JPH0311071A - 螢光原化合物およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、加水分解酵素の検出用の螢光厚化合物および
その螢光厚化合物の使用に関する。

加水分解酵素、いわゆるヒドロラーゼは、動物生体内に
おいて多数の反応に関与している。

本明細書においては、様々な機能をもつヒドロラーゼを
それらの特異性によって区別している。

たとえば、 一二ステラーゼ：たとえばアセチルコリンエステラーゼ
；カルボニルエステルを加水分解する、 −グリコシダーゼ：たとえばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
；糖と糖相互またはアルコールとの０−グリコシド結合
を加水分解する、 −ホス７アターゼ：たとえばアルカリホスファターゼ；
リン酸エステルを加水分解する、−スル７アターゼ：た
とえばイズロネートスル７アターゼ；流酸エステルを加
水分解する等である。

ヒトＣ７？−ゼは、動物生体の最も重要な酵素に属する
ものである。それらの欠損またはそれらの存在の減少も
しくは増力ａは、その生体の重篤な疾患を指示する場合
が多い。これまで知られている例にはムコ多糖症がある
。表出型によって７種類に分類することができるこの疾
患は遺伝的に決定されたヒドロラーゼの欠損に基づくも
のである。たとえばモルキネ病の場合はβ−ガラクトシ
ダーゼの、ハンター病の場合はイズロネートスルファタ
ーゼの欠損による。モルキネ病は、たとえば線維芽細胞
または白血球のβ−ガラクトシダーゼのレベルを定量す
ることによって確実に診断できる。他のグリコシダーゼ
、アミラーゼの血中または尿中レベルは膵臓疾患の診断
に使用される。加水分解酵素はさらに、診断補助用にい
わゆるマーカーとして、たとえば酵素免疫検定法に使用
される。

診断の目的での加水分解酵素の定量には、低い酵素濃度
でも正確に定量できるような高い感度と特異的な検出系
という条件が課せられてぃる。天然に存在する基質は、
加水分解生成物が試験実施前にすでにサンプル中に存在
するかまたは加水分解生成物の定量がきわめて困難であ
って、この場合の検出には不適当である。したがって、
従来技術においては、その加水分解生成物が物理的また
は化学的方法によって検出できる合成基質が用いられて
いる。一般には、検出は、加水分解反応時に放出される
螢光性物質または高い吸光性を示す着色物質の量の定量
によって行われる。色原体物質は、肉眼でも認識できる
こと、すなわち装置の補助を要しないで直接評価しやす
いので実際に有利である。一方では、装置の補助がなく
ても実施できる色原体試験の感度は必ずしも適当ではな
い。したがって、シグナルの放出が可能で、そのＩ；め
色原体試験の場合より係数で１０’も大きい試験感度を
得られる螢光測定法が高感度検出のためにしばらく用い
られてきた。標識として使用された以前の放射性同位元
素は、とくに免疫検定法では次第に螢光標識に置き換え
られている（Ｊ。

Ｐｈａｒｍ、　Ｂｉｏｍｅｄ、　Ａｎａｌ、　５（７）
、　１９８７．６４９〜５８）。

酵素増幅螢光測定技術はとくに、高い感受性を有する試
験法の開発に新しい道を開いている。

しかしながら、上述の引用文献の６５１〜６５２頁およ
びＣｌ１ｎ、　　Ｃｈｅｍ、　　２５（３）、　　１９
７５．　３５３〜３５５に記載されているように、この
有望な測定法の一般的導入には、螢光団が不十分な結果
としてのかなりの問題点がある。すなわち、たとえばフ
ルオレセイン、ローダミンまたはレゾルフィン型の螢光
染料は約２０ｎｍという異常に低いストークス・シフト
（励起光と発光の最大波長の差）を示す。ウンベリフェ
ロン型の螢光団は約７０ｎｍのストークス・シフトを有
するが、その発光波長が短＜　（４５０ｎｍ）　、その
ため約４００ｎｍまたはそれを越えるサンプル構成成分
や担体および容器材料の固有の螢光により測定結果に誤
りを生じることがある。さらに、他の螢光団には、上記
ヒドロラーゼの基質に必須のヒドロキシル基がない。

