CN116730914A - 一种啶酰菌胺半抗原、人工抗原及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种啶酰菌胺半抗原、人工抗原及其应用。本发明提供的啶酰菌胺半抗原有效提高了啶酰菌胺的免疫原性，制得的啶酰菌胺人工抗原及单克隆抗体可用于ELISA和胶体金免疫层析试纸条，检测的灵敏度高，特异性强，IC50值为2.02μg/L，对啶酰菌胺在标准溶液中的检测下限为10μg/kg，可实现快速简便的啶酰菌胺定性检测，满足现场快速临检的需要。

Description

一种啶酰菌胺半抗原、人工抗原及其应用
技术领域
本发明涉及生物化工领域，具体地，涉及一种啶酰菌胺半抗原、人工抗原及其应用。
背景技术
啶酰菌胺是德国巴斯夫公司研制的一种新型烟酰胺类杀菌剂，主要用于防治白粉病、灰霉病、各种腐病、褐腐病和根腐病，2004年在英国、德国和瑞士注册。啶酰菌胺属于线粒体呼吸链中琥珀酸辅酶Q还原酶抑制剂，对孢子萌发有较强的抑制作用，与其它杀菌剂无交叉抗性，具有广谱的杀菌作用，对几乎所有的真菌病都有活性主要用于包括油菜、葡萄、果树、蔬菜和大田作物等病害的防治。
现有与啶酰菌胺相关的检测技术中主要依靠仪器检测，但存在设备昂贵、耗时久、操作复杂等问题，无法满足现场快速临检的需要。现有技术中基于啶酰菌胺的本身直接制备得到的人工抗原存在灵敏度差、交叉反应率低的缺陷，无法建立达到使用要求的啶酰菌胺免疫检测分析方法。
发明内容
为了解决现有技术中缺少快捷、高效且特异性好的啶酰菌胺免疫检测分析方法的问题，本发明提供了一种啶酰菌胺半抗原、人工抗原及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种啶酰菌胺半抗原。
本发明的第二个目的是提供结构式如式(I)所示化合物的制备方法，
本发明的第三个目的是提供结构式如式(I)所示化合物在制备啶酰菌胺抗原中的应用，
本发明的第四个目的是提供一种啶酰菌胺人工抗原。
本发明的第五个目的是提供上述啶酰菌胺人工抗原的制备方法。
本发明的第六个目的是提供结构式如式(Ⅱ)所示化合物在制备啶酰菌胺人工抗体中的应用，
其中，Protein为载体蛋白，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或血蓝蛋白。
本发明的第七个目的是提供一种啶酰菌胺人工抗原组合。
本发明的第八个目的是提供上述啶酰菌胺人工抗原组合在制备检测啶酰菌胺的试剂盒中的应用。
本发明的第九个目的是提供一种检测啶酰菌胺的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明制备的半抗原不仅完整保留了啶酰菌胺的所有与苯环和吡啶环相连的卤族原素-氯原子，且引入了具有活性基团的直链手臂，半抗原与待测目标物的电子云密度几乎一致，使得制备的人工抗原上的小分子结构更突出，更有利于呈现啶酰菌胺的结构特征，提高了抗原的免疫原性。
一种啶酰菌胺半抗原，其结构式如式(I)所示，
结构式如式(I)所示化合物的制备方法，将化合物a、化合物b、N,N-二甲基甲酰胺、K2CO3和正四丁基碘化胺充分反应，之后依次经过己烷和乙酸乙酯萃取得到化合物c；化合物c在碱性条件下充分水解，将所得水解产物的pH调节至酸性，之后依次经过二氯甲烷和乙酸乙酯萃取，即得；
所述化合物a的结构式为：化合物a的CAS号为：661463-87-2；
所述化合物b的结构式为：化合物b的CAS号为：2969-81-5；
所述化合物c的结构式为：
优选地，化合物a、化合物b和K2CO3的摩尔比为1：(1.5～2.5)：(1～3)。
更优选地，化合物a、化合物b、和K2CO3的摩尔比为1：2：2。
所述正四丁基碘化胺为催化剂。优选地，所述正四丁基碘化胺的用量为反应体系总质量的5％～15％。
更优选地，所述正四丁基碘化胺的用量为反应体系总质量的10％。
具体地，所述制备方法包括以下步骤：
