚氰胺半抗原和人工抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

三聚氰胺半抗原和人工抗体及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110938040B
CN110938040B CN201911166797.1A CN201911166797A CN110938040B CN 110938040 B CN110938040 B CN 110938040B CN 201911166797 A CN201911166797 A CN 201911166797A CN 110938040 B CN110938040 B CN 110938040B
Authority
CN
China
Prior art keywords
melamine
hapten
artificial antigen
fluorescent
monoclonal antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911166797.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110938040A (zh
Inventor
李斌
石松
黄智永
王莹莹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong C&d Testing Technology Co ltd
Guangdong Dayuan Oasis Food Safety Technology Co ltd
Guangdong Industry Technical College
Original Assignee
Guangdong C&d Testing Technology Co ltd
Guangzhou Dayuan Food Safety Technology Co ltd
Guangdong Dayuan Oasis Food Safety Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong C&d Testing Technology Co ltd, Guangzhou Dayuan Food Safety Technology Co ltd, Guangdong Dayuan Oasis Food Safety Technology Co ltd filed Critical Guangdong C&d Testing Technology Co ltd
Priority to CN201911166797.1A priority Critical patent/CN110938040B/zh
Publication of CN110938040A publication Critical patent/CN110938040A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110938040B publication Critical patent/CN110938040B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D251/00—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings
    • C07D251/02—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings
    • C07D251/12—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D251/26—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hetero atoms directly attached to ring carbon atoms
    • C07D251/40—Nitrogen atoms
    • C07D251/54—Three nitrogen atoms
    • C07D251/70—Other substituted melamines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/77—Ovalbumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了三聚氰胺半抗原和人工抗原及其制备方法与应用，所述半抗原的结构如式I所示：
Figure DDA0002287675240000011
该半抗原由2‑氯‑4,6‑二氨基‑1,3,5‑三嗪和3,4‑二氨基丁酸为原料制备得到。所述人工抗原为上述半抗原与蛋白载体的偶联物，该人工抗原能够用于三聚氰胺单克隆抗体的制备、ELISA检测和荧光定量免疫层析检测及其产品中，其用于ELISA检测特异性强，用其制备的荧光定量免疫层析试纸条可快速、便捷地实现三聚氰胺的检测，灵敏度高达10μg/L；通过该全新的半抗原结构，最终制备了可定量的荧光免疫层析产品，丰富了三聚氰胺的研究内容，并对食品的安全监测和三聚氰胺药代动力学的研究具有一定的积极作用。

