CN111777612B - 一种6-苄基腺嘌呤半抗原、人工抗原及其在免疫检测中的应用 - Google Patents

一种6-苄基腺嘌呤半抗原、人工抗原及其在免疫检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种6‑苄基腺嘌呤半抗原、人工抗原及其在免疫检测中的应用。本发明通过化合物a和化合物b多步反应得到6‑苄基腺嘌呤半抗原，所得半抗原引入的手臂不仅具有活性基团，还完整保留了待测目标物的所有胺基；且使用半抗原制得的人工抗原及单克隆抗体IC50值为1.6μg/L，可快速、便捷地实现6‑BA的检测，本发明中制备的荧光定量免疫层析试纸条对6‑BA检测灵敏度为2μg/L。

Description

一种6-苄基腺嘌呤半抗原、人工抗原及其在免疫检测中的 应用
技术领域
本发明属于免疫检测领域，特别涉及一种6-苄基腺嘌呤半抗原、人工抗原及其在免疫检测中的应用。
背景技术
6-苄基腺嘌呤(6-benzylarninopuring，6-BA)是第一个人工合成的细胞分裂素，为白色或类白色晶体，难溶于水，微溶于乙醇，在酸、碱中稳定，具有抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质的分解，保绿防老；将氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能，广泛用在农业、果树和园艺作物从发芽到收获的各个阶段。由于6-BA药效良好、价格低廉，被当成一种生长调节剂广泛应用于无根培植豆芽的种植中。
人体摄入过多的6-BA会刺激皮肤黏膜，造成食道、胃黏膜损伤，出现恶心、呕吐等。原国家食品药品监督管理总局、农业部、国家卫生和计划生育委员会均禁止在豆芽生产过程中使用6-苄基腺嘌呤。因此加强对6-BA呤残留量监测对于保证食品质量安全十分重要。
目前，用于检测6-BA的方法主要为传统的检测方法，如分光光度法、高效液相色谱法及其联用技术等，以上方法虽然可以精确定量，但由于设备仪器昂贵，检测时间长，且需专业人员操作，无法实现真正意义上的现场快速检测；另一种检测方法为免疫学检测技术，此方法具有高特异性和高选择性的特点，非常适用于复杂基质痕量组分的分离或检测，随着学科间的相互渗透，其检测方法层出不穷，应用范围亦日益扩大，与传统检测方法相比，免疫学检测技术具有经济、快速、技术要点低、操作简便等特点。但免疫分析检测技术的关键是抗原和抗体的性能决定的，而抗原和抗体的关键又是相应的半抗原，因此，要得到性能优异的抗原和抗体，半抗原的结构设计就显得尤为重要。
因此需设计出具有更高识别度的完全抗原成为亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种6-苄基腺嘌呤半抗原；
本发明的另一目的在于提供上述的半抗原的制备方法；
本发明的另一目的在于提供一种人工抗原；
本发明的另一目的在于提供一种上述人工抗原的制备方法；
本发明的另一目的在于提供一种6-苄基腺嘌呤单克隆抗体；
本发明的另一目的在于提供上述6-苄基腺嘌呤单克隆抗体在ELISA检测方法中的应用；
本发明的另一目的在于提供上述6-苄基腺嘌呤单克隆抗体在免疫层析中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种6-苄基腺嘌呤荧光定量免疫层析试纸条。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种6-苄基腺嘌呤半抗原，其具有式I所示的结构式：
Figure BDA0002526737460000021
本发明的第二个方面，提供：
上述的半抗原的制备方法，包括如下步骤：
化合物a和化合物b反应得到化合物c；
化合物c水解得到半抗原
Figure BDA0002526737460000022
其中，化合物a的结构式为
Figure BDA0002526737460000023
化合物b的结构式为
Figure BDA0002526737460000024
化合物c的结构式为
Figure BDA0002526737460000031
进一步地，上述制备方法，还包括以下步骤：
(1)将化合物a和化合物b在甲苯条件下发生缩合、还原反应，经分离和萃取得到化合物c；
(2)化合物c在强碱条件下发生水解反应，经萃取、过滤，烘干后得到半抗原。
本发明的第三个方面，提供：
一种人工抗原，该人工抗原为上述的半抗原与蛋白载体偶联得到，该人工抗原的结构式如下：
Figure BDA0002526737460000032
其中，protein为蛋白载体。
进一步地，上述蛋白载体为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种。