将0.20g化合物a(0.56mmol，CAS：661463-87-2)、3mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和0.22g化合物b(1.12mmol，4-溴丁酸乙酯，CAS：2969-81-5)依次加入50mL圆底烧瓶中，充分搅拌溶解，再依次加入0.15g(1.12mmol)K2CO3和0.02g正四丁基碘化胺，反应混合物在室温下反应24～30h；之后加入20mL纯化水，用正己烷萃取两次，除去未反应完的化合物b，收集水相再用乙酸乙酯萃取两次，收集乙酸乙酯萃取液，并用无水硫酸钠干燥后再减压去溶剂，得到化合物c粗品；
将0.25g化合物c(0.53mmol)与3mL甲醇充分搅拌溶解，与3mL 6mol/L的氢氧化锂水溶液在室温下反应15～20h，之后加入20mL氯化钠水溶液，并用20mL二氯甲烷萃取两次，收集水相，用4M的盐酸将pH值调至4～5，再用乙酸乙酯萃取两次，减压除溶剂，即得到0.12g啶酰菌胺半抗原。
结构式如式(I)所示化合物在制备啶酰菌胺人工抗原中的应用也应在本发明的保护范围之内，
一种啶酰菌胺人工抗原，由上述啶酰菌胺半抗原偶联载体蛋白得到，其结构式如式(Ⅱ)所示，
其中，Protein为载体蛋白，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或血蓝蛋白。
上述啶酰菌胺人工抗原的制备方法，将上述啶酰菌胺半抗原通过活泼酯法偶联载体蛋白，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或血蓝蛋白。
优选地，所述活泼酯法包括以下步骤：
将上述酰菌胺半抗原、二甲基甲酰胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺充分反应，得到溶液1；载体蛋白溶于磷酸盐缓冲液得到溶液2；溶液1与溶液2充分反应后，经过透析，即得。
具体的，所述的制备方法如下：
将10mg上述啶酰菌胺半抗原与0.1mL二甲基甲酰胺充分混合溶解后，再与10mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和10mg N-羟基琥珀酰亚胺在室温下搅拌反应4h得到溶液1；将35mg BSA溶解于3.5mL浓度为0.01mol/L PBS溶液中，即得到溶液2；将溶液1逐滴缓慢滴加至溶液2中，边搅拌边，在室温下搅拌反应16～24h；所得反应溶液经过0.01mol/L的PBS透析，室温透析3天，每天换3次透析液，即得。
结构式如式(Ⅱ)所示化合物在制备啶酰菌胺抗体中的应用也应在本发明的保护范围之内，
其中，Protein为载体蛋白，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或血蓝蛋白。
一种啶酰菌胺抗体，由载体蛋白为血蓝蛋白的上述啶酰菌胺人工抗原作为免疫原免疫动物制备得到。
优选地，所述啶酰菌胺抗体为单克隆抗体，由载体蛋白为血蓝蛋白的上述啶酰菌胺人工抗原作为免疫原免疫动物得到杂交瘤细胞，培养所得杂交瘤细胞并收集细胞进行动物免疫获得腹水，经过鉴定纯化，即得。
一种啶酰菌胺人工抗原组合，包括免疫原和包被原，所述免疫原由上述啶酰菌胺半抗原偶联血蓝蛋白得到；所述包被原由上述啶酰菌胺半抗原偶联牛血清白蛋白得到。
上述啶酰菌胺人工抗原组合在制备检测啶酰菌胺的试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。
一种检测啶酰菌胺的免疫层析试纸条，所述免疫层析试纸条包括底板，所述底板上设置有依次搭接的样品垫、反应膜和吸水垫，所述反应膜为设有检测区和质控区的硝酸纤维素膜；所述的检测区包被有上述包被原，所述质控区包被有IgG抗体。所述检测区为T线，所述质控区为C线。
优选地，所述免疫层析试纸条的样品垫经过含有0.3％wt吐温20、1％wt蔗糖、0.5％wt BSA和0.05％wt叠氮化钠的0.1M PB缓冲液充分浸泡。
具体的，所述免疫层析试纸条的制备方法如下：
