CN111239414B - 一种检测il-6的试剂盒及检测il-6的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种检测IL‑6的免疫荧光试剂盒，包被有捕获抗体的羧基磁珠、生物素化的IL‑6检测抗体、亲和素偶联的β‑半乳糖苷酶、酶反应发光底物、已知浓度的IL‑6标准品、用于配制标准品溶液、质控品溶液、样品溶液的稀释液。本发明还提供其制备方法及检测IL‑6的方法。本发明提供的试剂盒具有所需样本体积小、检测结果准确、检测灵敏度高、特异性好、线性范围宽、重复性好、检测时间短、并方便用于全自动检测仪器等优点，克服了现有免疫检测技术中存在的很多缺点。易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景。

Description

一种检测IL-6的试剂盒及检测IL-6的方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种检测IL-6的试剂盒、其制备方法及检测IL-6的方法。
背景技术
白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)，属于白细胞介素的一种，由单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、肿瘤细胞及内分泌组织如垂体、甲状腺等多种细胞分泌，可以促进肝脏合成急性期蛋白，激活T淋巴细胞，并诱导B细胞的终末期分化，使之成为具有分泌免疫球蛋白的免疫活性细胞。
作为一种多效能细胞因子，IL-6与可溶性IL-6受体形成IL-6/IL-6R复合物，活化细胞膜表面的gpl30，诱导信号传导子及转录激活子3活化，即IL-6信号转导。IL-6在宿主防疫机制中发挥重要作用，在正常生理状态时，IL-6的表达水平比较低，但是在创伤、炎症、肿瘤等各种病理情况下，IL-6的表达明显升高。IL-6的升高可能对机体产生不利影响，造成组织损害和加重病情发展。目前IL-6主要在以下研究方面具有重要意义：
1、炎症反应
感染、创伤、大手术等因素可诱发全身炎症反应综合征(SIRS)，严重时可发展为多器官功能障碍综合征(MODS)，甚至死亡。国内外有学者报道，IL-6浓度的高低预示着SIRS患者病程的进展，并可以作为SIRS患者预后的一个预测因素。
过度的炎症可以导致斑块形成，冠脉粥样硬化斑块局部和粥样硬化损伤的动脉壁上均有IL-6的表达，且表达量是正常组织的10-40倍；IL-6在动脉粥样硬化壁中的浓度为其血清的200倍，并可以反映隐藏的斑块炎症和破裂可能性的大小。
作为感染性疾病新的标志物，IL-6测定还可用于感染性疾病的预后判断，动态观察IL-6水平有助于了解感染性疾病的进展和患者对治疗的反应。
2、肿瘤免疫
IL-6与多种肿瘤发生、发展关系密切，并与其诊断和预后相关联。它通过干预细胞的粘附性和活动力、血栓形成、肿瘤特异性抗原的表达及肿瘤细胞的增殖，从而影响肿瘤的进展。研究表明，IL-6对胆管癌、肝细胞癌、鼻咽癌、结直肠癌、乳腺癌等肿瘤疾病的预后具有重要意义。
3、心血管疾病
IL-6参与了冠状动脉粥样硬化的形成，是冠脉事件的预测因子，与心力衰竭的进展相关。此为，IL-6与心脏粘液瘤和不稳定型心绞痛、脑梗死等心血管疾病也有一定的关系。
目前临床上对IL-6的检测方法主要有放射免疫法、酶联免疫吸附试验法(ELISA)、化学发光法(CLIA)等。放射免疫法存在有效期短、放射性污染的缺点。ELISA方法通常只适用手工操作，不利于高通量的全自动检测仪器的检测，加大了实验结果人为因素引起的误差。并且ELISA方法检测灵敏度较低(通常只能达到pg/mL的灵敏度水平)，线性范围窄。CLIA方法需要特定的化学发光仪器，并且对实验操作人员的要求相对较高。
因此，提供一种分析灵敏度更高、线性范围更宽、操作简单便捷的检测IL-6的试剂盒具有重要的现实意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种检测IL-6的试剂盒，其具有灵敏度高的优点。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
