CN115340986A - 一株分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于免疫检测领域。本发明的分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45121。本发明的甲拌磷半抗原通过多次筛选和实验获得，再由该半抗原制备甲拌磷完全抗原，并以该完全抗原免疫动物获得杂交瘤细胞株，由该细胞株分泌的甲拌磷单克隆抗体对甲拌磷具有优异的亲和力和灵敏度，对甲拌磷的IC50达到4.56ng/mL，可用于制备甲拌磷的免疫检测产品，为甲拌磷的残留检测提供高效的检测方法及手段。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，尤其涉及一株分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
甲拌磷[phorate，O,O-二乙基-S-(乙硫基甲基)二硫化磷酸酯]是一种典型的广谱内吸性有机磷农药，因具有高效、低价等优势，被广泛应用于农业生产。甲拌磷是有机磷类重要的内吸性杀虫杀螨剂，属于高毒类农药，主要用于防治棉花、甜菜、小麦、高粱和油菜上的害虫，人体过量摄入会抑制胆碱酯酶活性，造成神经生理功能紊乱，危害人类身体健康。农业农村部已明确规定，禁止甲拌磷用于蔬菜、果树、茶叶及中药材生产。在甲拌磷施用过程中，未经植物吸收利用的部分会渗透进入土壤中，并长期残留。研究表明，甲拌磷在国内土壤中平均检出率高达13.72％，浓度范围为0～0.450mg·kg－1。土壤中残留的甲拌磷还会代谢产生甲拌磷砜等代谢物，该甲拌磷代谢物可以形成更高毒性的氧化物，其毒性更强、残留更久(残效期约1-2个月，甚至更长)。土壤中残留的甲拌磷、甲拌磷砜还会随水转移至地表水、河流和湖泊中，形成二次污染，对生命安全造成威胁。因此，对甲拌磷残留提供一种快速有效的检测方法具有重大意义。
有关甲拌磷药物残留在动物组织中的检测方法，国内外已有少量报道，主要是用荧光光度法、气相色谱法、气相色谱-串联质谱法、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法超高效液相色谱-高分辨质谱法等，检测样品主要为果蔬、茶叶、地表水和饮用水。仪器检测方法可进行定量分析并具有较低的检测限，但是通常需要昂贵的仪器和复杂的操作，前处理及检测时间长，严重制约了这些检测方法的推广。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员相对要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。Jeffre等利用O,O-二乙基-O-[对-(4-羧基丁基)苯基]硫代磷酸酯作为半抗原制得广谱特异性抗体，采用酶联免疫方法对有机磷类杀虫剂进行检测。刘贤进等采用二乙基膦酸乙酸做为通用结构半抗原制备抗血清，对毒死蜱、辛硫磷等12种常见有机磷农药具有特异性，IC50为0.12-3.8μg/mL。魏松红等(甲拌磷残留检测间接竞争ELISA试剂盒的研制[J].食品科学,2011,32(4):284-287.)研制了一种用于检测甲拌磷残留量的间接竞争ELISA试剂盒，在1-5000μg/L范围内呈线性关系，检测限为4.90μg/L，IC50为191.37μg/L。王翀等(甲拌磷半抗原及其衍生物合成的研究[C].//第十届全国农药学科教学科研研讨会论文集.2008:238-242.)以五硫化二磷与无水乙醇为原料，首先制得硫化物中间体，再添加甲醛和2-巯基乙醇进行反应，得到甲拌磷半抗原，并以该半抗原为基础合成了多克隆抗体(甲拌磷人工抗原的合成及多克隆抗体制备)，检测限为6.383μg/L。谢桂勉等(硫代磷酸二乙酯类农药半抗原设计及抗体识别特性[J].高等学校化学学报,2009,30(11):2193-2198.DOI:10.3321/j.issn:0251-0790.2009.11.019.)以二乙氧基硫代磷酰氯及苯酚衍生物为原料制备半抗原，通过该半抗原得到的抗体构建的间接竞争ELISA方法，对于甲拌磷的IC50达到0.751mg/L。专利CN200810041929.3提供了一种可检测多种有机磷农药残留的抗体制备方法，对甲拌磷的IC50达到0.033mg/L。专利CN201810229495.3提供了一种基于纳米抗体检测二乙氧基有机磷农药的酶联免疫试剂盒及其使用方法，以
为半抗原制备抗体，将筛选出的最优抗体进一步制备成酶联免疫试剂盒，对甲拌磷的IC50达到3422.26mg/L；专利CN201611236387.6同样以上式所示化合物为半抗原制备抗体，筛选得到的抗体检测甲拌磷时，IC50达到135.7ng/L。酶联免疫法(ELISA)是一种高效、敏感、快速的检测方法，也越来越多地应用于残留物检测中，但灵敏度还需进一步提高。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了对甲拌磷具有较高亲和力和检测灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株，可以用来建立甲拌磷的酶联免疫检测方法，为间接竞争ELISA试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定了基础。
本发明的第一个目的是提供一株分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株于2022年03月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.45121。