以载体蛋白为牛血清白蛋白的上述啶酰菌胺人工抗原作为检测抗原，用包被缓冲液(含有1％蔗糖和0.05％叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液，pH＝7.6)调节检测抗原的浓度至0.1～0.5mg/mL；以鼠IGg作为质控抗原，用包被缓冲液(含有1％wt蔗糖和0.05％wt叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液，pH＝7.6)调节质控抗原的浓度至0.1～0.5mg/mL；以硝酸纤维素膜为反应膜，按照0.8～1.2μL/cm将稀释后的检测抗原喷到反应膜上的T线，将稀释后的质控抗原喷到反应膜上的C线，T线和C线相距2.5mm，于45℃烘箱干燥12～16h，即得到包被抗原的反应膜；
将样品垫浸泡在含有0.3％wt吐温20、1％wt蔗糖、0.5％wt BSA和0.05％wt叠氮化钠的0.1M PB缓冲液中，浸泡5min后取出，在37℃干燥16h；
将包被抗原的反应膜置于在PVC板的中部，将吸水垫和干燥后的样品垫分别粘贴在反应膜的两端，吸水垫位于设有C线的一端，样品垫位于设有T线的一端，之后切割成宽度为3mm的试纸条；将试纸条装载于试纸卡内，样品垫邻近加样孔，即得。
一种检测啶酰菌胺的试剂盒，包含免疫层析试纸条和检测啶酰菌胺的抗体；所述免疫层析试纸条包括底板，所述底板上设置有依次搭接的样品垫、反应膜和吸水垫，所述反应膜为设有检测区和质控区的硝酸纤维素膜；所述的检测区包被有由上述啶酰菌胺半抗原偶联血蓝蛋白得到的包被原，质控区包被有IgG。
优选地，所述免疫层析试纸条的样品垫经过含有0.3％wt吐温20、1％wt蔗糖、0.5％wt BSA和0.05％wt叠氮化钠的0.1M PB缓冲液充分浸泡。
具体的，所述免疫层析试纸条的制备方法如下：
以载体蛋白为牛血清白蛋白的上述啶酰菌胺人工抗原作为检测抗原，用包被缓冲液(含有1％蔗糖和0.05％叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液，pH＝7.6)调节检测抗原的浓度至0.1～0.5mg/mL；以鼠IGg作为质控抗原，用包被缓冲液(含有1％wt蔗糖和0.05％wt叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液，pH＝7.6)调节质控抗原的浓度至0.1～0.5mg/mL；以硝酸纤维素膜为反应膜，按照0.8～1.2μL/cm将稀释后的检测抗原喷到反应膜上的T线，将稀释后的质控抗原喷到反应膜上的C线，T线和C线相距2.5mm，于45℃烘箱干燥12～16h，即得到包被抗原的反应膜；
将样品垫浸泡在含有0.3％wt吐温20、1％wt蔗糖、0.5％wt BSA和0.05％wt叠氮化钠的0.1M PB缓冲液中，浸泡5min后取出，在37℃干燥16h；
以PVC板作为底板，将包被抗原的反应膜置于在PVC板的中部，将吸水垫和干燥后的样品垫分别粘贴在反应膜的两端，吸水垫位于设有C线的一端，样品垫位于设有T线的一端，之后切割成宽度为3mm的试纸条；将试纸条装载于试纸卡内，样品垫邻近加样孔，即得。
优选地，所述检测啶酰菌胺的抗体为胶体金标记的抗体。
更优选地，所述抗体为单克隆抗体，由载体蛋白为血蓝蛋白的上述啶酰菌胺人工抗原作为免疫原免疫动物得到杂交瘤细胞，培养所得杂交瘤细胞并收集细胞进行动物免疫获得腹水，经过鉴定纯化，即得。
进一步优选地，所述胶体金标记的抗体由上述单克隆抗体与胶体金溶液按照质量体积比(5～15μg)：1mL充分反应得到；所述胶体金溶液由柠檬酸钠还原法制得。
更进一步优选地，所述胶体金标记的抗体由上述单克隆抗体与胶体金溶液按照质量体积比12μg：1mL充分反应得到。
具体的，所述胶体金标记的抗体的制备方法如下：
将1g氯金酸充分溶解于纯水中，定容至100mL，即得到氯金酸溶液；取1m氯金酸溶液与100mL纯水混合均匀，加热至沸腾后加入0.5mL 0.06％wt柠檬酸钠溶液，继续加热10min，冷却至室温后，加纯水补足至100mL，即得到胶体金溶液；
取1mL胶体金溶液，加入适量0.1mol/L的K2CO3溶液(加入的量为后续标记过程不变色时的最少用量)，将12μg所述单克隆抗体加入胶体金溶液中，室温反应5分钟，再加入10μL10％wt牛血清蛋白进行封闭，充分混匀后，12,000rpm离心10min，弃去全部清液，即得。
