CN116082185B

CN116082185B - 虫酰肼类半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备与应用

Info

Publication number: CN116082185B
Application number: CN202310357263.7A
Authority: CN
Inventors: 吴民富; 李莎; 詹清敏; 林立栋; 吴民华; 贺劲锋; 高柔敏; 林颖泓; 周彩琴; 张少敏; 刘考钰; 周欢欣; 刘艳灿; 饶芳芳; 方育芳; 卢玉萍; 林木健; 吴晖琳
Original assignee: Foshan Polytechnic
Current assignee: Foshan Polytechnic
Priority date: 2023-04-06
Filing date: 2023-04-06
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2043-04-06
Also published as: CN116082185A

Abstract

本发明公开了虫酰肼类半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备与应用，涉及虫酰肼类半抗原、抗原、抗体、胶体金层析检测装置及其制备和检测食品中虫酰肼类药物残留的应用。本发明提供了一种虫酰肼类半抗原，是针对虫酰肼以及其衍生物所具有的共性结构来设计和合成的通用半抗原，应用该半抗原制备得到了用于检测虫酰肼及其衍生物的人工抗原和抗体，该抗体对虫酰肼及其衍生物具有高灵敏度和宽谱识别能力，半抑制浓度为11.2ng/mL，定量检测线性范围（IC₂₀～IC₈₀）为0.75～95.11 ng/mL，最低检测限为0.28 ng/mL。

Description

虫酰肼类半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备与应用

技术领域

本发明涉及食品安全检测技术领域，更具体地，本发明涉及虫酰肼类半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备与应用。

背景技术

虫酰肼类农药均含有苯甲酰基酰肼结构，是非甾族新型昆虫激素类杀虫剂，主要用于防治蔬菜（甘蓝类、瓜类、茄果类等）、玉米、高梁、水稻、大豆、棉花、水果、甜菜、茶叶、花卉等作物上的缨翅目、鳞翅目、蚜科、叶蝉科、叶螨科、斑潜蝇属、根疣线虫属、鳞翅目幼虫等害虫。目前，此类农药在玉米、大豆、蔬菜以及林木病虫害防治方面得到了推广，但存在一定的危害。为确保食品安全，世界各国政府对食品中虫酰肼的残留限量都做出了明确规定。例如，欧盟规定玉米中虫酰肼的残留限量为 0.05 mg/kg。

目前，国内有SN/T 1770-2006《进出口食品中抑虫肼残留量测定方法-液相色谱法》，基质为大米，其方法检出限为0.025 mg/kg；SN/T 1738-2006《进出口粮谷和油籽中虫酰肼残留量的检验方法气相色谱串联质谱法》，基质为糙米、玉米、大豆和花生仁，其方法要检出限为0.1 mg/kg，部分不能满足国外检验限量要求（玉米、大豆：0.05 mg/kg）；JAP-055 日本有氟定脲、除虫脲、虫酰肼、氟苯脲、氟虫脲、氟铃脲和氟丙氧脲检测方法，采用丙酮提取，经液液分配转移至正己烷和乙腈中，然后用硅胶或胺基柱净化，利用液相色谱和液相色谱-质谱进行谷类、豆类、种子类、水果、蔬菜和茶中这几种农药残留量的测定，虫酰肼检测限为0.05 mg/kg（茶：0.1 mg/kg）。戴琳等采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定蔬菜中虫酰肼和甲氧虫酰肼残留，样品经碱性乙腈提取固相萃取净化，反相高效液相色谱柱分离后进行质谱分析，虫酰肼定量限为4μg/kg。

目前使用仪器检测虫酰肼类农药残留，样品前处理比较复杂、耗时多，操作不太方便，不能满足现场快速检测需求。为符合我国进出口贸易商品检验把关的需要，研究和建立具有操作方便、分析速度快、灵敏度高、选择性强、定性准确、可高通量检测特点的对食品中虫酰肼类农药残留的快速检测方法就显得极为紧迫和必要。

发明内容

本发明的目的在于提供了虫酰肼类半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和检测方法，针对检测食品中残留的虫酰肼类。

