CN101475587A - 二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药半抗原及其制备方法 - Google Patents
二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药半抗原及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药半抗原及其制备方法。所述半抗原为二乙氧基硫代磷酰氯与带羧基的苯酚衍生物或氨基酸亲核取代后的产物。本发明针对一类有机磷农药的共有结构－二乙氧基硫代磷酸酯提供了一系列半抗原，所述半抗原在分子结构、立体化学和电子分布上与含二乙氧基硫代磷酸酯共有结构有机磷农药对应体相似，在二乙氧基硫代磷酰酯氧原子上分别引入了长短不同的带有羧基的苯酚衍生物手臂，便于连接载体蛋白，本发明为抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体制备和快速检测产品开发提供了技术基础。
Description
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药半抗原及其制备方法。
背景技术
农药残留问题严重危害着人民群众的身体健康。近年来，因不合理使用农药而引起的群体性中毒和农产品农残超标事件屡有发生。农药残留问题也严重影响了我国农产品的国际竞争力，农药残留标准成为贸易技术壁垒的主要内容，近年来我国的蔬菜、茶叶等农产品和食品因农药残留等问题被进口国拒绝、扣留、退货、索赔和终止合同的事件时有发生。2003年种植业农产品所受损失的金额高达41.1亿美元。
有机磷类农药由于高效，廉价而在农业和种植业上广泛使用，但是有机磷农药作为神经毒物，会引起神经功能紊乱、震颤、精神错乱、语言失常等症状。在2002年中华人民共和国公布的第199号公告上明令禁止在蔬菜、果树、茶叶、中草药材上不得使用和限制使用的农药共有19种，其中有机磷农药占了17种，而含二乙氧基硫代磷酸酯共有结构的农药就有8种。根据农业部第194号、第199号和第274号公告等规定，我国已经限制甲胺磷等19种高毒农药的使用，决定对甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、久效磷和磷胺等五种有机磷高毒农药的使用进行削减，方案为2004年1月1日起禁止在除棉花以外的农作物使用，2007年1月1日起全面禁止在农业上使用。
加强农残检测、提高分析检测水平是控制农药残留的重要手段之一。研究和完善农药残留的分析检测技术，尤其是免疫快速检测技术，对于加强农药残留的监控管理、保障人民生命安全和农产品质量安全、提高农产品在国际市场的竞争力、满足我国人民物质生活水平日益提高的要求、促进我国经济发展具有重要意义。
目前国内外的农药残留免疫检测研究，基本上都集中于单组分特异性检测及相应试剂盒的研制，但是实际生产中，食物中残留的农药种类较多，单组分试剂盒很难实现快速高通量的检测，虽然仪器多残留检测已经可以实现越来越多组分的多残留检测，但所需仪器复杂昂贵，而且样品前处理繁琐费时，操作需专业人员、检测费用高，很难适应许多场合快速检测的需要。因此，实现农药多残留快速检测，已经是国内外残留分析的一种新趋势。
目前农药多残留免疫检测国内研究成果比较少，国外仅有少量用多克隆抗体和单克隆抗体进行有机磷农药多残留免疫检测的研究报道。Sudi，Johnson，Banks，Alcocer等相继研究了有机磷农药的共有结构，设计出能够识别相似结构的“簇抗原”，利用交叉反应，制备出“簇多克隆抗体”，并研究了该抗体对几种有机磷农药的选择性和亲和力，其中有的“簇多克隆抗体”已经应用于有机磷农药多残留的检测中，但有的抗体检测限较高，亲和力不够。2002年，Mi Soon Jang报道了用其设计的两种半抗原免疫动物后制备的单克隆抗体实现了一类有机磷农药的多残留检测。该抗体对部分有机磷农药检测的IC50为0.1～0.3μg/mL，但设计的半抗原只有两种，不能通过构效关系筛选更理想的半抗原用于制备单克隆抗体。2005年，刘金贤等公开了“用于检测有机磷农药残留的免疫抗体及其应用”。该发明以二乙基膦酸乙酸为半抗原，不需要进行结构改造即可与蛋白质偶联用于免疫动物，从而制备的抗体可以检测多种有机磷农药，但可以检测的农药没有针对性，检测限差异很大。可见本领域作为半抗原设计这个关键课题还没有很好解决。