一种以非疾病治疗与诊断为目的检测啶酰菌胺的方法，使用任一上述试剂盒检测待测样品。
优选地，使用检测啶酰菌胺的胶体金定性免疫层析试剂盒检测待测样品，包括以下步骤：
将待测样品与所述胶体金标记的抗体充分反应后，所得反应物于免疫层析试纸条的样品垫上充分反应，根据免疫层析试纸条的显色情况判定结果，具体判定方法如下：
C线不显色则判定检测结果为无效，需重新检测；C线显色且T线显色强于C线显色或与C线显色无明显差异则判定检测结果为阴性(-)，待测样品中没有啶酰菌胺；C线显色且T线不显色或T线显色明显弱于C线显色则判定检测结果为阳性(+)，待测样品中有啶酰菌胺。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的啶酰菌胺半抗原有效提高了啶酰菌胺的免疫原性，制得的啶酰菌胺人工抗原及单克隆抗体可用于ELISA和胶体金免疫层析试纸条，检测的灵敏度高，特异性强，IC50值为2.02μg/L，对啶酰菌胺在标准溶液中的检测下限为10μg/kg，可实现快速简便的啶酰菌胺定性检测，满足现场快速临检的需要。
附图说明
图1为啶酰菌胺半抗原的合成路线。
图2为啶酰菌胺半抗原的质谱结果。
图3为啶酰菌胺人工抗原的合成路线。
图4为啶酰菌胺人工抗原的紫外扫图鉴定结果。
图5为啶酰菌胺标准品溶液的标准曲线。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1啶酰菌胺半抗原的合成与鉴定
1、啶酰菌胺半抗原的合成
本发明啶酰菌胺半抗原的合成路线如图1所示，具体步骤如下：
(1)将0.20g化合物a(0.56mmol，CAS：661463-87-2)、3mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和0.22g化合物b(1.12mmol，4-溴丁酸乙酯，CAS：2969-81-5)依次加入50mL圆底烧瓶中，充分搅拌溶解，再依次加入0.15g(1.12mmol)K2CO3和0.02g正四丁基碘化胺，反应混合物在室温下反应24-30h；之后加入20mL纯化水，用己烷萃取两次，除去未反应完的化合物b，收集水相再用乙酸乙酯萃取两次，收集乙酸乙酯萃取液，并用无水硫酸钠干燥后再减压去溶剂，得到化合物c粗品。
(2)将0.25g化合物c(0.53mmol)与3mL甲醇充分搅拌溶解，与3mL 6mol/L的氢氧化锂水溶液在室温下反应15-20h，之后加入20mL氯化钠水溶液，并用20mL二氯甲烷萃取两次，收集水相，用4M的盐酸将pH值调至4～5，再用乙酸乙酯萃取两次，减压除溶剂，即得到0.12g啶酰菌胺半抗原。
啶酰菌胺半抗原的结构式如式(Ⅰ)所示：
啶酰菌胺半抗原的质谱结果如图2所示，具体为：ESI-MS：443[M-1]。
实施例2啶酰菌胺人工抗原的合成与鉴定
1、啶酰菌胺人工抗原的合成
本发明啶酰菌胺人工抗原的结构式如式(Ⅱ)所示，
其中Protein为载体蛋白，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)或血蓝蛋白(KLH)。
啶酰菌胺人工抗原的合成路线如图3所示，具体步骤如下：
(1)载体蛋白为牛血清白蛋白的啶酰菌胺人工抗原
将10mg实施例1制得的啶酰菌胺半抗原与0.1mL DMF充分混合溶解后，再与10mg1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和10mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在室温下搅拌反应4h得到溶液1。将35mg BSA溶解于3.5mL浓度为0.01mol/L PBS溶液中，即得到溶液2。将溶液1逐滴缓慢滴加至溶液2中，边搅拌边，在室温下搅拌反应16～24h。
所得反应溶液经过0.01mol/L的PBS透析，室温透析3天，每天换3次透析液，所得透析物即为载体蛋白为牛血清白蛋白的啶酰菌胺人工抗原。
