CN118033112A - 一种用于子宫内膜异位症蛋白检测的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于蛋白检测技术领域，具体涉及一种用于子宫内膜异位症蛋白检测的试剂盒及其应用。本发明提供的试剂盒包括复合微球、生物素标记的检测抗体和链霉亲和素偶联的荧光素酶；所述复合微球包括酰胺化修饰的纳米二氧化硅颗粒，以及包被在所述酰胺化修饰的纳米二氧化硅颗粒外的子宫内膜异位症蛋白捕获抗体，能够高效捕获待测生物样品中的子宫内膜异位症蛋白；生物素标记的检测抗体能够识别子宫内膜异位症蛋白捕获抗体，结合链霉亲和素偶联的荧光素酶进行检测，根据荧光结果即可进行判定，替代了更大表面积的96孔板，操作简单、易行，反应条件要求低；并且所需检测样本量少，检测限低，灵敏度高，可精准的检测生物样本中子宫内膜异位症蛋白含量。

Description

一种用于子宫内膜异位症蛋白检测的试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于蛋白检测技术领域，具体涉及一种用于子宫内膜异位症蛋白检测的试剂盒及其应用。

背景技术

子宫内膜异位症(Endometriosis，EMs)定义为子宫腔外子宫内膜组织(腺体和间质)的存在、生长和浸润，导致复发性出血、疼痛、不孕以及结节或肿块的形成。它是一种常见的慢性炎症性疾病，对妇女的生殖健康和生活质量构成威胁。目前子宫内膜异位症的检测和诊断方法包括超声和腹腔镜检查。超声因其特异性和准确性低而受到批评，腹腔镜检查虽然克服了超声的局限性，但由于其属于一种侵入性操作，不能用于疾病的早期筛查。因此，探索一种特异性体外检测途径存在强烈必要性。

外周血液的蛋白检测是EMs体外无创辅助检测方法之一。目前主流的蛋白检测，包括WB，ELISA，荧光标记流式等，近而发展出数字ELISA等蛋白分析技术。但子宫内膜异位症不属于真正的癌症，外周血可能没有异常或轻微异常，同时不能排除诊断其他疾病的可能性，EMs疾病诊断的灵敏度和特异性较低。因此，急需一种专一的，高灵敏度的检测子宫内膜异位症蛋白的方案，促进EMs早期筛查和诊断。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于子宫内膜异位症蛋白检测的试剂盒，特异性检测子宫内膜异位症蛋白，提高检测的灵敏度，降低检测限，为于子宫内膜异位症的早筛和诊断奠定基础。

本发明提供了一种用于子宫内膜异位症蛋白检测的试剂盒，所述试剂盒包括复合微球、生物素标记的检测抗体和链霉亲和素偶联的荧光素酶；

所述复合微球包括酰胺化修饰的纳米二氧化硅颗粒，以及包被在所述酰胺化修饰的纳米二氧化硅颗粒外的子宫内膜异位症蛋白捕获抗体。

优选的，所述酰胺化修饰的纳米二氧化硅颗粒的制备方法包括：依次对纳米二氧化硅颗粒进行氨基化修饰和羧基化修饰，将修饰后的纳米二氧化硅颗粒和酰胺反应溶液混合，20℃～37℃震荡4～8h，得到所述酰胺化修饰的纳米二氧化硅颗粒；

所述酰胺反应溶液包括如下浓度的组分：8～10mg/mL吗啉乙磺酸、30～40mg/mL碳二亚胺和50～60mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺。

优选的，所述氨基化修饰的步骤包括：将纳米二氧化硅颗粒和氨基化修饰溶液混合，20℃～37℃震荡4～8h后无水乙醇洗涤，得到氨基化修饰的纳米二氧化硅颗粒；

所述氨基化修饰溶液包括含有3-氨丙基三乙氧基硅的无水乙醇溶液；所述3-氨丙基三乙氧基硅的无水乙醇溶液中3-氨丙基三乙氧基硅的体积浓度为2％～6％；

优选的，所述羧基化修饰的步骤包括：将氨基化修饰的纳米二氧化硅颗粒和羧基化修饰溶液混合，20℃～37℃震荡8～12h后二甲基亚砜洗涤，得到氨基化-羧基化修饰的纳米二氧化硅颗粒；

