CN112047837B - 一种4-氯苯氧乙酸半抗原、人工抗原及其在免疫检测中的应用 - Google Patents

一种4-氯苯氧乙酸半抗原、人工抗原及其在免疫检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种4‑氯苯氧乙酸半抗原、人工抗原及其在免疫检测中的应用。本发明设计的4‑氯苯氧乙酸半抗原引入的手臂不仅具有活性基团，还可以完整保留待测目标物的羧基基团，使得半抗原与待测目标物的电子云密度保持一致，偶联简单。基于此构建的4‑氯苯氧乙酸人工抗原及单克隆抗体用于ELISA检测特异性强，IC50值为10.9μg/L；用于胶体金免疫层析技术时，灵敏度为20μg/L，实际样本中的检测限为70μg/kg，假阴和假阳性率均为0，且具有良好的特异性和稳定性。

Description

一种4-氯苯氧乙酸半抗原、人工抗原及其在免疫检测中的 应用
技术领域
本发明属于免疫检测领域，具体涉及一种4-氯苯氧乙酸半抗原、人工抗原及其在免疫检测中的应用。
背景技术
4-氯苯氧乙酸(4-chlorophenoxyacetate，4-CPA，也俗称防落素)是一种人工合成的细胞分裂素，通常为白色或类白色晶体，难溶于水，微溶于乙醇，在酸、碱中稳定，具有抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质的分解，保绿防老的作用；还具有将氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能，广泛用在农业、果树和园艺作物从发芽到收获的各个阶段。由于4-氯苯氧乙酸药效良好、价格低廉，被当成一种生长调节剂广泛应用于无根培植豆芽的种植中。
4-氯苯氧乙酸会在人体内残留并累积，长期食用会对人体产生蓄积危害。如使儿童发育早熟，女性生理发生改变，对人体有致癌、致畸的作用，即使有些危害不会在短时间内出现，但是长久沉积必然会给健康带来不利影响。原国家食品药品监督管理总局、农业部、国家卫生和计划生育委员会关于豆芽生产过程中禁止使用4-氯苯氧乙酸等物质的公告(2015年第11号)。因此加强对4-氯苯氧乙酸呤残留量监测对于保证食品质量安全十分重要。
目前，用于检测4-氯苯氧乙酸的方法主要有分光光度法、高效液相色谱法及其联用技术等，这些方法虽然可以精确定量，但由于设备仪器昂贵，检测时间长，且需专业人员操作，因此无法实现真正意义上的现场快速检测；另一种检测方法为免疫学检测技术，该方法具有高特异性和高选择性的特点，非常适用于复杂基质痕量组分的分离或检测，随着学科间的相互渗透，其检测方法层出不穷，应用范围亦日益扩大，与传统检测方法相比，免疫学检测技术具有经济、快速、技术要点低、操作简便等特点。但免疫分析检测技术的关键是抗原和抗体的性能决定的，而抗原和抗体的关键又是相应的半抗原，因此，要得到性能优异的抗原和抗体，半抗原的结构设计就显得尤为重要。
因此需设计出具有更高识别度的完全抗原成为亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种4-氯苯氧乙酸半抗原；
本发明的另一目的在于提供上述的半抗原的制备方法；
本发明的另一目的在于提供一种人工抗原；
本发明的另一目的在于提供一种上述人工抗原的制备方法；
本发明的另一目的在于提供一种4-氯苯氧乙酸单克隆抗体；
本发明的另一目的在于提供上述4-氯苯氧乙酸单克隆抗体在ELISA检测方法中的应用；
本发明的另一目的在于提供上述4-氯苯氧乙酸单克隆抗体在免疫层析中的应用；
本发明的另一目的在于提供一种4-氯苯氧乙酸胶体金免疫层析试剂卡。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种4-氯苯氧乙酸半抗原，该半抗原具有式I所示的结构：
Figure BDA0002624619360000021
本发明的第二个方面，提供：
上述的半抗原的制备方法，包括如下步骤：
1)化合物a和化合物b反应得到化合物c；
2)化合物c水解得到半抗原
Figure BDA0002624619360000022