本発明はしたがって、その加水分解により５００ｎｍ付
近またはそれ以上に極大をもち特異的にまた高感度に測
定可能な螢光シグナルを生じる、加水分解酵素検出用の
螢光原化合物を提供することを目的とするものである。

この目的は、本発明によれば、螢光原化合物としての一
般式（式中、 Ｘは０またはＳであり、 Ｒは酵素によって触媒される加水分解で分離できる基で
あり、 Ｒ１はＨ，Ｃ，−Ｃ，アルキル、または１〜３例のＣＨ
，で置換されていてもよいフェニルでアリ、Ａはベンゾ
異項環系の共役を延長できる分子構造であり、とくに芳
香族または異項環芳香族基であって、１個もしくは２個
以上の多重結合または電子吸引基たとえばＣＮもしくは
ＣＦ、を介してベンゾ異項環基の２位を攻撃できる、置
換されたまたベンゼン環が融合していてもよい５および
６員環系である）の化合物によって達成される。

式■において好ましい化合物は、Ａが１〜３個の電子吸
引基たとえば−ＣＮ、−ＣＦ３、チアゾールもしくはベ
ンゾチアゾールによって置換されていてもよいフェニル
またはナフチル基であるか、または１〜３個の電子吸引
基たとえば一〇Ｎもしくは−ＣＦ、によって置換されて
いてもよいチアゾール、オキサゾール、ベンゾチアゾー
ルもしくはベンゾオキサゾール基の化合物である。

とくに好ましい化合物は、Ａがフェニル、または３個ま
での−ＣＨ，、−ＣＦいチアゾールもしくはベンゾチア
ゾール基で置換されているフェニルの化合物である。

好ましい化合物としては、さらに、Ｒがカルボン酸基、
糖基、リン酸基または硫酸基の化合物を挙げることがで
きる。この場合さらに好ましい化合物は、カルボン酸が
Ｃ３〜Ｃ１゜とくに好ましくはＣ，−Ｃ，の脂肪族カル
ボン酸、アミノ酸とくに好ましくはアラニンもしくはそ
の誘導体、または芳香族カルボン酸の化合物である。

糖がα−もしくはβ−グルコースまたはａ−もしくはβ
−ガラクトースである化合物はさらにとくに好ましい。

式■においてＲ１が水素である化合物も好ましい。

本発明の螢光厚化合物は驚くべきことに、その選ばれた
基Ｒに応じて、様々な特異性を有する加水分解酵素と反
応することが見出された。

この化合物の励起光および発光極大は関連の遊離螢光図
の場合に比べて６０〜９０ｎｍ短波長側に移動する。特
定の励起光と発光極大の間のストークス・シフトは１５
０ｎｍまでに達する。本発明の化合物は螢光染料と特定
の酵素的に分解可能な基から文献の記載と類似の操作で
（Ｏｒｇ　、　Ｒｅａｃ−ｔｉｏｎｓ、　６．１９５１
．第８章むよびＨｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃＣｏｍｐｏｕ
ｎｄｓ　、　　第５巻、　１９５７．第６章）、それ自
体公知の方法により製造される。すなわち、ホスファタ
ーゼおよびスル７アターゼの検出用の螢光原物質は、螢
光団を適当な酸／・ライド（たとえばオキシ塩化リンま
たはクロロスルホン酸）とそれ自体公知の方法で反応さ
せることにより製造される。カルボン酸エステルは相当
する方法でカルボン酸クロリドから製造できる。

グリコシドの製造に際しては、螢光染料を同様にそれ自
体公知の方法でグリコジル化する。

β−ガラクトシドの製造は、たとえば相当する螢光染料
をα−Ｄ−アセトブロモガラクトースと反応させ、つい
で脱アシル化することによって行うことができる。グリ
コジル化過程につイテは、たとえば、Ａｎｇｅｗ、　Ｃ
ｈｅｍｉｅ、　９８．１９８６゜２１３〜２３６および
それに引用された文献に記載されている。この方法で得
られるグリコシドの例には、を二とえば、α−およびβ
−Ｄ−ガラクトピラノシド、ａ−およびβ−Ｄ−グルコ
ピラノシド、ならびにそれらから誘導され２〜ｌＯ個好
ましくは３〜７個の単糖単位を有するオリゴ糖誘導体が
ある。

