CN116768808A - 一种三唑酮半抗原、人工抗原及其应用 - Google Patents

一种三唑酮半抗原、人工抗原及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种三唑酮半抗原、人工抗原及其应用。本发明提供的三唑酮半抗原不仅完整保留了三唑酮的所有基团，且设计的偶联手臂直接与两个共轭双键连接，使得制备的三唑酮人工抗原上的小分子结构更突出，更有利于呈现三唑酮的结构特征，提高了抗原的免疫原性。本发明提供的三唑酮人工抗原及单克隆抗体用于ELISA检测特异性强，IC50值为4.62μg/L。以本发明提供的三唑酮人工抗原及单克隆抗体建立的胶体金免疫层析技术，灵敏度高，对三唑酮标准品的检测下限可达10μg/kg，在果蔬样品中的的检测下限可达50μg/kg，可快速、便捷地实现三唑酮的定性检测。

Description

一种三唑酮半抗原、人工抗原及其应用
技术领域
本发明涉及生物化工领域，具体地，涉及一种三唑酮半抗原、人工抗原及其应用。
背景技术
三唑酮是一种高效、低毒、低残留、持效期长、内吸性强的三唑类杀菌剂，被植物的各部分吸收后，能在植物体内传导，对锈病和白粉病具有预防、铲除、治疗等作用，对多种作物的病害如玉米圆斑病、麦类云纹病、小麦叶枯病、凤梨黑腐病、玉米丝黑穗病等均有效。由于三唑酮具有良好的杀菌效果，被广泛用于各类蔬果中。《GB 2763——2016食品中农药最大残留限量》中规定了三唑酮在各类食品中的最大残留限量标准(MRL)，其在麦类(小麦除外)、旱粮类(玉米除外)中的最大残留限量标准(MRL)均为0.2mg/kg，在茄果类蔬菜中的最大残留限量标准(MRL)为1mg/kg，以及在柑橘、苹果、香蕉中的最大残留限量标准(MRL)均为1mg/kg。
现有技术中，检测三唑酮的方法主要以仪器法和免疫分析检测技术为主。但是，仪器法由于设备昂贵，检测时间长，且需专业人员操作，无法真正意义上的实现现场检测和快速临检，给日常检测工作带来了极大的不便。而且，现有的免疫分析检测技术中，基于三唑酮的本身直接制备得到的人工抗原存在灵敏度差、交叉反应率低的缺陷，无法满足现有市场的实际使用需求。因此，亟需开发高特异性的三唑酮半抗原或人工抗原，建立快速、高灵敏度、简便且低成本的检测三唑酮方法。
发明内容
为了解决现有技术中缺少快速、高灵敏度、简便且低成本的三唑酮免疫检测方法的问题，本发明提供了一种三唑酮半抗原、人工抗原及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种三唑酮半抗原。
本发明的第二个目的是提供结构式如式(I)所示的化合物的制备方法，
本发明的第三个目的是提供结构式如式(I)所示的化合物在制备三唑酮抗原中的应用，
本发明的第四个目的是提供一种三唑酮人工抗原。
本发明的第五个目的是提供上述三唑酮人工抗原的制备方法。
本发明的第六个目的是提供结构式如式(Ⅱ)所示的化合物在制备三唑酮人工抗体中的应用，
其中，Protein为载体蛋白，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或血蓝蛋白。
本发明的第七个目的是提供一种三唑酮人工抗原组合。
本发明的第八个目的是提供上述三唑酮人工抗原组合在制备检测三唑酮的试剂盒中的应用。
本发明的第九个目的是提供一种检测三唑酮的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
免疫分析检测技术的检测效果关键由抗原和抗体的性能决定，而抗原和抗体的关键又是半抗原，因此，要得到性能优异的抗原和抗体，半抗原的结构设计就显得尤为重要。本发明制备的半抗原不仅完整保留了三唑酮的所有基团，且设计的偶联手臂直接与两个共轭双键连接，使得制备的人工抗原上的小分子结构更突出，更有利于呈现三唑酮的结构特征，提高了抗原的免疫原性。
一种三唑酮半抗原，其结构式如式(I)所示，
结构式如式(I)所示化合物的制备方法，1,2,4-三氮唑-3-羧酸甲酯、氯代醚酮、N,N-二甲基甲酰胺、K2CO3和正四丁基碘化胺充分反应，之后经过乙酸乙酯萃取得到中间产物；中间产物在碱性条件下充分水解，所得水解产物经过二氯甲烷萃取后，将pH调节至酸性，即得；
