CN104130325B - 一种甲羟孕酮人工抗原的合成方法 - Google Patents
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Abstract
一种甲羟孕酮人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明以甲羟孕酮为原料，通过氢氧化钾和二溴乙酸进行取代，得到甲羟孕酮半抗原，利用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA偶联，得到甲羟孕酮人工抗原。本发明成功的合成甲羟孕酮人工抗原，合成过程简单，抗原产物暴露了孕激素共同结构，为以后筛选群选性甲羟孕酮单克隆抗体奠定基础，得到的群选性单克隆抗体可以满足国内对孕激素多重检测的需求。
Description
技术领域
本发明涉及一种甲羟孕酮人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
甲羟孕酮（Medroxyprogesterone，MP）属于孕激素，是人工合成的黄体酮衍生物，作用和天然黄体酮类似，又称为安宫黄体酮。其是促孕剂的一种，医学方面主要是用于痛经、功能性闭经、习惯性流产等，大剂量可以用作长效的避孕针。养殖方面主要用来促进动物生长。但是在动物体内代谢较慢，易残留，容易引起性功能紊乱，精神状态不良，严重的还会造成肝肾脏损害，诱发肿瘤等潜在危害。现有的检测甲羟孕酮方法是仪器检测，其中包括高效液相色谱法（HPLC）、液质联用（LC-MS）、气质联用（GC-MS）等。这些方法检测结果准确，灵敏度高，但是整个过程需要专业技术人员操作，使用仪器昂贵，样品前处理过程繁琐，检测耗时，不能满足现场大批量快速检测的需求。相比较，随着免疫分析技术在兽药残留中的大量应用，酶联免疫分析技术（ELISA）成为检测的重要方法，可以在短时间内完成现场快速大批量检测。酶联免疫技术最关键的步骤就是免疫原的设计与合成，目前合成甲羟孕酮免疫原的方法都是改变甾体A环3位碳氧双键，得到的多数是特异性抗体，针对多种孕激素的群选性抗体少并且效果不好，本发明改变甾体D环17位碳上的羟基，暴露孕激素的共同结构，可以同时筛选甲羟孕酮和孕酮，使得筛选高效群选性甲羟孕酮单克隆抗体成为可能。
发明内容
本发明的目的是避免改造孕激素共同结构，提供了一种新型的甲羟孕酮半抗原和人工抗原的合成方法，为制备群选性甲羟孕酮单克隆抗体奠定基础。
本发明的技术方案，以甲羟孕酮为原料，通过氢氧化钾和二溴乙酸进行取代，得到甲羟孕酮半抗原，利用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA偶联，得到甲羟孕酮人工抗原，用紫外鉴定结果。
甲羟孕酮人工抗原合成路线图如图4所示。
合成步骤如下：
（1）甲羟孕酮半抗原的制备：甲羟孕酮34.4mg（0.1mmol）溶解于3mL无水二甲亚砜中为A液，二溴乙酸27.8mg（0.2mmol）溶解于1.4mL无水二甲亚砜中为B液，A液中加入氢氧化钾粉末208.5mg（1.5mmol），室温条件下搅拌至溶液颜色变为微黄色，将B液逐滴加入到A液中，黄色逐渐加深，溴取代甲羟孕酮17位羟基上的H键，成为带有羧基的甲羟孕酮半抗原，室温反应4h，用50mL冰水终止反应，乙酸乙酯萃取三遍，合并水相，将水相用2mol/L盐酸酸化得黄色沉淀，水洗四遍至中性，干燥后得到黄色甲羟孕酮半抗原（MP-2CME）粉末。产物溶解于甲醇后用LC-MS鉴定。
（2）甲羟孕酮人工抗原的制备：称取甲羟孕酮半抗原4.02mg（0.01mmol，Mw=402）溶解于600μL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，置于4℃冰浴中搅拌，溶液预冷后加入5.94μL（0.025mmol,Mw=185.35,ρ=0.78）三正丁胺，冰浴条件搅拌30min，加入3.24μL（0.025mmol,Mw-136.6,ρ=1.053）氯甲酸异丁酯，继续冰浴搅拌1小时，得活化后小分子溶液C液。称取载体蛋白BSA 10.6mg（Mw=64000）溶解于pH 9.6的碳酸盐缓冲液（CBS）中，得蛋白溶液。在冰浴条件下，将C液逐滴滴加到蛋白溶液中，反应8小时。反应结束后，将溶液离心，取上清，得到甲羟孕酮人工抗原混合液。