其中，化合物a的结构式为
Figure BDA0002624619360000023
化合物b的结构式为
Figure BDA0002624619360000031
化合物c的结构式为
Figure BDA0002624619360000032
进一步地，上述制备方法，还包括以下步骤：
(1)化合物a和化合物b在丙酮和K2CO3条件下，加热，反应至少5h，分离并萃取得到化合物c；
(2)化合物c在强碱条件下，室温反应至少2h，经萃取、过滤，烘干后得到半抗原。
其中，步骤(1)中的加热温度为60～70℃。
步骤(1)中的萃取使用的萃取溶剂为乙酸乙酯。
步骤(1)中的强碱包括氢氧化锂。
本发明的第三个方面，提供：
一种人工抗原，该人工抗原为上述的半抗原与蛋白载体偶联得到，该人工抗原的结构式如下：
Figure BDA0002624619360000033
其中，protein为蛋白载体。
进一步地，上述蛋白载体为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种。
本发明的第四个方面，提供：
一种上述人工抗原的制备方法，包括如下步骤：
(1)将上述的半抗原在室温避光条件下与活化剂和蛋白载体反应16～24h；
(2)加入硼氢化钠，室温避光条件下搅拌1～2h；
(3)透析分离，即得人工抗原
Figure BDA0002624619360000041
本发明的第五个方面，提供：
一种4-氯苯氧乙酸单克隆抗体，该单克隆抗体使用上述的半抗原或上述人工抗原制备得到。
本发明的第六个方面，提供：
上述4-氯苯氧乙酸单克隆抗体在ELISA检测方法中的应用。
本发明的第七个方面，提供：
上述4-氯苯氧乙酸单克隆抗体在免疫层析中的应用。
本发明的第八个方面，提供：
一种4-氯苯氧乙酸胶体金免疫层析试剂卡，该胶体金免疫层析试剂卡反应膜上包被有上述的人工抗原。
本发明的有益效果是：
1.本发明设计的4-氯苯氧乙酸半抗原引入的手臂不仅具有活性基团，还完整保留了待测目标物的羧基基团，使得半抗原与待测目标物的电子云密度保持一致，偶联简单。
2.本发明中的4-氯苯氧乙酸人工抗原及单克隆抗体用于ELISA检测特异性强，IC50值为10.9μg/L。
3.本发明中的4-氯苯氧乙酸人工抗原及单克隆抗体用于胶体金免疫层析技术，可快速、便捷地实现4-氯苯氧乙酸的检测，本发明中制备的胶体金免疫层析试剂卡对4-氯苯氧乙酸检测灵敏度为20μg/L，实际样本中的检测限为70μg/kg，假阴和假阳性率均为0，且具有良好的特异性和稳定性。
附图说明
图1为本发明的4-氯苯氧乙酸半抗原的合成线路图；
图2为本发明的4-氯苯氧乙酸人工抗原的合成线路图；
图3为ELISA测试中，不同浓度的4-氯苯氧乙酸标准溶液OD值的四参数Logistic曲线拟合绘制标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
实施例1 4-氯苯氧乙酸半抗原的制备
一种4-氯苯氧乙酸半抗原，所述4-氯苯氧乙酸半抗原具有式I所示的结构式：
Figure BDA0002624619360000051
如图1所示，本发明的4-氯苯氧乙酸半抗原通过以下方法制备，步骤如下：
(1)取2.0g(12.8mmol)化合物a，依次加入20mL丙酮、3.9g(25.6mmol)化合物b和3.5g(25.6mmol)K2CO3，于70℃反应5h。反应完毕，减压去溶剂(丙酮)，加入30mL纯化水，用乙酸乙酯萃取两次，再减压去溶剂(乙酸乙酯)，柱层析纯化得2.1g化合物c(溶剂为乙酸乙酯和石油醚，乙酸乙酯和石油醚的体积比为1：5)。
(2)将2.1g(8.7mmol)的化合物c溶于10mL乙醇中，再加入0.7g(17.4mmol)LiOH溶液和10mL纯化水，室温反应2h，然后加入40mL纯化水，用二氯甲烷萃取两次，水相通过2M的稀盐酸将PH值调至4～5，过滤，烘干得到半抗原。
实施例2 4-氯苯氧乙酸人工抗原的制备
本发明的4-氯苯氧乙酸人工抗原的结构式为：
Figure BDA0002624619360000052