(2)载体蛋白为血蓝蛋白的啶酰菌胺人工抗原
与“载体蛋白为牛血清白蛋白的啶酰菌胺人工抗原”的制备方法基本相同，区别仅在于用40mg KLH代替BSA溶解于4mL浓度为0.01mol/L PBS溶液。
2、啶酰菌胺人工抗原的鉴定
取上述BSA、KLH、啶酰菌胺半抗原、载体蛋白为牛血清白蛋白的啶酰菌胺人工抗原和载体蛋白为血蓝蛋白的啶酰菌胺人工抗原，分别用紫外全波长法进行鉴定。
如图4所示，啶酰菌胺半抗原(半抗原)、牛血清蛋白(BSA)、血蓝蛋白(KLH)、啶酰菌胺半抗原-牛血清蛋白(半抗原-BSA)及啶酰菌胺半抗原-血蓝蛋白(半抗原-KLH)的紫外扫描图结果显示，牛血清蛋白(BSA)和血蓝蛋白(KLH)在250nm至290nm之间有典型吸收，啶酰菌胺半抗原、啶酰菌胺半抗原-牛血清蛋白及啶酰菌胺半抗原-血蓝蛋白偶联物的吸收在250nm至290nm处有明显的偏移，这说明该人工抗原偶联物与其前体物质有不同的紫外吸收特征，表明啶酰菌胺半抗原分别与载体蛋白BSA和KLH偶联成功。
实施例3啶酰菌胺单克隆抗体的制备
1、动物免疫
以BALB/C小鼠作为免疫目标，将实施例2制得的载体蛋白为血蓝蛋白的啶酰菌胺人工抗原与等体积弗氏佐剂乳化后，以50μg/只～100μg/只的剂量免疫小鼠，每次免疫间隔2周，第3次免疫后采小鼠尾部静脉血检测血清效价，待抗体效价不不再上升，以无佐剂的100μg实施例2制得的载体蛋白为血蓝蛋白的啶酰菌胺人工抗原进行加强免疫。
2、杂交瘤细胞制备
在最后一次加强免疫的5天后，处死小鼠分离脾细胞，将其与人骨肉瘤细胞SP20细胞进行融合，培养于完全培养基中，培养5天后将完全培养基替换成HAT培养基进行培养，筛选融合细胞，用ELISA对细胞上清进行检测，选出检测结果为强阳性的孔内细胞进行有限稀释法克隆培养。经过3次克隆培养后，检测结果均呈阳性的孔内细胞即为分泌啶酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞。
3、单克隆抗体制备
将杂交瘤细胞放大培养后接种至小鼠腹腔，用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化小鼠含抗体的腹水，即得到啶酰菌胺单克隆抗体。
实施例4ELISA检测啶酰菌胺方法的建立及效果评价
本发明提供一种检测啶酰菌胺的ELISA方法，包括以下步骤：
1、酶标板包被：用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释实施例2制得的载体蛋白为牛血清白蛋白的啶酰菌胺人工抗原，使其浓度为0.05μg/mL，按照100μL/孔加入酶标板，4℃包被16～24h，甩干，用PBST洗涤3次，甩干；将封闭液(含1％wt BSA的磷酸盐缓冲液)按照250μL/孔加入酶标板，37℃封闭1h，甩干，用PBST洗涤3次，甩干，干燥后真空包装保存。
2、一抗稀释：用含0.05％wt叠氮钠的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释实施例3制得的啶酰菌胺单克隆抗体，使其浓度为0.06μg/mL。
3、啶酰菌胺标准溶液的制备：用0.01M PBS溶解啶酰菌胺标准品，得到浓度为0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L和40.5μg/L的啶酰菌胺标准品溶液。
4、加样：向包被有啶酰菌胺人工抗原的微孔酶标板中按照100μL/孔加入不同浓度的啶酰菌胺标准溶液。
5、孵一抗：按照20μL/孔加入稀释后的啶酰菌胺单克隆抗体，37℃孵育0.5h，甩干；按照250μL/孔加入PBST，洗涤3次，拍干。
6、孵二抗：按照100μL/孔加入羊抗鼠IgG酶标二抗，37℃孵育0.5h；按照250μL/孔加入PBST，洗涤3次，拍干。
7、显色：按照100μL/孔加入TMB显色液，37℃显色15min；按照50μL/孔加入1M硫酸，终止显色。
8、吸光值测定：设置酶标仪测定微孔酶标板各孔在450nm波长下的OD值。
9、检测结果
表1所示为ELISA检测各浓度的啶酰菌胺标准品溶液的测定结果。