由于大多数药物、毒素、环境污染物分子质量比较小，属于仅有反应原性而无免疫原性的半抗原，因此大部分小分子需要与大分子蛋白质偶联后才能产生免疫原性。目前制备小分子半抗原抗体的常规方法是选择具有毒理学意义的原形药物作为待测物，设计合成保留待测物分子结构特征或类似结构特征并带有活性基团的半抗原，通过共价键使半抗原与大分子蛋白质载体偶联，制备人工免疫原，经动物免疫程序制备针对半抗原的特异性抗体。而半抗原的提供是免疫化学分析中最为关键的步骤，合理的半抗原设计和制备将大大提高抗体的质量。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一系列可通用于一类有机磷农药检测的半抗原，所述半抗原偶连载体蛋白后能使机体产生效价高，能识别该类有机磷农药共有结构的特异抗体。
本发明的另一个目的是提供所述半抗原的制备方法。
本发明还有一个目的是提供所述半抗原的应用。
本发明所指的一类有机磷农药共有结构是二乙氧基硫代磷酸酯。
本发明的技术方案是：
提供一类半抗原，是二乙氧基硫代磷酰氯与带羧基的苯酚衍生物或氨基酸亲核取代后的产物。
上述带羧基的苯酚衍生物或氨基酸优选具有式(AI)、式(AII)、式(AIII)、式(AIV)、式(AV)、式(AVI)、式(AVII)、式(AVIII)、式(AIX)所示结构式的物质，(AI)～(AVIII)式中n为0～9的整数，(AIX)式中n为3～7的整数：
采用上述结构式(AI)～(AIX)所示的带羧基的苯酚衍生物或氨基酸与二乙氧基硫代磷酰氯亲核取代得到的半抗原(OP)的结构式分别对应为(式(AI)对应式(BI)，依此类推)：
其中(BI)～(BVIII)式中n为0～9的整数，(BIX)式中n为3～7的整数。
本发明同时提供了所述半抗原的制备方法是将二乙氧基硫代磷酰氯和带羧基的苯酚衍生物手臂在0℃～60℃、缚酸剂存在的条件下，于有机溶剂中进行反应，生成目标半抗原(OP)。
所述带羧基的苯酚衍生物手臂可选用带羧基的苯酚衍生物、氨基酸，或者通过羟基苯甲醛和丙二酸或氨基苯酚和酸酐合成得到。
所述缚酸剂优选氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钠、金属钠、甲醇钠、乙醇钠、吡啶或三乙胺的任意一种。
所述有机溶剂优选甲醇、乙醇、四氢呋喃、二氧六环、丙酮或二氯甲烷的任意一种或两种以上任意比例的混合物。
本发明提供的半抗原偶连载体蛋白后，能使机体产生效价高，特异性好的针对含二乙氧基硫代磷酸酯共有结构有机磷农药的抗体。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明针对一类有机磷农药的共有结构—二乙氧基硫代磷酸酯提供一系列半抗原，半抗原在分子结构，立体化学和电子分布上与含二乙氧基硫代磷酸酯共有结构有机磷农药对应体相似。半抗原结构中引入苯环平面，使之与蛋白质偶联后的全抗原更易于暴露在蛋白质载体外面，因而更易于产生理想的抗体。所述半抗原的连接臂不易于诱导产生“臂抗体”，并且使用了一定长度的饱和或不饱和碳链，使机体更易于识别。本发明所述半抗原分子具有便于与蛋白载体偶联的活性基团，且活性基团的存在对待测物分子的电子分布没有影响。此半抗原偶连载体蛋白后能使机体产生效价高，特异性好的针对含二乙氧基硫代磷酸酯共有结构有机磷农药的抗体，所述抗体可以检测绝大部分含二乙氧基硫代磷酸酯共有结构有机磷农药，对17种限制使用的有机磷农药中的对硫磷、甲拌磷、特丁硫磷、治螟磷、内吸磷、硫环磷、蝇毒磷、氯唑磷有很好的检测效果，对哒嗪硫磷，三唑磷等高效低毒农药也具有较好的检测效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步详细说明本发明。
实施例1 半抗原BI(n＝0)的制备方法
0℃下，取0.884g(6.4mmol)对羟基苯甲酸，0.898g(16mmol)KOH溶解于50mL甲醇中。搅拌下逐滴加入1.81g(9.6mmol)二乙氧基硫代磷酰氯，升温至65℃，搅拌反应18h。反应结束，反应旋转蒸发浓缩，得到的粗产物，溶解于乙酸乙酯中，用50mL 2M NaOH溶液萃取，水层用6M盐酸酸化，析出沉淀，用水洗，得到产物1.05g，产率为56.4％。ESI-MS analysis(negative)m/z 289[M-H]-；1H-NMR(400MHz，CDCl3 and TMS)：δ 1.36(t，J＝7.1Hz，6H，CH3)；4.24(qd，J1＝7.1Hz，J2＝7.1Hz，J3＝7.1Hz，J4＝10.0Hz，4H，CH2)；7.26(d，J＝8.1，2H，ArH)；8.09(d，J＝8.5，2H，ArH).
