CN109917127B

CN109917127B - 一种杀虫脒检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN109917127B
Application number: CN201910203633.5A
Authority: CN
Inventors: 刘宏生; 邹本尧; 王蕊; 朱俊丰
Original assignee: Liaoning Wellcome Testing And Evaluation Technology Co ltd
Current assignee: Liaoning Wellcome Testing And Evaluation Technology Co ltd
Priority date: 2019-03-18
Filing date: 2019-03-18
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2039-03-18
Also published as: CN109917127A

Abstract

本发明公开了一种杀虫脒检测试剂盒及其应用。所述试剂盒包括：含有包被了杀虫脒‑OVA偶联物的微量测试孔的酶标板、系列杀虫脒标准溶液、杀虫脒‑BSA多克隆抗体、清洗缓冲液、抗体稀释液、HRP标记的山羊抗兔二抗、底物溶液A、底物溶液B和反应终止液。本发明还公开了使用上述试剂盒检测杀虫脒的方法。本发明的杀虫脒检测试剂盒，可用于检测水产品及饲养水产品的水样。该试剂盒简化了样品处理方式，使用简便，整个操作过程一个小时左右，回收率和灵敏度较高。

Description

一种杀虫脒检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及农药杀虫脒的快速检测方法，具体地，涉及一种基于杀虫脒酶联免疫试剂盒快速检测杀虫脒的方法。

背景技术

杀虫脒(Chlordimeform)，又称杀螨脒或克死螨，是一种高效杀螨剂，其分子式为C₁₀H₁₃ClN₂，化学名为N-(2-甲基-4-氯苯基)-N’,N’-二甲基甲脒。杀虫脒主要用于防治水稻螟虫，也可用于防治棉花红蜘蛛、红铃虫、果树红蜘蛛和介壳虫等。国内生态流行病学提示，在接触杀虫脒的工人的尿样中检出了其代谢产物4-氯邻甲苯胺，这些工人的膀胱癌发生率是未接触工人的72倍。长期大量使用杀虫脒的地区显示肿瘤及女性膀胱癌有所增加。毒理研究发现，4-氯邻甲苯胺对脱氧核苷酸(DNA)有损伤和诱变作用。由于杀虫脒的主要代谢产物4-氯邻甲苯胺对人体具有潜在的致癌作用，目前世界各国对于食品中的杀虫脒的残留都进行了严格的控制。其母体及其代谢产物均对人体有危害性，因其滥用或使用不当而导致的人体中毒事件多有发生。因此，在生物检测当中，对杀虫脒的检测尤为重要。

目前对于杀虫脒杀虫剂的检测方法研究主要针对大米、蜂蜜和鱼类等农副产品，常见的检测方法有气相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱-质谱法，而对鱼类产品中甲脒类农药的检测方法较少。然而以上这些方法除需要使用昂贵的设备仪器外，还需要专业人员的操作。而且样品的提取、净化、衍生化等前处理步骤又非常耗时。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明通过特殊的免疫方案，利用免疫动物制备高亲和力、高特异性的抗体，建立一种可以检测杀虫脒的高特异性、高亲和力、灵敏快速的间接竞争ELISA检测方法。相比其他检测方法，本方法具有操作更简便、时间更短、特异性更高的特点。