所述1,2,4-三氮唑-3-羧酸甲酯的结构式为：
所述氯代醚酮的结构式为：
所述中间产物的结构式为：
优选地，所述1,2,4-三氮唑-3-羧酸甲酯、氯代醚酮和K2CO3的摩尔比为1：1.5～2.5：1.5～2.5。
更优选地，所述1,2,4-三氮唑-3-羧酸甲酯、氯代醚酮和K2CO3的摩尔比为1：2：2。
所述正四丁基碘化胺为催化剂。优选地，所述正四丁基碘化胺的用量为反应体系总质量的6％～8％。
更优选地，所述正四丁基碘化胺的用量为反应体系总质量的7％。
具体地，所述制备方法包括以下步骤：
取2.0g 1,2,4-三氮唑-3-羧酸甲酯，(15.74mmol，CAS：4928-88-5)于100mL圆底烧瓶中，再依次加入20mL N,N-二甲基甲酰胺和8.22g氯代醚酮(31.47mmol，CAS：57000-78-9)，搅拌溶解后，再依次加入4.35g K2CO3(31.47mmol)和0.20g正四丁基碘化胺，所得反应混合物在室温下反应48h～56h；反应完毕，向反应产物中加入100mL纯化水，用乙酸乙酯萃取两次，再减压去溶剂，得到中间产物粗品；将中间产物粗品溶解于5mL甲醇中，再加入20mL6mol/L的氢氧化锂水溶液中，所得反应混合物在室温下反应15-20h，加入100mL饱和氯化钠水溶液，并用30mL二氯甲烷萃取两次，收集水相，用4M的盐酸调节pH值至4～5，固体析出，过滤、烘干，即得到0.94g三唑酮半抗原。
结构式如式(I)所示的化合物在制备三唑酮人工抗原中的应用也应在本发明的保护范围之内，
一种三唑酮人工抗原，由上述三唑酮半抗原偶联载体蛋白得到，其结构式如式(Ⅱ)所示，
其中，Protein为载体蛋白，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或血蓝蛋白。
上述三唑酮人工抗原的制备方法，将上述三唑酮半抗原通过活泼酯法偶联载体蛋白，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或血蓝蛋白。
优选地，所述活泼酯法包括以下步骤：
将上述三唑酮半抗原、二甲基甲酰胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺充分反应，得到溶液A；载体蛋白溶于磷酸盐缓冲液得到溶液B；溶液A与溶液B充分反应后，经过透析，即得。
具体的，所述载体蛋白为牛血清白蛋白的三唑酮人工抗原的制备方法如下：
取10mg上述三唑酮半抗原，溶解于0.2mL二甲基甲酰胺中，搅拌充分后，加入5mg1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和5mg N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌4h，即得到半抗原活化酯1；取45mg牛血清白蛋白，使其充分溶解于4.5mL浓度为0.01mol/L PBS溶液中，即得到载体蛋白溶液1；边搅拌边将上一步所得半抗原活化酯1逐滴缓慢滴加至载体蛋白溶液1中，并在室温下搅拌16h～24h；用0.01mol/L的PBS透析上一步所得反应溶液，室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，即得。
具体的，所述载体蛋白为血蓝蛋白的三唑酮人工抗原的制备方法如下：
取10mg上述三唑酮半抗原，溶解于0.2mL二甲基甲酰胺中，搅拌充分后，加入10mg1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和10mg N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌4h，即得到半抗原活化酯2；取45mg血蓝蛋白，使其充分溶解于4.5mL浓度为0.01mol/L PBS溶液中，即得到载体蛋白溶液2；边搅拌边将上一步所得半抗原活化酯2逐滴缓慢滴加至载体蛋白溶液2中，并在室温下搅拌16h～24h；用0.01mol/L的PBS透析上一步所得反应溶液，室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，即得。