实施例2 半抗原BII(n＝0)制备方法
0℃下，取0.884g(6.4mmol)间羟基苯甲酸，0.898g(16mmol)KOH溶解于50mL甲醇中。搅拌下逐滴加入1.81g(9.6mmol)二乙氧基硫代磷酰氯，升温至65℃，搅拌反应18h。反应结束，反应旋转蒸发浓缩，得到的粗产物，用乙酸乙酯溶解，溶液浓缩，氯仿：甲醇＝8：1过硅胶柱，得到黄色固体0.5g，产率为27.0％。ESI-MS analysis(negative)m/z 289[M-H]-；1H-NMR(400MHz，CDCl3and TMS)：δ1.37(t，J＝7.0Hz，6H，CH3)；4.25(qd，J1＝7.1Hz，J2＝7.1Hz，J3＝7.1Hz，J4＝9.6Hz，4H，CH2)；7.45(d，J＝4.7，2H，ArH)；7.89(s，1H，ArH)；7.94(d，J＝4.6，1H，ArH).
实施例3 半抗原BIII(n＝0)制备方法
取4.8848g(0.04moL)对羟基苯甲醛溶于吡啶中，加入催化剂量DMAP，用干燥管保护，水浴85℃，搅拌。往上述溶液滴加3.746(0.036moL)丙二酸，反应3h。反应结束，混合液倾入饱和碳酸氢钠溶液中，搅拌15min，用乙酸乙酯萃取，水层用4M盐酸调pH至3，析出白色固体2.32g，产率为78.6％。ESI-MS analysis(negative)m/z 163[M-H]-；1H-NMR(400MHz，d6-Acetone and TMS)：δ 6.33(d，J＝16.0Hz，1H，CH＝CH)；6.89(d，J＝8.6Hz，2H，ArH)；7.54(d，J＝8.6Hz，2H，ArH)；7.60(d，J＝16.0Hz，1H，CH＝CH)；8.86(s，1H，OH)；10.77(s，1H，COOH).
称取0.7(0.0125moL)KOH溶于无水甲醇中，称取0.821g(0.005moL)上述固体，0℃搅拌下溶于上述溶液中，搅拌30min。滴加1.415g(0.0075moL)二乙氧基硫代磷酰氯，0℃反应过夜。反应结束，过滤，上清液旋转蒸发浓缩，用乙酸乙酯溶解，过滤，滤液选装蒸发浓缩，加入适量饱和碳酸氢钠溶液，搅拌25min，用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩析出结晶，用石油醚洗，得到产物0.75g，产率为11.9％。ESI-MS analysis(negative)m/z315[M-H]-；1H-NMR(400MHz，CDCl3 and TMS)：δ 1.36(t，J1＝7.0Hz，J2＝7.0Hz，6H，CH3)；4.23(qd，J1＝7.1Hz，J2＝7.1Hz，J3＝7.1Hz，J4＝9.6Hz，4H，CH2)；6.37(d，J＝16.0Hz，1H，CH＝CH)；7.21(d，J＝8.4Hz，2H，ArH)；7.52(d，J＝8.5Hz，2H，ArH)；7.74(d，J＝16.0Hz，1H，CH＝CH).
实施例4 半抗原BIV(n＝0)制备方法
取9.77g(0.08moL)间羟基苯甲醛溶于吡啶中，加入催化剂量DMAP，用干燥管保护，水浴85℃，搅拌。往上述溶液滴加7.492(0.072moL)丙二酸，反应3h。反应结束，混合液倾入饱和碳酸氢钠溶液中，搅拌15min，用乙酸乙酯萃取，水层用4M盐酸调pH至3，析出白色固体11.82g，产率为75.2％。ESI-MS analysis(negative)m/z163[M-H]-；1H-NMR(400MHz，d6-Acetone and TMS)：δ 6.45(d，J＝16.0Hz，1H，CH＝CH)；6.90(dd，J1＝2.1Hz，J2＝7.8Hz，1H，ArH)；7.13(dd，J1＝4.8Hz，J2＝11.9Hz，2H，ArH)；7.25(t，J＝7.8Hz，1H，ArH)；7.60(d，J＝16.0Hz，1H，CH＝CH)；8.54(s，1H，OH)；10.77(s，1H，COOH).