本发明的第四个方面，提供：
一种上述人工抗原的制备方法，包括如下步骤：
将上述半抗原与蛋白载体连接，得到上述人工抗原
Figure BDA0002526737460000033
其中，上述半抗原在活化剂条件下与蛋白载体连接；
上述活化剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺。
本发明的第五个方面，提供：
一种6-苄基腺嘌呤单克隆抗体，使用上述的半抗原或上述人工抗原制备得到。
本发明的第六个方面，提供：
上述6-苄基腺嘌呤单克隆抗体在ELISA检测方法中的应用。
本发明的第七个方面，提供：
上述6-苄基腺嘌呤单克隆抗体在免疫层析中的应用。
本发明的第八个方面，提供：
一种6-苄基腺嘌呤荧光定量免疫层析试纸条，该试纸条中的反应膜包被有上述的人工抗原。
本发明的有益效果是：
1.本发明设计的6-BA半抗原引入的手臂不仅具有活性基团，还完整保留了待测目标物的所有胺基，使得半抗原与待测目标物的电子云密度一致。
2.本发明中的6-BA人工抗原及单克隆抗体用于ELISA检测特异性强，IC50值为1.6μg/L。
3.本发明中的6-BA人工抗原及单克隆抗体用于荧光定量免疫层析技术，可快速、便捷地实现6-BA的检测，本发明中制备的荧光定量免疫层析试纸条对6-BA检测灵敏度为2μg/L。
附图说明
图1为本发明的6-BA半抗原的合成线路图；
图2为本发明的6-BA半抗原ESI-MS分析图；
图3为本发明的6-BA人工抗原的合成线路图；
图4为不同浓度的6-BA标准溶液的OD值的四参数Logistic曲线图；
图5为荧光定量检测试纸条对6-BA测定结果的四参数Logistic曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
实施例1 6-BA半抗原的制备
一种6-苄基腺嘌呤半抗原，所述6-苄基腺嘌呤半抗原具有式I所示的结构式：
Figure BDA0002526737460000051
如图1所示，本发明的6-BA半抗原通过以下方法制备，步骤如下：
(1)取2.0g(14.8mmol)化合物a，依次加入10ml甲苯和4.9g(29.6mmol)化合物b，于100～120℃反应5h以上。反应完毕，减压去溶剂，加入20ml无水乙醇溶解残余物，用冰浴冷却后，加入1.1g(29.6mmol)NaBH4，待不产气后升温到60～70℃反应2h以上。反应完毕，减压去溶剂，加入20ml纯化水，用1M的稀盐酸将水相PH值调至1～2，乙酸乙酯萃取两次，水相加入碳酸氢钠固体至PH≥8，再用二氯甲烷萃取两次，合并二氯甲烷层，减压去溶剂，得3.6g化合物c。
(2)将3.6g(12.7mmol)的化合物c溶于20ml乙醇中，加入6mol/L的氢氧化锂溶液将化合物c的乙醇溶液的PH值调至12以上，室温反应15～26h，然后加入40ml纯化水，用二氯甲烷萃取两次，水相通过1M的稀盐酸将PH值调至4～5，过滤，烘干得到1.5g半抗原。
对制得的半抗原进行ESI-MS分析(270.1[M+1])，结果如图2所示，制得的6-BA半抗原的结构式为
Figure BDA0002526737460000052
实施例2 6-BA人工抗原的制备
本发明中的6-BA人工抗原，其结构式为：
Figure BDA0002526737460000061
其中，protein为蛋白载体，该蛋白载体为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种。
该人工抗原的合成线路如图3所示。
1.载体蛋白为牛血清白蛋白的6-BA人工抗原，合成方法如下：
1)取10mg实施例1中制备的6-BA半抗原，溶解于0.2mL二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌充分后，加入10mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和10mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌4h，即可得到半抗原活化酯；
2)称取40mg牛血清蛋白(BSA)，使其充分溶解在4mL 0.01mol/L的PBS溶液中，形成载体蛋白溶液，在搅拌下将所述半抗原活化酯逐滴缓慢滴加至所述载体蛋白溶液中，并在室温下搅拌16～24h；
3)步骤2)制得的溶液用0.01mol/L的PBS室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，即得载体蛋白为牛血清白蛋白的6-BA人工抗原。
制得的载体蛋白为牛血清白蛋白的6-BA人工抗原可进行分装，于4℃保存备用。