本发明采用的技术方案是：一种杀虫脒检测试剂盒，包括：

①含有若干包被了杀虫脒-OVA偶联物的微量测试孔的酶标板；

②标准浓度在0ng/mL～20ng/mL范围内的系列杀虫脒标准溶液；

③含有吐温20的0.05moL/L的PBS缓冲液作为清洗缓冲液；

④以杀虫脒-BSA偶联物为免疫原制备的杀虫脒-BSA多克隆抗体；

⑤含有H₂O₂的pH值为4.5～5.0的柠檬酸缓冲液作为底物溶液A；

⑥四甲基联苯胺的二甲基亚砜溶液作为底物溶液B；

⑦HRP标记的山羊抗兔二抗；

⑧PBS溶液作为抗体稀释液；

⑨硫酸溶液作为反应终止液。

优选的，所述杀虫脒-OVA偶联物的制备方法包括如下步骤：

1)将杀虫脒溶解在DMF中，加入碳酸铯搅拌混匀，加入溴化乙醇进行取代反应，柱层析纯化得杀虫脒衍生物；

2)将杀虫脒衍生物和琥珀酸酐溶解于DMSO中，85-95℃反应1-2h，冷却至室温，缓慢加入蒸馏水，边滴加边搅拌，析出黄色沉淀，抽滤取沉淀，干燥，用蒸馏水重结晶，得杀虫脒-HS(N-(4-氯-2-甲基苯基)-N'-(2-羟基乙基)甲脒半琥珀酸酯)；

3)将杀虫脒-HS、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和DCC(二环己基碳二亚胺)溶解于DMF中，20-30℃下震荡24-26h，得到A液；将OVA(卵清蛋白)用PBS溶解，得到B液，将B液缓慢滴入A液中，37℃搅拌15-17h；所得产物以PBS作为透析液，4℃下进行透析后，4500rpm超滤浓缩，得杀虫脒-OVA偶联物。

优选的，杀虫脒-OVA偶联物的包被浓度为8～32μg/mL。更优选的，杀虫脒-OVA偶联物的包被浓度为16μg/mL。

优选的，所述杀虫脒-BSA偶联物的制备方法包括如下步骤：

2)将杀虫脒衍生物和琥珀酸酐溶解于DMSO中，85-95℃反应1-2h，冷却至室温，缓慢加入蒸馏水，边滴加边搅拌，析出黄色沉淀，抽滤取沉淀，干燥，用蒸馏水重结晶，得杀虫脒-HS；

3)将杀虫脒-HS、NHS和DCC溶解于DMF中，20-30℃下震荡24-26h，得到A液；将BSA(牛血清白蛋白)用PBS溶解，得到B液，将B液缓慢滴入A液中，37℃搅拌15-17h；所得产物以PBS作为透析液，4℃下进行透析后，4500rpm超滤浓缩，得杀虫脒-BSA偶联物。

优选的，所述清洗缓冲液是：于0.05moL/L的PBS缓冲液中加入吐温20至吐温20的终浓度为按重量浓度为2～7‰。更优选的，吐温20的终浓度为按重量浓度为5‰.。

优选的，所述底物溶液A是：于pH值为4.5～5.0的柠檬酸缓冲液中加入H₂O₂至H₂O₂的终浓度为按体积浓度为1～2‰。

优选的，所述底物溶液B是：将四甲基联苯胺溶于二甲基亚砜溶液中，至四甲基联苯胺浓度为6mg/mL。

优选的，所述抗体稀释液是：浓度为0.1mol/L的PBS溶液。

优选的，所述反应终止液是：2M硫酸溶液。

上述的杀虫脒检测试剂盒在检测杀虫脒中的应用。

一种检测杀虫脒的方法，利用上述的杀虫脒检测试剂盒，方法如下：

1)将杀虫脒-BSA多克隆抗体和HRP标记的山羊抗兔二抗用抗体稀释液进行稀释；

2)向若干包被了杀虫脒-OVA偶联物的微量测试孔中分别加入相同体积的不同标准浓度的杀虫脒标准溶液和待测样品溶液，然后再向每一孔中，加入杀虫脒-BSA多克隆抗体稀释液，避光37℃温育1～2h后倒掉反应液，用清洗缓冲液冲洗每一微量测试孔。其中，每孔按体积比，杀虫脒标准溶液:杀虫脒-BSA多克隆抗体稀释液＝1:1；或待测样品溶液:杀虫脒-BSA多克隆抗体稀释液＝1:1；