本発明の螢光厚化合物は、様々な加水分解酵素たとえば
カルボキシルエステラーゼ、ホスファターゼ、スル７ア
ターゼおよびグリコシダーゼの検出に使用される。酵素
の検出には、螢光原基質は、必要な緩衝物質、安定剤、
活性化剤、可溶化剤、補助酵素まｌ；は他の補助化学剤
との試薬混合物として利用できる。これらの補助剤は、
とくに反応条件、たとえば定量すべき酵素の性質、なら
びに基質によって特定的に選択される。使用される特定
の補助剤は熟練者によく知られているとおりである。多
種の各化学剤は十分な安定性と化学的適合性があれば溶
液中に一緒に含有させてもよいが、それらは検出反応の
直前に互いに混合してもよい。試薬混合物を検出すべき
加水分解酵素または試験すべき生物学的サンプルと混合
したのち、相当する免疫原基質から酵素触媒加水分解に
よって放出された螢光染料の螢光の測定により、加水分
解活性酵素の実際の検出が行われる。

溶液中での反応は、所望によりセル内で直接実施するこ
とができ、ついで螢光測光法でのシグナル定量によって
直接評価できるので、この場合とくに好ましい。本発明
の螢光原基質をマトリック様たとえば繊維もしくはフィ
ルム様の試薬担体に適用すれば、反応実施後に螢光測光
法でのシグナル定量が可能で、この方法も同様に好まし
い。

本発明の化合物を、検出すべきヒドロラーゼが特異的結
合対の一方のパートナ−たとえば抗体、核酸、ホルモン
等に共有結合している酵素免疫検定法の基質として使用
することも同様に好ましい。この場合、接合体は遊離型
でも固相への結合型でもよい。固相の例はたとえば粒子
相であり、とくにラテックス粒子または磁化できる粒子
が好ましい。

本発明の螢光厚化合物は様々な形態として提供できる。

この場合、本発明の螢光原基質を試験に必要な補助的試
薬とすでに組合せて含有させた態様が好ましい。これら
の例としては、検出反応を溶液中で実施する場合には、
溶液、試薬錠剤、粉末混合物または凍結乾燥物がある。

また、螢光原基質は、試験に必要な補足的試薬とともに
、吸収性担体に吸収させるか、または親水性および吸湿
性のフィルムに導入させることもできる。

本発明を以下の実施例によって例示する。

実施例 実施例　１ ２−フェニル−６−ヒドロキシベンズオキサゾールの製
造 ４−アミルゾルシノール塩酸塩０．００５モルを加熱し
ながらベンゾイルクロリド７．５ｍＱに溶解し、ついで
この溶液を還流下に７時間煮沸した。次に過剰のベンゾ
イルクロリドを真空下に留去し、残留物にエタノール’
ｈＯｍＱを加え、混合物を短時間煮沸させ、冷却後１０
　Ｍ　　Ｎ　ａ　ＯＨでアルカリ性にした。このアルカ
リ性溶液を水２０ＯｍＱ中に混合し、濃塩酸でｐｕメー
ターを用いてｐＨを３にした。沈殿した結晶塊を吸引濾
過し、トルエン１５ｍ（２から再結晶した。乾燥した生
成物（２５０ｒＲｇ）は薄層クロマトグラフィー（シリ
カゲルプレート、酢酸エチル／氷酢酸　２４：ｌ）によ
り均一であった。