所述羧基化修饰溶液包括丁二酸酐的二甲基亚砜溶液；所述丁二酸酐的二甲基亚砜溶液中丁二酸酐的浓度为8～12mg/mL。

优选的，所述子宫内膜异位症蛋白包括IL-10、IL-6和TNF-α中的一种或多种；

所述子宫内膜异位症蛋白捕获抗体包括IL-10捕获抗体、IL-6捕获抗体和TNF-α捕获抗体中的一种或多种；

所述检测抗体包括IL-10检测抗体、IL-6检测抗体和TNF-α检测抗体中的一种或多种；

所述荧光素酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和磷酸二酯酶中的一种或多种。

优选的，所述子宫内膜异位症蛋白检测的试剂盒还包括微流控芯片、表面活性剂和链酶亲和素偶联的荧光素酶底物。

优选的，所述微流控芯片包括第一微通道、第二微通道以及汇聚所述第一微通道和第二微通道的总管路；

所述第一微通道用于输送内相流体；所述第二微通道用于输送外相流体。

优选的，所述第一微通道的管径为30～60μm，第二微通道的管径为30～60μm。

本发明还提供了上述技术方案所述的试剂盒在制备子宫内膜异位症蛋白检测产品、子宫内膜异位症筛查产品和子宫内膜异位症辅助诊断产品中的一种或多种中的应用。

本发明还提供了一种基于上述技术方案所述的试剂盒的非诊断目的的检测子宫内膜异位症蛋白的方法，包括如下步骤：

将含有复合微球的溶液和待检测样本混合，20℃～37℃孵育2～4h后收集沉淀，洗涤，得到复合微球-样本偶联物；

将所述复合微球-样本偶联物和含有生物素标记的检测抗体的溶液混合，20℃～37℃孵育1～2h后收集沉淀，洗涤，得到复合微球-样本-检测抗体偶联物；

将所述复合微球-样本-检测抗体偶联物和含有链霉亲和素偶联的荧光素酶的溶液混合，20℃～37℃孵育30～60min，得到SiO₂三明治复合体微球；

向微流控芯片的第一微通道通入所述SiO₂三明治复合体微球、底物酶和琼脂糖的混合液；向微流控芯片的第二微通道通入含有表面活性剂的溶液；所述微流控芯片包括汇聚所述第一微通道、第二微通道的总管路；

控制第一微通道流速为50μL/h，第二微通道流速为110μL/h，收集总管路的液滴，进行荧光检测；若检测到荧光则说明待检测样本中含有检测子宫内膜异位症蛋白。

有益效果：

本发明提供的试剂盒包括复合微球、生物素标记的检测抗体和链霉亲和素偶联的荧光素酶；所述复合微球包括酰胺化修饰的纳米二氧化硅颗粒，以及包被在所述酰胺化修饰的纳米二氧化硅颗粒外的子宫内膜异位症蛋白捕获抗体，能够高效捕获待测生物样品中的子宫内膜异位症蛋白；生物素标记的检测抗体能够识别子宫内膜异位症蛋白捕获抗体，结合链霉亲和素偶联的荧光素酶进行检测，根据荧光结果即可进行判定，替代了更大表面积的96孔板，操作简单、易行，反应条件要求低；并且所需检测样本量少，检测限低，灵敏度高。本发明提供的试剂盒可精准的检测生物样本中子宫内膜异位症蛋白含量，在子宫内膜异位症早筛和诊断等方面有良好的应用前景。

进一步的，本发明使用微流控芯片，采用微流控芯片进行液滴制备，通道简单、搭建步骤少，不需要复杂的机械加工过程，工艺简单，单分散乳液液滴尺寸可通过内外相流速或内外相毛细管管径进行调节，操作方便；微流控芯片的多通道特性适配多样本同期检测的要求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1制备用于子宫内膜异位症蛋白检测的液滴数字酶联免疫吸附试验的SiO₂三明治复合体微球的制备流程图；其中，(a)为酰胺化修饰的SiO₂纳米颗粒的流程图；(b)为由酰胺化修饰的SiO₂纳米颗粒制备SiO₂三明治复合体微球的流程图；

图2为实施例1傅里叶变换红外光谱(FTIR)检测结果；

图3为实施例1中BSA蛋白检测结果；其中，(a)为SiO₂纳米颗粒偶联捕获抗体的效率和捕获抗体原液浓度的关系；(b)当SiO₂纳米颗粒上的偶联捕获浓度达到抗体原液浓度的42.2％时的样本图片；(c)为蛋白浓度的标准曲线；