表1ELISA测试不同浓度的啶酰菌胺标准品溶液的OD值
采用ELISA Calc软件对表1所示的数据进行四参数Logistic曲线拟合，绘制得到如图5所示的标准曲线，线性方程为：y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D，r2＝0.9994，A＝2.37548，B＝0.97397，C＝1.74611，D＝0.15997，x表示待测物浓度，y表示OD值。通过计算得到IC50值为2.02μg/L，在0.5μg/L～40.5μg/L呈线性关系。
实施例5一种检测啶酰菌胺的胶体金定性免疫层析试剂盒及效果评价
一、胶体金定性免疫层析试剂盒的组成
所述免疫层试纸卡的制备方法如下：
1、包被抗原的反应膜的制备
以实施例2制得的载体蛋白为牛血清白蛋白的啶酰菌胺人工抗原作为检测抗原，用包被缓冲液(含有1％wt蔗糖和0.05％wt叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液，pH＝7.6)调节检测抗原的浓度至0.1～0.5mg/mL；以羊抗鼠IgG作为质控抗原，用包被缓冲液(含有1％wt蔗糖和0.05％wt叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液，pH＝7.6)调节质控抗原的浓度至0.1～0.5mg/mL。以硝酸纤维素膜(NC膜)为反应膜，按照0.8～1.2μL/cm将稀释后的检测抗原喷到反应膜上的T线，将稀释后的质控抗原喷到反应膜上的C线，T线和C线相距2.5mm，于45℃烘箱干燥12～16h，取出后置于恒温恒湿保藏箱里备用。
2、样品垫的处理
将样品垫(30cm×30cm)浸泡在样品本处理液(含有0.3％wt吐温20、1％wt蔗糖、0.5％wt BSA和0.05％wt叠氮化钠的0.1M PB缓冲液)中，浸泡5min后取出，在37℃干燥16h，置于恒温恒湿保藏箱里备用。
3、金子垫的制备
所述金子垫的制备方法如下：
(1)胶体金溶液的制备
将1g氯金酸充分溶解于纯水中，定容至100mL，即得到氯金酸溶液，4℃避光保存备用。取1m氯金酸溶液与100mL纯水混合均匀，加热至沸腾后加入0.5mL0.06％wt柠檬酸钠溶液，继续加热10min，冷却至室温后，加纯水补足至100mL，即得到胶体金溶液，避光室温放置备用。
(2)啶酰菌胺单克隆抗体的标记
取1mL胶体金溶液，加入适量0.1mol/L的K2CO3溶液(加入的量为后续标记过程不变色时的最少用量)，将5μg所述单克隆抗体加入胶体金溶液中，室温反应5分钟，再加入10μL10％wt牛血清蛋白进行封闭，充分混匀后，于12,000rpm离心10min，弃去全部清液，所得沉淀即为胶体金标记的啶酰菌胺单克隆抗体。
(3)金子垫的制备
用1mL金子稀释液(含2％wt Tris、5％wt牛血清蛋白、0.05％wt硫柳汞、5％wt蔗糖的水溶液)复胶体金标记的啶酰菌胺单克隆抗体，均匀涂抹在面积为5cm×5cm的玻璃纤维上，37℃干燥16小时，即得到金子垫，保存备用。
4、试剂卡的组装
以PVC板作为底板，在PVC板背衬中部叠置步骤1制得的反应膜，两端分别叠置步骤3的金子垫和吸水垫，反应膜和金子垫、吸水垫相搭连，金子垫与步骤2样品垫相搭连，检测区靠近样品垫，控制区靠近吸水垫，得到试纸板，将试纸板切割成宽度3nm试纸条，将试纸条装载于试纸卡内，得胶体金定性免疫层析试纸卡。
二、胶体金定性免疫层析试剂盒的使用方法
(1)检测
取100μL标品配制液加至金子垫，反复吹打使溶液复溶均匀，静置3min，将金标微孔中的溶液转移至免疫层试纸析卡的加样孔中，加样后开始计时，静置5～8min观察结果，超过8min判读无效。检测试验设置3组重复。
(2)结果判读
判读方法具体如下：
C线不显色则判定检测结果为无效，需重新检测；C线显色且T线显色强于C线显色或与C线显色无明显差异则判定检测结果为阴性(-)，待测样品中没有啶酰菌胺；C线显色且T线不显色或T线显色明显弱于C线显色则判定检测结果为阳性(+)，待测样品中有啶酰菌胺。