Description

三聚氰胺半抗原和人工抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及免疫化学技术领域，具体涉及一种三聚氰胺半抗原和人工抗体及其制备方法与应用。
背景技术
三聚氰胺，分子式C3N6H6，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物。三聚氰胺最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂的原料，也广泛应用于材料、电气和医药等行业。
蛋白质的检测常用“凯氏定氮法”通过测定氮含量估算蛋白质含量，蛋白质主要由氨基酸组成，其氮含量通常不高于30％，而三聚氰胺的氮含量高达66％。因其含氮量较高，所以常被不法厂商非法添加到食品或饲料中，用于提高食品蛋白质中氮原子含量的测定。三聚氰胺被摄入人体后，通过小肠吸收进入血液循环并最终进入肾脏，形成肾结石，尤其对于哺乳期的婴儿，更容易造成结石，危害极大。经研究表明，动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，甚至会诱发膀胱癌。因此，为了保障食品安全，迫切需要建立一种快速准确、成本低以及适合大规模推广的三聚氰胺检测方法。
目前我国三聚氰胺含量的检测方法主要有高效色谱法和免疫层析法。尽管仪器方法是三聚氰胺检测的确证方法，但是由于其样本前处理过程繁琐，制备复杂，且对需要昂贵的仪器设备及专业的操作技术人员，因此，很难达到大量样品的快速筛查检测的要求。而免疫分析技术弥补了仪器分析方法的不足，现已成为市场快速筛查手段的主流技术。
免疫分析技术的核心是抗原抗体。在现有技术中，专利CN 101402683 B中公开了一种三聚氰胺半抗原和完全抗原及其制备方法，此方法采用戊二醛直接与三聚氰胺偶联，其不足之处在于戊二醛与蛋白上的胺基反应时，产物不单一，副反应较多，生成的碳氮双键稳定性较差，同时也影响了三聚氰胺的电子云密度；专利CN 101643453 B中公开的一种三聚氰胺半抗原的连接臂直接引入了强电子基团苯环，对整个结构的电子云密度影响较大。因此，合成出稳定、高效和灵敏度的半抗原和抗原以应用于三聚氰胺含量及免疫检测具有重要的意义。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种三聚氰胺半抗原，其有两个三聚氰胺的特征结构，该结构稳定，能够用于样品中三聚氰胺含量及免疫检测，具有检测快速、操作简便和灵敏度高等优点。
本发明还提出上述半抗原的制备方法。
本发明还提出一种由上述半抗原制得的人工抗原。
本发明还提出上述人工抗原的制备方法。
本发明还提出上述人工抗原的应用。
根据本发明的第一方面实施例的三聚氰胺半抗原，所述半抗原具有式I所示的结构：
Figure BDA0002287675220000021
根据本发明实施例的三聚氰胺半抗原，至少具有如下有益效果：本发明设计的三聚氰胺半抗原引入的手臂不仅具有活性基团，还完整保留了待测目标物(三聚氰胺)的所有胺基，使得半抗原与待测目标物的电子云密度一致；同时，该半抗原结构中有两个待测目标物的特征结构，使得半抗原在载体蛋白中的空间位置更加突出，增加了识别位点，有效的提高了小分子半抗原的抗原性。
根据本发明的第二方面实施例的上述半抗原的制备方法，以2-氯-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪和3,4-二氨基丁酸为原料，在碱性环境下及(70～90)℃温度下反应(16～24)h，得到式I所示的半抗原。
根据本发明的第三方面实施例的人工抗原，所述人工抗原为上述半抗原与蛋白载体的偶联物；所述人工抗原具有式II所示的结构：
Figure BDA0002287675220000031
其中，protein为蛋白载体。
根据本发明的一些实施例，所述蛋白载体为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的至少一种。
根据本发明的第三方面实施例的人工抗原，至少具有如下有益效果：本发明设计的人工抗原由上述三聚氰胺半抗原制得，引入的手臂同样具备与三聚氰胺电子云密度一致且有多个特征结构的优点，因此，有效提高了该人工抗原的免疫原性。
根据本发明的第四方面实施例的上述人工抗原的制备方法，包括如下步骤：
1)将式I所示的半抗原、EDC和N-羟基琥珀酰亚胺混合，室温反应(3～5)h，得到半抗原活化酯；
2)将载体蛋白与半抗原活化酯混合，室温反应(16～24)h得到所述人工抗原。
根据本发明第四方面实施例的制备方法，至少具有如下有益效果：该制备方法工艺简单、效率高且产物单一。
根据本发明的第五方面实施例的上述人工抗原的应用，包括以下方面：
上述人工抗原在制备三聚氰胺单克隆抗体中的应用；或
上述人工抗原在ELISA检测方法中的应用；或
上述人工抗原在荧光定量免疫层析检测及检测产品中的应用：一种检测三聚氰胺的荧光定量免疫层析试纸条，所述荧光定量免疫层析试纸条上包被有上述的人工抗原。