图4～5为实施例2单分散性乳液液滴生成结果；其中，图4中a为使用的微流控芯片的实物图；图4中b为琼脂糖添加量为3％时生成的不同粒径的液滴；图5为不同琼脂糖添加量生成的粒径为50μm的液滴；

图6为实施例2多通道单分散性乳液液滴的子宫内膜异位症子宫内膜原代细胞荧光检测结果；其中(a)为荧光图像的明场图片；(b)为IL-10荧光图像，发出明亮的绿色荧光；(c)为IL-6荧光图像，发出明亮的蓝色荧光；(d)为TNF-α荧光图像，发出明亮的红色荧光；(e)为荧光显微镜观测的荧光图像；(f)为炎症因子表达含量检测结果，横坐标表示检测的炎症因子指标，纵坐标表示炎症因子含量；

图7为实施例2多通道单分散性乳液液滴的子宫内膜异位症月经血来源的子宫内膜原代细胞荧光检测结果；其中(a)为荧光图像的明场图片；(b)为IL-10荧光图像，发出明亮的绿色荧光；(c)为IL-6荧光图像，发出明亮的蓝色荧光；(d)为TNF-α荧光图像，发出明亮的红色荧光；(e)为荧光显微镜观测的荧光图像；(f)为炎症因子表达含量检测结果，横坐标表示检测的炎症因子指标，纵坐标表示炎症因子含量；

图8为实施例2中液滴数字酶联免疫吸附试验(ddELISA)和传统ELISA的检测的结果；其中，(a)为生物样本(子宫内膜异位症子宫内膜原代细胞)稀释100倍后ddELISA和传统ELISA检测结果的对比图；(b)为生物样本的梯度稀释后的传统ELISA检测结果；

图9为实施例3中巨噬细胞和子宫内膜异位症原代细胞相互共培养获取生物样本的示意图；其中，(a)为子宫内膜异位症子宫内膜原代细胞上清液获取过程；(b)为巨噬细胞细胞上清液获取过程；

图10为实施例3与巨噬细胞共培养后子宫内膜异位症子宫内膜原代细胞中的炎症因子表达情况；其中，(a)为明场图片；(b)为IL-10荧光图像，发出明亮的绿色荧光；(c)为IL-6荧光图像，发出明亮的蓝色荧光；(d)为TNF-α荧光图像，发出明亮的红色荧光；(e)为荧光显微镜观测的荧光图像；(f)为炎症因子表达含量检测结果，横坐标表示检测的炎症因子指标，纵坐标表示炎症因子含量，对照为未与巨噬细胞共培养的子宫内膜异位症子宫内膜原代细胞；

图11为实施例3与子宫内膜异位症子宫内膜原代细胞共培养后巨噬细胞中的炎症因子表达情况；其中，(a)为明场图片；(b)为IL-10荧光图像，发出明亮的绿色荧光；(c)为IL-6荧光图像，发出明亮的蓝色荧光；(d)为TNF-α荧光图像，发出明亮的红色荧光；(e)为荧光显微镜观测的荧光图像；(f)为炎症因子表达含量检测结果，横坐标表示检测的炎症因子指标，纵坐标表示炎症因子含量，对照为未与子宫内膜异位症原代细胞共培养的巨噬细胞。

具体实施方式

本发明提供了一种用于子宫内膜异位症蛋白检测的试剂盒，所述试剂盒包括复合微球、生物素标记的检测抗体和链霉亲和素偶联的荧光素酶；

所述复合微球包括酰胺化修饰的纳米二氧化硅颗粒以及包被在所述酰胺化修饰的纳米二氧化硅颗粒外的子宫内膜异位症蛋白捕获抗体。

在本发明中，所述子宫内膜异位症蛋白优选包括IL-10、IL-6和TNF-α中的一种或多种，进一步优选为IL-10、IL-6和TNF-α。本发明所述子宫内膜异位症蛋白捕获抗体优选包括IL-10捕获抗体、IL-6捕获抗体和TNF-α捕获抗体中的一种或多种，进一步优选为IL-10捕获抗体、IL-6捕获抗体和TNF-α捕获抗体；所述检测抗体优选包括IL-10检测抗体、IL-6检测抗体和TNF-α检测抗体中的一种或多种，进一步优选为IL-10检测抗体、IL-6检测抗体和TNF-α检测抗体；所述荧光素酶优选包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和磷酸二酯酶中的一种或多种，进一步优选为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和磷酸二酯酶。

