JP2010032283A - 免疫学的測定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】蛍光粒子を標識物質として用い、例えば競合的免疫測定方法において好適に利用可能なタンパク質(アビジン、ストレプトアビジンなど)及び/又はリンカーを介して蛍光粒子に結合した抗原を含む標識抗原。
【選択図】なし
Description
J. Pharm. Soc. Jpn., 127(1), 55-69, 2007
また、標識に蛍光粒子を用いることにより酵素を標識とする方法で問題となる試薬の安定性を向上させることが可能になり、標識抗原を含むキットを長期にわたって安定に保存、流通させることができ、またキャリブレーションも容易になる。
例1
(1)サイロキシン結合BSA(T4-MEMIDA-BSA)の作製
特開昭51-106724号公報に記載の方法に従って合成した。
(2)抗サイロキシン抗体固相化プレートの作製
96ウェル黒色プレート(NUNC社製 #475515)の各ウェルに、10 μg/mLに調製した抗サイロキシンモノクローナル抗体(Medix社製#100074)の150 mM塩化ナトリウム溶液を100μLずつ添加し、室温で1時間静置した。抗体溶液を除去し、予め調製した洗浄用バッファー(0.05%(w/v) Tween-20を含むPBS(pH7.4))で洗浄した(350μL/ウェル、3回)。洗浄終了後、抗体の未吸着部分のブロッキングを行うため、1%カゼインを含むPBS(pH7.4)を200μLずつ各ウェルに添加し、3時間、室温で静置した。上記の洗浄用バッファーで洗浄後、安定化剤としてImmunoassay Stabilizer(ABI社製)を200μLずつ各ウェルに添加し、室温で30分間放置後、溶液を除去し乾燥機中で水分を完全に取り除いたものを実験に使用した。
2%蛍光粒子溶液(F8811、φ210 nm、Molecular Probes社)250 μLに50 mM MESバッファー(pH 6.0)150μLおよび、10.0 mg/mLサイロキシン結合BSA PBS溶液100 μLを加え室温で15分間攪拌した。400 mg/mLのWSC(品番01-62-0011、和光純薬)水溶液を5 μL加え室温で2時間撹拌した。2 mol/L Glycine水溶液を 25μL添加し30分間撹拌した後、遠心分離(15,000rpm、4℃、15分)にて粒子を沈降させた。上清を取り除き、PBS (pH7.4)を500μL加え、超音波洗浄機により蛍光粒子を再分散させた。さらに遠心分離(15,000 rpm、4℃、15分)を行い、上清を除いた後、1%BSAのPBS(pH7.4)溶液500 μL加え、蛍光粒子を再分散させることでサイロキシン-BSA結合粒子の1%(w/v)溶液を得た。
上記条件で作製したサイロキシン-BSA結合粒子を1重量%のBSAを含むPBS溶液(pH7.4)で0.005重量%に希釈した。また、1×10-4 Mのサイロキシン溶液をリン酸緩衝液(pH7.4)で下記濃度となるように希釈系列を作製し抗原溶液とした。
0.005重量%サイロキシン-BSA結合粒子30μLと各水準のサイロキシン溶液30μLを混合し、そのうち50μLを上記の抗サイロキシン抗体固相化プレートの各ウェルに添加した。1時間室温で静置したのち、反応液を除去した。リン酸緩衝液(pH7.4)350μLで洗浄した後、マイクロプレートリーダー(ARVOMX, パーキンエルマー社製)を用いて蛍光強度を測定した(光源Xeランプ、励起光フィルター485nm、蛍光フィルター535nm)。結果を図1に示す。サイロキシン−BSA結合粒子はT4の測定系に有用であることが示された。
(1)ビオチン化T4の合成
1H-NMR(CD3OD) δ/ppm; 7.81(s, 2H), 7.06(s, 2H), 4.70(m, 1H), 4.45(m, 1H), 4.25(m, 1H), 3.78(s, 3H), 3.60(m, 10H) 3.20(m, 2H), 2.90(m, 2H), 2.70(m, 1H), 2.20(t, 2H), 1.20〜1.60(m, 6H)