根据本发明第五方面实施例的应用，至少具有如下有益效果：本发明中的三聚氰胺人工抗原及单克隆抗体用于ELISA检测特异性强，IC50值为10.02μg/L；本发明中的三聚氰胺人工抗原及单克隆抗体用于荧光定量免疫层析技术，可快速、便捷地实现三聚氰胺的检测，本发明中制备的荧光定量免疫层析试纸条对三聚氰胺检测灵敏度为10μg/L，另外该荧光定量免疫层析试纸条稳定性好，可在室温下稳定保存一年以上，可以满足市场在保存和运输过程中的要求。
根据本发明一些实施例的上述荧光定量免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1)反应膜的制备：所述反应膜包括检测区和质控区，将所述人工抗原喷涂到反应膜的检测区，将兔IGg喷涂到反应膜的质控区，干燥处理后保存备用；
2)样品垫的制备：将裁剪好的空白样品垫浸泡在样品垫处理液中浸泡，取出样品垫干燥处理后保存备用；
3)组装和剪切：在背衬中部叠置反应膜，两端分别叠置样品垫和吸水垫，反应膜和吸水垫、样品垫相搭连，检测区靠近样品垫，质控区靠近吸水垫，得到试纸板，将试纸板裁剪成所需宽度，即得荧光定量免疫层析试纸条。
根据本发明一些实施例的利用上述荧光定量免疫层析试纸条检测三聚氰胺的方法，包括以下步骤：
1)将荧光微球活化后与三聚氰胺单克隆抗体偶联，得到荧光微球标记的三聚氰胺单克隆抗体；所述三聚氰胺单克隆抗体是上述人工抗原免疫小鼠得到的；
2)将上述荧光微球标记的三聚氰胺单克隆抗体用荧光缓冲液稀释，得到荧光微球标记的三聚氰胺单克隆抗体检测液；
3)取上述荧光微球标记的三聚氰胺单克隆抗体检测液和标准溶液混匀后滴加到荧光定量免疫层析试纸条的样品区，用荧光定量检测仪读取T/C值，通过标准溶液浓度对应的T/C值建立标准曲线；
4)测定待测样品的T/C值，结合上述标准曲线分析检测结果。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例1中制备的三聚氰胺半抗原质谱图。
图2为本发明实施例4中ELISA检测标准曲线；
图3为本发明实施例5中荧光定量免疫层析定量检测标准曲线。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
实施例1：三聚氰胺半抗原及其制备方法
一种三聚氰胺半抗原，其结构式为：
Figure BDA0002287675220000051
该半抗原的合成路线为：
Figure BDA0002287675220000052
制备方法如下：
取3.1g(21.3mmol)2-氯-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪(化合物a)于50mL圆底烧瓶中，再依次加入27mL乙醇，3mL水，1.0g(8.5mmol)3,4-二氨基丁酸(化合物b)和1.4g(34.0mmol)氢氧化钠。于80℃反应20h。反应完毕，减压去溶剂，加入50mL纯化水，用二氯甲烷萃取两次，所得水溶液用1M的稀盐酸将pH值调至4.5，过滤，固体用80％乙醇/水淋洗两次，烘干得三聚氰胺半抗原0.6g，质谱图如图1所示，ESI-MS：335[M-H]-。
实施例2：三聚氰胺人工抗原及其制备方法
一种三聚氰胺人工抗原，其结构式为：
Figure BDA0002287675220000061
其中Protein为载体蛋白，载体蛋白为牛血清白蛋白或血蓝蛋白；
该人工抗原的合成线路为：
Figure BDA0002287675220000062
1、载体蛋白为牛血清白蛋白的三聚氰胺人工抗原的合成方法如下：
(1)取10mg实施例1中制备的三聚氰胺半抗原，溶解于0.5mL二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌充分后，加入10mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和10mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌4h，即可得到半抗原活化酯；
(2)称取50mg牛血清蛋白(BSA)，使其充分溶解在5mL的浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，形成载体蛋白溶液，在搅拌下将所述半抗原活化酯逐滴缓慢滴加至所述载体蛋白溶液中，并在室温下搅拌20h；
(3)步骤(2)制得的溶液用0.01mol/L的PBS室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；
(4)分装，于4℃保存备用。
2、载体蛋白为血蓝蛋白的三聚氰胺人工抗原的合成方法如下：
(1)取2mg实施例1中制备的三聚氰胺半抗原，溶解于0.2mL二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌充分后，加入3mg EDC和3mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌4h，即可得到半抗原活化酯；