融点−２１４°Ｃ（分解） 螢光データ： 励起光（ｎｍ）　　　発光（ｎｍ） 酸　　性　　　　　　３０８　　　　　　　　　４８０
塩基性　　　３７０　　　　　４８０ 実施例　２ ２−（４’−トリフルオロメチルフェニル）−６−ヒド
ロキンベンズオキサゾールの製造４−トリ７ルオロメチ
ルベンゾイルクロリド１、５ｍＱ　（　１０ｍｍｏｆｆ
）を油浴中１　９　０　’Ｏに加熱し、４ーアミルゾル
シノールＬ．６ｇ　（　１０ｍｍｏｆ２）を少量ずつ加
えた。１時間後に、反応混合物をｌｏ％濃度の炭酸ナト
リウム溶液１００ｍＱ中に加え、加熱した。この操作の
間に未反応酸クロリドは加水分解された。ついで生成物
を酢酸エチルで抽出し、カラムクロマトグラフィー（シ
リカゲル６０、酢酸エチルまたはクロロホルム／氷酢酸
　９：１）で精製した。

螢光デー、夕： 励起光（ｎｍ）　　　発光（ｎｍ） 塩基性　　　３８０　　　　　　５２０同様の経路で以
下の生成物が得られた。

２−（４’−シアノフェニル）−６−ヒドロキシベンズ
オキサゾール（　ＣＰＨＢ） 塩基性　　　３９０　　　　　　５４０２−（４’−ピ
リジル）−６−ヒドロキシベンズオキサゾール 塩基性　　　３　７　０　　　　　　５　２　［１実施
例　３ ２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾールの製造 この製造はＢｕｌｌ　　Ｃｈｅｍ．　　Ｓｏｃ．　　Ｊ
ｐｎ．　　３６，　　３３２（　１９６３）に言及され
ている。

市販されている２−シアノー６−メトキシベンゾチアゾ
ールに出発し、所望の生成物は酸加水分解によって得ら
れた（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ−１ｏｇ７
．　１３巻（１９８６）、　２０〜２１頁）。

収量（メトキシ化合物５００ｍｇを使用）：薄層クロマ
トグラフィーで純粋な生成物１３０ｍｇ、移動相：クロ
ロホルム／酢酸エチル２０１５融点：２０８°Ｃ（分解
） 螢光データ： 励起光（ｎｍ）　　　発光（ｎｍ） 塩基性　　　３８０　　　　　５００ 実施例　４ グリコジル化反応 Ａ）２−（４’−シアノフェニル）−６−ヒドロキシベ
ンズオキサゾール（ＣＰＨＢ）のグリコジル化 ＣＰＨＢ　０．０１＋ｏｆ２．アセトブロモガラクトー
ス０、ＯｌｍｏＱ％Ａｇ、ｏ　　５　ｍｍｏＱおよび硫
酸カルシウム（ｌ八木和物）　Ｏ，ＯｌｍｏＱを、乾燥
装置中、乾燥トルエン１００ｍｆ２にとり還流下に加熱
した（反応促進剤として混合物にキノリンを加えてもよ
い）。

反応は光および水を避けて（還流冷却器上に塩化カルシ
ウム乾燥管を付す）、撹拌下に実施した。

２時間反応させたのち、反応を薄層クロマトグラフィー
でチエツクした。生成したＣＰＨＢアセトガラクトシド
は暗青色の螢光スポットとして認められた。

移動相：クロロホルム／酢酸エチル　４／１またはクロ
ロホルム／アセトン　４／１反応が不完全であった場合
はさらにアセトブロモガラクトースおよびＡｇ、Ｏを追
加して、反応混合物を再び還流下に加熱した。

反応が終結しｔ；ならば、反応溶液を濾過し、炉液をト
ルエンで洗浄し、トルエン洗液と母液を合して、エバポ
レーターを用い最高浴温４０℃、約７Ｑｍｂａｒで蒸発
させた。

残留物を、真空乾燥キャビネット中、室温、２００ｍｂ
ａｒで乾燥した。不純な生成物をカラムクロマトグラフ
ィーで精製した。

分離剤ニジリカゲル６０または５ｅｐｈａｄｅｘ　ＲＰ
８移動相：クロロホルム／酢酸エチル　４：ｌ精製され
たＣＰＨＢテトラアセチルガラクトシドを乾燥し、その
純度を薄層クロマトグラフィーでチエツクした。