二、胶体金定性免疫层析试剂盒的效果评价
1、灵敏度
用0.01M PBS缓冲液将啶酰菌胺标准品稀释至浓度为0μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L和40μg/L，使用本实施例的胶体金定性免疫层析试剂盒进行检测。
表2灵敏度测定结果
如表2所示，本发明制备的胶体金定性免疫层析试剂盒对啶酰菌胺的检测具有高灵敏度，检测下限可达10μg/L。
2、稳定性
本实施例胶体金定性免疫层析试纸卡的保存条件为室温，为了确定试纸条的稳定性，对试纸条进行加速破坏性实验，在45℃条件下连续放置60天，并在第0天、第5天、第10天、第20天、第30天、第40天、第50天和第60天，分别用0.01MPBS缓冲液将啶酰菌胺标准品稀释至浓度为0μg/L、5μg/L、10μg/L和20μg/L，使用本实施例的胶体金定性免疫层析试剂盒进行检测，实验设置3组重复。
表3稳定性测定结果
如表3所示，在45℃下密封保存的胶体金定性免疫层析试纸卡，存放60天后，试纸卡的T线和C线的显色深度判读结果均无明显变化，说明胶体金定性免疫层析试纸卡在加速实验45℃下最少可稳定保存60天。
在本领域的常规认知中，45℃下加速37.5天相当于室温存放一年，因此从以上加速破坏性实验的结果中可以得知，本发明制备的啶酰菌胺胶体金定性免疫层析试纸卡可在室温下稳定保存一年以上，完全可以满足市场在保存和运输过程中的要求。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种啶酰菌胺半抗原，其特征在于，其结构式如式(I)所示，
2.结构式如式(I)所示化合物的制备方法，其特征在于，将化合物a、化合物b、N,N-二甲基甲酰胺、K2CO3和正四丁基碘化胺充分反应，之后依次经过己烷和乙酸乙酯萃取得到化合物c；化合物c在碱性条件下充分水解，将所得水解产物的pH调节至酸性，之后依次经过二氯甲烷和乙酸乙酯萃取，即得；
所述化合物a的结构式为：
所述化合物b的结构式为：
所述化合物c的结构式为：
3.结构式如式(I)所示化合物在制备啶酰菌胺人工抗原中的应用，
4.一种啶酰菌胺人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述啶酰菌胺半抗原偶联载体蛋白得到，其结构式如式(Ⅱ)所示，
其中，Protein为载体蛋白，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或血蓝蛋白。
5.权利要求4所述啶酰菌胺人工抗原的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述啶酰菌胺半抗原通过活泼酯法偶联载体蛋白，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或血蓝蛋白。
6.结构式如式(Ⅱ)所示化合物在制备啶酰菌胺抗体中的应用，
其中，Protein为载体蛋白，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或血蓝蛋白。
7.一种啶酰菌胺人工抗原组合，其特征在于，包括免疫原和包被原，所述免疫原由权利要求1所述啶酰菌胺半抗原偶联血蓝蛋白得到；所述包被原由权利要求1所述啶酰菌胺半抗原偶联牛血清白蛋白得到。
8.权利要求7所述啶酰菌胺人工抗原组合在制备检测啶酰菌胺的试剂盒中的应用。
9.一种检测啶酰菌胺的试剂盒，其特征在于，包含免疫层析试纸条和检测啶酰菌胺的抗体；所述免疫层析试纸条包括底板，所述底板上设置有依次搭接的样品垫、反应膜和吸水垫，所述反应膜为设有检测区和质控区的硝酸纤维素膜；所述的检测区包被有权利要求7中所述包被原，质控区包被有IgG；所述检测啶酰菌胺的抗体由权利要求7中所述免疫原免疫动物制备得到。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述检测啶酰菌胺的抗体为胶体金标记的抗体。
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