本发明的第二个目的是提供一种分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：
S1、将甲拌磷半抗原制备成完全抗原，采用所述完全抗原进行动物免疫；
S2、对免疫动物进行采血，对免疫动物的血清免疫效价和免疫抑制能力进行筛选；
S3、将步骤S2筛选出的免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合培养，得到所述分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
其中，所述甲拌磷半抗原的结构如下所示：
进一步地，在步骤S1中，所述动物免疫过程包括首次免疫、加强免疫和冲刺免疫，首次免疫采用完全抗原和完全弗氏佐剂，加强免疫采用完全抗原和不完全弗氏佐剂，冲刺免疫采用完全抗原。
进一步地，所述动物为小鼠。
进一步地，上述甲拌磷半抗原的制备方法包括以下步骤：
S1、将式1所示化合物与乙基黄原酸盐进行反应，得到式2所示化合物；
S2、将式2所示化合物与2N KOH进行反应，酸化后得到式3所示化合物；
S3、将式3所示化合物进行酯化，得到式4所示化合物；
S4、将式4所示化合物与卤化氢进行反应，得到式5所示化合物；
S5、将式5所示化合物与O，O-二甲基硫代硫代磷酸盐进行反应，得到式6所示化合物，将式6所示化合物酸化，得到所述甲拌磷半抗原；
其中，式1-6所示化合物的结构如下，式中X代表卤素：
进一步地，在步骤S1中，所述甲拌磷完全抗原由上述甲拌磷半抗原与载体蛋白偶联得到。
进一步地，所述载体蛋白包括牛血清蛋白BSA、卵清蛋白OVA等。
进一步地，上述甲拌磷完全抗原通过碳二亚胺法将甲拌磷半抗原与载体蛋白偶联，具体制备方法包括以下步骤：
(1)将上述甲拌磷半抗原活化，得到活化液；
(2)将上述步骤(1)得到的活化液加入载体蛋白溶液中，反应得到甲拌磷完全抗原。
进一步地，在步骤(1)中，所述的活化为，将甲拌磷半抗原溶解，加入1-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺进行反应。
进一步地，采用N,N-二甲基甲酰胺溶解甲拌磷半抗原。
进一步地，在步骤(2)中，对反应后的溶液进行透析、分离，得到甲拌磷完全抗原。
进一步地，在步骤(2)中，所述载体蛋白溶液是通过将载体蛋白溶解于碳酸盐缓冲溶液中得到。
进一步地，所述碳酸盐缓冲溶液为0.01-0.5mol/L(优选为0.05mol/L)，pH为8.0-10.0(优选为9.6)。
进一步地，甲拌磷免疫原的制备方法包括以下步骤：取上述甲拌磷半抗原，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS，使用N,N-二甲基甲酰胺DMF溶解，室温搅拌，活化；另取牛血清蛋白BSA溶解于碳酸盐缓冲溶液CB中；将上述活化液加入BSA溶液中，室温搅拌反应过夜后，得到所述甲拌磷免疫原。
进一步地，甲拌磷包被原的制备方法包括以下步骤：取上述甲拌磷半抗原，再加入EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，使用DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶解，室温搅拌，活化；另取OVA(鸡卵白蛋白)溶解于碳酸盐缓冲溶液中；将上述活化液逐滴加入OVA溶液中，室温搅拌反应过夜后，得到所述甲拌磷包被原。
进一步地，在步骤S2中，通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测血清免疫效价和免疫抑制能力，实现免疫动物的筛选。
具体地，本发明提供的分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法如下：
(1)半抗原的合成：通过在甲拌磷原化学结构的基础上衍生出苯环和羧基，以便于连接载体蛋白。
(2)免疫原的制备与鉴定：以甲拌磷衍生物为原料，通过活化酯法与蛋白载体的氨基相连，反应结束后，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，完全抗原通过紫外吸收扫描方法鉴定；
(3)小鼠的免疫：选取6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。将免疫原与福氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫小鼠，首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；
(4)细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇(PEG 4000)法，使小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株；
(5)杂交瘤细胞株性质的鉴定：采用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定；IC50值、交叉反应率和亲和力的测定通过ELISA法。
传统使用的半抗原结构(如专利CN201810229495.3中使用的半抗原)没有完整地保留甲拌磷的空间结构，且苯环和有机磷基团距离过近，羧基偶联载体蛋白后，载体蛋白与抗原决定簇之间没有合适长度的连接臂。而本发明中设计的半抗原完整地保留了甲拌磷的全部特征结构和化学元素，且该半抗原结构的羧基与甲拌磷的特征有机磷基团之间有合适长度的连接臂，并且有足够的刚性，从而更容易使得抗原决定簇暴露，进而产生高灵敏度和高特异性的抗体。