3)向步骤2)冲洗后的微量测试孔中加入HRP标记的山羊抗兔二抗稀释液，避光37℃温育1～2h后倒掉，再次用清洗缓冲液冲洗每一微量测试孔。其中，每孔中，HRP标记的山羊抗兔二抗稀释液的体积用量等于杀虫脒标准溶液和杀虫脒-BSA多克隆抗体稀释液的总体积，或HRP标记的山羊抗兔二抗稀释液的体积用量等于待测样品溶液和杀虫脒-BSA多克隆抗体稀释液的总体积；

4)向步骤3)冲洗后的微量测试孔中加入底物溶液A和底物溶液B的混合液，显色15-25min。其中，按体积比，底物溶液A:底物溶液B＝1:1；每孔中，底物溶液A和底物溶液B的混合液的体积用量等于HRP标记的山羊抗兔二抗稀释液的体积用量；

5)最后加入反应终止液终止反应，用酶标仪选择450nm波长读取吸光值；

优选的，杀虫脒-BSA多克隆抗体的稀释度为1:6400～25600。

优选的，HRP标记的山羊抗兔二抗的稀释度为1:3000～5000。

优选的，所述待测样品是尿液、水样、饲料、水产品或肉类。

本发明主要是利用抗原与抗体的特异性免疫反应的基本原理来进行，主要是间接竞争ELISA，利用杀虫脒或者待测样品与一抗等体积混合与固相载体竞争结合进行显色的方法。在整个反应完成后，样品中杀虫脒含量越多，反应呈色就越浅；反之，样品中杀虫脒含量越少，则呈色越深。

本发明的有益效果是：

1.本发明提供的检测方法快速、简便、灵敏度高。检测试剂盒便于携带。

2.本发明的杀虫脒检测试剂盒，除可用于尿液检测外，还可用于对水样的检测，使检验结果更准确，更稳定；也可对饲料、鸡肉、组织等样品进行检测。

3.本发明的杀虫脒检测试剂盒，简化了样品处理方式，使用简便，省时、省力、省钱，整个操作过程为一个小时左右，回收率为83％-117％，灵敏度可达到0.1ng/ml，是各类水产品养殖检测机构的理想产品

附图说明

图1是杀虫脒-OVA偶联物的电泳鉴定图；

其中，M:Marker；1:OVA标准品(44.5kd)；2和3:杀虫脒-OVA偶联物(0.5mg/ml)。

图2是杀虫脒-BSA偶联物的电泳鉴定图；

其中，M:Marker；1:BSA标准品(66.4kd)；2和3:杀虫脒-BSA偶联物(0.5mg/ml)。

图3是杀虫脒-BSA多克隆抗体的特异性鉴定图；

其中，M:Marker；1:阴性血清(1:1000)；2:阴性血清(1:2500)；3:阴性血清(1:5000)；4:BSA标准品0.1mg/ml；5:杀虫脒-BSA0.1mg/ml。

图4是杀虫脒抗血清效价检测图。

图5是间接竞争ELISA方法检测杀虫脒浓度的竞争抑制标准曲线。

具体实施方式

实施例1。

一、杀虫脒-OVA偶联物的包被浓度及杀虫脒-BSA多克隆抗体稀释度的选择

1、微量测试孔的包被

1.1)杀虫脒-OVA偶联物的制备：

取0.54g杀虫脒，溶解在10ml的DMF中，再加入0.13g碳酸铯，搅拌混匀后，加入0.27g溴化乙醇，在50℃下搅拌8h进行取代反应，蒸干得粗产物，再利用柱层析纯化得到精提的杀虫脒衍生物。

采用琥珀酸酐法合成杀虫脒人工抗原。首先将杀虫脒衍生物琥珀酸化，取26.3g杀虫脒衍生物和13g琥珀酸酐，溶解于100ml的DMSO中，90℃反应1h，反应液冷却至室温，缓慢加入400ml蒸馏水，边滴加边搅拌，析出黄色沉淀，抽滤留下沉淀，50℃烘干，再用蒸馏水重结晶3次，干燥得到结晶，即为N-(4-氯-2-甲基苯基)-N'-(2-羟基乙基)甲脒半琥珀酸酯(杀虫脒-HS)。