Ｂ）生成したアセチルグリコシドの脱アセチル化 脱アセチル化は無水メタノール中ナトリウムメチラート
を用いて実施した。このためには、アセチルグリコシド
（２１１１９／　ｄＱ）をメタノールに溶解し、少量の
ナトリウムメチラートを加えた（３０％濃度のメタノー
ル溶液５〜１０μａ）。脱アセチル化の経過は薄層クロ
マトグラフィーによってモニタリングいこ。

移動相：クロロホルム／酢酸エチル　４：１およびクロ
ロホルム／メタノール　３：１反応が終結したならば、
溶液をイオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ　５０Ｘ　８で中性な
いし弱酸性とした。純度は薄層クロマトグラフィーでチ
エツクした。

移動相：メタノール／クロロホルムｌ：３ついで溶液を
濃縮し、残留物を乾燥した。

Ｃ）　　ＣＰＨＢのグリコジル化 Ｂｒ１ｇ１の無水物０．Ｏｌｍｏ（ｌとＣＰＨＢ　Ｏ，
ＯｌｍｏＱをトルエンｔｏ（１＋Ｑ中、撹拌しながら湿
気を避けて還流下に加熱した。反応時間＝２４〜４８時
間。

反応は薄層クロマトグラフィーによってチエツクした。

移動相：クロロホルム／酢酸エチル４：１ 脱アシル化はＢに記載のようにして実施した。

弱い暗青色の螢光を示すβ−グルコシドが得られた。

実施例　５ 酢酸エステルの製造 実施例２からのベンズオキサゾール誘導体５０■をＴＨ
Ｆ　ＬＯｍＱに溶解し、無水酢酸１ｍ＋２およびピリジ
ン１００μＱを加えた。１時間反応させたのち、反応混
合物を調製用薄層クロマトグラフィー板上で分離した。

移動相：クロロホルム／氷酢酸　９：１分離により、白
っぽい螢光をもつ未反応出発物質に加えて、暗青色の螢
光をもつ酢酸エステルが認められｔ；。相当するシリカ
ゲルの領域を溶出すると酢酸エステルが得られた。

実施例　６ リン酸エステルの製造 ２−フェニル−６−ヒドロキシベンズオキサゾールＯ，
Ｏ１ｍｏＩ２をジアザビシクロウンデセン２ｍＱととも
にメチレンクロリド２０ｍＱに溶解し、この溶液を一４
°Ｃに冷却した。この溶液を、ピリジン２０ｍＱとオキ
シ塩化リン５ＴＲＱの混合物中に４°Ｃで、ピペットに
より徐々に加え、混合物をときどき撹拌しながら一４°
Ｃに２時間放置した。反応混合物を次に５０％濃度の炭
酸水素ナトリウム溶液５００ｍｆｆ中に加え、混合物を
１時間激しく撹拌し、ついで酢酸エチルで数回抽出して
未反応出発物質を除去した。水溶液をｐＨ３にして濃縮
乾固し、所望のリン酸エステルはメタノールを用いて塩
混合物から抽出した。さらにクロマトグラフィーによっ
て精製した（調製用薄層クロマトグラフィー、移動相：
酢酸エチル／水／メタノール１００　：　２５　：　３
０）。

実施例　７ Ｎ−トルエンスルホニルアラニンエステルの製造 トシルアラニン０．Ｏ１ｍｏｆ２．　　ヒドロキシベン
ゾチアゾール１．１ｍｏｆ２およびジシクロへキシルカ
ルボジイミド（ＤＣＣＩ）　１．１ｍｏｆ２をＴＨＦ　
２　ｍＱ中に順次溶解し、この溶液を室温で３０分間撹
拌した。次にＣＰＨＢ　（実施例２　）　０．１ｍｏｆ
２をＴＨＦ　ｌ　ｍＱに溶解し、上記溶液を加え、混合
物を２時間撹拌した。続いてさらに２ｍｍｏＱのＤＣＣ
Ｉを計量して加え、反応混合物を一夜放置した。

単離： 生成したジシクロへキシル原素を遠心分離して除き、澄
明なテトラヒドロフラン溶液を氷水中に注いだ。このよ
うにして生成した水相を酢酸エチル５０ｍＱで３回抽出
し、抽出液を合せて硫酸ナトリウム上で乾燥したのち、
真空中で濃縮しｔこ。