本发明的第三个目的是提供上述分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株在制备甲拌磷单克隆抗体中的应用。
本发明的第四个目的是提供上述分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株在甲拌磷检测中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种甲拌磷单克隆抗体，所述甲拌磷单克隆抗体是通过上述杂交瘤细胞株分泌得到。
本发明的第六个目的是提供上述甲拌磷单克隆抗体在甲拌磷检测中的应用。
本发明的第七个目的是提供一种甲拌磷检测产品，所述甲拌磷检测产品包括上述甲拌磷单克隆抗体或上述分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株。当然，检测产品可制备成试剂盒、试剂、试纸条等任何形式。
进一步地，上述甲拌磷检测产品可用于食品安全检测中甲拌磷的残留分析检测。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明提供了一种新的合成甲拌磷半抗原和免疫原的方法，合成步骤更加简化，有效，为今后人们的研究提供了合成免疫原的思路与方法；以其为基础制备的完全抗原、由完全抗原免疫动物得到的杂交瘤细胞株以及其分泌的单克隆抗体对甲拌磷具有较好的特异性以及检测灵敏度和亲和力(甲拌磷单克隆抗体对甲拌磷的IC50为4.56ng/mL)，可实现对甲拌磷残留量的检测，为食品中甲拌磷残留的免疫检测提供了免疫检测方法和原料，具有实际应用价值。
生物材料保藏
单克隆细胞株，所述单克隆细胞株已于2022年03月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45121，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是甲拌磷半抗原合成路线图；
图2是实施例制备的甲拌磷单克隆抗体的标准抑制曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明通过在甲拌磷原化学结构的基础上衍生出苯环和羧基，得到半抗原，用碳二亚胺法将半抗原与载体蛋白偶联，用紫外分光光度计鉴定偶联是否成功。首次免疫时以注射免疫100μg/只小鼠的量将甲拌磷的完全抗原与等量完全弗氏佐剂混合乳化，通过颈背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂；最后一次用甲拌磷完全抗原(完全抗原用生理盐水稀释，不含佐剂)进行冲刺免疫，对小鼠进行腹腔注射。选择高效价，低IC50小鼠的脾细胞，通过PEG 4000的方法与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用选择培养基筛选出三种细胞融合后的杂交细胞；再经过间接竞争酶联免疫法筛选细胞并四次亚克隆，最终得到一株单克隆抗体杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对甲拌磷具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为4.56ng/mL)，可实现对作为有机磷农药的甲拌磷残留量的检测，为甲拌磷残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。本发明还成功合成了甲拌磷人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原。
实施例1甲拌磷单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备
1、甲拌磷半抗原的合成，其合成路线如下：
(1)将无水K2CO3(17.06g,123.41mmol)和乙基黄原酸钾(19.78g,123.41mmol)加入到化合物1(10g,41.14mmol)在无水CH3CN(200mL)中的溶液中，并将所得混合物在室温反应20小时。然后将反应用水(100mL)淬灭并用AcOEt(3×100mL)萃取。将合并的有机相用盐水(100mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并减压蒸发以获得粗产物，将其通过SiO2凝胶上的柱色谱纯化，用AcOEt/正己烷(1:20)混合物洗脱)得到化合物2，为油状中间体。
(2)将2N KOH溶液(50mL)加入到化合物2(8.5g，29.89mmol)在80mL EtOH:H2O混合物(1:1)中的溶液中，并将反应在室温下搅拌7小时。反应结束后，减压蒸发EtOH，所得水用5％(w/w)柠檬酸酸化，得到悬浮固体，将其滤出，得到粗化合物3。
(3)向化合物3(4.5g，26.75mmol)的甲醇(50mL)溶液中加入催化H2SO4(1-2滴)并回流5-6小时。TLC显示不存在起始材料并形成产物；真空蒸馏除去甲醇，残余物用乙酸乙酯稀释。有机层用水(2x 25mL)洗涤，然后用10％aq.碳酸氢钠溶液。有机层用Na2SO4干燥并真空浓缩，得到化合物4，为灰白色固体。