一种检测IL-6的免疫荧光试剂盒，其包含有：包被有捕获抗体的羧基磁珠、生物素化的IL-6检测抗体、亲和素偶联的β-半乳糖苷酶(SBG)、酶反应发光底物(RGP)、已知浓度的IL-6标准品、用于配制标准品溶液、质控品溶液、样品溶液的稀释液。
在一种具体实施方式中，该试剂盒中，所述包被有捕获抗体的羧基磁珠的数量为3.0×108～5×108个。
在一种具体实施方式中，该试剂盒中，所述生物素化的IL-6检测抗体的工作浓度为0.15～0.25μg/mL。
在一种具体实施方式中，该试剂盒中，所述亲和素偶联的β-半乳糖苷酶的使用浓度为30～80pM。
具体的，所述捕获抗体为能与人体内IL-6抗原特异性结合的单克隆抗体。
具体的，所述生物素化的IL-6检测抗体为能与IL-6抗原特异结合的单克隆抗体。
所述捕获抗体与所述生物素化的IL-6检测抗体除能与IL-6抗原特异性结合外，配对使用时可与抗原形成“三明治”夹心结构。
具体的，所述稀释液的组分为磷酸盐缓冲液+表面活性剂+ProClin 300。
具体的，所述酶反应发光底物使用商品化试剂。
优选的，所述生物素化的IL-6检测抗体的工作浓度为0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25μg/mL；优选的，所述生物素化的IL-6检测抗体的工作浓度为0.18～0.22μg/mL；更优选的，所述生物素化的IL-6检测抗体的工作浓度为0.19～0.22μg/mL；更优选的，所述生物素化的IL-6检测抗体的工作浓度为0.2μg/mL。
优选的，所述亲和素偶联的β-半乳糖苷酶的使用浓度为30、35、40、43、47、50、53、54、57、60、65、70、75、80pM；更优选的，所述亲和素偶联的β-半乳糖苷酶的使用浓度为40～70pM；更优选的，所述亲和素偶联的β-半乳糖苷酶的使用浓度为45～60pM；更优选的，所述亲和素偶联的β-半乳糖苷酶的使用浓度为47～55pM；更优选的，所述亲和素偶联的β-半乳糖苷酶的使用浓度为50pM。
具体的，所述标准品溶液是使用所述已知浓度的IL-6标准品和所述稀释液配制得到。标准品溶液为至少五个呈一定浓度梯度的溶液，用于制备标准曲线。在一种具体的实施方式中，标准品溶液的浓度分别为：30pg/mL、10pg/mL、3.33pg/mL、1.11pg/mL、0.37pg/mL、0.123pg/mL、0.041pg/mL和0pg/mL。
具体的，所述质控品溶液是使用所述已知浓度的IL-6标准品和所述稀释液配制得到。在一种具体的实施方式中，质控品溶液的浓度分别为：2pg/mL和20pg/mL。
第二方面，本发明还提供了这种检测IL-6的免疫荧光试剂盒的制备方法：
分别配制包被有捕获抗体的磁珠试剂、生物素化的IL-6检测抗体、链霉亲和素偶联的β-半乳糖苷酶(streptavidin-β-galactosidase,SBG)、拟合曲线的已知浓度的IL-6标准品(质控品)，并与商品化的酶反应发光底物(Resorufinβ-D-galactopyranoside，RGP)和标准品/质控品/样本稀释液一起独立地置于包装容器内，得到具有高灵敏度的检测IL-6的免疫荧光试剂盒。
具体地，所述检测IL-6的免疫荧光试剂盒按照如下方法制备而成：
A、IL-6标准品溶液、IL-6质控品溶液的配制方法如下：
用标准品/质控品/样本稀释液将已知浓度的IL-6标准品稀释成特定浓度的IL-6标准品溶液和质控品溶液。其中，IL-6标准品溶液的浓度分别为：30pg/mL、10pg/mL、3.33pg/mL、1.11pg/mL、0.37pg/mL、0.123pg/mL、0.041pg/mL和0pg/mL；IL-6质控品溶液的浓度分别为：2pg/mL和20pg/mL。
B、磁珠试剂的制备方法如下：
1)洗涤捕获抗体，将缓冲液置换为磁珠偶联缓冲液，并重新收集IL-6捕获抗体(调整浓度至0.2mg/mL)。
2)将充分混匀的羧基磁珠浓缩液(含4.2×108个羧基磁珠)转移至1.7mL离心管中，将离心管置于磁力架上放置1min，吸去上清，向离心管中加入磁珠洗涤缓冲液，震荡混匀；再将离心管置于磁力架上放置1min后吸去上清，如是重复洗涤羧基磁珠3次；再用上述方法使用磁珠偶联缓冲液洗涤羧基磁珠3次；最后，向羧基磁珠加入磁珠偶联缓冲液，震荡混匀后置于冰上待用。