(2)称取8mg血蓝蛋白(KLH)，使其充分溶解在2mL的浓度为0.01mol/L的PBS溶液中，形成载体蛋白溶液，在搅拌下将所述半抗原活化酯逐滴缓慢滴加至所述载体蛋白溶液中，并在室温下搅拌16～24h；
(3)步骤(2)制得的溶液用0.01mol/L的PBS室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；
(4)分装，于4℃保存备用。
实施例3：三聚氰胺人工抗原在制备抗三聚氰胺单克隆抗体中的应用
抗三聚氰胺单克隆抗体的制备方法如下：
以上述载体蛋白为血蓝蛋白的三聚氰胺人工抗原为免疫原，与等体积弗氏佐剂乳化后，免疫BALB/C小鼠。每只鼠免疫剂量为80μg，免疫间隔2周，免疫3次后，采小鼠尾部静脉血检测血清效价。如抗体效价不达要求，需加强免疫，待抗体效价不再升高后，以100μg全抗原进行皮下加强免疫，5天后取小鼠脾细胞与SP20细胞(小鼠骨髓瘤细胞)融合。融合后的细胞在HAT培养基中筛选，5天后以完全培养基替换成HAT培养基进行培养。用ELISA对细胞上清进行检测，将检测结果为强阳性的孔内细胞进行有限稀释法克隆培养，经3次克隆培养检测后，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞放大培养后，接种至小鼠腹腔，产生含抗体的腹水。用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水，经冷冻干燥后即可得到高纯度、高特异性的单克隆抗体。
实施例4：三聚氰胺人工抗原在ELISA中的应用与效果评价
用pH9.6的碳酸盐缓冲液作包被稀释液，将载体蛋白为牛血清白蛋白的三聚氰胺人工抗原稀释至1μg/mL，按100μL/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4℃包被过夜，甩干，按250μL/孔加入1％BSA，磷酸盐缓冲液中37℃封闭1h，甩干，干燥后真空包装保存。
向包被有三聚氰胺人工抗原的微孔酶标板中加入三聚氰胺标准溶液50μL/孔(用pH7.4的磷酸盐缓冲液进行梯度稀释)，再相应加入三聚氰胺单克隆抗体溶液50μL/孔(用含0.05％叠氮钠，pH7.4的磷酸盐缓冲液，将单克隆抗体稀释至0.08μg/mL，现配现用)，37℃反应0.5h；甩干后，加入洗液280μL/孔，洗涤3次后拍干；再加入酶标二抗100μL/孔，37℃反应0.5h；再次洗涤3次后拍干，加入100μL/孔显色液，37℃反应15min；加入1M硫酸50μL/孔终止，设定酶标仪于450nm波长测定每孔的OD值。结果如下表1所示：
表1.ELISA测试不同浓度的三聚氰胺标准溶液的OD值
Figure BDA0002287675220000081
通过表1中数据，采用ELISA Calc软件进行四参数Logistic曲线拟合绘制标准曲线，得到的标准曲线如图2所示，三聚氰胺的线性方程为：y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D，r2＝0.999，A＝2.84656，B＝0.78807，C＝10.42229，D＝-0.04000，x表示待测物浓度，y表示OD值，通过计算得到IC50值为10.02μg/L，在3～243μg/L呈线性关系。
由上述结果可知，到IC50值为10.02μg/L说明本发明中的三聚氰胺人工抗原及单克隆抗体用于ELISA检测特异性强。
实施例5：三聚氰胺荧光定量免疫层析试纸条的制备及性能评价
1、荧光定量免疫层析试纸条的制备
(1)制备包被有人工抗原和兔IGg的反应膜：
以硝酸纤维素膜(NC膜)为反应膜，将载体蛋白为牛血清白蛋白的人工抗原用包被缓冲液调节浓度至0.1～0.5mg/mL，并将兔IGg用包被缓冲液也调节浓度至0.1～1mg/mL，按照0.8～1.2μL/cm的膜液量，将抗原和兔IGg喷到反应膜对应的检测区和质控区，检测区和质控区之间间隔为5mm，放置40～45℃烘箱处理24h以上，干燥后真空包装保存，所用包被缓冲液为含有0.5％PEG20000、1％蔗糖、0.5％BSA、0.05％叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液；
(2)样品垫的制备：
将裁剪好的空白样品垫浸泡在样品本处理液中，浸泡5min后，取出在37℃干燥16h，置于恒温恒湿保藏箱里备用，所用样品垫处理液为含有0.3％吐温20、1％蔗糖、1％Tris、0.5％BSA、0.05％叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液；
(3)荧光定量免疫层析试纸条的组装：
在PVC板背衬中部叠置步骤(1)制得的反应膜，两端分别叠置步骤(2)制得的样品垫和吸水垫，反应膜和吸水垫、样品垫相搭连，检测区靠近样品垫，质控区靠近吸水垫，得到试纸板，得到试纸板，将试纸板切割成试纸条，将试纸条装载于试纸卡内，得荧光定量免疫层析试纸条。
2、荧光定量免疫层析试纸条的性能评价