(4)将溴化氢气体通入在乙酸乙酯(100ml)中的化合物4(4.3g，23.60mmol)中40分钟，该乙酸乙酯(100ml)已经在干冰/丙酮浴中冷却，直到内部温度在多聚甲醛(1.63g，54.34mmol)之前稳定使用固体加料漏斗缓慢加入。将反应冷搅拌3小时，在此期间继续进行溴化氢鼓泡，然后随着反应温和地温热至环境温度并搅拌过夜而停止。将反应倒入冰水(200ml)中。除去水相，有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到化合物5，为黄色油状物。
(5)将化合物5(8.0g，15.17mmol)、O，O-二甲基硫代硫代磷酸钾(5.96g，30.34mmol)和丙酮(100ml)装入配备有搅拌器、温度计和回流冷凝器的玻璃反应烧瓶中。将反应混合物在搅拌下加热回流约16小时。然后将反应混合物冷却、过滤并汽提丙酮，得到残余物。残余物用氯仿萃取，氯仿溶液用水洗涤并用硫酸钠干燥。将滤液浓缩并通过SiO2凝胶上的柱色谱法纯化，得到化合物6，为黄色凝胶。
(6)向1.5g(3.94mmol)化合物6、20mL水和20mL EtOH的悬浮液中滴加4mL(4.0mmol)1N氢氧化钠水溶液，同时在室温和氮气下搅拌。将混合物回流1小时，然后冷却至室温并除去溶剂直至开始结晶。浓缩物用50mL乙酸乙酯萃取，水层通过加入1N盐酸水溶液(HCl)酸化。用无水硫酸钠干燥并减压浓缩。使用制备型HPLC纯化，得到灰白色固体，即为甲拌磷半抗原。
2、完全抗原的合成：
甲拌磷免疫原的制备方法：取4.6mg上述甲拌磷半抗原，再加入5.0mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和3.7mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，使用DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶解，室温搅拌，活化6h；另取15mg BSA(牛血清蛋白)溶解于3mL、0.05M、pH9.6的CB(碳酸盐缓冲溶液)溶液中；将上述活化液逐滴加入BSA溶液中，室温搅拌反应过夜后，取出免疫原PBS透析3天，-20℃分装保存。
甲拌磷包被原的制备方法：取3.2mg上述甲拌磷半抗原，再加入5.0mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和3.7mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，使用DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶解，室温搅拌，活化6h；另取10mg OVA(鸡卵白蛋白)溶解于3mL、0.05M、pH9.6的CB(碳酸盐缓冲溶液)溶液中；将上述活化液逐滴加入OVA溶液中，室温搅拌反应过夜后，取出免疫原PBS透析3天，-20℃分装保存。
3、动物免疫：
选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取甲拌磷完全抗原(1mg/mL)与等量福氏佐剂乳化均匀后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，每只100μL。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；选择抑制最好的小鼠，在五免后18天冲刺免疫，准备融合。
4、细胞融合：
在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
(1)无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；
(2)收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
(3)将脾细胞和SP2/0细胞按照2～10:1的计数比例混合，离心后用PEG融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20％胎牛血清、2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。
5、细胞筛选与细胞株建立：
在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天用含20％胎牛血清、1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用甲拌磷为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对甲拌磷有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得杂交瘤细胞株，保藏。
6、单克隆抗体的制备与鉴定：
取8～10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。
使用小鼠单抗亚型鉴定试剂盒对腹水纯化获得的单克隆抗体进行免疫球蛋白亚型鉴定，其亚型为IgG2b型，具体如表1所示。
表1甲拌磷单克隆抗体的亚型鉴定
使用间接竞争ELISA法，测定单克隆抗体对甲拌磷的IC50为4.56ng/mL，并验证了其对甲胺磷、乙酰甲胺磷、甲拌磷砜等的IC50及交叉反应率，具体如表2所示。
表2甲拌磷单克隆抗体对甲拌磷、甲胺磷、乙酰甲胺磷、甲拌磷砜的IC50及交叉反应率
7、抗体应用：
将杂交瘤细胞株通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于甲拌磷ELISA添加回收试验，具体步骤如下：