分别称取6mg杀虫脒-HS、4mg NHS和2mg DCC，用500ul的DMF溶解，25℃下震荡24h，得到A液；称取2mg OVA用2ml PBS溶解，得到B液，将B液缓慢滴入A液中，37℃下搅拌16h。将得到的液体放在截留分子量为30KD的透析袋中，以PBS作为透析液，放在4℃下进行透析，直到透析完全。取透析袋中的清澈液体转移到超滤管中，4500rpm超滤浓缩8min，得到杀虫脒-OVA偶联物，-20℃条件下分装贮存。

OVA标准品分子量为44.5kDa，如图1所示，杀虫脒-OVA偶联物的分子量略大于OVA标准品的分子量，条带略有滞后和拖尾现象，说明偶联成功。

1.2)微量测试孔的包被：以制备的杀虫脒-OVA偶联物为包被原，用0.05mol/L、pH为9.6的碳酸盐缓冲液稀释到8-32μg/mL，每孔0.1ml加入到96孔酶标板，4℃过夜。

2、杀虫脒-BSA多克隆抗体

2.1)杀虫脒-BSA偶联物的制备：

分别称取6mg杀虫脒-HS、4mg NHS和2mg DCC，用500ul的DMF溶解，25℃下震荡24h，得到A液；称取2mg BSA用2ml PBS溶解，得到B液，将B液缓慢滴入A液中，37℃下搅拌16h。将得到的液体放在截留分子量为50KD的透析袋中，以PBS作为透析液，放在4℃下进行透析，直到透析完全。取透析袋中的清澈液体转移到超滤管中，4500rpm超滤浓缩8min，得到杀虫脒-BSA偶联物，-20℃条件下分装贮存。

BSA标准品分子量为66.4kDa，如图2所示，杀虫脒-BSA偶联物的分子量略大于BSA标准品的分子量，条带略有滞后和拖尾现象，说明偶联成功。

2.2)杀虫脒-BSA多克隆抗体的制备

将杀虫脒-BSA进行透析处理，其中蛋白含量为2.69mg/mL。以透析后所得杀虫脒-BSA免疫家兔，初次免疫用100-500μg杀虫脒-BSA加入等量完全弗氏佐剂，在家兔背部皮下注射4点，每点0.1mL。每隔4-6个星期用100-500μg杀虫脒-BSA于弗氏不完全佐剂中，在皮下注射加强免疫，加强免疫共5次，每次1mL。佐剂和杀虫脒-BSA按照1:1的比例混合乳化。每只兔子每次免疫使用1mL乳化完全的抗原，杀虫脒-BSA含量100-500μg；分4个点打入，每个点0.1mL。最后一次加强免疫直接用1mL生理盐水稀释100-500μg杀虫脒-BSA，静脉注射，10天后颈部静脉取血，获得抗血清。经检测，第五次加强免疫后的抗血清为合格。

将获得的抗血清采用ProteinA琼脂糖凝胶抗体纯化方法进行纯化，获得纯化的杀虫脒-BSA多克隆抗体；具体为：

将获得的抗血清用平衡缓冲液(pH为9.6的磷酸盐缓冲液)稀释5-10倍。

将ProteinA-Agarose填料混匀后加入层析柱，室温静置10分钟，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。

向装填后的柱中加入3-5个柱床体积的超纯水将乙醇冲洗干净，用平衡缓冲液(pH为9.6的磷酸盐缓冲液)流洗5-10个柱床体积平衡柱子。

将稀释的抗血清样品上柱，上样流速60cm/h。平衡缓冲液再洗5-10个柱床体积，直至基线平稳。

洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH4.0)洗脱，收集洗脱液，用中和缓冲液(1MTris-Cl，pH9.0)将收集的洗脱液中和到中性，得纯化的杀虫脒多克隆抗体。