(1)荧光微球标记的抗三聚氰胺单克隆抗体的制备：取1mL荧光微球溶液(荧光微球固含量1％，即含荧光微球10mg)，并用超声波处理；室温下分别加入5mg NHS和4mg EDC，并在室温下活化20分钟以上；活化完后，用0.1M碳酸钾溶液调pH为8.5；加入0.2mg三聚氰胺单克隆抗体，搅拌均匀后，在室温下偶联反应4h以上；偶联完成后，加入100μL 10％BSA水溶液，室温封闭1h以上；封闭完成后，反应液在12000rpm下离心10min，除去上清，加入1mL荧光缓冲液，超声重悬后，离心、除去上清，该操作重复3次，最后一次离心除上清后，加入1mL荧光缓冲液超声重悬荧光微球，2～8℃冰箱保存备用，所用荧光缓冲液为含有0.5％PEG20000、2％蔗糖、0.1％吐温20，0.5％BSA、0.05％叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液。
(2)荧光微球标记的抗三聚氰胺单克隆抗体检测液的制备：将上述荧光微球标记的三聚氰胺单克隆抗体取出放置至室温，用荧光缓冲液稀释100～1000倍成荧光微球标记的三聚氰胺单克隆抗体检测液，荧光缓冲液为含有0.5％PEG20000、2％蔗糖、0.1％吐温20，0.5％BSA、0.05％叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液，然后置于2～8℃冰箱保存备用。
(3)用0.01M PBS缓冲液配备一系列不同浓度的三聚氰胺的标准溶液，然后取上述制备的荧光微球标记的三聚氰胺单克隆抗体检测液20μL和100μL配制好的系列标准品溶液混合1min后，取80μL滴加到本发明中的荧光定量免疫层析试纸条的样品区，15min后，用荧光定量检测仪读取T/C的荧光信号值比值，检测试验设置3组重复。再通过系列标品浓度对应的T/C值建立四参数Logistic曲线，曲线所得的四个参数值录入荧光定量检测仪的标定软件，即可实现荧光定量免疫层析试纸条在荧光免疫层析分析仪上的快速定量检测。测定结果如下表2所示：
表2.使用荧光定量免疫层析试纸条与对应的三聚氰胺标准液的测定结果
Figure BDA0002287675220000101
通过对三聚氰胺系列标准液的T/C值进行了测定，并计算了B/B0(不同浓度的标准品测试卡T/C值与含量为0的标准品测试卡T/C值的比值)，结果如上表2所示。从表2中可看出，当三聚氰胺的标准液含量为10μg/L时，其B/B0值为78.82％，说明此浓度下检测的T/C值与含0μg/L浓度的三聚氰胺标准液的测试卡T/C值有明显差异，故本发明制备的荧光定量免疫层析试纸条对三聚氰胺检测灵敏度为10μg/L。
(4)通过表2数据，采用ELISA Calc软件进行四参数Logistic曲线拟合绘制荧光定量免疫层析试纸条的定量标准曲线(如图3所示)，所得曲线的线性方程为：y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D，r2＝0.999，A＝5.44229，B＝0.93312，C＝34.24606，D＝-0.42636，线性方程中x表示待测物浓度，y表示T/C值。在荧光免疫层析分析仪的定量曲线设置界面当中，分别将A，B，C，D的值录入荧光免疫层析分析仪的标定软件，即可实现荧光定量免疫层析试纸条在荧光免疫层析分析仪上的快速定量检测。
3、荧光定量免疫层析试纸条的稳定性测试
荧光定量免疫层析试纸条保存的条件为室温，为了确保试纸条的稳定性，对试纸条进行了加速破坏性实验，分别在室温、45℃条件下连续放置60天，并在第3天，第6天，第15天，第30天和第60天分别检测荧光信号值，实验设置3组重复，结果如下表3所示：
表3.加速破坏实验
Figure BDA0002287675220000102
由上表3的数据结果可知，在常温和45℃下密封保存的荧光定量免疫层析试纸条60天后，四个项目的试纸条的T/C值均无明显变化，说明荧光定量免疫层析试纸条在加速实验45℃下最少可稳定保存60天。因此，本发明制备的三聚氰胺荧光定量免疫层析试纸条可在室温下稳定保存一年以上，完全可以满足市场在保存和运输过程中的要求。
综上所述，本发明的有益效果在于：
1、本发明设计的三聚氰胺半抗原引入的手臂不仅具有活性基团，还完整保留了待测目标物的所有胺基，使得半抗原与待测目标物的电子云密度一致；同时，该半抗原结构中有两个待测目标物的特征结构，使得半抗原在载体蛋白中的空间位置更加突出，增加了识别位点，有效的提高了小分子半抗原的抗原性。
2、本发明中的三聚氰胺人工抗原及单克隆抗体用于ELISA检测特异性强，IC50值为10.02μg/L。
3、本发明中的三聚氰胺人工抗原及单克隆抗体用于荧光定量免疫层析技术，可快速、便捷地实现三聚氰胺的检测，本发明中制备的荧光定量免疫层析试纸条对三聚氰胺检测灵敏度为10μg/L，另外该荧光定量免疫层析试纸条稳定性好，可在室温下稳定保存一年以上，能够满足市场在保存和运输过程中的要求。
以上所述实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。上述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。