剪取透析袋约8.0 cm，煮沸消毒约10min，用去离子水冲洗多次，将甲羟孕酮人工抗原混合液移入到透析袋中，用0.01M pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）透析三天，期间每天换液三次，透析结束后取出甲羟孕酮人工抗原分装在1mL的无菌的离心管，在-20℃保存，备用。该甲羟孕酮人工抗原作为免疫原，将载体蛋白换为OVA，方法不变，合成的完全抗原为包被原。
（3）甲羟孕酮人工抗原鉴定：紫外分光光度法对甲羟孕酮人工抗原鉴定。原理是利用不同分子有各自不同的紫外吸收峰，在偶联的过程中，根据光谱叠加原理，偶联产物会有二种偶联物质的吸收峰，由此比较得出偶联是否成功。
酶标板法鉴定是用间接ELISA方法检测血清效价：
1)包被：将包被抗原用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液梯度稀释，100μL/孔，37℃孵育2h；
2)洗涤：将板内溶液倾去，每孔注入200μL PBST溶液，置于摇床上振荡3min，甩干，洗涤3次。以下洗涤方法相同；
3)封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃孵育2h，洗涤后烘干备用；
4)加样：酶标板上半部分加入PBS，50μL/孔（上半部分称为0标），下半部分加入不同浓度的甲羟孕酮或者孕酮标准品（用PBS稀释），将抗血清从1:1000开始梯度稀释，50μL/孔（下半部分成为加标），上下部分对应加入不同稀释梯度包被抗原的孔中，37℃孵育30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗兔IgG，100μL/孔，37℃孵育30min，洗涤后拍干；
5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的显色液（TMB与底物液比例1︰5），37℃避光反应15min；
6)终止和测定：取出酶标板，每孔加入50μL终止液（2mol/L的硫酸）终止反应，然后用酶标仪测定各孔的吸光值A450。
7)结果判读：以OD值大于或等于阴性血清对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。上下部分对照，加标OD值为0标一半的即是所加的标准品浓度。
本发明的有益效果：本发明成功的合成甲羟孕酮人工抗原，合成过程简单，抗原产物暴露了孕激素共同结构，为以后筛选群选性甲羟孕酮单克隆抗体奠定基础，得到的群选性单克隆抗体可以满足国内对孕激素多重检测的需求。
附图说明
图1是甲羟孕酮半抗原色谱图。
图2是甲羟孕酮半抗原质谱图，质谱图目标质核比402，负离子。
图3是甲羟孕酮人工抗原紫外光谱图。
BSA：牛血清白蛋白；OVA：鸡血清白蛋白；MP-2CME：甲羟孕酮半抗原；MP-2CME-OVA：包被原；MP-2CME-BSA：免疫原。
图4甲羟孕酮人工半抗原合成路线图。
具体实施方式
实施例1：
（1）甲羟孕酮半抗原的制备：
甲羟孕酮34.4mg（0.1mmol）溶解于3mL无水二甲亚砜中为A液，二溴乙酸27.8mg（0.2mmol）溶解于1.4mL无水二甲亚砜中为B液，A液中加入氢氧化钾粉末208.5mg（1.5mmol），室温条件下搅拌至溶液颜色变为微黄色，将B液逐滴加入到A液中，黄色逐渐加深，溴取代甲羟孕酮17位羟基上的H键，成为带有羧基的甲羟孕酮半抗原，室温反应4h，用50mL冰水终止反应，乙酸乙酯萃取三遍，合并水相，将水相用2mol/L盐酸酸化得黄色沉淀，水洗四遍至中性，干燥后得到黄色甲羟孕酮半抗原（MP-2CME）粉末。产物溶解于甲醇后用LC-MS鉴定。
（2）甲羟孕酮人工抗原的制备：
称取甲羟孕酮半抗原4.02mg（0.01mmol，Mw=402）溶解于600μL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF），置于4℃冰浴中搅拌，溶液预冷后加入5.94μL（0.025mmol,Mw=185.35,ρ=0.78）三正丁胺，冰浴条件搅拌30min，加入3.24μL（0.025mmol,Mw-136.6,ρ=1.053）氯甲酸异丁酯，继续冰浴搅拌1小时，得活化后小分子溶液C液。称取载体蛋白BSA 10.6mg（Mw=64000）溶解于pH 9.6的碳酸盐缓冲液（CBS）中，得蛋白溶液。在冰浴条件下，将C液逐滴滴加到蛋白溶液中，反应8小时。反应结束后，将溶液离心，取上清，得到甲羟孕酮人工抗原混合液。