3)活化羧基磁珠：向磁珠偶联缓冲液中的磁珠试剂中加入EDC(1-Ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodiimide，终浓度为：0.3mg/mL),充分混匀后，将离心管置于混合器上2-8℃混匀30min。
4)将IL-6捕获单抗偶联至羧基磁珠：将与EDC混合好的羧基磁珠置于磁力架上放置1min，吸去上清，加入磁珠偶联缓冲液并混匀，再放置磁力架上1min并吸去上清，加入步骤1准备好的捕获抗体，震荡充分混匀，将离心管置于混合器上2-8℃混匀2小时。
5)封闭偶联后的羧基磁珠：将与捕获抗体偶联后的磁珠置于磁力架上放置1min，吸去上清，加入磁珠洗涤缓冲液并震荡混匀；再将离心管置于磁力架上，吸去上清，如是洗涤偶联后的磁珠两次；最后，在磁力架上吸去磁珠洗涤缓冲液，加入磁珠封闭液，充分混匀后，置于混合器上封闭45min。
6)洗涤：将装有封闭后磁珠的离心管置于磁力架放置1min，吸取上清，加磁珠洗涤缓冲液，充分混匀；然后置于磁力架上放置1min，吸去上清后加入磁珠稀释液并充分混匀；再按上述方法，吸去磁珠稀释液后，加入新的磁珠稀释液，并放于4℃冰箱待用。
C、NHS-PEG4-Biotin与IL-6检测抗体偶联物的制备方法如下：
1)将缓冲液置换为生物素化反应缓冲液，并重新收集检测抗体(1mg/mL)。
2)生物素标记检测抗体：按照检测抗体与生物素质量比为4∶1的比例向检测抗体中加入生物素，充分混匀，室温孵育30min。
3)纯化生物素化检测抗体：利用离心过滤管使用生物素化反应缓冲液洗涤检测抗体3次并重新收集检测抗体，并放入4℃冰箱待用。生物素化的IL-6检测抗体的工作浓度为0.2μg/mL。
D、链霉亲和素β-半乳糖苷酶SBG试剂的制备方法如下：
用SBG稀释液将已知浓度的SBG稀释成50pM的使用浓度备用。
第三方面，本发明还提供了利用这种IL-6高灵敏度检测试剂盒检测IL-6的方法，该方法包括步骤：
1)标准品溶液的制备：使用标准品/质控品/样本稀释液将已知浓度的IL-6标准品浓缩液稀释至30pg/mL、10pg/mL、3.33pg/mL、1.11pg/mL、0.37pg/mL、0.123pg/mL、0.041pg/mL和0pg/mL，8个浓度各230μL，加入96孔板。
2)质控品溶液的制备：使用标准品/质控品/样本稀释液将已知浓度的IL-6标准品浓缩液稀释至2pg/mL和20pg/mL，2个浓度各80μL，加入96孔板。
3)加样本至96孔板，并装载入检测仪器。
4)将制备或稀释好的磁珠试剂、检测抗体试剂、链霉亲和素β-半乳糖苷酶试剂、标准品/质控品/样本稀释液装载入检测仪器。
5)检测仪器中反应步骤如下：
a)25μL结合了IL-6捕获抗体的磁珠试剂与100μL待检物孵育30min。
b)向上述混合溶液中加入100μL生物素化的IL-6检测抗体，孵育5min。
c)向上述混合溶液中加入100μL 50pM的SBG试剂，孵育5min。上述三个步骤完成后，形成“捕获抗体-目的蛋白-检测抗体”的“三明治”夹心结构。
d)洗涤磁珠以去除非特异性结合的蛋白质。
e)加入100μL酶反应底物RGP，加入RGP的磁珠免疫复合物被转移至Simoa光盘上的小孔中并产生荧光信号。
f)油封将荧光信号封闭在小孔中。
g)荧光被CCD成像系统进行数字化解读。
h)仪器自动导出待检物中IL-6浓度。
上述方法的待测样品选自血浆、血清、细胞培养上清或细胞裂解液。
本发明的试剂盒中未详细提及的试剂组分(例如清洗液、缓冲液等)、试剂盒的外包装以及各组分的独立包装容器等均购自美国Quanterix公司，均按照Quanterix公司的操作说明进行操作。本发明的方法中未详细提及的操作步骤也可参照所属领域的常规操作进行，例如在检测前半小时将各试剂放置室温(18-25℃)，加样前充分混匀；所用检测仪器设备的使用按说明书操作进行；本发明中，未特别注明单位的比例与含量，固体组分为质量比例与含量，液体组分为体积比例与含量。