其中，protein为蛋白载体，其蛋白载体为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种。
该人工抗原的合成线路如图2所示。
1.载体蛋白为牛血清白蛋白的4-氯苯氧乙酸人工抗原，合成方法如下：
1)称取50mg牛血清白蛋白(BSA)，使其充分溶解在5mL pH6.0的MES缓冲液中，得到牛血清白蛋白缓冲溶液；
2)取10mg实施例1中制备的4-氯苯氧乙酸半抗原，充分溶解于0.5mL二甲基甲酰胺(DMF)中，并在搅拌下逐滴加入到步骤1)制得的牛血清白蛋白缓冲溶液中，并在室温下避光搅拌16h，得到载体蛋白溶液；
3)取60mg硼氢化钠溶解在0.5mL冰水中，并在搅拌下逐滴加入到步骤2)制得的载体蛋白溶液中，并在室温下避光搅拌1～2h；
4)用0.01mol/L的PBS室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；
5)分装，于4℃保存备用。
2.载体蛋白为血蓝蛋白的4-氯苯氧乙酸人工抗原，合成方法如下：
1)称取20mg血蓝蛋白(KLH)，使其充分溶解在2mL pH6.0的MES缓冲液中，得到血蓝蛋白缓冲溶液；
2)取4mg实施例1中制备的4-氯苯氧乙酸半抗原，充分溶解于0.2mL二甲基甲酰胺(DMF)中，并在搅拌下逐滴加入到步骤1)制得的血蓝蛋白缓冲溶液中，并在室温下避光搅拌24h，得到载体蛋白溶液；
3)取30mg硼氢化钠溶解在0.8mL冰水中，并在搅拌下逐滴加入到步骤2)制得的载体蛋白溶液中，并在室温下避光搅拌2h；
4)用0.01mol/L的PBS室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；
5)分装，于4℃保存备用。
实施例3 4-氯苯氧乙酸单克隆抗体的制备
抗4-氯苯氧乙酸单克隆抗体的制备方法如下：
以上述载体蛋白为血蓝蛋白的4-氯苯氧乙酸人工抗原为免疫原，与等体积弗氏佐剂乳化后，免疫BALB/C小鼠。每只鼠免疫剂量为100μg，免疫间隔2周，免疫4次后，采小鼠尾部静脉血检测血清效价。如抗体效价不达要求，需加强免疫，待抗体效价不再升高后，以100μg全抗原进行皮下加强免疫，5天后取小鼠脾细胞与SP20细胞(小鼠骨髓瘤细胞)融合。融合后的细胞在HAT培养基中筛选，5天后以完全培养基替换成HAT培养基进行培养。用ELISA对细胞上清进行检测，将检测结果为强阳性的孔内细胞进行有限稀释法克隆培养，经3次克隆培养检测后，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞放大培养后，接种至小鼠腹腔，产生含抗体的腹水。用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水，经冷冻干燥后即可得到高纯度、高特异性的单克隆抗体。
实施例4 4-氯苯氧乙酸单克隆抗体在ELISA中的应用与效果评价
用pH9.6的碳酸盐缓冲液作包被稀释液，将载体蛋白为牛血清白蛋白的4-氯苯氧乙酸人工抗原稀释至0.5μg/mL，按100μL/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4℃包被过夜，甩干，按300μL/孔加入含1％BSA的磷酸盐缓冲液，并在37℃封闭1h，甩干，干燥后真空包装保存。
向包被有4-氯苯氧乙酸人工抗原的微孔酶标板中加入4-氯苯氧乙酸标准溶液100μL/孔(用pH7.4的磷酸盐缓冲液进行梯度稀释)，再相应加入4-氯苯氧乙酸单克隆抗体溶液50μL/孔(用含0.05％叠氮钠，pH7.4的磷酸盐缓冲液，将单克隆抗体稀释至0.5μg/mL，现配现用)，37℃反应0.5h；甩干后，加入洗液250μL/孔，洗涤3次后拍干；再加入酶标二抗100μL/孔，37℃反应0.5h；再次洗涤3次后拍干，加入100μL/孔显色液，37℃反应15min；加入0.5M硫酸50μL/孔终止，设定酶标仪于450nm波长测定每孔的OD值。
结果如下表1所示：
表1.ELISA测试不同浓度的4-氯苯氧乙酸标准溶液的OD值
