CN100537579C - 一种二甲氧基磷酸酯类农药通用半抗原的合成方法 - Google Patents

Abstract

一种二甲氧基磷酸酯类农药通用半抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明的合成过程分酯化、酰化、水解三个步骤，首先将对羟基苯丙酸与甲醇发生酯化反应，使羧基甲酯化；然后所得的对羟基苯丙酸甲酯再与二甲氧基磷酰氯反应，得到二甲氧基磷酸酯；最后是将第一步酯化形成的甲酯再水解，将羧基还原出来得O，O-二甲基-O-(4-丙酸基苯基)磷酸酯；此磷酸酯与卵清蛋白偶联，作为二甲氧基磷酸酯类农药多残留ELISA分析的包被抗原。该物质与蛋白偶联之后作为此类农药酶联免疫检测过程中的包被抗原，因为此结构中含有苯环，利用包被抗原与免疫原结构上的差异来进一步提高检测灵敏度，降低检测限。

Description

一种二甲氧基磷酸酯类农药通用半抗原的合成方法

技术领域

一种二甲氧基磷酸酯类农药通用半抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

有机磷农药的基本化学结构为：

二甲氧基磷酸酯是R和R′均为甲基、Y为氧的一种结构，针对具有这种结构的一类农药来合成通用半抗原O，O-二甲基-O-(4-丙酸基苯基)磷酸酯。有机磷农药由于其杀虫广谱，药效高，在我国的农业生产实践中得到了广泛的应用，由于其使用量大，应用面广，在环境保护和食品安全方面受到了普遍关注。免疫检测方法在农药残留检测上的发展非常迅速，目前已经有十几种常用的有机磷农药建立了免疫检测方法，但都是针对一种农药。而进出口贸易中，对一种产品往往规定若干个农药残留标准，再加上农药的混配生产和使用剧增，因此开展农药的多残留免疫分析具有更新的现实意义。多残留免疫分析的原理就是针对一组或一类化合物的共性结构特征来设计和合成半抗原，从而得到对于特定的一组或一类化合物都具有识别和检测能力的抗体，即具有宽谱特异性(broad specificity)，这种抗体有望用于某一类化合物的多残留ELISA分析。对于有机磷农药的多残留ELISA研究，国内外都进行了一些尝试，但到目前为止，对于久效磷、磷胺、速灭磷、百治磷、敌敌畏等几种高毒磷酸酯类农药国内外尚未见其多残留分析研究的报道。而合成针对该类物质的通用半抗原是建立多残留免疫分析的前提。

发明内容

本发明的目的是合成一种针对二甲氧基磷酸酯类农药的通用半抗原，该物质与蛋白偶联之后可以作为此类农药酶联免疫检测过程中的包被抗原，利用包被抗原与免疫原结构上的差异来进一步提高检测灵敏度，降低检测限。

本发明的技术方案：一种二甲氧基磷酸酯类农药通用半抗原的合成方法，合成过程分酯化、酰化、水解三个步骤，首先将对羟基苯丙酸与甲醇发生酯化反应，使羧基甲酯化；然后所得的对羟基苯丙酸甲酯再与二甲氧基磷酰氯反应，得到二甲氧基磷酸酯；最后是将第一步酯化形成的甲酯再水解，将羧基还原出来得O，O-二甲基-O-(4-丙酸基苯基)磷酸酯；此磷酸酯与卵清蛋白偶联，作为二甲氧基磷酸酯类农药多残留ELISA分析的包被抗原；第一步以对羟基苯丙酸为原料进行甲酯化先将羧基保护；第二步是用前一步的产物对羟基苯丙酸甲酯与二甲氧基磷酰氯发生酰化，形成磷酸酯；第三步是将甲酯水解羧基脱保护。其反应方程式为：

合成步骤为：

(1)酯化

在50mL烧瓶中加入对羟基苯丙酸3.5g和甲醇14mL，对羟基苯丙酸与甲醇的质量/体积比为1∶4，和加1mL浓硫酸，120℃加热回流2h，之后先蒸出5mL的甲醇，加入碳酸钠饱和溶液直到无气体产生；然后用二氯甲烷萃取，萃取液经35℃旋转蒸发除去溶剂，再真空干燥得的红棕色油状物对羟基苯丙酸甲酯，纯度达99％以上。