根据本发明的一个方面，提供了虫酰肼类半抗原，其结构如式（Ⅰ）所示：

（Ⅰ）。

根据本发明的另一个方面，提供了制备虫酰肼类半抗原的方法，包括以下步骤：

1）将3-羟基苯甲醛和4-溴丁酸甲酯反应制得中间体1；

2）将所述中间体1氧化反应得到中间体2；

3）将中间体2与叔丁基肼盐酸盐在HBTU缩合剂作用下发生缩合反应，制得中间体3；

4）将中间体3与3，5-二甲基苯甲酰氯在碱性条件下发生缩合反应，制得中间体4；

5）将中间体4在氢氧化锂水溶液作用下进行水解，经提纯得到虫酰肼半抗原。

在一些实施方式中，步骤1）包括将3-羟基苯甲醛和4-溴丁酸甲酯溶解DMF中，再加入碱，60-90℃的条件下反应数小时，过滤除去不溶物，滤液减压旋蒸，除去溶剂，纯化后得到中间体1。

在一些实施方式中，步骤2）包括将中间体1用乙腈溶解后，室温下加入NaClO₂作为氧化剂，将中间体1的醛基氧化成羧基，提纯后得到中间体2。

根据本发明的再一个方面，虫酰肼类抗原为虫酰肼类半抗原与载体蛋白的偶联物，载体蛋白为乳铁蛋白或鸡卵清白蛋白中的一种。

根据本发明的第四个方面，虫酰肼类抗体是由虫酰肼类抗原经动物免疫制备得到，虫酰肼类抗体为抗虫酰肼类单克隆抗体。

根据本发明的第五个方面，提供了虫酰肼类半抗原、虫酰肼类抗原在虫酰肼类农药的免疫学检测中的应用。

在一些实施方式中，虫酰肼类农药包括虫酰肼、甲氧虫酰肼、氯虫酰肼、环虫酰肼、呋喃虫酰肼。

根据本发明的第六个方面，提供了由虫酰肼类抗原或虫酰肼类抗体制备的虫酰肼类农药酶联免疫检测试剂盒。

根据本发明的第七个方面，提供了一种食品中虫酰肼类农药残留的快速检测方法，方法为使用虫酰肼类农药酶联免疫检测试剂盒对食品中的虫酰肼类农药残留进行检测，食品包括动物源性食品和植物源性食品。

本发明的有益效果：本发明提供了一种虫酰肼类半抗原，是针对虫酰肼以及其衍生物所具有的共性结构来设计和合成的通用半抗原，应用该半抗原制备得到了用于检测虫酰肼及其衍生物的人工抗原和抗体，该抗体对虫酰肼及其衍生物具有高灵敏度和宽谱识别能力，半抑制浓度为11.2ng/mL，定量检测线性范围（IC₂₀～IC₈₀）为0.75～95.11 ng/mL，最低检测限为0.28 ng/mL。同时本发明还建立了特异性和灵敏度更高的针对虫酰肼及其衍生物的免疫分析检测方法及试剂盒，具有操作方便、分析速度快、灵敏度高、选择性强、定性准确、可高通量检测等特点，可用于检测动物源性和植物性食品中虫酰肼及其衍生物的残留量，对于解决国外贸易技术壁垒、推动食品安全又快又好的发展具有一定的参考意义。

附图说明

图1为本发明的一种实施方案的虫酰肼类半抗原的质谱图。

图2为本发明的一种实施方案的基于虫酰肼类单克隆抗体建立的间接竞争ELISA标准曲线图。

图3为本发明的一种实施方案的虫酰肼类半抗原的合成路线图。

具体实施方式

通过具体的实施案例对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场可购买的原料、试剂。

实施例1 本实施例中3-羟基苯甲醛选择国药集团化学试剂有限公司供应的色谱级3-羟基苯甲醛，4-溴丁酸甲酯选择国药集团化学试剂有限公司供应的色谱级4-溴丁酸甲酯，碳酸钾选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯无水碳酸钾，乙酸乙酯选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯乙酸乙酯，无水硫酸钠选择国药集团化学试剂有限公司供应的99%无水硫酸钠，磷酸二氢钠选择国药集团化学试剂有限公司供应的99%无水磷酸二氢钠，亚氯酸钠选择国药集团化学试剂有限公司供应的80%亚氯酸钠，2-甲基-2-丁烯选择国药集团化学试剂有限公司供应的色谱级2-甲基-2-丁烯，二氯甲烷选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯二氯甲烷，叔丁基肼盐酸盐选择国药集团化学试剂有限公司供应的98%叔丁基肼盐酸盐，3，5-二甲基苯甲酰氯选择国药集团化学试剂有限公司供应的97%3，5-二甲基苯甲酰氯。

实施例2 虫酰肼类半抗原的制备方法，包括以下步骤：

1）将2.4g 3-羟基苯甲醛和4.0g 4-溴丁酸甲酯溶解于25mL DMF中，再加入5.0g碳酸钾，60-90℃的条件下反应5h，加大量水稀释后，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥后，减压旋蒸，过柱纯化，得到3.5g中间体1；