在本发明中，所述酰胺化修饰的纳米二氧化硅颗粒的制备方法优选包括：依次对纳米二氧化硅颗粒进行氨基化修饰和羧基化修饰，将修饰后的纳米二氧化硅颗粒和酰胺反应溶液混合，20℃～37℃震荡4～8h，得到所述酰胺化修饰的纳米二氧化硅颗粒，进一步优选为20℃～37℃震荡6h。

本发明优选先对纳米二氧化硅颗粒进行氨基化修饰，得到氨基化修饰的纳米二氧化硅颗粒。在本发明中，所述氨基化修饰的步骤优选包括：将纳米二氧化硅颗粒和氨基化修饰溶液混合，20℃～37℃震荡4～8h后无水乙醇洗涤，得到氨基化修饰的纳米二氧化硅颗粒，进一步优选为20℃～37℃震荡6h。本发明所述氨基化修饰溶液优选包括3-氨丙基三乙氧基硅的无水乙醇溶液；所述3-氨丙基三乙氧基硅的无水乙醇溶液中3-氨丙基三乙氧基硅的体积浓度优选为2％～6％，进一步优选为4％。

得到氨基化修饰的纳米二氧化硅颗粒后，本发明优选对所述氨基化修饰的纳米二氧化硅颗粒进行羧基化修饰，得到氨基化-羧基化修饰的纳米二氧化硅颗粒。在本发明中，所述羧基化修饰的步骤优选包括：将氨基化修饰的纳米二氧化硅颗粒和羧基化修饰溶液混合，20℃～37℃震荡8～12h后二甲基亚砜洗涤，得到氨基化-羧基化修饰的纳米二氧化硅颗粒，进一步优选为20℃～37℃震荡6h。本发明所述羧基化修饰溶液包括含有丁二酸酐的二甲基亚砜溶液；所述丁二酸酐的二甲基亚砜溶液中丁二酸酐的浓度优选为8～12mg/mL，进一步优选为10mg/mL。本发明以丁二酸酐的二甲基亚砜溶液作为羧基化修饰溶液。

得到氨基化-羧基化修饰的纳米二氧化硅颗粒后，本发明优选将所述氨基化-羧基化修饰的纳米二氧化硅颗粒和酰胺反应溶液混合，20℃～37℃震荡4～8h，得到所述酰胺化修饰的纳米二氧化硅颗粒，进一步优选为20℃～37℃震荡6h。在本发明中，所述酰胺反应溶液优选包括如下浓度的组分：8～10mg/mL吗啉乙磺酸、30～40mg/mL碳二亚胺和50～60mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺，进一步优选包括浓度的组分：9.76mg/mL吗啉乙磺酸、35mg/mL碳二亚胺和55mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺。本发明所述酰胺反应溶液的溶剂优选为超纯水。

得到酰胺化修饰的纳米二氧化硅颗粒后，本发明优选将所述酰胺化修饰的纳米二氧化硅颗粒和含有子宫内膜异位症蛋白捕获抗体的溶液混合，得到所述复合微球。本发明所述含有子宫内膜异位症蛋白捕获抗体的溶液优选为含有子宫内膜异位症蛋白捕获抗体的超纯水溶液；所述超纯水溶液中捕获抗体的浓度优选为50～100μg/mL，进一步优选为60～80μg/mL。本发明所述酰胺化修饰的纳米二氧化硅颗粒和含有子宫内膜异位症蛋白捕获抗体的溶液的混合物中，酰胺化修饰的纳米二氧化硅颗粒的密度优选为5×10⁴～6×10⁶个/mL。

在本发明中，所述试剂盒优选还包括微流控芯片、表面活性剂和链酶亲和素偶联的荧光素酶底物。本发明所述微流控芯片优选优选包括第一微通道、第二微通道以及汇聚所述第一微通道和第二微通道的总管路；所述第一微通道用于输送内相流体；所述第二微通道用于输送外相流体。本发明所述第一微通道的管径优选为30～60μm，进一步优选为50μm；所述第二微通道的管径优选为30～60μm，进一步优选为50μm。本发明所述微流控芯片优选由玻璃毛细管、载玻片、点样针头和速干胶组装而成；所述玻璃毛细管形成所述第一微通道和第二微通道的流入和流出管道。本发明通过控制第一微通道和第二微通道直径，能够调整单分散乳液液滴尺寸，制备尺寸均一的多通道单分散乳液液滴，操作简单。