本发明利用酶联免疫吸附实验双抗体夹心法的原理，并结合了SIMOA(SingleMolecular Array)单分子免疫阵列分析技术，能够在飞升大小的微孔中捕获单个分子，允许单个磁珠信号的数字化读取，并将数字化信号转换成为待测分子浓度，使得灵敏度大大提高，可以对以往技术难检测的或不能检测到的生物蛋白标记物进行检测和定量。相较于传统ELISA技术，本发明的检测灵敏度平均提高了1000倍以上，并可以同时提高蛋白浓度检测的线性范围。
此外，本发明利用SIMOA技术配合全自动检测仪器，采用机械臂处理样本，自动化完成加样、稀释、混合、洗涤、孵育以及结果的读出/分析，实现从样本到结果一站式检测，不依赖工作人员，降低手工操作误差，解决了传统免疫测定费时费力的问题，保证结果的重复性和精准性。但是该方法所使用的仪器成本相对较高，只有一些相对较大的实验室才能具备相应的条件。
本发明公开了该试剂盒的制备方法以及使用该试剂盒检测IL-6的方法。磁珠上包被的捕获抗体与生物素标记的检测抗体以及被测样本的IL-6形成“包被抗体-抗原-生物素标记抗体”的夹心复合物结构。检测抗体上所标记的生物素NHS-PEG4-Biotin与链霉亲和素β-半乳糖苷酶(streptavidin-β-galactosidase,SBG)结合，SBG进而与酶反应底物RGP(resorufinβ-Dgalactopyranoside)反应产生荧光信号，用以进行IL-6定量分析。
本发明提供的试剂盒具有所需样本体积小、检测结果准确、检测灵敏度高、特异性好、线性范围宽、重复性好、检测时间短、并方便用于全自动检测仪器等优点，克服了现有免疫检测技术中存在的很多缺点。易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景。
本发明的有益效果还包括：
1、本发明优化了SBG的使用浓度，为30～80pM，在最低检测限、定量下限、定量上限、以及检测动态范围等参数上表现出优越的效果；特别是优选50pM，效果更佳。
2、本发明优化了生物素化的IL-6检测抗体的工作浓度，为0.15～0.25μg/mL，在信噪比、试剂盒的最低检测限(LOD)、以及检测的动态范围等参数上表现出优越的效果；特别是优选0.2μg/mL，效果更佳。
3、本发明优化了在检测过程中捕获抗体、目的蛋白、检测抗体、以及SBG的孵育顺序和孵育时间。本发明采用三步法优化，步骤一：结合了IL-6捕获抗体的磁珠与目的蛋白孵育30min；步骤二：目的蛋白与IL-6检测抗体孵育5min；步骤三：检测抗体与SBG孵育5min。三个步骤完成后，形成“捕获抗体-目的蛋白-检测抗体”的“三明治”夹心结构。
4、本发明以光盘上芯片中的小孔为反应室，小孔体积50fL，极小的反应体系可以降低背景噪音和信号散射，使得本发明比现有的常规ELISA方法的检测灵敏度平均高1000倍以上，可以检测非常低浓度的IL-6，所需样本含量少，可以节约珍贵样本，减少基质效应。
5、与本发明相应的检测分析仪器自动化完成稀释、混合、洗涤、孵育以及结果的读出和分析，实现从样本到结果一站式检测，不依赖工作人员，保证结果的重复性和精准性。
6、与本发明对应的SIMOA检测技术可以针对低浓度和高浓度样品采用数字检测和模拟检测两种不同的分析方式，提高了检测动态范围。
附图说明
图1为IL-6的标准曲线图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
标准品和质控品的制备：
使用标准品/质控品/样本稀释液来稀释已知浓度的IL-6，配制成如表1所示浓度的8个标准品和表2所示浓度的2个质控品。本实施例采用的已知浓度的IL-6购自生产厂家R&D公司。
表1标准品的制备
表2质控品的制备
实施例2
磁珠试剂的制备：
1)洗涤捕获抗体，将缓冲液置换为磁珠偶联缓冲液，并重新收集IL-6捕获抗体(调整浓度至0.2mg/mL)。
2)将充分混匀的羧基磁珠浓缩液(含4.2×108个羧基磁珠)转移至1.7mL离心管中，将离心管置于磁力架上放置1min，吸去上清，向离心管中加入磁珠洗涤缓冲液，震荡混匀；再将离心管置于磁力架上放置1min后吸去上清，如是重复洗涤羧基磁珠3次；再用上述方法使用磁珠偶联缓冲液洗涤羧基磁珠3次；最后，向羧基磁珠加入磁珠偶联缓冲液，震荡混匀后置于冰上待用。
3)活化羧基磁珠：向磁珠偶联缓冲液中的磁珠试剂中加入EDC(1-Ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodiimide，终浓度为：0.3mg/mL),充分混匀后，将离心管置于混合器上2-8℃混匀30min。