2）将980 mg中间体1加入30mL t-BuOH/H₂O溶液，t-BuOH/H₂O溶液中t-BuOH与水的质量比为5:1，然后加入800mg NaH₂PO₄，700mg NaClO₂和4.5 mL 2-甲基-2-丁烯，待混合物搅拌2h后，蒸干溶剂再用30mL CH₂Cl₂萃取。有机层蒸干后，用中低压制备色谱仪提纯，流动相为正己烷/乙酸乙酯=1:10，得到白色的固体760mg，即为中间体2；

3）向100mL干净单口瓶中依次加入500mg中间体2，314mg叔丁基肼盐酸盐、956mgHBTU和20mL二氯甲烷，室温搅拌至溶清，加入733mg DIEA，继续室温搅拌，TLC监控反应至物料点消失。向反应液中加入20mL饱和碳酸氢钠溶液，搅拌分液，取有机层，水层用20mL二氯甲烷萃取，合并有机层，干燥，过滤，滤液柱层析，得白色固体475mg。即为中间体3；

4）向50mL干净单口瓶中依次加入470mg中间体3和10mL甲苯，降温至0℃左右搅拌，向反应瓶中滴加3，5-二甲基苯甲酰氯-甲苯溶液（将260mg 3，5-二甲基苯甲酰氯溶于3mL甲苯中），同时滴加氢氧化钠溶液（62mg氢氧化钠溶于10mL水中），使其同时滴完。滴毕后转至室温搅拌，TLC监控物料中间体3反应完全。向反应液中加入40mL乙酸乙酯和40mL纯化水，搅拌分液，取有机层，水层再用40mL乙酸乙酯萃取，合并有机层，干燥，过滤，滤液过柱层析，分出目标液，蒸干，得白色固体620mg，即为中间体4；

5）向50mL干净单口瓶中依次加入300mg中间体4和3mL甲醇，室温搅拌。加入氢氧化锂水溶液（45mg氢氧化锂溶于7mL水中），室温搅拌，继续室温搅拌至TLC监控物料中间体4反应完全。将反应液减压50℃蒸馏除去部分甲醇溶剂，剩余溶液用6mol/L盐酸溶液调节pH至5-6，加入30mL纯化水，室温搅拌，溶液成白色乳浊，过滤，滤饼用20mL纯化水洗涤，抽干，室温晾干，得白色固体270mg，即虫酰肼类半抗原。

采用质谱法鉴定虫酰肼类半抗原，所得到的质谱图见图1。从质谱图可以看出，虫酰肼类半抗原的分子离子峰为m/z 425.1[M-H]-，且为最高峰，与该虫酰肼半抗原的分子量426.22相符，表明成功合成了式（Ⅰ）所示的虫酰肼类半抗原。

实施例3 虫酰肼类免疫用抗原、包被用抗原的制备

利用实施例2制备的虫酰肼半抗原来制备虫酰肼类免疫用抗原，具体如下：取虫酰肼类半抗原0.1 mmol溶于2mL 二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌，加入27.5 mg二环己基碳二亚胺（DCC）和14.4 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后保留上清液，并将其标记为A液。称取牛乳铁蛋白（LF）、卵清蛋白（OVA）140 mg，将其分别溶于10mL浓度为0.1 mol/L的pH=8.0的PBS缓冲液中，再加入1mL DMF，搅拌溶解，由此制备获得B液、C液。在磁力搅拌下，将A液分别逐渐滴入B液或C液中，并于4℃反应12小时。离心后，取上清液，并于4℃用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液，由此可以获得与牛血清白蛋白偶联的虫酰肼类免疫用抗原（TEB-H-LF）、与血蓝蛋白偶联的虫酰肼类包被用抗原（TEB-H-OVA）。将所得的虫酰肼类免疫用抗原、虫酰肼类包被用抗原分别以1 mg/mL的浓度分装于0.5 mL离心管中，并冻存于-20℃冰箱中。