称取4.48g(0.08moL)KOH溶于无水甲醇中，称取3.283g(0.02moL)上述固体，0℃搅拌下溶于上述溶液中，搅拌30min。滴加5.658g(0.03moL)二乙氧基硫代磷酰氯，0℃反应过夜。反应结束，过滤，上清液旋转蒸发浓缩，用乙酸乙酯溶解，过滤，滤液选装蒸发浓缩，加入适量饱和碳酸氢钠溶液，搅拌15min，用乙酸乙酯萃取，水层用6M盐酸调pH至3，析出沉淀，用水洗，得到产物1.25g，产率为19.8％。ESI-MS analysis(negative)m/z 315[M-H]-；1H-NMR(400MHz，CDCl3 and TMS)：δ 1.36(t，J＝7.1Hz，6H，CH3)；4.23(qd，J1＝7.1Hz，J2＝7.1Hz，J3＝7.1Hz，J4＝10.0Hz，4H，CH2)；6.43(d，J＝16.0Hz，1H，CH＝CH)；7.22-7.23(m，1H，ArH)；7.36(d，J＝5.4Hz，3H，ArH)；7.74(d，J＝16.0Hz，1H，ArH)；7.73(d，J＝16.0，1H，CH＝CH).
实施例5 半抗原BV(n＝1)制备方法
分别取5.46g(0.05moL)对氨基苯酚和5g(0.05moL)丁二酸酐溶于无水吡啶中，后者滴加入前者，室温搅拌反应30min。加入适量饱和碳酸钾溶液，用乙酸乙酯萃取，水层用6M盐酸调pH至2，析出灰紫色固体，用蒸馏水洗，干燥得到产物3.5g，产率33.5％。ESI-MSanalysis(negative)m/z 208[M-H]-；1H-NMR(400MHz，d6-Acetoneand TMS)：δ 2.61-2.67(m，4H，CH2)；6.74-6.77(m，2H，ArH)；7.45-7.47(m，2H，ArH)；8.10(s，1H，NH)；8.98(s，1H，OH)；10.712(s，1H，COOH).
称取1.01g(0.018moL)KOH溶于无水甲醇中，称取1.31g(0.006moL)上述固体，0℃搅拌下溶于上述溶液中，搅拌30min。滴加1.1317g(0.006moL)二乙氧基硫代磷酰氯，0℃反应12h。反应结束旋干，用氯仿洗，过滤，上清浓缩后过(氯仿：甲醇＝6：1)硅胶柱，得0.60g，产率27.6％。ESI-MS analysis(negative)m/z 360[M-H]-；1H-NMR(400MHz，CDCl3 and TMS)：δ 1.32(t，J＝7.1Hz，6H，CH3)；2.58(s，2H，CH2)；2.69(s，2H，CH2)；4.15-4.23(m，4H，CH2)；7.06(d，J＝7.9Hz，2H，ArH)；7.42(d，J＝8.6Hz，2H，ArH)；8.11(s，1H，NH).
实施例6 半抗原BVI(n＝1)制备方法
分别取5.46g(0.05moL)3-氨基苯酚和5.0g(0.05moL)丁二酸酐溶于无水吡啶中，后者滴加入前者，室温搅拌反应30min。加入适量饱和碳酸钠溶液，用乙酸乙酯萃取，水层用6M盐酸调pH至2，析出白色或淡黄色固体，用蒸馏水洗，干燥得到产物2.5g，产率23.9％。ESI-MS analysis(negative)m/z 208[M-H]-；1H-NMR(400MHz，d6-Acetone and TMS)：δ 2.64(s，4H，CH2)；6.51(ddd，J1＝0.9Hz，J2＝2.2Hz，J3＝7.8Hz，1H，ArH)；7.00(d，J＝8.5Hz，1H，ArH)；7.06(t，J＝8.0Hz，1H，ArH)；7.34(s，1H，ArH)；8.24(s，1H，NH)；9.09(s，1H，OH).