如图3所示，经纯化的杀虫脒多克隆抗体与杀虫脒-BSA进行的Western-Blot，多抗只与杀虫脒-BSA具有特异性反应，并不与阴性血清和BSA标准品发生特应性反应，说明多抗制备成功。

将阴性血清和阳性血清分别稀释成同样的浓度梯度，进行间接ELISA方法进行检测，如图4所示，得到的OD值用阳性血清/阴性血清的比值≥2.1的血清最大稀释度为该抗血清的效价，由图4可知，本试剂盒的多克隆抗体的效价为1:128000。

3、方法：

3.1)以上述制备的杀虫脒-OVA偶联物为包被原，用0.05mol/L、pH为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至浓度分别为8μg/mL、16μg/mL和32μg/mL后分别包被微量测试孔。将上述制备的杀虫脒-BSA多克隆抗体用抗体稀释液稀释，稀释度分别为1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200。杀虫脒小分子溶液的浓度分别为0ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml。

3.2)向若干包被了杀虫脒-OVA偶联物的微量测试孔中分别加入50μl杀虫脒小分子溶液，然后再向每一孔中，加入50μl经稀释的杀虫脒-BSA多克隆抗体稀释液，避光37℃温育1h后倒掉反应液，用清洗缓冲液冲洗每一微量测试孔。

3.3)向步骤3.2)冲洗后的微量测试孔中加入100μl HRP标记的山羊抗兔二抗稀释液(稀释度为1:3000)，避光37℃温育1h后倒掉，再次用清洗缓冲液冲洗每一微量测试孔。

3.4)向步骤3.3)冲洗后的微量测试孔中加入体积比为1:1的底物溶液A和底物溶液B的混合液100μl，显色20min。

3.5)最后加入50μl反应终止液终止反应，用酶标仪选择450nm波长读取吸光值。结果如表1和表2。

表1

表2

吸光值在1.0左右时，即为两个参数的最佳工作浓度，由表1初步选择包被原包被浓度为16μg/ml，抗体稀释度为1:6400、1:12800、1:25600。由表2可见，经棋盘滴定实验和间接竞争ELISA实验，确定包被原杀虫脒-OVA偶联物的包被浓度优选16μg/ml。杀虫脒-BSA多克隆抗体的稀释度优选1:25600。

二、本实施例提供一种杀虫脒检测试剂盒，该试剂盒组成如表3。

表3

三、杀虫脒检测试剂盒的制备

1、包被杀虫脒-OVA偶联物的微量测试孔

以制备的杀虫脒-OVA偶联物为包被原，用0.05mol/L、pH为9.6的碳酸盐缓冲液稀释到16μg/mL，每孔0.1ml加入到96孔酶标板，4℃过夜。

2、系列杀虫脒标准溶液

精确称取杀虫脒标准品1mg，用甲醇溶解，制成浓度为1000ng/mL的母液，然后用甲醇分别稀释成0ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml的系列杀虫脒标准溶液。

3、清洗缓冲液：

于0.05moL/L的PBS缓冲液中加入吐温20，使吐温20的终浓度为重量浓度为5‰。使用时需要用双蒸水稀释20倍后使用。

4、杀虫脒-BSA多克隆抗体

将杀虫脒-BSA进行透析处理，其中蛋白含量为2.69mg/mL。以透析后所得杀虫脒-BSA免疫家兔，初次免疫用100-500μg杀虫脒-BSA加入等量完全弗氏佐剂，在家兔背部皮下注射4点，每点0.1mL。每隔4-6个星期用100-500μg杀虫脒-BSA于弗氏不完全佐剂中，在皮下注射加强免疫，加强免疫共5次，每次1mL。佐剂和杀虫脒-BSA按照1:1的比例混合乳化。每只兔子每次免疫使用1mL乳化完全的抗原，杀虫脒-BSA含量100-500μg；分4个点打入，每个点0.1mL。最后一次加强免疫直接用1mL生理盐水稀释100-500μg杀虫脒-BSA，静脉注射，10天后颈部静脉取血，获得抗血清。经检测，第五次加强免疫后的抗血清为合格。将获得的抗血清采用ProteinA琼脂糖凝胶抗体纯化方法进行纯化，获得纯化的杀虫脒-BSA多克隆抗体。