Figure BDA0002624619360000071
通过表1中数据，采用ELISA Calc软件进行四参数Logistic曲线拟合绘制标准曲线，得到的标准曲线如图3所示，4-氯苯氧乙酸的线性方程为：
Figure BDA0002624619360000072
r2＝0.999，A＝2.34255，B＝0.87048，C＝9.72155，D＝0.11207，x表示待测物浓度，y表示OD值，通过计算得到IC50值为10.9μg/L，在3～243μg/L呈线性关系。
由上述结果可知，到IC50值为10.9μg/L说明本发明中的4-氯苯氧乙酸人工抗原及单克隆抗体用于ELISA检测特异性强。
实施例5 4-氯苯氧乙酸胶体金免疫层析试剂卡的制备及性能评价
4-氯苯氧乙酸胶体金免疫层析试剂卡的制备
4-氯苯氧乙酸胶体金免疫层析试剂卡的制备方法如下：
(1)制备包被有人工抗原和羊抗鼠IgG的反应膜：
以硝酸纤维素膜(NC膜)为反应膜，将载体蛋白为牛血清白蛋白的人工抗原用包被缓冲液调节浓度至0.5～1.0mg/mL，并将羊抗鼠IgG用包被缓冲液也调节浓度至0.01～0.1mg/mL。按照0.8～1.2μL/cm的膜液量，将抗原和羊抗鼠IgG喷到反应膜对应的检测区(T线)和控制区(C线)，检测区和控制区之间间隔为2.5mm，放置37℃烘箱处理12～16h，置于恒温恒湿保藏箱里备用；包被缓冲液为含有1％蔗糖、0.02％ProClintonTM300、pH＝7.6的0.01M PBS缓冲液。
(2)制备纳米金标记的4-氯苯氧乙酸单克隆抗体的微孔：
(a)纳米金的制备：
纳米金溶液的制备：取1g氯金酸，用纯水及超声溶解后定容至100mL，4℃避光保存备用。取1mL上述溶液至100mL纯水中，加热至沸腾后再添加0.5mL 0.06％的柠檬酸钠溶液，继续加热10分钟，冷却至室温后，用纯水恢复至原体积(100mL)，避光常温放置备用。所用全部玻璃器皿需使用高锰酸钾及硫酸混合液过夜浸泡，清洗晾干后使用。
(b)4-氯苯氧乙酸单克隆抗体的标记：
纳米金标记的4-氯苯氧乙酸单克隆抗体的制备：
将5μg 4-氯苯氧乙酸单克隆抗体加入到1mL 0.01％的纳米金溶液中，室温反应5分钟，加入10μl 10％牛血清蛋白进行封闭，12,000rpm离心15分钟，弃去全部清液。
(c)微孔的制备：
加入含有2％Tris、5％牛血清蛋白、0.05％硫柳汞、5％蔗糖的金子稀释液0.5mL复溶，吸取15μL复溶液到微孔中，37℃干燥处理16小时后保存备用。
(3)样品垫的制备：
将裁剪好的30*30cm空白样品垫浸泡在样品垫处理液中，浸泡5min后，取出在37℃干燥16h，置于恒温恒湿保藏箱里备用；样品垫处理液为含有0.3％吐温20、1％蔗糖、0.5％BSA、0.05％ProClintonTM300的0.1M PB缓冲液。
(4)胶体金免疫层析试剂卡的组装：
在PVC板背衬中部叠置步骤(1)制得的反应膜，两端分别叠置步骤(3)的样品垫和吸水垫，反应膜和样品垫、吸水垫相搭连，检测区靠近样品垫，控制区靠近吸水垫，得到试纸板，将试纸板切割成3nm宽的试纸条，将试纸条装载于试纸卡内，得胶体金免疫层析试剂卡。
对本发明制备的4-氯苯氧乙酸胶体金免疫层析试剂卡作进一步检测。
4-氯苯氧乙酸胶体金免疫层析试剂卡检测限测试：
用0.01M PBS缓冲液配备一系列不同浓度的4-氯苯氧乙酸的标准溶液，然后取100μl的标准溶液加入到本发明中4-氯苯氧乙酸胶体金免疫层析试剂卡的加样孔中，加样后开始计时，8～10min即可观察结果，10min后判读无效。
肉眼判读方法：T线显色强于C线显色或与C线显色无明显差异，表示检测结果阴性(﹣)。T线显色明显弱于C线显色或T线不显色，表示检测结果阳性(+)。无效：未出现C线，表明操作不正确或试纸条已失效。检测试验设置3组重复。即可实现胶体金免疫层析试剂卡的快速定性检测。
测定结果如下：
表2不同浓度4-氯苯氧乙酸标准液的测定结果
Figure BDA0002624619360000091