称取1.68g(0.03moL)KOH溶于无水甲醇中，称取2.09g(0.01moL)上述固体，0℃搅拌下溶于上述溶液中，搅拌30min。滴加0.15g(0.008moL)二乙氧基硫代磷酰氯，0℃反应12h。反应结束旋干，用氯仿洗，过滤，上清浓缩后过(氯仿：甲醇＝6：1)硅胶柱，得0.80g，产率27.5％。ESI-MS analysis(negative)m/z 360[M-H]-；1H-NMR(400MHz，CDCl3and TMS)：δ 1.32(t，J1＝7.0Hz，J2＝7.0Hz，6H，CH3)；2.60(t，J＝6.3Hz，2H，CH2)；2.69(t，J＝6.2Hz，2H，CH2)；4.19(dqd，J1＝0.6Hz，J2＝7.0Hz J3＝6.9Hz，J4＝6.9Hz，J5＝9.6Hz，4H，CH2)；6.87(d，J＝7.5Hz，1H，ArH)；7.19(td，J1＝8.0Hz，J2＝8.0Hz，J3＝15.9Hz，2H，ArH)；7.48(s，1H，ArH)；8.16(s，1H，NH).
实施例7 半抗原BV(n＝2)制备方法
分别取5.46g(0.05moL)对氨基苯酚和5.7g(0.05moL)戊二酸酐溶于无水吡啶中，后者滴加入前者，室温搅拌反应30min。加入适量饱和碳酸钾溶液，用乙酸乙酯萃取，水层用6M盐酸调pH至2，析出灰紫色固体，用蒸馏水洗，干燥得到产物7.034g，产率63.1％。ESI-MSanalysis(negative)m/z 222[M-H]-；1H-NMR(400MHz，d6-DMSO andTMS)：δ 1.77(p，J＝7.4Hz，2H，CH2)；2.26(dd，J1＝7.6Hz，J2＝15.6Hz，4H，CH2)；6.67(d，J＝8.8Hz，2H，ArH)；7.34(dd，J1＝1.9Hz，J2＝8.7Hz，2H，ArH)；9.15(s，1H，NH)；9.61(s，1H，OH).
称取1.68g(0.018moL)KOH溶于无水甲醇中，称取2.23g
(0.01moL)上述固体，0℃搅拌下溶于上述溶液中，搅拌30min。滴加1.5g(0.008moL)二乙氧基硫代磷酰氯，0℃反应12h。反应结束旋干，用氯仿洗，过滤，上清浓缩后过(氯仿：甲醇＝6：1)硅胶柱，得0.60g，产率19.8％。ESI-MS analysis(negative)m/z 374[M-H]-；1H-NMR(400MHz，CDCl3and TMS)：δ 1.30(t，J＝7.1Hz，6H，CH3)；1.87(s，1H，CH2)；2.27(s，4H，CH2)；4.13-4.20(m，4H，CH2)；7.02(d，J＝8.1Hz，2H，ArH)；7.46(d，J＝7.7Hz，2H，ArH)；8.62(s，1H，NH).
实施例8 半抗原BVI(n＝2)制备方法
分别取5.46g(0.05moL)3-氨基苯酚和5.8g(0.05moL)戊二酸酐溶于无水吡啶中，后者滴加入前者，室温搅拌反应30min。加入适量饱和碳酸钠溶液，用乙酸乙酯萃取，水层用6M盐酸调pH至2，析出灰紫色固体，用蒸馏水洗，干燥得到产物6.7g，产率60.03％。ESI-MSanalysis(negative)m/z 222[M-H]-；1H-NMR(400MHz，d6-Acetone andTMS)：δ 1.93(p，J＝7.4Hz，2H，CH2)；2.39(td，J1＝7.4Hz，J2＝7.4Hz，J3＝12.8Hz，4H，CH2)；6.51(ddd，J1＝1.1Hz，J2＝2.3Hz，J3＝7.9Hz，1H，ArH)；7.01(dd，J1＝1.2Hz，J2＝8.1Hz，1H，ArH)；7.06(t，J＝8.0Hz，1H，ArH)；7.36(t，J＝1.9Hz，1H，ArH)；8.30(s，1H，NH)；9.05(s，1H，OH).