5、底物溶液A

称取3.5g Na₂HPO₄·12H₂O和1.1g柠檬酸，加蒸馏水溶解至200mL，得柠檬酸缓冲液，调节pH值至5.0，加入H₂O₂至H₂O₂的终浓度为体积浓度为1.5‰。

6、底物溶液B

将6mg四甲基联苯胺溶解于1ml二甲基亚砜中，使四甲基联苯胺浓度为6mg/mL，避光保存。

7、HRP标记的山羊抗兔二抗：市购

8、抗体稀释液：浓度为0.1mol/L的PBS溶液

9、反应终止液：将浓硫酸稀释成2M硫酸溶液。

实施例2一种检测杀虫脒的方法

(一)检测方法

利用实施例1制备的杀虫脒检测试剂盒，检测前，将系列杀虫脒标准溶液、待测样品、杀虫脒-BSA多克隆抗体、HRP标记的山羊抗兔二抗、含有96个包被了杀虫脒-OVA偶联物的微量测试孔的酶标板，置于室温下，回温5分钟，检测杀虫脒的方法如下：

1)稀释

将杀虫脒-BSA多克隆抗体用抗体稀释液进行稀释，稀释度为1:25600。

将HRP标记的山羊抗兔二抗用抗体稀释液进行稀释，稀释度为1:3000。

用蒸馏水将清洗缓冲液稀释20倍，作为酶标板清洗液。

2)向若干包被了杀虫脒-OVA偶联物的微量测试孔中分别加入50μl不同标准浓度的杀虫脒标准溶液和50μl待测样品溶液，然后再向每孔中加入50μl杀虫脒-BSA多克隆抗体稀释液，轻敲板子四周，使其充分混合后，避光37℃温育1h后倒掉反应液，用清洗缓冲液冲洗微量测试孔3次。将剩余微孔条放回铝箔袋中，以胶带封好储存于4℃。

3)向步骤2)冲洗后的微量测试孔中加入100μl HRP标记的山羊抗兔二抗稀释液，避光37℃温育1h后倒掉，再次用清洗缓冲液冲洗微量测试孔4次。

4)向步骤3)冲洗后的微量测试孔中加入100μl底物溶液A和底物溶液B(体积比为1：1)的混合液，轻敲板子四周，使其充分混合，于37℃下避光静置20min后倒掉。

5)最后向每一微孔中加入50μl反应终止液终止反应，用酶标仪选择450nm波长测定吸光度值。

(二)标准曲线的绘制

计算B/B0值。用杀虫脒标准溶液的吸光度值(B)除以浓度为0ng/ml的杀虫脒标准溶液的吸光度值(B0)再乘以100％。

以B/B0值为纵坐标，以杀虫脒标准溶液的浓度的对数值为横坐标，做标准半对数曲线。结果如图5所示，由图5可见杀虫脒浓度在0～20ng/ml的范围内呈线性关系，线性方程为y＝-27.334x+125.8，R²＝0.9872。