(2)酰化

在50mL的圆底烧瓶中加入10～15mL乙腈作溶剂，加入第一步产物对羟基苯丙酸甲酯和二甲氧基磷酰氯，两者为等摩尔配比，对羟基苯丙酸甲酯10mmol、二甲氧基磷酰氯10mmol、2.5g碳酸钾，常温下磁力搅拌2h，反应过程中不断用薄层层析监测反应进度，直到酰氯完全反应；然后静置一段时间，上层液体再经0.5μm的滤膜过滤得澄清液体，旋转蒸发将溶剂除去后得黄色油状物，再经硅胶柱色谱分离得到目标产物二甲氧基磷酸酯，纯度大于90％；

分离过程：

①展开剂的选择：取一块2cm×5cm大小的硅胶板，在距硅胶板下边缘0.8cm处用铅笔作一水平线。将样品溶于甲醇配成1％左右的溶液，用内径1mm管口平齐的毛细管点样，垂直轻轻地点在起始线上，吹干。然后将薄板放入层析液中层析，层析液是石油醚/乙酸乙酯＝7∶3(v/v)，当溶剂前沿距薄板上边缘0.8cm时将板取出，吹干。将薄板放入紫外分析仪中观察，可发现板上有两个点，其中上方的点为过量的对羟基苯丙酸甲酯Rf＝0.647、下方的点为目标物其Rf＝0.162。

②装柱：将2cm×30cm的空柱洗净干燥，垂直固定在铁架上，在柱底铺一层脱脂棉，再在上面覆盖一层厚0.5～1cm的石英砂。按湿法装柱装入约2/3高度的硅胶，再在上方盖一层0.5～1cm的石英砂。

③加样及洗脱：将配成适当浓度的样品沿管壁加入色谱柱，并用少量溶剂洗涤柱壁上所沾的样品。加样完毕后，首先用石油醚/乙酸乙酯＝7∶3(v/v)的洗脱液进行洗脱，收集过程中通过在硅胶板上不断的点样来确定分离组分的流出。当过量的对羟基苯丙酸甲酯全部被洗脱下来之后，换用乙酸乙酯进行洗脱，并收集目标产物。

(3)水解

在20mL的乙醇溶液中加入1mmol纯化后的第二步产物二甲氧基磷酸酯，然后加入7mL 1M的氢氧化钾，室温下搅拌45min，然后用1M的盐酸酸化，再用乙酸乙酯来萃取，萃取液经旋转蒸发除去溶剂得浅黄色油状物，再经硅胶柱色谱分离，得到最终目标产物O，O-二甲基-O-(4-丙酸基苯基)磷酸酯，纯度大于97％。

分析：经LC-MS分析得到的产物不纯，含有一种主要杂质。需要过硅胶柱进行分离。

分离过程：

1.分离条件选择：取一块2cm×5cm大小的硅胶板，在距硅胶板下边缘0.8cm处用铅笔作一水平线。将所得样品溶于甲醇配成1％左右的溶液，用内径1mm管口平齐的毛细管点样，垂直轻轻地点在起始线上，吹干。然后将薄板放入层析液中层析，层析液是氯仿/乙酸乙酯/乙酸＝65∶35∶1(v/v/v)，当溶剂前沿距薄板上边缘0.8cm时将板取出，吹干。将薄板放入紫外分析仪中观察，可发现板上有两个点，其中上方的点Rf＝0.428、下方的点Rf＝0.328。

2.装柱：同上(略)。

3.加样及洗脱：将配成适当浓度的样品沿管壁加入色谱柱，并用少量溶剂洗涤柱壁上所沾的样品。加样完毕后，用氯仿/乙酸乙酯/乙酸＝65∶35∶1(v/v/v)的洗脱液进行洗脱，收集过程中通过不断的点样确定分离组分的流出，将两种物质分离开来，并收集。

经LC-MS测试，确定下方的点Rf＝0.328为要合成的目标物O，O-二甲基-O-(4-丙酸基苯基)磷酸酯。

本发明的有益效果：该物质与蛋白偶联之后可以作为此类农药酶联免疫检测过程中的包被抗原，因为此结构中含有苯环，利用包被抗原与免疫原结构上的差异来进一步提高检测灵敏度，降低检测限。