实施例4 虫酰肼类单克隆抗体，其制备方法包括如下步骤：

利用实施例3制备的虫酰肼类免疫用抗原（TEB-H-LF）来制备虫酰肼类单克隆抗体，具体如下：使用经鉴定的虫酰肼类免疫用抗原（TEB-H-LF）免疫10只8周龄昆明小鼠，加强免疫三次后，采血测效价。待血清效价不再上升，用两倍剂量的抗原不加佐剂免疫小鼠，三天后脱颈致死小鼠，在无菌条件下取脾脏制备脾细胞，与生长旺盛的小鼠骨髓瘤细胞按8:1的比例混合于50mL离心管，加入30mL无血清IPMI 1640培养基，1100 r/min离心5min弃上清，将细胞团轻轻振松，置于37℃水浴中。将1mL 50% PEG-4000缓缓加入细胞中，在1min内滴完，同时轻轻搅动底部沉淀，静置1min后，前30s沿管壁缓慢匀速加入无血清培养基1mL，后30s加入2mL，然后快速加入27 mL终止融合过程，1100 r/min离心5min，弃上清，用HAT选择性培养基重悬后，加到已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，并于37℃、体积分数5%的CO₂条件下培养。7d后将培养基换成HT培养液，待孔内的杂交细胞数量达到300个以上时，用间接ELISA法筛选，选择强阳性、抑制效果好、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，经3次以上的克隆培养和检测，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞扩大培养以备单克隆抗体的制备。

采用体内诱生腹水法生产抗虫酰肼类单克隆抗体，具体如下：选4只经产昆明小鼠，腹腔注射液体石蜡油 0.5 mL/只，7d后腹腔注射杂交瘤细胞3-5×10⁶/只，10d后，待小鼠腹部明显膨大时收集腹水。用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化腹水，经紫外测定抗虫酰肼类单克隆抗体的含量。

实施例5 抗虫酰肼类单克隆抗体的间接竞争ELISA检测方法的建立

一种检测虫酰肼类单克隆抗体的间接竞争ELISA方法，包括以下步骤：

（1）将实施例3制备的虫酰肼类包被用抗原（TEB-H-OVA）作为包被原，用包被液稀释至50μg/L，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，37℃温育过夜；

（2）弃去包被液，洗涤2次，拍干；

（3）每孔加入120μL封闭液（即1wt％鱼皮胶原蛋白），37℃封闭3h；

（4）弃去封闭液，拍板，37℃烘干30min后取出；

（5）用PBST将实施例4制备的抗虫酰肼类单克隆抗体稀释16000倍，并将虫酰肼药物稀释至1000 ng/mL、250 ng/mL、62.5 ng/mL、15.63 ng/mL、3.91 ng/mL、0.98 ng/mL、0.25 ng/mL、0.06 ng/mL、0ng/mL；

（6）每行加50μL虫酰肼标品稀释液（三组平行），再加入50μL/孔16000倍稀释的抗虫酰肼类单克隆抗体稀释液，在37℃温育40min，洗涤5次，拍干；

（7）加入羊抗鼠二抗-HRP（5000倍稀释）100μL/孔，37℃孵育30min，洗涤五次，拍干；

（8）加入显色液，每孔100μL，显色10min；

（9）加入50μL 2mol/L的H₂SO₄溶液终止反应，并在450nm处读取OD值。

虫酰肼类单克隆抗体的间接竞争ELISA标准曲线如图2所示，从图2可知实施例4制备的虫酰肼类单克隆抗体对虫酰肼的半抑制浓度（IC₅₀）为为11.2ng/mL，定量检测线性范围（IC₂₀～IC₈₀）为0.75～95.11 ng/mL，最低检测限为0.28 ng/mL；说明本发明制备得到的抗虫酰肼类单克隆抗体可以满足检测要求，且对虫酰肼类农药的识别能力高。

实施例6 抗虫酰肼类单克隆抗体的特异性评价

通过虫酰肼类农药进行交叉反应实验来确定抗虫酰肼类单克隆抗体的特异性，其抗体的特异性用交叉反应率（CR）表示，交叉反应率越小，特异性越强。将虫酰肼类农药包括虫酰肼及其衍生物，其衍生物如甲氧虫酰肼、氯虫酰肼、环虫酰肼、呋喃虫酰肼分别作倍比稀释，采用间接竞争ELISA法进行测定，步骤同实施例5的灵敏度验证方法，得到各农药成分的IC₅₀值，按照以下公式计算交叉反应率(CR)：

CR（％）＝IC₅₀（虫酰肼）/IC₅₀（衍生物）×100％

将实施例5中的药物成分虫酰肼换成其衍生物甲氧虫酰肼、氯虫酰肼、环虫酰肼、呋喃虫酰肼，并以同样的稀释倍数进行上述试验，测定实施例4制备的单克隆抗体对其他结构类似物的交叉反应率，见表1。通过表1可以看出该单克隆抗体和虫酰肼的衍生物均有很高的交叉反应，说明该抗体可以用来进行宽谱检测。