(1)用碳酸盐缓冲液(CBS)稀释好的0.1μg/mL的甲拌磷包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
(2)用含0.2％明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
(3)用磷酸盐缓冲液(PBS)分别配置0，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2μg/L的甲拌磷标准溶液。将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL 1：16000稀释的抗甲拌磷单克隆抗体，37℃反应半小时后，洗板拍干；
(4)每孔加入100μL用含0.1％明胶的PBS 1：3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应半小时后，洗板拍干；
(5)每孔加入100μL TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2M H2SO4终止液，450nm测吸光值；
(6)添加回收及样品前处理：取新鲜的黄瓜样品5g，添加三个不同剂量的甲拌磷标准品，分别为5ng、10ng、20ng。将其置于50mL离心管中，缓慢滴入50％氢氧化钾溶液1mL，在旋涡混合器上充分振荡，缓慢滴入乙酸乙酯20mL，在旋涡混合器上振荡10min，然后放入离心器中以3000r/min离心5min。移取4mL上清液于另一支离心管中，氮气吹干，加入1mL含有10％甲醇的PBS复溶，取50μL用于检测。采用间接竞争ELISA进行添加回收试验，其回收率分别为90.2％、103.1％、99.3％。
溶液的配置：
碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4，3.62g Na2HPO4·12H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05％Tween20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1：5混合即为TMB显色液，现用现混。
综上，本发明通过将甲拌磷完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对甲拌磷有较好亲和力和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一株分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株于2022年03月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.45121。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在甲拌磷检测中的应用。
3.一种分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将甲拌磷半抗原制备成完全抗原，采用所述完全抗原进行动物免疫；
S2、对免疫动物进行采血，对免疫动物进行筛选；
S3、将筛选出的免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合培养，得到所述分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
其中，所述甲拌磷半抗原的结构如下所示：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述甲拌磷半抗原由以下步骤制备得到：
S1、将式1所示化合物与乙基黄原酸盐进行反应，得到式2所示化合物；
S2、将式2所示化合物与2N KOH进行反应，酸化后得到式3所示化合物；
S3、将式3所示化合物进行酯化，得到式4所示化合物；
S4、将式4所示化合物与卤化氢进行反应，得到式5所示化合物；
S5、将式5所示化合物与O，O-二甲基硫代硫代磷酸盐进行反应，得到式6所示化合物，将式6所示化合物酸化，得到所述甲拌磷半抗原；
其中，式1-6所示化合物的结构如下，式中X代表卤素：
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述动物为小鼠。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述甲拌磷完全抗原由所述甲拌磷半抗原与载体蛋白偶联得到。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述载体蛋白包括牛血清蛋白或卵清蛋白。
8.一种甲拌磷单克隆抗体，其特征在于：所述甲拌磷单克隆抗体是通过权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌得到。
9.权利要求8所述的甲拌磷单克隆抗体在甲拌磷检测中的应用。
10.一种甲拌磷检测产品，其特征在于：所述甲拌磷检测产品包括权利要求8所述的甲拌磷单克隆抗体或权利要求1所述的杂交瘤细胞株。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116143832A (zh) * | 2023-04-17 | 2023-05-23 | 中国中医科学院医学实验中心 | 一种甲拌磷半抗原及其合成工艺 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5677432A (en) * | 1992-02-27 | 1997-10-14 | The Horticulture And Food Research Institute Of New Zealand Limited | Immunological detection of organophosphates |