2.载体蛋白为血蓝蛋白的6-BA人工抗原，合成方法如下：
1)取5mg实施例1中制备的6-BA半抗原，溶解于0.2mL二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌充分后，加入10mg EDC和10mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌4h，即可得到半抗原活化酯；
2)称取10mg血蓝蛋白(KLH)，使其充分溶解在4mL 0.01mol/L的PBS溶液中，形成载体蛋白溶液，在搅拌下将所述半抗原活化酯逐滴缓慢滴加至所述载体蛋白溶液中，并在室温下搅拌16～24h；
4)步骤2)制得的溶液用0.01mol/L的PBS室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，即得载体蛋白为血蓝蛋白的6-BA人工抗原。
制得的载体蛋白为血蓝蛋白的6-BA人工抗原可进行分装，于4℃保存备用。
实施例3 6-BA人工抗原在制备抗6-BA单克隆抗体中的应用
抗6-BA单克隆抗体的制备方法如下：
以实施例2中的载体蛋白为血蓝蛋白的6-BA人工抗原为免疫原，与等体积弗氏佐剂乳化后，免疫BALB/C小鼠。每只鼠免疫剂量为100μg，免疫间隔2周，免疫3次后，采小鼠尾部静脉血检测血清效价。如抗体效价不达要求，需加强免疫，待抗体效价不再升高后，以100μg全抗原进行皮下加强免疫，5天后取小鼠脾细胞与SP20细胞(小鼠骨髓瘤细胞)融合。融合后的细胞在HAT培养基中筛选，5天后以完全培养基替换成HAT培养基进行培养。用ELISA对细胞上清进行检测，将检测结果为强阳性的孔内细胞进行有限稀释法克隆培养，经3次克隆培养检测后，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞放大培养后，接种至小鼠腹腔，产生含抗体的腹水。用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水，经冷冻干燥后即可得到高纯度、高特异性的单克隆抗体。
实施例4 6-BA人工抗原在ELISA中的应用与效果评价
用pH9.6的碳酸盐缓冲液作包被稀释液，将载体蛋白为牛血清白蛋白的6-BA人工抗原稀释至0.2μg/mL，按100μL/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4℃包被过夜，甩干，按250μL/孔加入1％BSA，磷酸盐缓冲液中37℃封闭1h，甩干，干燥后真空包装保存。
向包被有6-BA人工抗原的微孔酶标板中加入6-BA标准溶液100μL/孔(用pH7.4的磷酸盐缓冲液进行梯度稀释)，再相应加入6-BA单克隆抗体溶液50μL/孔(用含0.05％叠氮钠，pH7.4的磷酸盐缓冲液，将单克隆抗体稀释至0.1μg/mL，现配现用)，37℃反应0.5h；甩干后，加入洗液250μL/孔，洗涤3次后拍干；再加入酶标二抗100μL/孔，37℃反应0.5h；再次洗涤3次后拍干，加入100μL/孔显色液，37℃反应15min；加入0.5M硫酸50μL/孔终止，设定酶标仪于450nm波长测定每孔的OD值。
结果如下表1所示：
表1.ELISA测试不同浓度的6-BA标准溶液的OD值
Figure BDA0002526737460000071
通过表1中数据，采用ELISA Calc软件进行四参数Logistic曲线拟合绘制标准曲线，得到的标准曲线如图4所示，6-BA的线性方程为：
Figure BDA0002526737460000072
r2＝0.999，A＝2.31708，B＝0.81662，C＝1.42452，D＝0.10002，x表示待测物浓度，y表示OD值，通过计算得到IC50值为1.6μg/L，在0.5～40.5μg/L呈线性关系。
由上述结果可知，到IC50值为1.6μg/L说明本发明中的6-BA人工抗原及单克隆抗体用于ELISA检测特异性强。
实施例5 6-BA荧光定量免疫层析试纸条的制备及性能评价
本发明中的6-BA荧光定量免疫层析试纸条的制备方法如下：
(1)制备包被有人工抗原和兔IGg的反应膜
以硝酸纤维素膜(NC膜)为反应膜，将NC膜固定粘贴在PVC背衬的中间部位，将实施例2的抗原用包被缓冲液调节浓度至0.1～0.5mg/mL，并将兔IGg用包被缓冲液也调节浓度至0.1～1mg/mL，按照0.8～1.2uL/cm的膜液量，将抗原和兔IGg喷到反应膜对应的检测区和控制区，检测区和控制区之间间隔为5mm，放置40～45℃烘箱处理16-35小时，置于恒温恒湿保藏箱里备用，所用包被缓冲液为含有0.5％PEG20000、1％蔗糖、0.5％BSA、0.05％叠氮化钠NaN3的0.01M磷酸盐缓冲液PBS；