结构式如式(Ⅱ)所示的化合物在制备三唑酮抗体中的应用也应在本发明的保护范围之内
其中，Protein为载体蛋白，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或血蓝蛋白。
一种三唑酮抗体，由载体蛋白为血蓝蛋白的上述三唑酮人工抗原作为免疫原免疫动物制备得到。
优选地，所述三唑酮抗体为单克隆抗体，由载体蛋白为血蓝蛋白的上述三唑酮人工抗原作为免疫原免疫动物得到杂交瘤细胞，培养所得杂交瘤细胞并收集细胞进行动物免疫获得腹水，经过鉴定纯化，即得。
一种三唑酮人工抗原组合，包括免疫原和包被原，所述免疫原由上述三唑酮半抗原偶联血蓝蛋白得到；所述包被原由上述三唑酮半抗原偶联牛血清蛋白得到。
上述三唑酮人工抗原组合在制备检测三唑酮的试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。
一种检测三唑酮的免疫层析试纸条，包括底板，所述底板上设置有依次搭接的样品垫、反应膜和吸水垫，所述反应膜为设有检测区和质控区的硝酸纤维素膜；所述的检测区包被有由上述三唑酮半抗原偶联血蓝蛋白得到的包被原，质控区包被有IgG。所述检测区为T线，所述质控区为C线。
优选地，所述样品垫经过样品本处理液浸泡，所述样品处理液为含有0.3％wt吐温20、1％wt蔗糖、0.5％wt BSA和0.05％wt叠氮化钠的0.1M PB缓冲液。
具体的，所述免疫层析试纸条的制备方法如下：
以载体蛋白为牛血清白蛋白的三唑酮人工抗原作为抗原，用包被缓冲液(含有1％wt蔗糖和0.05％wt叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液，pH＝7.6)调节浓度至0.05mg/mL～0.2mg/mL；并将鼠IgG用包被缓冲液也调节浓度至0.1mg/mL～0.5mg/mL；以硝酸纤维素膜为反应膜，按照0.8μL/cm～1.2μL/cm的膜液量，将稀释后的抗原喷到反应膜上的T线，将稀释后的鼠IgG喷到反应膜上的C线，T线和C线之间间隔为2.5mm，放置于45℃烘箱处理12h～16h，即得到包被抗原的反应膜；
将裁剪好的30cm×30cm空白样品垫浸泡在样品本处理液(含有0.3％wt吐温20、1％wt蔗糖、0.5％wt BSA和0.05％wt叠氮化钠的0.1M PB缓冲液)中，浸泡5min后取出，在37℃干燥16h，即得到样品垫；
以PVC板作为底板，将上述包被抗原的反应膜粘贴在PVC板的中部，将吸水垫和上述样品垫分别粘贴在反应膜的两端，吸水垫邻近C线，样品垫邻近T线，即得到试纸板；将试纸板切割成宽度为3mm的试纸条，将试纸条装载于试纸卡内，样品垫邻近加样孔，即得。
一种检测三唑酮的试剂盒，包含免疫层析试纸条和检测三唑酮的抗体；所述免疫层析试纸条包括底板，所述底板上设置有依次搭接的样品垫、反应膜和吸水垫，所述反应膜为设有检测区和质控区的硝酸纤维素膜；所述的检测区包被有由上述三唑酮半抗原偶联血蓝蛋白得到的包被原，质控区包被有IgG。
优选地，所述免疫层析试纸条的样品垫经过样品本处理液浸泡，所述样品处理液为含有0.3％wt吐温20、1％wt蔗糖、0.5％wt BSA和0.05％wt叠氮化钠的0.1M PB缓冲液。
具体的，所述免疫层析试纸条的制备方法如下：
以载体蛋白为牛血清白蛋白的三唑酮人工抗原作为抗原，用包被缓冲液(含有1％wt蔗糖和0.05％wt叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液，pH＝7.6)调节浓度至0.05mg/mL～0.2mg/mL；并将鼠IgG用包被缓冲液也调节浓度至0.1mg/mL～0.5mg/mL；以硝酸纤维素膜为反应膜，按照0.8μL/cm～1.2μL/cm的膜液量，将稀释后的抗原喷到反应膜上的T线，将稀释后的鼠IgG喷到反应膜上的C线，T线和C线之间间隔为2.5mm，放置于45℃烘箱处理12h～16h，即得到包被抗原的反应膜；