通过对4-氯苯氧乙酸标准液的浓度值进行了检测，结果如表2所示，本发明制备的胶体金免疫层析试剂卡对4-氯苯氧乙酸检测具有较高灵敏度，可达20μg/L。
胶体金免疫层析试剂卡的稳定性测试
胶体金免疫层析试剂卡保存的条件为室温，为了确保试纸条的稳定性，对试纸条进行了加速破坏性实验。在37℃条件下连续放置90天，并在第0天，第7天，第14天，第30天，第45天，第60天，第75天和第91天分别检测阴性及4-氯苯氧乙酸标准溶液显色变化，实验设置3组重复，结果如表4所示：(“+”代表阳性，“－”代表阴性)
表3稳定性测试
Figure BDA0002624619360000092
Figure BDA0002624619360000101
由表3可知，在37℃下密封保存的胶体金免疫层析试剂卡90天后，试纸条的T/C显色深度判读结果均无明显变化，说明胶体金免疫层析试剂卡在加速实验37℃下最少可稳定保存90天。因此，本发明制备的4-氯苯氧乙酸胶体金免疫层析试剂卡可在室温下稳定保存一年以上，完全可以满足市场在保存和运输过程中的要求。
胶体金免疫层析试剂卡的样本检测性能测试
蔬果类样本处理：
取100g以上的样本(如豆芽、白菜、西红柿等)切小块后均匀搅碎，称取1.0g样本加入到10mL离心管中，加入2mL 0.01M PBS，震荡混匀提取1min；静置分层后取100μL上清液待测。
检测过程及结果分析：
取100μL的待测液加入本发明中4-氯苯氧乙酸胶体金免疫层析的加样孔中，加样后开始计时，8～10min即可观察结果，10min后判读无效。肉眼判读方法：T线显色强于C线显色或与C线显色无明显差异，表示样本阴性(-)。阳性(+)：T线显色明显弱于C线显色或T线不显色，表示样本阳性(+)。无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已失效。
最低检测限：用4-氯苯氧乙酸标准溶液对10份空白样本进行梯度加标检测，加标递度为0、17.5、35、70、140、280μg/kg，结果得该方法豆芽、西红柿、青瓜、苦瓜、土豆、白菜、胡萝卜、莲藕、白萝卜、娃娃菜等样本的最低检测限结果如表4所示。
表4蔬果类样本加标检测限
Figure BDA0002624619360000102
Figure BDA0002624619360000111
从上表可知，本发明制备的胶体金免疫层析试剂卡在10种样本中的检测结果重复性好，当样本中的4-氯苯氧乙酸含量低于70μg/kg时，均为阴性；高于70μg/kg时，均为阳性。故本发明制备的4-氯苯氧乙酸胶体金免疫层析试剂卡在样本中的检测限为70μg/kg。
胶体金免疫层析试剂卡的特异性检测
本发明的特异性测定以豆芽样本为检测对象。选取经验证的阴性样本，分别添加多菌灵、百菌清、噻虫嗪、6-苄基腺嘌呤和2,4,5-三氯苯氧乙酸标准品，使样本的含量为7000μg/kg，每种标准品各添加10份，按上述样本前处理方法进行前处理后，取样本处理液进行检测，结果如表5：
表5特异性检测结果
Figure BDA0002624619360000112
结果表明，分别添加浓度为7000μg/kg的上述五种药物时，检测结果均为阴性。因此，4-氯苯氧乙酸胶体金免疫层析试剂卡与多菌灵、百菌清、噻虫嗪、6-苄基腺嘌呤和2,4,5-三氯苯氧乙酸的交叉反应率均小于1％。
假阳性率的测定
本发明的假阳性率以豆芽样本为检测对象。选取经验证的豆芽阴性样本20份，按上述样本前处理方法进行前处理后，取样本处理液进行检测，结果如表6：
表6假阳性检测结果
Figure BDA0002624619360000113
Figure BDA0002624619360000121
结果表明，4-氯苯氧乙酸胶体金免疫层析试剂卡对20个豆芽阴性样本的检测结果均为阴性，阳性个数为0，假阳性率为0％。
假阴性率的测定
本发明的假阳性率以豆芽样本为检测对象。选取经验证的豆芽阳性样本50份，按上述样品前处理方法进行前处理后，取样本处理液进行检测，结果如表7：
表7假阴性检测结果
Figure BDA0002624619360000122