Claims (9)

1.一种三聚氰胺半抗原，其特征在于，所述半抗原具有式I所示的结构：
Figure FDA0002764629440000011
2.如权利要求1所述的半抗原的制备方法，其特征在于，以2-氯-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪和3,4-二氨基丁酸为原料，在碱性环境及70℃～90℃温度下反应16h～24h，得到式I所示的半抗原。
3.一种人工抗原，其特征在于，所述人工抗原为如权利要求1所述的半抗原与蛋白载体的偶联物；所述人工抗原具有式II所示的结构：
Figure FDA0002764629440000012
其中，protein为蛋白载体；所述蛋白载体为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的至少一种。
4.如权利要求3所述的人工抗原的制备方法，包括如下步骤：
1)将式I所示的半抗原、EDC和N-羟基琥珀酰亚胺混合，室温反应3h～5h，得到半抗原活化酯；
2)将载体蛋白与半抗原活化酯混合，室温反应16h～24h得到所述人工抗原。
5.如权利要求3所述的人工抗原在制备三聚氰胺单克隆抗体中的应用。
6.如权利要求3所述的人工抗原在ELISA检测方法中的应用。
7.一种检测三聚氰胺的荧光定量免疫层析试纸条，其特征在于，所述荧光定量免疫层析试纸条上包被有如权利要求3所述的人工抗原。
8.如权利要求7所述的荧光定量免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)反应膜的制备：所述反应膜包括检测区和质控区，将所述人工抗原喷涂到反应膜的检测区，将兔IGg喷涂到反应膜的质控区，干燥处理后保存备用；
2)样品垫的制备：将裁剪好的空白样品垫浸泡在样品垫处理液中浸泡，取出样品垫干燥处理后保存备用；
3)组装和剪切：在背衬中部叠置反应膜，两端分别叠置样品垫和吸水垫，反应膜和吸水垫、样品垫相搭连，检测区靠近样品垫，质控区靠近吸水垫，得到试纸板，将试纸板裁剪成所需宽度，即得荧光定量免疫层析试纸条。
9.一种采用权利要求7所述的荧光定量免疫层析试纸条检测三聚氰胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将荧光微球活化后与三聚氰胺单克隆抗体偶联，得到荧光微球标记的三聚氰胺单克隆抗体；所述三聚氰胺单克隆抗体是由所述人工抗原免疫小鼠得到的；
2)将上述荧光微球标记的三聚氰胺单克隆抗体用荧光缓冲液稀释，得到荧光微球标记的三聚氰胺单克隆抗体检测液；
3)取上述荧光微球标记的三聚氰胺单克隆抗体检测液和标准溶液混匀后滴加到荧光定量免疫层析试纸条的样品区，用荧光定量检测仪读取T/C值，通过标准溶液浓度对应的T/C值建立标准曲线；
4)测定待测样品的T/C值，结合上述标准曲线，分析检测结果。
CN201911166797.1A 2019-11-25 2019-11-25 三聚氰胺半抗原和人工抗体及其制备方法与应用 Active CN110938040B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911166797.1A CN110938040B (zh) 2019-11-25 2019-11-25 三聚氰胺半抗原和人工抗体及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911166797.1A CN110938040B (zh) 2019-11-25 2019-11-25 三聚氰胺半抗原和人工抗体及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110938040A CN110938040A (zh) 2020-03-31
CN110938040B true CN110938040B (zh) 2021-03-09