称取1.68g(0.018moL)KOH溶于无水甲醇中，称取2.23g(0.01moL)上述固体，0℃搅拌下溶于上述溶液中，搅拌30min。滴加1.5g(0.008moL)二乙氧基硫代磷酰氯，0℃反应12h。反应结束旋干，用氯仿洗，过滤，上清浓缩后过(氯仿：甲醇＝6：1)硅胶柱，得0.72g，产率24.0％。ESI-MS analysis(negative)m/z 374[M-H]-；1H-NMR(400MHz，CDCl3 and TMS)：δ 1.34(dt，J1＝0.6Hz，J2＝7.0Hz，J3＝7.0Hz，6H，CH3)；2.02(p，J＝7.1Hz，2H，CH2)；2.44(td，J1＝7.1Hz，J2＝7.1Hz，J3＝11.4Hz，4H，CH2)；4.21(qd，J1＝7.1Hz，J2＝7.1Hz，J3＝7.0Hz，J4＝9.8Hz，4H，CH2)；6.90(d，J＝7.2Hz，1H，ArH)；7.24(q，J1＝8.2Hz，J2＝8.2Hz，J3＝8.1Hz，2H，ArH)；7.49(s，1H，ArH)；7.67(s，1H，NH).
实施例9 半抗原BVII(n＝0)制备方法
分别取5.46g(0.05moL)对氨基苯酚和4.903g(0.05moL)顺丁烯二酸酐溶于无水吡啶中，后者滴加入前者，室温搅拌反应30min。加入适量饱和碳酸钾溶液，用乙酸乙酯萃取，水层用6M盐酸调pH至2，析出草绿色固体，用蒸馏水洗，干燥得到产物5.546g，产率53.5％。ESI-MS analysis(negative)m/z 206[M-H]-；1H-NMR(400MHz，d6-Acetone and TMS)：δ 6.33(d，J＝12.8Hz，1H，CH＝CH)；6.67(d，J＝12.8Hz，1H，CH＝CH)；6.84-6.88(m，2H，ArH)；7.54(td，J1＝2.5Hz，J2＝2.5Hz，J3＝10.1Hz，2H，ArH)；8.51(s，1H，NH)；10.26(s，1H，OH)；15.22(s，1H，COOH).
称取1.68g(0.018moL)KOH溶于无水甲醇中，称取2.072g(0.01moL)上述固体，0℃搅拌下溶于上述溶液中，搅拌30min。滴加1.5g(0.008moL)二乙氧基硫代磷酰氯，0℃反应12h。反应结束旋干，用氯仿洗，过滤，上清浓缩后过(氯仿：甲醇＝6：1)硅胶柱，得1.2g，产率42.0％。ESI-MS analysis(negative)m/z 358[M-H]-；1H-NMR(400MHz，CDCl3and TMS)：δ 1.33(t，J＝7.0Hz，6H，CH3)；4.17-4.24(m，4H，CH2)；6.37(d，J＝12.1Hz，1H，CH＝CH)；6.71(d，J＝9.5Hz，1H，CH＝CH)；7.15(d，J＝7.2Hz，2H，ArH)；7.66(d，J＝7.8Hz，2H，ArH)；10.03(s，1H，NH).
实施例10 半抗原BVIII(n＝0)制备方法
分别取5.46g(0.05moL)3-氨基苯酚和4.9g(0.05moL)顺丁烯二酸酐溶于无水吡啶中，后者滴加入前者，室温搅拌反应30min。加入适量饱和碳酸钠溶液，用乙酸乙酯萃取，水层用6M盐酸调pH至2，析出灰紫色固体，用蒸馏水洗，干燥得到产物7.544g，产率72.93％。ESI-MS analysis(negative)m/z 206[M-H]-；1H-NMR(400MHz，d6-DMSO and TMS)：δ 6.50(ddd，J1＝0.8Hz，J2＝2.3Hz，J3＝8.0Hz，1H，CH＝CH)；6.64(d，J＝15.4Hz，1H，CH＝CH)；7.04(d，J＝8.1Hz，1H，ArH)；7.12(dd，J1＝11.8Hz，J2＝20.4，2H，ArH)；7.26(t，J＝2.1Hz，1H，ArH)；9.46(s，1H，NH)；10.36(s，1H，OH)；12.97(s，1H，COOH).