结果表明，4-氯苯氧乙酸胶体金免疫层析试剂卡对20个豆芽阳性样本的检测结果均为阳性，阴性个数为0，假阴性率为0％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种4-氯苯氧乙酸半抗原，其特征在于，所述半抗原具有式I所示的结构：
Figure FDA0002624619350000011
2.权利要求1所述的半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)化合物a和化合物b反应得到化合物c；
2)化合物c水解得到半抗原
Figure FDA0002624619350000012
其中，化合物a的结构式为
Figure FDA0002624619350000013
化合物b的结构式为
Figure FDA0002624619350000014
化合物c的结构式为
Figure FDA0002624619350000015
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：
(1)化合物a和化合物b在丙酮和K2CO3条件下，加热，反应至少5h，分离并萃取得到化合物c；
(2)化合物c在强碱条件下，室温反应至少2h，经萃取、过滤，烘干后得到半抗原。
4.一种人工抗原，其特征在于，所述人工抗原为权利要求1所述的半抗原与蛋白载体偶联得到，所述人工抗原的结构式如下：
Figure FDA0002624619350000021
其中，protein为蛋白载体。
5.根据权利要求4所述的人工抗原，其特征在于：蛋白载体为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种。
6.一种权利要求4或5所述人工抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述的半抗原在室温避光条件下与活化剂和蛋白载体反应16～24h；
(2)加入硼氢化钠，室温避光条件下搅拌1～2h；
(3)透析分离，即得所述人工抗原
Figure FDA0002624619350000022
7.一种4-氯苯氧乙酸单克隆抗体，其特征在于：使用权利要求1所述的半抗原或权利要求4～5任一所述的人工抗原制备得到。
8.权利要求7所述的4-氯苯氧乙酸单克隆抗体在ELISA检测方法中的应用。
9.权利要求7所述的4-氯苯氧乙酸单克隆抗体在免疫层析中的应用。
10.一种4-氯苯氧乙酸胶体金免疫层析试剂卡，其特征在于，所述胶体金免疫层析试剂卡反应膜上包被有如权利要求4或5所述的人工抗原。
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JPH10101615A (ja) * 1996-09-26 1998-04-21 Kankyo Meneki Gijutsu Kenkyusho:Kk フェノキシ酢酸類のハプテン化合物、抗体および測定方法
CN101407501B (zh) * 2008-11-21 2012-05-09 华南农业大学 5-甲基吗啉-3-氨基-2-噁唑烷酮衍生物半抗原、抗原和抗体及应用
CN101407480A (zh) * 2008-11-21 2009-04-15 华南农业大学 氨基脲衍生物半抗原、抗原和抗体的制备方法
CN203519613U (zh) * 2013-06-28 2014-04-02 武汉伊莱瑞特生物科技有限公司 半定量检测4-氯苯氧乙酸的试纸条
CN110683965B (zh) * 2019-10-18 2021-04-27 中国农业大学 硝呋地腙半抗原和人工抗原及其制备方法与应用
CN112174838A (zh) * 2020-10-13 2021-01-05 广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司 一种2,4,5-三氯苯氧乙酸半抗原、人工抗原及其在免疫检测中的应用

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