表1 抗虫酰肼单克隆抗体与虫酰肼衍生物的交叉反应率

实施例7 虫酰肼类农药酶联免疫检测试剂盒的制备

制备虫酰肼类农药酶联免疫检测试剂盒，试剂盒包含下述各部分：

包被有虫酰肼类包被用抗原的酶标板的制备：将实施例3制备的虫酰肼类包被用抗原（TEB-H-OVA）作为包被原，用包被缓冲液将包被原稀释至50μg/L，每孔加入100μL，37℃避光孵育过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μL封闭液，25℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存；

包被缓冲液为pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭液为pH值为7.1～7.5，含有1wt％～3wt％酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液；

（2）虫酰肼标准品溶液：9个浓度梯度，分别为1000ng/mL、250 ng/mL、62.5 ng/mL、15.63 ng/mL、3.91 ng/mL、0.98 ng/mL、0.25 ng/mL、0.06 ng/mL、0ng/mL；

（3）16000倍稀释的抗虫酰肼类单克隆抗体稀释液；

（4）酶结合物：辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体；

（5）底物显色液：由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；

（6）终止液为2mol/L的H₂SO₄；

（7）洗涤液为pH值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，百分比为重量体积百分比。

实施例8 一种食品中虫酰肼类农药残留的快速检测方法

8.1样品前处理

称取2.0g±0.01g均质的蔬菜样品至50mL离心管中，加入样品提取液8mL，盖上盖子，涡旋混合器混匀或手动上下振荡混匀30 s，静置分层或4000 r/min离心1 min，取上清液为待测液。样品提取液：称取0.085M的四硼酸钠溶解到水中，定容至1L，充分溶解后用HCl调pH至8.2即可。

8.2检测

将样品待测液和虫酰肼标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样品孔所在的位置。根据需要量将酶结合物浓缩液用酶结合物稀释液按1:10体积比进行稀释（即一份酶结合物浓缩液加入10份酶结合物稀释液，现配现用）。加入标准品/样品50μL到对应的微孔中，然后加入抗体工作液50μL，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250μL/孔。充分洗涤4～5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干。加入底物显色液A液50μL/孔，再加入底物显色液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应10min。加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔的OD值。

8.3检测结果分析

标准品或样品待测液的百分吸光率等于标准品或样品待测液的吸光度值的双孔平均值除以第一个标准品（0 ng/mL）的吸光度值的平均值，再乘以100％。以标准品百分吸光率为纵坐标，以虫酰肼标准品浓度（ng/mL）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样品待测液的百分吸光率代入酶标仪所给出的标准曲线中，从标准曲线上读出样品待测液所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数，即为蔬菜样品中虫酰肼类农药的实际浓度，完成对蔬菜样品中虫酰肼类农药残留的快速检测。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims

1.虫酰肼类半抗原，其特征在于，其结构如式（Ⅰ）所示：

（Ⅰ）。

2.制备权利要求1所述的虫酰肼类半抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将3-羟基苯甲醛和4-溴丁酸甲酯溶解DMF中，再加入碱，60-90℃的条件下反应数小时，过滤除去不溶物，滤液减压旋蒸，除去溶剂，纯化后得到中间体1；

2）将所述中间体1用乙腈溶解后，室温下加入NaClO2作为氧化剂，将所述中间体1的醛基氧化成羧基，提纯后得到中间体2；

5）将中间体4在氢氧化锂水溶液作用下进行水解，经提纯得到虫酰肼类半抗原。

3.虫酰肼类抗原，其特征在于，所述虫酰肼类抗原为权利要求1所述的虫酰肼类半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白为乳铁蛋白或鸡卵清白蛋白中的一种。

4.权利要求1所述的虫酰肼类半抗原、权利要求3所述的虫酰肼类抗原在虫酰肼类农药的免疫学检测中的应用，所述虫酰肼类农药选自虫酰肼、甲氧虫酰肼、氯虫酰肼、环虫酰肼、呋喃虫酰肼。

5.由权利要求3所述的虫酰肼类抗原制备的虫酰肼类农药酶联免疫检测试剂盒，所述虫酰肼类农药选自虫酰肼、甲氧虫酰肼、氯虫酰肼、环虫酰肼、呋喃虫酰肼。

6.食品中虫酰肼类农药残留的快速检测方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求5所述的虫酰肼类农药酶联免疫检测试剂盒对食品中的虫酰肼类农药残留进行检测，所述食品包括动物源性食品和植物源性食品，所述虫酰肼类农药选自虫酰肼、甲氧虫酰肼、氯虫酰肼、环虫酰肼、呋喃虫酰肼。