在本发明中，优选将含有所述表面活性剂的溶液作为外相流体的成分，进一步优选将十二烷基硫酸钠的HFE 7500溶液作为外相流体的成分；所述十二烷基硫酸钠的HFE7500溶液中十二烷基硫酸钠的体积浓度优选为10％。本发明优选将含有所述链霉亲和素偶联的荧光素酶底物的溶液作为内相流体的成分，进一步优选将含有所述链酶亲和素偶联的荧光素酶底物的5×PBS溶液作为内相流体的成分；所述含有所述链酶亲和素偶联的荧光素酶底物的5×PBS溶液中链酶亲和素偶联的荧光素酶底物的体积浓度优选为2％；所述荧光素酶底物优选为链酶亲和素偶联的荧光素酶底物的5×PBS溶液作为内相流体的成分。本发明所述荧光素酶底物优选为显色过氧化物酶底物、4-甲基伞形磷酸酯和磷酸二酯酶底物-4中的一种或多种。

本发明提供的试剂盒可以用于液滴数字酶联免疫吸附试验，可精准的检测生物样本中子宫内膜异位症蛋白含量，基于本发明提供的试剂盒的作用，所述试剂盒在制备子宫内膜异位症蛋白检测产品、子宫内膜异位症筛查产品和子宫内膜异位症辅助诊断产品中的一种或多种中的应用同样属于本发明的保护范围，本发明提供的试剂盒在子宫内膜异位症早筛和诊断等方面有良好的应用前景。

本发明还提供了一种基于上述技术方案所述的试剂盒的非诊断目的的检测子宫内膜异位症蛋白的方法，包括如下步骤：

将含有复合微球的溶液和待检测样本混合，20～37℃孵育2～4h后收集沉淀，洗涤，得到复合微球-样本偶联物；

将所述复合微球-样本偶联物和含有生物素标记的检测抗体的溶液混合，20℃～37℃孵育1～2h后收集沉淀，洗涤，得到复合微球-样本-检测抗体偶联物；

将所述复合微球-样本-检测抗体偶联物和含有链霉亲和素偶联的荧光素酶的溶液混合，20℃～37℃孵育30～60min，得到SiO₂三明治复合体微球；

向微流控芯片的第一微通道通入所述SiO₂三明治复合体微球、荧光素酶底物和琼脂糖的混合液；向微流控芯片的第二微通道通入含有表面活性剂的溶液；

控制第一微通道流速为50μL/h，第二微通道流速为110μL/h，收集液滴，进行荧光检测；若检测到荧光则说明待检测样本含有检测子宫内膜异位症蛋白。

本发明将含有复合微球的溶液和待检测样本混合，20℃～37℃孵育2～4h后收集沉淀，洗涤，得到复合微球-样本偶联物。在本发明中，所述含有复合微球的溶液优选为含有复合微球的溶液5×PBS溶液；所述5×PBS溶液中捕获抗体的浓度优选为0.5～2mg/mL，进一步优选为1.0～1.5mg/mL。本发明所述洗涤液优选为含0.1％Tween的5×PBS溶液。

得到复合微球-样本偶联物后，本发明将所述复合微球-样本偶联物和含有生物素标记的检测抗体的溶液混合，20℃～37℃孵育1～2h后收集沉淀，洗涤，得到复合微球-样本-检测抗体偶联物。在本发明中，所述含有生物素标记的检测抗体的溶液优选为含有生物素标记的检测抗体的5×PBS溶液；所述5×PBS溶液中生物素标记的检测抗体的浓度优选为0.5mg/mL。

得到复合微球-样本-检测抗体偶联物后，本发明将所述复合微球-样本-检测抗体偶联物和含有链霉亲和素偶联的荧光素酶的溶液混合，20℃～37℃孵育30～60min，得到SiO₂三明治复合体微球。在本发明中，所述含有链霉亲和素偶联的荧光素酶的溶液中链霉亲和素偶联的荧光素酶的浓度优选为1mg/mL。