精製： 粗生成物を、調製用薄層クロマトグラフィ板（Ｅ、　Ｍ
ｅｒｃｋ）を用いて精製した。移動相：酢酸エチル 実施例　８ 白血球エステラーゼの検出 実施例７に従って調製用薄層クロマトグラフィー板から
得られた本発明の所望の生成物のメタノール抽出液を、
予めＱ、１ｍｏＱのボウ酸−ｈｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７，
５に浸漬した濾紙に適用し、濾紙を乾燥した。この試験
紙上にサンプルを滴下すると、濃度的１０ＯＬ／μＱの
尿中白血球は、１５秒以内に黄色の螢光を生じることに
よって検出された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）　式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼　　　　（ I ） （式中、 ＸはＯまたはＳであり、 Ｒは酵素によって触媒される加水分解で分 離できる基であり、 Ｒ＿１はＨ、Ｃ＿１〜Ｃ＿４アルキル、または１〜３個
   の−ＣＨ＿３で置換されていてもよいフェニルであり、 　Ａはベンゾ異項環系の共役を延長できる分子構造であ
   り、とくに芳香族または異項環芳香族基であって、１個
   もしくは２個以上の多重結合、または電子吸引基たとえ
   ばＣＮもしくはＣＦ，を介してベンゾ異項環基の２位を
   攻撃できる、置換されたまたベンゼン環が縮合していて
   もよい５および６員環系である）で示される螢光原化合
   物。 ２）　Ｘが酸素である請求項１記載の螢光原化合物。 ３）　Ａが１〜３個の電子吸引基たとえば−ＣＮ、−Ｃ
   Ｆ＿３、チアゾールもしくはベンゾチアゾールで置換さ
   れていてもよいフェニルまたはナフチル基であるか、ま
   たは１〜３個の電子吸引基たとえば−ＣＮもしくは−Ｃ
   Ｆ＿３で置換されていてもよいチアゾール、オキサゾー
   ル、ベンゾチアゾールもしくはベンズオキサゾール基で
   ある請求項１記載の螢光原化合物。 ４）　Ａがフェニル、または３個までの−ＣＮ、−ＣＦ
   ＿３、チアゾールもしくはベンゾチアゾール基で置換さ
   れたフェニルである請求項１記載の螢光原化合物。 ５）Ｒがカルボン酸基、糖基、リン酸基または硫酸基で
   ある請求項１記載の螢光原化合物。 ６）ＲがＣ＿１〜Ｃ＿１＿０好ましくはＣ＿１〜Ｃ＿３
   脂肪族カルボン酸、アミノ酸好ましくはアラニンもしく
   はアラニン誘導体、芳香族カルボン酸、α−もしくはβ
   −グルコース、またはα−もしくはβ−ガラクトースで
   ある請求項５記載の螢光原化合物。 ７）Ｒ＿１は水素である請求項１記載の螢光原化合物。 ８）ヒドロラーゼの定量的および／または定性的検出試
   験における請求項１記載の螢光原化合物の使用。 ９）ヒドロラーゼは生物学的活性物質、たとえば抗体、
   核酸またはホルモンに結合している請求項８記載の使用
   。 １０）ヒドロラーゼは粒子相たとえばラテックスまたは
   磁化できる粒子に結合している請求項８記載の使用。 １１）請求項１記載の螢光原化合物１種または２種以上
   に加えて熟練者によく知られている補助剤たとえば緩衝
   物質、安定剤、活性化剤、可溶化剤、補助酵素および他
   の補助化学剤を含有する、遊離型または結合型加水分解
   酵素の検出用試薬混合物。 １２）螢光原化合物を試験に必要な補助的試薬とともに
   適宜、溶液、試薬錠剤、粉末混合物または凍結乾燥物と
   した請求項１１記載の試薬混合物。 １３）螢光原化合物を試験に必要な補助的試薬と組合せ
   て適宣、吸収担体に吸収させるかまたは親水性フィルム
   に導入させた請求項１１記載の試薬混合物。