(2)样品垫的制备
将裁剪好的空白样品垫浸泡在样品本处理液中，浸泡5min后，取出在37℃干燥16h，置于恒温恒湿保藏箱里备用，所用样品垫处理液为含有0.3％吐温20、1％蔗糖、0.5％BSA、0.05％叠氮化钠NaN3的0.1M磷酸盐缓冲液PBS；
(3)荧光定量检测试纸条的组装
在PVC板背衬上顺序粘贴步骤(2)制得的样品垫、步骤(1)制得的反应膜以及吸水垫，得到试纸板，将试纸板切割成试纸条，将试纸条装载于试纸卡内，得荧光定量免疫层析试纸条；
(4)荧光微球标记蛋白液的制备：
取500μL荧光微球溶液(荧光微球固含量1％，既荧光微球5mg)，并用超声波处理；搅拌下分别加入5mgNHS和4mgDEC，控制荧光微球溶液的温度为4-10℃，并在此温度下活化20min；活化完后，用0.1M碳酸钾溶液调pH为8-9，控制荧光微球溶液的温度为4-10℃；加入0.25mg蛋白，搅拌均匀后，移去冰浴，让其自然升至室温，并在室温下搅拌4-6h；偶联完成后，反应液在10000rpm下离心10min，除去上清，加入1mL荧光缓冲液，超声重悬后，离心、除去上清，该操作重复3次，最后一次离心，除上清后，加入0.5mL荧光缓冲液超声重悬荧光微球，2～8℃冰箱保存备用，所用荧光缓冲液为含有0.5％PEG20000、2％蔗糖、0.1％吐温20，0.5％BSA、0.05％叠氮化钠NaN3的0.01M磷酸盐缓冲液PBS；
(5)荧光微球标记蛋白检测液的制备
将上述荧光微球标记蛋白液取出放置至室温，用荧光缓冲液稀释100-1000倍成荧光微球标记蛋白检测液，荧光缓冲液为含有0.5％PEG20000、2％蔗糖、0.1％吐温20，0.5％BSA、0.05％叠氮化钠NaN3的0.01M磷酸盐缓冲液PBS，然后置于2～8℃冰箱保存备用；
(6)荧光定量检测试纸条的性能评价
用0.01M磷酸盐缓冲液PBS配备一系列不同浓度的6-BA的标准溶液，然后取上述制备的荧光微球标记蛋白检测液20μL和100μL配制好的系列标准品溶液混合1min后，取80μL滴加到上述制备的荧光定量检测试纸条上，15min后，用荧光定量检测仪读取T/C的荧光信号值比值。再通过系列标品浓度对应的T/C值建立四参数Logistic曲线，曲线所得的四个参数值录入荧光定量检测仪的标定软件，即可实现荧光定量检测试纸条在荧光免疫层析分析仪上的快速定量检测。
(7)荧光定量检测试纸条对6-BA的测定，测定结果如表2所示。
表2荧光定量检测试纸条对6-BA的测定结果
Figure BDA0002526737460000091
通过对不同6-BA浓度的T/C值进行了测定，并计算了B/B0(不同浓度的标准品测试卡T/C值与含量为0的标准品测试卡T/C值的比值)，结果如上表所示。从表中可看出，当6-BA含量为2μg/L时，其B/B0值为74.31％，说明此浓度下检测的T/C值与含0μg/L浓度的测试卡T/C值有明显差异，故荧光定量检测试纸条对6-BA的检测灵敏度可达2μg/L。
通过上表数据，采用ELISA Calc软件进行四参数Logistic曲线拟合绘制标准曲线(图5)，所得曲线的线性方程为：
Figure BDA0002526737460000092
r2＝0.998，A＝6.55744，B＝0.82884，C＝6.16908，D＝0.20595，线性方程中x表示待测物浓度，y表示T/C值。
在荧光免疫层析分析仪的定量曲线设置界面当中，分别将A，B，C，D的值录入荧光免疫层析分析仪的标定软件，即可实现荧光定量检测试纸条在荧光免疫层析分析仪上的快速定量检测。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.6-苄基腺嘌呤半抗原的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）在化合物a中依次加入甲苯和化合物b，于100～120℃反应5h以上，去除溶剂，加入NaBH4，待不产气后升温到60～70℃反应2h以上，去除溶剂，pH值调至1～2，乙酸乙酯萃取，水相调节至pH≥8，二氯甲烷萃取，得化合物c；
（2）将化合物c pH值调至12以上，室温反应15～26h，二氯甲烷萃取，水相pH值调至4～5，过滤，即得6-苄基腺嘌呤半抗原
Figure 484173DEST_PATH_IMAGE002
其中，
化合物a的结构式为
Figure 463630DEST_PATH_IMAGE004
化合物b的结构式为
Figure 571264DEST_PATH_IMAGE006
化合物c的结构式为
Figure 91107DEST_PATH_IMAGE008
。
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