称取1.68g(0.018moL)KOH溶于无水甲醇中，称取2.072g(0.01moL)上述固体，0℃搅拌下溶于上述溶液中，搅拌30min。滴加1.5g(0.008moL)二乙氧基硫代磷酰氯，0℃反应12h。反应结束旋干，用氯仿洗，过滤，上清浓缩后过(氯仿：甲醇＝6：1)硅胶柱，得0.9g，产率31.5％。ESI-MS analysis(negative)m/z 358[M-H]-；1H-NMR(400MHz，CDCl3 and TMS)：δ 1.36(t，J＝7.0Hz，6H，CH3)；4.24(qd，J1＝7.1Hz，J2＝7.1Hz，J3＝7.1Hz，J4＝14.2Hz，4H，CH2)；6.42(d，J＝12.0Hz，1H，CH＝CH)；6.50(d，J＝7.0Hz，1H，CH＝CH)；7.33(dd，J1＝7.4Hz，J2＝15.5Hz，2H，ArH)；7.63(s，1H，ArH)；8.81(s，1H，NH).
实施例11 半抗原BIX(n＝3)制备方法
称取1.68g(0.018moL)KOH溶于无水甲醇中，称取1.00g(0.01moL)氨基丁酸，0℃搅拌下溶于上述溶液中，搅拌30min。滴加1.5g(0.008moL)二乙氧基硫代磷酰氯，0℃反应12h。反应结束旋干，用氯仿洗，过滤，上清浓缩后过(氯仿：甲醇＝3：1)硅胶柱，得1.14g，产率56.0％。ESI-MS analysis(negative)m/z 254[M-H]-；1H-NMR(400MHz，CDCl3 and TMS)：δ 1.27(t，J＝7.0Hz，6H，CH3)；1.77(p，J＝6.9Hz，2H，CH2)；2.39(t，J＝7.3Hz，2H，CH2)；2.98(td，J1＝6.8Hz，J2＝6.8Hz，J3＝6.8Hz，J4＝11.1Hz，2H，CH2)；4.01(ddd，J1＝1.4Hz，J2＝7.3Hz，J3＝15.9Hz，4H，CH2).
实施例12 半抗原BIX(n＝5)制备方法
称取1.68g(0.018moL)KOH溶于无水甲醇中，称取1.31g(0.01moL)氨基己酸，0℃搅拌下溶于上述溶液中，搅拌30min。滴加1.5g(0.008moL)二乙氧基硫代磷酰氯，0℃反应12h。反应结束旋干，用氯仿洗，过滤，上清浓缩后过(氯仿：甲醇＝3：1)硅胶柱，得1.36g，产率60.0％。ESI-MS analysis(negative)m/z 282[M-H]-；1H-NMR(400MHz，CDCl3 and TMS)：δ 1.26(t，J＝7.1Hz，6H，CH3)；1.33(dt，J1＝4.5Hz，J2＝8.6Hz，J3＝8.8Hz，2H，CH2)；1.45(td，J1＝7.2Hz，J2＝7.2Hz，J3＝14.3Hz，2H，CH2)；1.55-1.63(m，2H，CH2)；2.31(t，J＝7.4Hz，2H，CH2)；2.89(td J1＝7.0Hz，J2＝7.0Hz，J3＝10.5Hz，2H，CH2)；3.96-4.03(m，4H，CH2).