将裁剪好的30cm×30cm空白样品垫浸泡在样品本处理液(含有0.3％wt吐温20、1％wt蔗糖、0.5％wt BSA和0.05％wt叠氮化钠的0.1M PB缓冲液)中，浸泡5min后取出，在37℃干燥16h，即得到样品垫；
将上述包被抗原的反应膜粘贴在PVC板的中部，将吸水垫和上述样品垫分别粘贴在反应膜的两端，吸水垫邻近C线，样品垫邻近T线，即得到试纸板；将试纸板切割成宽度为3mm的试纸条，将试纸条装载于试纸卡内，样品垫邻近加样孔，即得。
优选地，所述检测三唑酮的抗体为胶体金标记的抗体。
更优选地，所述抗体为单克隆抗体，由载体蛋白为血蓝蛋白的上述三唑酮人工抗原作为免疫原免疫动物得到杂交瘤细胞，培养所得杂交瘤细胞并收集细胞进行动物免疫获得腹水，经过鉴定纯化，即得。
进一步优选地，所述胶体金标记的抗体由上述单克隆抗体与胶体金按照质量体积比(3～10μg)：1mL充分反应得到。
更进一步优选地，所述胶体金标记的抗体由上述单克隆抗体与胶体金按照质量体积比5μg：1mL充分反应得到。
具体的，所述胶体金标记的抗体的制备方法如下：
取1g氯金酸，用纯水及超声溶解后定容至100mL，即得到氯金酸溶液，4℃避光保存备用。取1m氯金酸溶液至100mL纯水中，加热至沸腾，加入0.5mL0.06％wt柠檬酸钠溶液，继续加热10min，冷却至室温后，加纯水补足至体积至100mL，即得到胶体金溶液；
取1mL胶体金溶液，加入适量0.1mol/L的K2CO3溶液(加入的量为后续标记过程不变色时的最少用量)，将5μg所述单克隆抗体加入胶体金溶液中，室温反应5分钟，再加入10μL10％wt牛血清蛋白进行封闭，充分混匀后，12,000rpm离心10min，弃去全部清液，即得。
一种以非疾病治疗与诊断为目的检测三唑酮的方法，使用任一上述试剂盒检测待测样品。
优选地，所述方法包括以下步骤：
将待测样品与所述胶体金抗体充分反应后，再与所述免疫层析试纸条的样品垫充分接触后，根据免疫层析试纸条的显色情况判定结果，具体判定方法如下：
C线不显色，检测结果为无效；C线显色，且T线显色强于C线显色或与C线显色无明显差异，检测结果为阴性(-)，待测样品中没有三唑酮；C线显色，且T线显色明显弱于C线显色或T线不显色，检测结果为阳性(+)，待测样品中有三唑酮。
优选地，待测样品经过破碎、提取和固液分离得到待测液。
更优选地，所述破碎的方法包括剪碎成1cm见方的碎片。
更优选地，所述提取的方法包括用将破碎的样品与2.5倍体积的稀释液充分震荡混匀。
更优选地，所述固液分离的方法包括静置。
进一步优选地，所述固液分离的方法还包括过滤或离心。
更进一步优选地，所述离心为4000转离心3min。
更进一步优选地，所述过滤为滤纸过滤。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的三唑酮半抗原不仅完整保留了三唑酮的所有基团，且设计的偶联手臂直接与两个共轭双键连接，使得制备的三唑酮人工抗原上的小分子结构更突出，更有利于呈现三唑酮的结构特征，提高了抗原的免疫原性。本发明提供的三唑酮人工抗原及单克隆抗体用于ELISA检测特异性强，IC50值为4.62μg/L。以本发明提供的三唑酮人工抗原及单克隆抗体建立的胶体金免疫层析技术，灵敏度高，对三唑酮标准品的检测下限可达10μg/kg，在果蔬样品中的的检测下限可达50μg/kg，可快速、便捷地实现三唑酮的定性检测。
附图说明
图1为三唑酮半抗原的合成路线。
图2为三唑酮半抗原的质谱结果。
图3为三唑酮人工抗原的合成路线。
图4为三唑酮人工抗原的紫外扫图鉴定结果。
图5为三唑酮标准品溶液的标准曲线。
图6为胶体金定性免疫层析试剂盒的检测结果判读示意图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1三唑酮半抗原的合成与鉴定
1、三唑酮半抗原的合成
本发明三唑酮半抗原的合成路线如图1所示，具体步骤如下：