附图说明

图1 O，O-二甲基-O-(4-丙酸基苯基)磷酸酯的液相色谱图。

图2 O，O-二甲基-O-(4-丙酸基苯基)磷酸酯的质谱图。

具体实施方式

(1)酯化

在50mL烧瓶中加入对羟基苯丙酸3.5g(21mmol)、14mL甲醇和1mL浓硫酸，120℃加热回流2h。之后先蒸出5mL左右的甲醇，加入碳酸钠饱和溶液直到无气体产生。然后用二氯甲烷萃取，萃取液经35℃旋转蒸发除去溶剂，再真空干燥得的红棕色油状物，此产物纯度达99％以上。

(2)酰化

在50mL的圆底烧瓶中加入10～15mL乙腈作溶剂，加入第一步产物对羟基苯丙酸甲酯1.9280g(10mmoL)、二甲氧基磷酰氯10mmoL、2.5g碳酸钾，常温下磁力搅拌大约2h，反应过程中不断用TLC监测反应进度，直到酰氯完全反应。然后静置一段时间，上层液体再经0.5μm的滤膜过滤得澄清液体。将溶剂旋转蒸发掉后得黄色油状物。

分离纯化：将2cm×30cm的空柱洗净干燥，垂直固定在铁架上，在柱底铺一层脱脂棉，再在上面覆盖一层厚0.5～1cm的石英砂。按湿法装柱装入约2/3高度的硅胶，再在上方盖一层0.5～1cm的石英砂。将配成适当浓度的样品，沿管壁加入色谱柱，并用少量溶剂洗涤柱壁上所沾的样品。加样完毕后，首先用石油醚/乙酸乙酯＝7∶3(v/v)的洗脱液进行洗脱，收集过程中通过不断的点样确定分离组分的流出。当过量的对羟基苯丙酸甲酯全部被洗脱下来之后，换用乙酸乙酯进行洗脱，并收集目标产物。

(3)水解

在20mL的乙醇溶液中加入0.288g(1mmoL)纯化后的第二步产物，然后加入7mL 1M的氢氧化钾，室温下搅拌45min，然后用1M的盐酸酸化，再用乙酸乙酯来萃取，萃取液经旋转蒸发除去溶剂得浅黄色油状物。

分离纯化：湿法装柱之后，加样、用氯仿/乙酸乙酯/乙酸＝65∶35∶1(v/v/v)的洗脱液进行洗脱，收集目标组分物。

Claims (1)

1、一种二甲氧基磷酸酯类农药通用半抗原的合成方法，其特征是合成过程分酯化、酰化、水解三个步骤，首先将对羟基苯丙酸与甲醇发生酯化反应，使羧基甲酯化；然后所得的对羟基苯丙酸甲酯再与二甲氧基磷酰氯反应，得到二甲氧基磷酸酯；最后是将第一步酯化形成的甲酯再水解，将羧基还原出来得O，O-二甲基-O-(4-丙酸基苯基)磷酸酯；合成步骤为：

(1)酯化

在50mL烧瓶中加入对羟基苯丙酸3.5g和甲醇14mL，对羟基苯丙酸与甲醇的质量/体积比为1∶4，加1mL浓硫酸，120℃加热回流2h，之后先蒸出5mL的甲醇，加入碳酸钠饱和溶液直到无气体产生；然后用二氯甲烷萃取，萃取液经35℃旋转蒸发除去溶剂，再真空干燥得红棕色油状物对羟基苯丙酸甲酯，纯度达99％以上；

(2)酰化

在50mL的圆底烧瓶中加入10～15mL乙腈作溶剂，加入第一步产物对羟基苯丙酸甲酯和二甲氧基磷酰氯，两者为等摩尔配比，对羟基苯丙酸甲酯10mmol、二甲氧基磷酰氯10mmol、2.5g碳酸钾，常温下磁力搅拌2h，反应过程中不断用薄层层析监测反应进度，直到酰氯完全反应；然后静置一段时间，上层液体再经0.5μm的滤膜过滤得澄清液体，旋转蒸发将溶剂除去后得黄色油状物，再经硅胶柱色谱分离得到目标产物二甲氧基磷酸酯，纯度大于90％；

(3)水解

在20mL的乙醇溶液中加入1mmol纯化后的第二步产物二甲氧基磷酸酯，然后加入7mL 1M的氢氧化钾，室温下搅拌45min，然后用1M的盐酸酸化，再用乙酸乙酯来萃取，萃取液经旋转蒸发除去溶剂得浅黄色油状物，再经硅胶柱色谱分离，得到最终目标产物O，O-二甲基-O-(4-丙酸基苯基)磷酸酯，纯度大于97％。

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