实施例13 免疫原OP-BSA的制备方法
取半抗原(OP)0.12mmol溶于2mlDMF中，搅拌加入DCC29.7mg和NHS16.6mg。4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液，称取BSA136mg溶于10ml浓度为0.1mol/L的PBS(PH8.0)中，搅拌溶解制备B液。磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h。离心后，取上清夜，4℃下用生理盐水透析3d，每天更换4次透析液。得到的免疫原OP-BSA以1mg/ml的浓度分装于0.5ml离心管中。冻存于-20℃冰箱中，供免疫用。
免疫原鉴定：对载体蛋白BSA，半抗原OP和免疫原OP-BSA进行紫外扫描测定(200～400nm)，发现免疫原OP-BSA与BSA和半抗原OP相比，吸收曲线有明显改变，说明半抗原OP与BSA偶连成功。
实施例14 包被原OP-OVA的制备方法
取半抗原(OP)0.12mmol溶于2mlDMF中，搅拌加入DCC29.7mg和NHS16.6mg。4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液，称取BSA136mg溶于10ml浓度为0.1mol/L的PBS(PH8.0)中，搅拌溶解制备B液。磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h。离心后，取上清夜，4℃下用生理盐水透析3d，每天更换4次透析液。得到的包被原OP-OVA以1mg/ml的浓度分装于0.5ml离心管中。冻存于-20℃冰箱中，供免疫用。
包被原鉴定：对载体蛋白OVA，半抗原OP和包被原OP-OVA进行紫外扫描测定(200～400nm)，发包被原OP-OVA与载体蛋白OVA及半抗原OP相比，吸收曲线有明显改变，说明半抗原OP与载体蛋白OVA偶连成功。
实施例15 多克隆抗体的制备方法及抗体效价测定
多克隆抗体的制备：将免疫原解冻，然后加入等剂量的佐剂(第1次免疫用弗氏完全佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)用搅拌器乳化。完全乳化后，采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳缘静脉多种注射方式免疫6只体重为2.5～3kg的健康新西兰大白兔。第一次免疫隔一个月后每两周加强免疫一次。第4次加强免疫后1周耳缘静脉采血，并利用间接ELISA测定血清效价。当效价不再上升时，采用耳缘静脉加强免疫。1周后心脏采血，室温静置0.5～1h，于4℃冰箱过夜后吸取上层析出的血清。抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化得到多克隆抗体，透析后冷冻干燥成粉末，于-20℃下保存备用。
抗体效价的检测：间接竞争ELISA测定抗体阳性滴度以2.1倍于阴性血清的测定值为准，测得抗体的阳性滴度为1:512000以上。实施例16抗体亲和性及特异性试验
将不同浓度的有机磷标准品与抗体一起进行间接竞争ELISA反应，测定其抑制率，以确定抗体对多种有机磷标准品的亲和性。各种有机磷的抑制中浓度IC50见表1。
以上实验结果说明由所设计半抗原制备的免疫原免疫产生的抗体能够检测大多数含二乙氧基硫代磷酸酯的有机磷农药，具有灵敏度高，检测方便等优点。
表1 不同有机磷农药对抗体的抑制效果
Claims (7)
1、一种二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药半抗原，其特征在于所述半抗原为二乙氧基硫代磷酰氯与带羧基的苯酚衍生物或氨基酸亲核取代后的产物。
2、根据权利要求1所述的半抗原，其特征在于所述带羧基的苯酚衍生物具有式(AI)所示结构，所述半抗原具有式(BI)所示结构：
其中n为0～9的整数；
或者所述带羧基的苯酚衍生物具有式(AII)所示结构，所述半抗原具有式(BII)所示结构：
(BII)；
其中n为0～9的整数；
或者所述带羧基的苯酚衍生物具有式(AIII)所示结构，所述半抗原具有式(BIII)所示结构：
其中n为0～9的整数；
或者所述带羧基的苯酚衍生物具有式(AIV)所示结构，所述半抗原具有式(BIV)所示结构：
其中n为0～9的整数；
或者所述带羧基的苯酚衍生物具有式(AV)所示结构，所述半抗原具有式(BV)所示结构：
其中n为0～9的整数；
或者所述带羧基的苯酚衍生物具有式(AVI)所示结构，所述半抗原具有式(BVI)所示结构：
其中n为0～9的整数；
或者所述带羧基的苯酚衍生物具有式(AVII)所示结构，所述半抗原具有式(BVII)所示结构：
其中n为0～9的整数；
或者所述带羧基的苯酚衍生物具有式(AVIII)所示结构，所述半抗原具有式(BVIII)所示结构：
其中n为0～9的整数；
或者所述带羧基的苯酚衍生物具有式(AIX)所示结构，所述半抗原具有式(BIX)所示结构：
其中n为3～7的整数。
3、一种权利要求1所述半抗原的制备方法，其特征在于是将二乙氧基硫代磷酰氯和带羧基的苯酚衍生物手臂在0℃～60℃、缚酸剂存在的条件下，于有机溶剂中进行反应，生成目标半抗原。
4、根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述带羧基的苯酚衍生物手臂为带羧基的苯酚衍生物或者氨基酸。
5、根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述带羧基的苯酚衍生物手臂为羟基苯甲醛和丙二酸或氨基苯酚和酸酐合成产物。
6、根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述缚酸剂为氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钠、金属钠、甲醇钠、乙醇钠、吡啶或三乙胺的任意一种。
7、根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述有机溶剂为甲醇、乙醇、四氢呋喃、二氧六环、丙酮或二氯甲烷的任意一种或两种以上的混合物。
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