(1)取2.0g化合物b(即1,2,4-三氮唑-3-羧酸甲酯，CAS：4928-88-5，15.74mmol)于100mL圆底烧瓶中，再依次加入20mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和8.22g化合物a(即氯代醚酮，CAS：57000-78-9，31.47mmol)，搅拌溶解后，再依次加入4.35g K2CO3(31.47mmol)和0.20g正四丁基碘化胺，所得反应混合物在室温下反应48～56h。反应完毕，向反应产物中加入100mL纯化水，用乙酸乙酯萃取两次，再减压去溶剂，得到中间产物，即化合物c粗品。
(2)将化合物c粗品溶解于5mL甲醇中，再加入20mL 6mol/L的氢氧化锂水溶液中，所得反应混合物在室温下反应15～20h，加入100mL饱和氯化钠水溶液，并用30mL二氯甲烷萃取两次，收集水相，用4M的盐酸调节pH值至4～5，固体析出，过滤、烘干，即得到0.94g三唑酮半抗原。
三唑酮半抗原的结构式如式(Ⅰ)所示：
三唑酮半抗原的质谱结果如图2所示，具体为：ESI-MS：336[M-1]。
实施例2三唑酮人工抗原的合成与鉴定
1、三唑酮人工抗原的合成
本发明三唑酮人工抗原的结构式如式(Ⅱ)所示，
其中Protein为载体蛋白，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)或血蓝蛋白(KLH)。
三唑酮人工抗原的合成路线如图3所示，具体步骤如下：
(1)载体蛋白为牛血清白蛋白的三唑酮人工抗原
取10mg实施例1中制备的三唑酮半抗原，溶解于0.2mL二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌充分后，加入5mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和5mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌4h，即得到半抗原活化酯1。
取45mg BSA，使其充分溶解于4.5mL浓度为0.01mol/L PBS溶液中，即得到载体蛋白溶液1；边搅拌边将上一步所得半抗原活化酯1逐滴缓慢滴加至载体蛋白溶液1中，并在室温下搅拌16h～24h。
用0.01mol/L的PBS透析上一步所得反应溶液，室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，所得透析物即为载体蛋白为牛血清白蛋白的三唑酮人工抗原，分装后于4℃保存备用。
(2)载体蛋白为血蓝蛋白的三唑酮人工抗原
取10mg实施例1中制备的三唑酮半抗原，溶解于0.2mL二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌充分后，加入10mg EDC和10mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌4h，即得到半抗原活化酯2。
取45mg KLH，使其充分溶解于4.5mL浓度为0.01mol/L PBS溶液中，即得到载体蛋白溶液2；边搅拌边将上一步所得半抗原活化酯2逐滴缓慢滴加至载体蛋白溶液2中，并在室温下搅拌16h～24h。
用0.01mol/L的PBS透析上一步所得反应溶液，室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，所得透析物即为载体蛋白为血蓝蛋白的三唑酮人工抗原，分装后于4℃保存备用。
2、三唑酮人工抗原的鉴定
取上述BSA、KLH、三唑酮半抗原、载体蛋白为牛血清白蛋白的三唑酮人工抗原和载体蛋白为血蓝蛋白的三唑酮人工抗原，分别用紫外全波长法进行鉴定。
如图4所示，三唑酮半抗原(半抗原)、牛血清蛋白(BSA)、血蓝蛋白(KLH)、三唑酮半抗原-牛血清蛋白(半抗原-BSA)及三唑酮半抗原-血蓝蛋白(半抗原-KLH)的紫外扫图鉴定结果显示，牛血清蛋白(BSA)和血蓝蛋白(KLH)在250nm至290nm之间有典型吸收，三唑酮半抗原、三唑酮半抗原-牛血清蛋白及三唑酮半抗原-血蓝蛋白偶联物的吸收在250nm至290nm处有明显的偏移，这说明该人工抗原偶联物与其前体物质有不同的紫外吸收特征，表明半抗原与载体蛋白偶联成功。