根据待测样品的B/B0值，即可从曲线上读出相对应的浓度。

(三)灵敏度的测定

向包被了包被原的微量测试孔中，加入50μl浓度为0ng/mL的杀虫脒标准溶液和50μl杀虫脒-BSA多克隆抗体稀释液，避光37℃竞争反应1h后倒掉反应液，用清洗缓冲液洗板3次后，加入100μl HRP标记的山羊抗兔二抗稀释液，避光37℃温育1h后倒掉，再次用清洗缓冲液冲洗微量测试孔4次后，加入100μl底物溶液A和底物溶液B(v:v＝1:1)的混合液，避光37℃下温育20min显色后倒掉，最后加入50μl反应终止液，用酶标仪选择450nm波长读取吸光度值。测试20次的吸光度值见表4。

表4：

2.077	1.987	1.867	2.011	1.821
					2.111	2.113	1.966	1.863	1.564
1.787	1.868	1.797	2.236	2.111
					1.82	1.78	1.882	1.898	2.019

本试剂盒灵敏度在平行20个孔测定零标准品的吸光度值，计算测定结果的平均值(B)与标准差(SD)。灵敏度为LOD所得的值在标准曲线上所对应的浓度值。

灵敏度LOD＝B0-3SD

代入曲线计算得：灵敏度＝0.1ng/ml。

(四)特异性

上述制备的杀虫脒试剂盒的特异性通过对相应的物质进行交叉反应性分析而得到。抗血清的抑制物分别沙丁胺醇、克伦特罗等类似物，以类似物的IC50除以标准曲线的IC50再乘以100％为该物质的交叉反应率。

向若干包被了杀虫脒包被原的微量测试孔中，分别加入50μl不同浓度的杀虫脒标准溶液和50μl如表5所示的其他相关物质的溶液，然后向每一孔中分别加入50μl杀虫脒-BSA多克隆抗体稀释液，避光37℃下竞争反应30min后倒掉反应液，用清洗缓冲液洗板3次后，加入100μl HRP标记的山羊抗兔二抗稀释液，避光37℃温育1h后倒掉，再次用清洗缓冲液冲洗微量测试孔4次后，加入100μl底物溶液A和底物溶液B(v:v＝1:1)的混合液，37℃下温育15min显色后倒掉，最后加入50μl反应终止液，用酶标仪选择450nm波长读取吸光度值。结果如表5所示，表5为本发明试剂盒与杀虫脒类似物的交叉反应结果。

表5

标准品及交叉反应物	交叉反应率％
		杀虫脒	100％
肾上腺素	<4％
		呋喃唑酮	<0.1％
克伦特罗	<5％
		氯霉素	12％

由表5可见，本发明的试剂盒与所测各类似物基本没有交叉反应，具有较好的特异性。

(五)精密度

使用本发明试剂盒进行三次质控样品的检测，其中三种质控样品的浓度分别为0.1ng/ml，1ng/ml，10ng/ml，每份样品做5次重复。回收率结果如表6，重复性结果如表7。

表6。

由表6可见，在该三个质控样品内测定回收率，范围在81.3％-117％，说明本发明试剂盒回收率较好。

表7

由表7结果显示，本发明试剂盒批内变异系数<10％，批间变异系数<20％。体现了良好的精密度。

(六)实际应用

待测样品为从辽宁省兴城大菱鲆养殖基地采集的十个水样，将水样进行离心取上清液作为检测用待测样品溶液，取50μl直接按本实施例(一)所述的方法进行检测，结果如表8。

表8

养殖水产品水样	吸光度值(重复3孔平均值)	试剂盒测出杀虫脒含量ng/ml
			1	1.402±0.014	0.144
2	1.292±0.072	0.346
			3	1.302±0.037	0.323
4	0.919±0.009	6.76
			5	0.797±0.047	17.782
6	1.219±0.019	1.148
			7	1.103±0.100	1.548
8	0.922±0.026	6.309
			9	0.813±0.020	15.776
10	1.093±0.055	1.698