得到SiO₂三明治复合体微球后，本发明向微流控芯片的第一微通道通入所述SiO₂三明治复合体微球、链酶亲和素偶联的荧光素酶底物和琼脂糖的混合液；向微流控芯片的第二微通道通入含有表面活性的溶液；控制第一微通道流速为50μL/h，第二微通道流速为110μL/h，收集液滴，进行荧光检测；若检测到荧光则说明含有检测子宫内膜异位症蛋白。

在本发明中，所述SiO₂三明治复合体微球、链酶亲和素偶联的荧光素酶底物和琼脂糖的混合液中琼脂糖的质量浓度优选为1％～3％，进一步优选为2％，本发明利用琼脂糖能够提高包裹SiO₂三明治复合体微球溶液的乳液液滴稳定性，将琼脂糖的浓度控制在1％～3％，利用能够使乳液的稳定性进一步提高。所述混合液的溶剂优选为5×PBS溶液。本发明控制第一微通道和第二微通道的流速，能够制备尺寸均一的多通道单分散乳液液滴，操作简单。本发明收集所述液滴时，优选将液滴收集至含有收集液的固定容器中；所述收集液优选为SDS的甘油溶液；所述固定溶剂优选为细胞计数板。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种复合微球及其在子宫内膜异位症中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

用于子宫内膜异位症蛋白检测的SiO₂三明治复合体微球的制备，制备流程如图1所示，具体由以下步骤组成：

(1)溶液配置

1.1)氨基化修饰溶液：由3-氨丙基三乙氧基硅(APTES)和无水乙醇组成，具体为含4％APTES的无水乙醇溶液。

1.2)羧基化修饰溶液：由丁二酸酐(DSSA)和二甲基亚砜(DMSO)溶液组成，具体是DSSA固体粉末溶于DMSO中配合而成，DSSA的浓度为10mg/mL。

1.3)酰胺反应溶液：由吗啉乙磺酸(MES)、碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和超纯水(ddH₂O)组成，其中MES、EDC和NHS的具体浓度依次为9.76mg/mL，35mg/mL和55mg/mL。

(2)制备酰胺化修饰的SiO₂纳米颗粒

将二氧化硅(SiO₂)纳米颗粒溶于氨基化修饰溶液中，20℃～37℃旋转震荡6小时，无水乙醇洗涤吹洗1次；重悬于羧基化修饰溶液中，室温旋转震荡12小时，DMSO洗涤一次；重悬于酰胺反应溶液中，37℃旋转震荡6小时，获得酰胺化修饰的SiO₂纳米颗粒。傅里叶变换红外光谱(FTIR)检测SiO₂纳米颗粒表面基团变化，结果表明，在1107cm^-1处存在吸收峰(SiO₂特有吸收峰)，在3300～3500cm^-1之间存在吸收峰(氨基表征峰)，在1700～1800cm^-1之间存在吸收峰(羧基表征峰)，成功制得酰胺化修饰的SiO₂纳米颗粒(图2)

(3)制备SiO₂三明治复合体微球溶液

3.1)配置捕获抗体溶液：将IL-10、IL-6和TNF-α(捕获抗体)分别与ddH₂O混合，得到3种捕获抗体溶液，其中捕获抗体的浓度为100μg/mL。

3.2)培养生物样本：培养子宫内膜异位症子宫内膜原代细胞(手术取材提取并培养)和子宫内膜异位症月经血来源的子宫内膜原代细胞(手术前无创体外收集并培养)于6孔板中，细胞密度为1×10⁶个/孔，48小时后提取细胞上清液，每个样本需要样本量为100μL。

3.3)配置生物素标记的检测抗体溶液：由生物素标记的检测抗体和5×PBS组成，生物素标记的检测抗体的浓度为0.5mg/mL。

3.4)配置洗涤液：由Tween和5×PBS组成，Tween具体含量为0.1％。

3.5)制备SiO₂纳米颗粒偶联捕获抗体溶液：

将步骤(2)获取的酰胺化修饰的SiO₂纳米颗粒置于捕获抗体溶液中，37℃旋转震荡3小时，使得捕获抗体稳定、均一地修饰在酰胺化修饰的SiO₂纳米颗粒表面，随后洗涤液清洗3次，最终由5×PBS溶液定容至10mL，其中酰胺化修饰的SiO₂纳米颗粒的密度为6×10⁵个/10mL。