实施例3三唑酮单克隆抗体的制备
1、动物免疫
以实施例2制备的载体蛋白为血蓝蛋白的三唑酮人工抗原作为免疫原，与等体积弗氏佐剂乳化后，免疫BALB/C小鼠，每只鼠的免疫剂量为50μg～100μg。免疫间隔2周，免疫3次后，采小鼠尾部静脉血检测血清效价。如抗体效价不达要求，需加强免疫。
待抗体效价不再升高后，以100μg全抗原进行皮下加强免疫。
2、杂交瘤细胞制备
最后一次加强免疫的5天后，取小鼠脾细胞与人骨肉瘤细胞SP20细胞进行融合。融合后的细胞在HAT培养基中筛选，5天后以完全培养基替换成HAT培养基进行培养。
用ELISA对细胞上清进行检测，将检测结果为强阳性的孔内细胞进行有限稀释法克隆培养。经3次克隆培养检测后，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。
3、单克隆抗体制备
将杂交瘤细胞放大培养后，接种至小鼠腹腔，产生含抗体的腹水。用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水，即可得到高纯度且高特异性的三唑酮单克隆抗体。
实施例4ELISA性能评价
1、实验方法
对本发明制备的人工抗原和单克隆抗体采用ELISA方法进行性能评价，包括以下步骤：
(1)抗原包被
以pH9.6的碳酸盐缓冲液作为包被稀释液，将实施例2制得的载体蛋白为牛血清白蛋白的三唑酮人工抗原稀释至0.2μg/mL，按100μL/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4℃包被过夜，甩干，用PBST洗涤三次。
(2)封闭
按280μL/孔加入含1％wt BSA的磷酸盐缓冲液中，37℃封闭1h，甩干，用PBST洗涤三次，干燥后真空包装保存。
(3)一抗稀释
用含0.05％wt叠氮钠的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，将实施例3制得的三唑酮单克隆抗体稀释至0.04μg/mL，4℃保存备用。
(4)标准溶液制备
将三唑酮标准品溶解于0.01M PBS中，即得到浓度为0μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L和81μg/L的三唑酮标准品溶液。
(5)加样及一抗孵育
向包被有三唑酮人工抗原的酶标板微孔中加入三唑酮标准溶液100μL/孔，再相应加入三唑酮单克隆抗体溶液20μL/孔，37℃反应0.5h，甩干。
(6)洗一抗
加入PBST 280μL/孔，洗涤3次后拍干。
(7)二抗孵育
加入HRP酶标记的羊抗鼠IgG酶标二抗100μL/孔，37℃反应0.5h。
(8)洗二抗
加入PBST 280μL/孔，再次洗涤3次后拍干。
(9)显色
分别加入50μL/孔的显色液A和显色液B，37℃反应15min；加入2M硫酸50μL/孔，终止显色。
(10)吸光值测定
将上一步所得微孔酶标板放入酶标仪中，设定酶标仪于450nm波长测定每孔的OD值。
2、实验结果
表1ELISA测试不同浓度的三唑酮标准品溶液的OD值
不同浓度的三唑酮标准品溶液的OD值测定结果如表1所示。通过表1所示的数据，采用ELISA Calc软件进行四参数Logistic曲线拟合，绘制得到如图5所示的标准曲线，其线性方程如下：
y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D，r2＝0.9998；其中A＝1.85574，B＝0.81651，C＝4.02831，
D＝0.09949，x表示待测物浓度，y表示OD值。
通过计算得到IC50值为4.62μg/L，在1μg/L～81μg/L呈线性关系。
实施例5一种检测三唑酮的胶体金定性免疫层析试剂盒及效果评价
一、胶体金定性免疫层析试剂盒的组成
1、免疫层析试纸卡
所述免疫层试纸卡的制备方法如下：
(1)包被有人工抗原和羊抗鼠IgG的反应膜的制备