剪取透析袋约8.0 cm，煮沸约10min，用去离子水冲洗多次，将甲羟孕酮人工抗原混合液移入到透析袋中，用0.01M pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）透析三天，期间每天换液三次，透析结束后取出甲羟孕酮人工抗原分装在1mL的无菌的离心管，在-20℃保存，备用。该甲羟孕酮人工抗原作为免疫原，将载体蛋白换为OVA，方法不变，合成的完全抗原为包被原。
（3）甲羟孕酮人工抗原鉴定：紫外分光光度法对甲羟孕酮人工抗原鉴定。原理是利用不同分子有各自不同的紫外吸收峰，在偶联的过程中，根据光谱叠加原理，偶联产物会有二种偶联物质的吸收峰，由此比较得出偶联是否成功。
酶标板法鉴定是用间接ELISA方法检测血清效价：
1)包被：将包被抗原用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液梯度稀释，100μL/孔，37℃孵育2h；
2)洗涤：将板内溶液倾去，每孔注入200μL PBST溶液，置于摇床上振荡3min，甩干，洗洗涤3次。以下洗涤方法相同；
3)封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃孵育2h，洗涤后烘干备用；
4)加样：酶标板上半部分加入PBS，50μL/孔（上半部分称为0标），下半部分加入不同浓度的甲羟孕酮或者孕酮标准品（用PBS稀释），将抗血清从1:1000开始梯度稀释，50μL/孔（下半部分成为加标），上下部分对应加入不同稀释梯度包被抗原的孔中，37℃孵育30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗兔IgG，100μL/孔，37℃孵育30min，洗涤后拍干；
5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的显色液（TMB与底物液比例1︰5），37℃避光反应15min；
6)终止和测定：取出酶标板，每孔加入50μL终止液（2mol/L的硫酸）终止反应，然后用酶标仪测定各孔的吸光值A450；
7)结果判读：以OD值大于或等于阴性血清对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。上下部分对照，加标OD值为0标一半的即是所加的标准品浓度。
甲羟孕酮和孕酮测试结果如表1所示，甲羟孕酮IC50=5ng，孕酮IC50=20ng。
表1
。
Claims (1)
1.一种甲羟孕酮人工抗原的合成方法，其特征在于以甲羟孕酮为原料，通过氢氧化钾和二溴乙酸进行取代，得到甲羟孕酮半抗原，利用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA或OVA偶联，得到甲羟孕酮人工抗原；
具体合成步骤：
（1）甲羟孕酮半抗原的制备：取甲羟孕酮0.1mmol溶解于3mL无水二甲亚砜中为A液，二溴乙酸0.2mmol溶解于1.4mL无水二甲亚砜中为B液，A液中加入氢氧化钾粉末1.5mmol，室温条件下搅拌至溶液颜色变为微黄色，将B液逐滴加入到A液中，黄色逐渐加深，溴取代甲羟孕酮17位羟基上的H键，室温反应4h，用50mL冰水终止反应，乙酸乙酯萃取三遍，合并水相，将水相用2mol/L盐酸酸化得黄色沉淀，水洗四遍至中性，干燥后得到黄色甲羟孕酮半抗原粉末；
（2）甲羟孕酮人工抗原的制备：称取甲羟孕酮半抗原0.01mmol溶解于600μL无水N,N-二甲基甲酰胺DMF中，置于4℃冰浴中搅拌，溶液预冷后加入0.025mmol三正丁胺，冰浴条件搅拌30min，加入0.025mmol氯甲酸异丁酯，继续冰浴搅拌1h，得活化后小分子溶液C液；称取载体蛋白BSA 10.6mg，溶解于pH 9.6的碳酸盐缓冲液CBS中，得蛋白溶液；在冰浴条件下，将小分子溶液C液逐滴滴加到蛋白溶液中，反应8h；反应结束后，将溶液离心，取上清，得到甲羟孕酮人工抗原混合液；
剪取透析袋煮沸消毒，将甲羟孕酮人工抗原混合液移入到透析袋中，用0.01M pH 7.4的磷酸盐缓冲液PBS透析三天，期间每天换液三次，透析结束后取出甲羟孕酮人工抗原分装在1mL的无菌的离心管，在-20℃保存，备用；该甲羟孕酮人工抗原，即甲羟孕酮半抗原-BSA，作为免疫原；
将载体蛋白由BSA换为OVA，方法不变，合成的甲羟孕酮人工抗原，即甲羟孕酮半抗原-OVA，作为包被原。
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