Family

ID=69907435

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911166797.1A Active CN110938040B (zh) 2019-11-25 2019-11-25 三聚氰胺半抗原和人工抗体及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110938040B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112557661A (zh) * 2020-10-31 2021-03-26 上海海洋大学 一种快速检测乙型肝炎病毒前s2抗原的磁性免疫层析试纸条及方法
CN112698027B (zh) * 2020-12-14 2022-04-01 广东唯实生物技术有限公司 一种半抗原免疫层析检测试剂

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101555234A (zh) * 2009-03-31 2009-10-14 华南农业大学 氰脲三酰胺半抗原、人工抗原和抗体制备方法及应用
CN103102319B (zh) * 2011-11-11 2016-02-24 北京勤邦生物技术有限公司 三聚氰胺半抗原及其制备方法和应用
CN102942531B (zh) * 2012-11-06 2015-12-16 北京博奥森生物技术有限公司 一种三聚氰胺衍生物及三聚氰胺单克隆抗体的制备方法和应用
CN103145633B (zh) * 2013-02-06 2015-12-02 天津科技大学 新型三聚氰胺抗原和抗体及应用
CN105503759A (zh) * 2014-09-25 2016-04-20 北京维德维康生物技术有限公司 三聚氰胺半抗原和抗原的制备方法及其在化学发光免疫试剂盒中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110938040A (zh) 2020-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108640850B (zh) 一种孔雀石绿半抗原、人工抗原及其在荧光定量免疫层析中的应用
CN110938040B (zh) 三聚氰胺半抗原和人工抗体及其制备方法与应用
CN108508215A (zh) 一种检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN102621326B (zh) 一种检测食品中呋喃它酮代谢物含量的方法
CN111187346B (zh) 一种检测氟虫腈及其代谢物的胶体金试纸条及其制备方法
CN102288764B (zh) 一种基于量子点的免疫荧光检测三聚氰胺的方法及专用试剂盒
CN108918851A (zh) 一种拉莫三嗪胶体金试纸条的制备方法
CN108558718B (zh) 氟苯尼考及氟苯尼考胺抗原、抗体及其同时检测酶联免疫分析方法
CN112939954A (zh) 一种罗丹明b人工抗原和试纸条及其制备方法与应用
CN113968853B (zh) 阿托品类生物碱的半抗原、人工抗原及其制备方法与应用
CN114716535B (zh) 一种展青霉素人工抗原合成方法及其单克隆抗体的制备和应用
CN110240576B (zh) 氢氯噻嗪半抗原和人工抗原及其制备方法和应用
CN110927375A (zh) 一种检测喹乙醇残留的荧光微球免疫层析试纸条及其应用
CN110684188A (zh) 壬基酚聚氧乙烯醚半抗原和全抗原及其制备方法与应用
CN102798711B (zh) 荧光增白剂vbl检测试剂盒及其制备方法
CN111777612B (zh) 一种6-苄基腺嘌呤半抗原、人工抗原及其在免疫检测中的应用
CN103645310A (zh) 一种呋喃妥因化学发光检测试剂盒
CN109061153B (zh) 一种检测异菌脲的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN109061154B (zh) 一种检测甲霜灵的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN113125729A (zh) 一种检测橘青霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法
CN113636954B (zh) 一种氟虫腈人工抗原、制备方法及应用
CN114044782B (zh) 一种黄曲霉毒素b1半抗原、人工抗原及其制备方法与应用
CN109061150A (zh) 一种检测甲霜灵的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN114685387B (zh) 粉唑醇半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和应用
CN115322089B (zh) 一种覆盆子酮半抗原、人工抗原及其制备方法、抗体和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230118

Address after: 510663 Guangdong Guangzhou high tech Industrial Development Zone, Science City, open source road 11, A2 third.

Patentee after: GUANGDONG DAYUAN OASIS FOOD SAFETY TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Patentee after: GUANGDONG C&D TESTING TECHNOLOGY CO.,LTD.

Patentee after: Guangdong Industry Technical College

Address before: 510535 3rd floor, building A2, No. 11, Kaiyuan Avenue, Science City, Guangzhou high tech Industrial Development Zone, Guangdong Province

Patentee before: GUANGDONG DAYUAN OASIS FOOD SAFETY TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Patentee before: GUANGZHOU DAYUAN FOOD SAFETY TECHNOLOGY CO.,LTD.

Patentee before: GUANGDONG C&D TESTING TECHNOLOGY CO.,LTD.