以实施例2制得的载体蛋白为牛血清白蛋白的三唑酮人工抗原作为抗原，用包被缓冲液(含有1％wt蔗糖和0.05％wt叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液，pH＝7.6)调节浓度至0.05mg/mL～0.2mg/mL；并将鼠IgG用包被缓冲液也调节浓度至0.1mg/mL～0.5mg/mL。以硝酸纤维素膜(NC膜)为反应膜，按照0.8μL/cm～1.2μL/cm的膜液量，将稀释后的抗原喷到反应膜上的检测区(T线)，将稀释后的鼠IgG喷到反应膜上的控制区(C线)，检测区和控制区之间间隔为2.5mm，放置于45℃烘箱处理12h～16h，置于恒温恒湿保藏箱里备用。
(2)样品垫的制备
将裁剪好的30cm×30cm空白样品垫浸泡在样品本处理液(含有0.3％wt吐温20、1％wt蔗糖、0.5％wt BSA和0.05％wt叠氮化钠的0.1M PB缓冲液)中，浸泡5min后取出，在37℃干燥16h，置于恒温恒湿保藏箱里备用。
(3)组装
以PVC板作为底板，将步骤1制得的反应膜粘贴在PVC板的中部，将吸水垫和步骤2制得的样品垫分别粘贴在反应膜的两端，吸水垫邻近控制区(C线)，样品垫邻近检测区(T线)，即得到试纸板。将试纸板切割成宽度为3mm的试纸条。将试纸条装载于试纸卡内，样品垫邻近加样孔，即得到胶体金定性免疫层析试纸卡。
2、金标微孔
所述金标微孔的制备方法如下：
(1)胶体金溶液的制备
取1g氯金酸，用纯水及超声溶解后定容至100mL，即得到氯金酸溶液，4℃避光保存备用。取1m氯金酸溶液至100mL纯水中，加热至沸腾，加入0.5mL0.06％wt柠檬酸钠溶液，继续加热10min，冷却至室温后，加纯水补足至体积至100mL，即得到胶体金溶液，避光常温放置备用。所用全部玻璃器皿需使用高锰酸钾及硫酸混合液过夜浸泡，清洗晾干后使用。
(2)三唑酮单克隆抗体的标记
取1mL胶体金溶液，加入适量0.1mol/L的K2CO3溶液(加入的量为后续标记过程不变色时的最少用量)，将5μg所述单克隆抗体加入胶体金溶液中，室温反应5分钟，再加入10μL10％wt牛血清蛋白进行封闭，充分混匀后，于12,000rpm离心10min，弃去全部清液，所得沉淀即为胶体金标记的三唑酮单克隆抗体。
(3)金标微孔的烘干
用1mL金子稀释液(含2％wtTris、5％wt牛血清蛋白、0.05％wt硫柳汞、5％wt蔗糖的水溶液)复溶上一步所得胶体金标记的三唑酮单克隆抗体，以10μL/孔分装于微孔中，37℃干燥处理16小时，即得到金标微孔，保存备用。
二、胶体金定性免疫层析试剂盒的使用方法
(1)样品处理
取2g果蔬样品(块茎类取4g横截面样品或表皮样品)，剪成1cm左右见方的碎片，放入50mL离心管中，加入5mL 0.01M PB，剧烈震荡混匀2min，静置2min，收集上清液，即得到样品液。若加入稀释液出现混浊或杂质太多，可滤纸过滤或者4000转离心3min后再收集上清液。检测前用离心管将样品液与稀释液进行不同比例稀释，得待测液。
(2)检测
取100μL待测液加入金标微孔，反复吹打使溶液复溶均匀，静置3min，将金标微孔中的溶液转移至免疫层试纸析卡的加样孔中，加样后开始计时，静置5min～8min观察结果，超过8min判读无效。检测试验设置3组重复。
(3)结果判读
如图6所示，判读方法具体如下：
当C线不显色时，表明检测结果为无效，操作过程不正确或试纸条已失效；当C线显色，且T线显色强于C线显色或与C线显色无明显差异时，检测结果为阴性(-)，表明待测样品中没有三唑酮；当C线显色，且T线显色明显弱于C线显色或T线不显色时，检测结果为阳性(+)，表明待测样品中有三唑酮。
三、胶体金定性免疫层析试剂盒的性能评价
1、灵敏度
用0.01M PBS缓冲液将三唑酮标准品稀释至浓度为0μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L和40μg/L，使用本实施例的胶体金定性免疫层析试剂盒进行检测。
表2灵敏度测定结果
如表2所示，本发明制备的胶体金定性免疫层析试剂盒对三唑酮的检测具有高灵敏度，检测下限可达10μg/L。
2、稳定性