2%蛍光粒子溶液(F8811、φ210 nm、Molecular Probes社)250 μLに50 mM MESバッファー(pH 6.0)150μLおよび、10.0 mg/mLストレプトアビジンPBS溶液100 μLを加え室温で15分間攪拌した。400 mg/mLのWSC(品番01-62-0011、和光純薬)水溶液を5 μL加え室温で2時間撹拌した。2 mol/L Glycine水溶液を 25μL添加し30分間撹拌した後、遠心分離(15,000 rpm、4℃、15分)にて、粒子を沈降させた。上清を取り除き、PBS (pH7.4)を500μL加え、超音波洗浄機により蛍光粒子を再分散させた。さらに遠心分離(15,000rpm、4℃、15分)を行い、上清を除いた後、1%BSAのPBS(pH7.4)溶液500 μL加え、蛍光粒子を再分散させることで、ストレプトアビジン修飾蛍光粒子の1%(w/v)溶液を得た。
ビオチン化サイロキシン4(PEG n=4)および上記で作製したストレプトアビジン修飾蛍光粒子を、表Aに示した濃度比となるように混合し、室温で15時間反応させた。遠心分離(15,000rpm、4℃、15分)にて、粒子を沈降させた後、上清を取り除き、PBS (pH7.4)を500μL加え、超音波洗浄機により蛍光粒子を再分散させた。さらに遠心分離(15,000 rpm、4℃、15分)を行い、上清を除いた後、1%BSAのPBS(pH7.4)溶液500 μL加え、蛍光粒子を再分散させることで、ビオチン化サイロキシン4(PEG n=4)結合蛍光粒子を得た。
上記条件Dで作製したビオチン化サイロキシン4(PEG n=4)結合蛍光粒子を1重量%のBSAを含むPBS溶液(pH7.4)で0.005重量%に希釈した。また、1×10-6 Mのサイロキシン溶液をリン酸緩衝液(pH7.4)で下記グラフの濃度となるように希釈系列を作製し抗原溶液とした。
(1)サイロキシン結合粒子(φ210 nm)の作製
2%蛍光粒子溶液(F8811、φ210 nm、Molecular Probes社)250 μLに50 mM MESバッファー(pH 6.0)150μL及び10.0mg/mLサイロキシンメチルエステルのDMSO溶液10 μLを加え室温で10分間攪拌した。400 mg/mLのWSC(品番01-62-0011、和光純薬)水溶液を5 μL加え室温で15時間撹拌した。2 mol/L Glycine水溶液を 25μL添加し30分間撹拌した後、遠心分離(15,000 rpm、4℃、15分)にて粒子を沈降させた。上清を取り除き、PBS (pH7.4)を500μL加え、超音波洗浄機により蛍光粒子を再分散させた。さらに遠心分離(15,000 rpm、4℃、15分)を行い、上清を除いた後、1%BSAのPBS(pH7.4)溶液500 μL加え、蛍光粒子を再分散させることでサイロキシン結合粒子の1%(w/v)溶液を得た。
上記条件で作製したT4−直接結合粒子を使用したこと以外、上記(8)の条件に従ってT4測定を実施したが、濃度依存的なシグナル変化は観測されなかった。このことにより、蛍光粒子に抗原を結合させる際にタンパク質又はリンカーを介在させる本発明の標識抗体の優れた効果が証明された。
Claims (11)
- タンパク質及び/又はリンカーを介して蛍光粒子に結合した抗原を含む標識抗原。
- 抗原が蛍光粒子にタンパク質を介して結合している請求項1に記載の標識抗原。
- タンパク質が血清タンパク質及び血漿タンパク質からなる群から選ばれるタンパク質である請求項2に記載の標識抗原。
- タンパク質がアビジン、ストレプトアビジン、又はュートラアビジンである請求項2に記載の標識抗原。
- 抗原とタンパク質とが分子間相互作用による結合で固定されている請求項2ないし4のいずれか1項に記載の標識抗原。
- 分子間相互作用による結合がアビジン、ストレプトアビジン、又はニュートラアビジンとビオチン化された抗原との結合である請求項5に記載の標識抗原。
- 該抗原がビオチン化された抗原であり、ビオチン骨格部と抗原骨格とがスペーサーを介して連結した抗原である請求項6に記載の標識抗原。
- 該スペーサーの全長が3 nm以上である請求項7に記載の標識抗原。
- 競合的免疫測定方法に用いるための請求項1ないし8のいずれか1項に記載の標識抗原。
- あらかじめ目的物質に対する抗体を結合させた不溶性担体に被検物質を含む試料及び標識抗原を添加して抗原抗体複合体を形成させた後、該抗原抗体複合体を形成した標識抗原、又は該抗原抗体複合体を形成しなかった標識抗原を検出することにより被検物質を定量する方法において、請求項1ないし8のいずれか1項に記載の標識抗原を用いることを特徴とする方法。
- 請求項10に記載の方法に用いるためのキットであって、少なくとも2の要素を含み、かつそれらのうちの1つの要素が請求項1ないし8のいずれか1項に記載の標識抗原であるキット。
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