4)将IL-6捕获单抗偶联至羧基磁珠：将与EDC混合好的羧基磁珠置于磁力架上放置1min，吸去上清，加入磁珠偶联缓冲液并混匀，再放置磁力架上1min并吸去上清，加入步骤1)准备好的捕获抗体，震荡充分混匀，将离心管置于混合器上2-8℃混匀2小时。
5)封闭偶联后的羧基磁珠：将与捕获抗体偶联后的磁珠置于磁力架上放置1min，吸去上清，加入磁珠洗涤缓冲液并震荡混匀；再将离心管置于磁力架上，吸去上清，如是洗涤偶联后的磁珠两次；最后，在磁力架上吸去磁珠洗涤缓冲液，加入磁珠封闭液，充分混匀后，置于混合器上封闭45min。
6)洗涤：将装有封闭后磁珠的离心管置于磁力架放置1min，吸取上清，加磁珠洗涤缓冲液，充分混匀；然后置于磁力架上放置1min，吸去上清后加入磁珠稀释液并充分混匀；再按上述方法，吸去磁珠稀释液后，加入新的磁珠稀释液，并放于4℃冰箱待用。
实施例3
NHS-PEG4-Biotin与检测抗体偶联物的制备方法如下：
1)将缓冲液置换为生物素化反应缓冲液，并重新收集检测抗体(1mg/mL)。
2)生物素标记IL-6检测抗体：按照检测抗体与生物素质量比为4∶1的比例向IL-6检测抗体中加入生物素，充分混匀，室温孵育30min。
3)纯化生物素化的IL-6检测抗体：利用离心过滤管使用生物素化反应缓冲液洗涤检测抗体3次并重新收集检测抗体，并放入4℃冰箱待用。
实施例4
本发明还提供了利用这种IL-6高灵敏度检测试剂盒检测IL-6的方法，该方法包括步骤：
1)25μL结合了IL-6捕获抗体的磁珠试剂与100μL待检物孵育30min。
2)向上述混合溶液中加入100μL生物素化的IL-6检测抗体，孵育5min。
3)向上述混合溶液中加入100μL 50pM的SBG试剂，孵育5min。上述三个步骤完成后，形成“捕获抗体-目的蛋白-检测抗体”的“三明治”夹心结构。
4)洗涤磁珠以去除非特异性结合的蛋白质。
5)加入100μL酶反应底物RGP，加入RGP的磁珠免疫复合物被转移至Simoa光盘上的小孔中并产生荧光信号。
6)油封将荧光信号封闭在小孔中。
7)荧光被CCD成像系统进行数字化解读。
实施例5
根据实施例4所述的IL-6高灵敏检测试剂盒检测IL-6的方法，优化包被有捕获抗体的磁珠、生物素化的检测抗体、目的蛋白、亲和素偶联的酶SBG四者之间孵化顺序和孵化时间。本发明比较了两种方法：两步法和三步法，具体实施方法入表3和表4所示。结果如表5所示，通过比较最低检测限，定量下限，定量上限，以及检测动态范围等参数，确定三步法优于两步法。
表3两步法
表4三步法
表5两步法与三步法结果比较
标准曲线参数 两步法 三步法
最低检测限 0.0681pg/mL 0.0554pg/mL
定量下限 0.1140pg/mL 0.1190pg/mL
定量上限 135pg/mL 330pg/mL
检测动态范围 2.8logs 2.9logs
实施例6
根据实施例4所述的IL-6高灵敏检测试剂盒检测IL-6的方法，优化SBG的使用浓度。本发明比较了三种SBG的使用浓度：150pM，100pM，以及50pM。结果如表6所示，通过比较最低检测限，定量下限，定量上限，以及检测动态范围等参数，确定50pM的SBG浓度优于150pM和100pM。
表6使用三种SBG浓度(150pM，100pM，50pM)的试剂盒测试结果比较：
标准曲线参数 150pM 100pM 50pM
最低检测限 0.0493pg/mL 0.0455pg/mL 0.0368pg/mL
定量下限 0.0980pg/mL 0.0880pg/mL 0.0800pg/mL
定量上限 238pg/mL 220pg/mL 365
检测动态范围 3.0logs 3.0logs 3.2logs
实施例7
根据实施例4所述的IL-6高灵敏检测试剂盒检测IL-6的方法，优化生物素化的检测抗体的工作浓度。本发明比较了三种检测抗体的工作浓度：0.3μg/mL和0.2μg/mL。
使用两种IL-6检测抗体的工作浓度(0.3μg/mL和0.2μg/mL)的试剂盒测试结果比较：