。

Claims

1.一种检测杀虫脒的方法，其特征在于，利用杀虫脒检测试剂盒，方法如下：

1)将杀虫脒-BSA多克隆抗体用抗体稀释液进行稀释，稀释度为1:25600；将HRP标记的山羊抗兔二抗用抗体稀释液进行稀释，稀释度为1:3000；

2)向若干包被了杀虫脒-OVA偶联物的微量测试孔中分别加入不同标准浓度的杀虫脒标准溶液和待测样品溶液，然后再向每一孔中，分别加入杀虫脒-BSA多克隆抗体稀释液，避光37℃温育1～2h后倒掉反应液，用清洗缓冲液冲洗每一微量测试孔；其中，每孔按体积比，杀虫脒标准溶液:杀虫脒-BSA多克隆抗体稀释液＝1:1；或待测样品溶液:杀虫脒-BSA多克隆抗体稀释液＝1:1；

3)向步骤2)冲洗后的微量测试孔中加入HRP标记的山羊抗兔二抗稀释液，避光37℃温育1～2h后倒掉，再次用清洗缓冲液冲洗每一微量测试孔；其中，每孔中，HRP标记的山羊抗兔二抗稀释液的体积用量等于杀虫脒标准溶液和杀虫脒-BSA多克隆抗体稀释液的总体积，或HRP标记的山羊抗兔二抗稀释液的体积用量等于待测样品溶液和杀虫脒-BSA多克隆抗体稀释液的总体积；

4)向步骤3)冲洗后的微量测试孔中加入底物溶液A和底物溶液B的混合液，显色15-25min；其中，按体积比，底物溶液A:底物溶液B＝1:1；每孔中，底物溶液A和底物溶液B的混合液的体积用量等于HRP标记的山羊抗兔二抗稀释液的体积用量；

所述杀虫脒检测试剂盒，包括：

①含有若干包被了杀虫脒-OVA偶联物的微量测试孔的酶标板；杀虫脒-OVA偶联物的包被浓度为16μg/ml；

②标准浓度在0ng/mL～20ng/mL范围内的系列杀虫脒标准溶液；

③含有吐温20的0.05moL/L的PBS缓冲液作为清洗缓冲液；

⑥四甲基联苯胺的二甲基亚砜溶液作为底物溶液B；

⑦HRP标记的山羊抗兔二抗；

⑧PBS溶液作为抗体稀释液；

⑨硫酸溶液作为反应终止液；

所述杀虫脒-OVA偶联物的制备方法包括如下步骤：

3)将杀虫脒-HS、NHS和DCC溶解于DMF中，20-30℃下震荡24-26h，得到A液；将OVA用PBS溶解，得到B液，将B液缓慢滴入A液中，37℃搅拌15-17h；所得产物以PBS作为透析液，4℃下进行透析后，4500rpm超滤浓缩，得杀虫脒-OVA偶联物；

所述杀虫脒-BSA偶联物的制备方法包括如下步骤：

3)将杀虫脒-HS、NHS和DCC溶解于DMF中，20-30℃下震荡24-26h，得到A液；将BSA用PBS溶解，得到B液，将B液缓慢滴入A液中，37℃搅拌15-17h；所得产物以PBS作为透析液，4℃下进行透析后，4500rpm超滤浓缩，得杀虫脒-BSA偶联物。

2.根据权利要求1所述的一种检测杀虫脒的方法，其特征在于，所述待测样品是尿液、水样、饲料、水产品或肉类。

3.根据权利要求1所述的一种检测杀虫脒的方法，其特征在于，所述清洗缓冲液是：于0.05moL/L的PBS缓冲液中加入吐温20至吐温20的终浓度为按重量浓度为2～7‰；所述底物溶液A是：于pH值为4.5～5.0的柠檬酸缓冲液中加入H₂O₂至H₂O₂的终浓度为按体积浓度为1～2‰；所述底物溶液B是：将四甲基联苯胺溶于二甲基亚砜溶液中，至四甲基联苯胺浓度为6mg/mL；所述抗体稀释液是：浓度为0.1mol/L的PBS溶液；所述反应终止液是：2M硫酸溶液。