| CN101475587A (zh) * | 2009-01-09 | 2009-07-08 | 华南农业大学 | 二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药半抗原及其制备方法 |
| CN104764880A (zh) * | 2014-01-08 | 2015-07-08 | 马晓宁 | 一种甲拌磷残留的酶联免疫检测方法 |
| CN105884831A (zh) * | 2014-12-19 | 2016-08-24 | 江苏师范大学 | 一种甲拌磷农药半抗原的制备方法及其应用 |
| CN111825713A (zh) * | 2020-07-22 | 2020-10-27 | 广西大学 | 一种针对二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的半抗原、完全抗原制备方法及其应用 |
| CN113234167A (zh) * | 2021-04-30 | 2021-08-10 | 苏州诚检生物科技有限公司 | 一种甲拌磷单克隆抗体及其应用 |
| CN113637081A (zh) * | 2021-08-08 | 2021-11-12 | 江南大学 | 一株分泌抗二甲戊灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 |
-
2022
- 2022-09-22 CN CN202211157688.5A patent/CN115340986B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5677432A (en) * | 1992-02-27 | 1997-10-14 | The Horticulture And Food Research Institute Of New Zealand Limited | Immunological detection of organophosphates |
| CN101475587A (zh) * | 2009-01-09 | 2009-07-08 | 华南农业大学 | 二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药半抗原及其制备方法 |
| CN104764880A (zh) * | 2014-01-08 | 2015-07-08 | 马晓宁 | 一种甲拌磷残留的酶联免疫检测方法 |
| CN105884831A (zh) * | 2014-12-19 | 2016-08-24 | 江苏师范大学 | 一种甲拌磷农药半抗原的制备方法及其应用 |
| CN111825713A (zh) * | 2020-07-22 | 2020-10-27 | 广西大学 | 一种针对二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的半抗原、完全抗原制备方法及其应用 |
| CN113234167A (zh) * | 2021-04-30 | 2021-08-10 | 苏州诚检生物科技有限公司 | 一种甲拌磷单克隆抗体及其应用 |
| CN113637081A (zh) * | 2021-08-08 | 2021-11-12 | 江南大学 | 一株分泌抗二甲戊灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| YOO JUNG KIM等: "Synthesis of haptens for immunoassay of organophosphorus pesticides and effect of heterology in hapten spacer arm length on immunoassay sensitivity" * |
| ZHEN-LIN XU等: "Conformational changes of hapten-protein conjugates resulting in improved broad-specificity and sensitivity of an ELISA for organophosphorus pesticides" * |
| 徐振林等: "有机磷农药半抗原设计及多特异性抗体识别机制研究" * |
| 王晶等: "硫代磷酸酯类有机磷药物抗原设计及免疫分析" * |
| 谢桂勉等: "硫代磷酸二乙酯类农药半抗原设计及抗体识别特性" * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116143832A (zh) * | 2023-04-17 | 2023-05-23 | 中国中医科学院医学实验中心 | 一种甲拌磷半抗原及其合成工艺 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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