经过比较检测结果中的信噪比、该试剂盒的最低检测限(LOD)，以及检测的动态范围，最终确定使用该试剂盒检测过程中抗体孵育与目的蛋白孵育时采用三步法；检测抗体的工作浓度为0.2μg/mL；SBG的使用浓度为50pM。
优化结果如表5所示。通过四参数非线性拟合标准品的浓度值和信号值获得标准曲线的四参数方程：Y＝49.8901+(0.0185-49.8901)/(1+(X/321.3584)^0.9582)；R2＝0.9999。标准曲线如图1所示，其中，横轴代表标准品的浓度值，纵轴代表信号值。由表5可以看出，最低检测限低于0.020pg/mL；定量下限约0.050pg/mL；定量上限约300pg/mL；检测动态范围3.8logs。说明本试剂盒灵敏度高、检测动态范围宽、可配合全自动仪器使用。
表5
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (13)

1.一种检测IL-6的免疫荧光试剂盒，其特征在于，包被有捕获抗体的羧基磁珠、生物素化的IL-6检测抗体、亲和素偶联的β-半乳糖苷酶、酶反应发光底物、干粉或溶液状态的IL-6标准品、用于配制标准品溶液、质控品溶液、样品稀释液；所述捕获抗体为能与人IL-6抗原不同表位特异性结合的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素化的IL-6检测抗体为能与IL-6抗原不同表位特异结合的单克隆抗体；所述两种单克隆抗体与IL-6抗原的亲和力测定时需满足解离常数KD＜10-9 M。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包被有捕获抗体的羧基磁珠的使用数量为3.0×108~5.0×108个。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述包被有捕获抗体的羧基磁珠的使用数量为4.2×108个。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，亲和素偶联的β-半乳糖苷酶的使用浓度为30~80 pM。
6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述亲和素偶联的β-半乳糖苷酶的使用浓度为50 pM。
7. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，生物素化的IL-6检测抗体的工作浓度为0.15~0.25 μg/mL。
8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素化的IL-6检测抗体的工作浓度为0.2 μg/mL。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品溶液是使用所述已知浓度的IL-6标准品和所述稀释液配制得到；所述标准品溶液的浓度分别为：30 pg/mL、10 pg/mL、3.33 pg/mL、1.11 pg/mL、0.37 pg/mL、0.123 pg/mL、0.041 pg/mL和0 pg/mL；所述质控品溶液是使用所述已知浓度的IL-6标准品和所述稀释液配制得到；所述质控品溶液的浓度分别为：2 pg/mL和20 pg/mL。
10.一种采用权利要求1-9任一项所述的试剂盒检测IL-6的方法，其特征在于，采用三步法孵育包被有IL-6捕获抗体的磁珠试剂、生物素化的IL-6检测抗体、待检物和链霉亲和素β-半乳糖苷酶SBG试剂。
11. 如权利要求10所述的方法，其特征在于，25 μL包被有IL-6捕获抗体的磁珠试剂与100 μL待检物孵育30min，得混合液一。
12. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，向所述混合液一中加入100 μL IL-6检测抗体试剂，孵育5min，得混合液二。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，向所述混合液二中加入100 μL 50pM的链霉亲和素β-半乳糖苷酶SBG试剂，孵育5min。
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