本实施例胶体金定性免疫层析试纸卡的保存条件为室温，为了确定试纸条的稳定性，对试纸条进行加速破坏性实验，在45℃条件下连续放置60天，并在第0天、第5天、第10天、第20天、第30天、第40天、第50天和第60天，分别用0.01MPBS缓冲液将三唑酮标准品稀释至浓度为0μg/L、5μg/L、10μg/L和20μg/L，使用本实施例的胶体金定性免疫层析试剂盒进行检测，实验设置3组重复。
表3稳定性测定结果
如表3所示，在45℃下密封保存的胶体金定性免疫层析试纸卡，存放60天后，试纸卡的T线和C线的显色深度判读结果均无明显变化，说明胶体金定性免疫层析试纸卡在加速实验45℃下最少可稳定保存60天。45℃下加速37.5天相当于室温存放一年，因此，本发明制备的三唑酮胶体金定性免疫层析试纸卡可在室温下稳定保存一年以上，完全可以满足市场在保存和运输过程中的要求。
3、果蔬样品加标检测限
以结球甘蓝、豌豆、大白菜、油麦菜、菜心、豇豆、苹果、梨、橙子和荔枝作为待测样品，按照本实施例中的“样品处理”方法，得到各待测样品的样品液。用三唑酮标准品对各待测样品的样品液进行梯度加标检测，加标递度为0μg/kg、25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg和200μg/kg，使用本实施例的胶体金定性免疫层析试剂盒进行检测。
表4果蔬样品加标检测限测定结果
如表4所示，本发明制备的胶体金定性免疫层析试剂盒在10种样本中的检测结果重复性好，当样本中的三唑酮含量低于50μg/kg时，均为阴性；高于50μg/kg时，均为阳性。故本发明制备的三唑酮胶体金免疫层析试剂卡在果蔬样本中的检测限为50μg/kg。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种三唑酮半抗原，其特征在于，其结构式如式(I)所示，
2.结构式如式(I)所示的化合物的制备方法，其特征在于，1,2,4-三氮唑-3-羧酸甲酯、氯代醚酮、N,N-二甲基甲酰胺、K2CO3和正四丁基碘化胺充分反应，之后经过乙酸乙酯萃取得到中间产物；中间产物在碱性条件下充分水解，所得水解产物经过二氯甲烷萃取后，将pH调节至酸性，即得；
所述中间产物的结构式为：
3.结构式如式(I)所示的化合物在制备三唑酮人工抗原中的应用，
4.一种三唑酮人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述三唑酮半抗原偶联载体蛋白得到，其结构式如式(Ⅱ)所示，
其中，Protein为载体蛋白，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或血蓝蛋白。
5.权利要求4所述三唑酮人工抗原的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述三唑酮半抗原通过活泼酯法偶联载体蛋白。
6.结构式如式(Ⅱ)所示的化合物在制备三唑酮抗体中的应用，
其中，Protein为载体蛋白，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或血蓝蛋白。
7.一种三唑酮人工抗原组合，其特征在于，包括免疫原和包被原，所述免疫原由权利要求1所述三唑酮半抗原偶联血蓝蛋白得到；由权利要求1所述三唑酮半抗原偶联牛血清蛋白得到。
8.权利要求7所述三唑酮人工抗原组合在制备检测三唑酮的试剂盒中的应用。
9.一种检测三唑酮的试剂盒，其特征在于，包含免疫层析试纸条和检测三唑酮的抗体；所述免疫层析试纸条包括底板，所述底板上设置有依次搭接的样品垫、反应膜和吸水垫，所述反应膜为设有检测区和质控区的硝酸纤维素膜；所述的检测区包被有权利要求7中所述包被原，质控区包被有IgG；所述检测三唑酮的抗体由权利要求7中所述免疫原免疫动物制备得到。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述检测三唑酮的抗体为胶体金标记的抗体。
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