3.6)制备SiO₂三明治复合体微球溶液：

步骤3.5)的酰胺化修饰的SiO₂纳米颗粒偶联捕获抗体溶液中加入100μL生物样本，室温旋转震荡2小时，随后洗涤液清洗3次；置于检测生物素标记的检测抗体溶液中，室温旋转震荡1小时，洗涤液清洗3次；加入链霉亲和素偶联的荧光素酶，使其终浓度为1mg/mL，室温旋转震荡30分钟。利用BCA实验检测SiO₂纳米颗粒偶联捕获抗体效率，结果表明，SiO₂纳米颗粒偶联捕获抗体最大捕获效率为捕获抗体原液浓度的42.2％(图3)

实施例2

液滴数字酶联免疫吸附试验(ddELISA)用于EMs炎症因子检测

(1)溶液配制

1.1)外相溶液：十二烷基硫酸钠/HFE 7500溶液；所述十二烷基硫酸钠/HFE 7500的比例为10％，通过十二烷基硫酸钠固体粉末溶于HFG7500溶液中配制而成；

1.2)内相溶液：由内相溶液1和内相溶液2按照1：1的体积比混合；其中：

内相溶液1由琼脂糖溶液和底物酶溶液按照0：100(0％)、1：100(1％)、2：100(2％)或3：100(3％)的体积比混合得到；底物酶溶液由一定量的底物酶溶于5×PBS中组成，底物酶溶于5×PBS中的比例为0.2％；

内相溶液2由琼脂糖溶液和实施例1得到的SiO₂三明治复合体微球溶液按照0：100(0％)、1：100(1％)、2：100(2％)或3：100(3％)的体积比混合得到；

制备内相溶液1和内相溶液2时使用的琼脂糖溶液的独立浓度为100mg/mL；

1.3)收集液：SDS/甘油溶液，其中甘油的体积浓度为1v/v％；

(2)制备多通道单分散性乳液液滴：

将内相溶液和外相溶液分别抽取到相应规格的玻璃注射器中并将其分别安放在三台蠕动泵上，玻璃注射器和O/W单乳液微流控芯片通过聚乙烯管连接，设定内外相流速，启动蠕动泵工作；控制内向流速(内向管径50μm)为50μL/h，其他因素不变，外相流速(外向管径50μm)为110μL/h。在微流控通道内，当内外相流体相遇时，由于粘性力和界面张力的共同作用，内相流体被拉伸并最终断裂形成单分散性乳液液滴。进行多指标检测时，上述多个通道同时进行，形成多通道单分散性乳液液滴(图4)；利用琼脂糖溶液作为内相能够提高包裹SiO₂三明治复合体微球溶液的乳液液滴稳定性，在琼脂糖溶液比例在0～3％范围内，单分散性乳液液滴的稳定性随琼脂糖比例的增加而提高；3％琼脂糖的可维持单分散性乳液液滴的稳定性(图5)。

(3)制备荧光检测阵列

将步骤(2)制备的多通道单分散乳液液滴液收集在倒有收集液的固定容器(滴于细胞计数板)中，形成荧光检测阵列。

(4)荧光检测阵列用于EMs炎症因子(IL-10、IL-6和TNF-α)检测：

4.1)步骤(3)收集30分钟进行荧光检测，观察多通道单分散性乳液液滴中EMs炎症因子荧光图像，并根据观测的荧光图像计算并分析炎症因子表达含量，结果表明，在生物样品(子宫内膜异位症子宫内膜原代细胞)中检测到三种炎症因子IL-10，IL-6和TNF-α，其含量依次为26.1pg/mL,21.7pg/mL和38.6pg/mL(图6)。在生物样品(子宫内膜异位症月经血来源的子宫内膜原代细胞)中检测到三种炎症因子IL-10，IL-6和TNF-α，其含量依次为32.3pg/mL，23.4pg/mL和23.5pg/mL(图7)。

4.2)为了突出本发明ddELISA试验的优势，对生物样本(子宫内膜异位症子宫内膜原代细胞)进行不同倍数稀释，分别采用本发明提供的ddELISA法和传统ELISA法进行检测，检测指标与步骤4.1)相同，结果表明传统ELISA检测时，生物样本10倍稀释后失去线性关系，稀释20倍后检测不到阳性信号，本发明提供的ddELISA法，生物样品稀释到100倍仍能实现检测，表明ddELISA检测具有更高的灵敏度(图8)。

实施例3

液滴数字酶联免疫吸附试验(ddELISA)用于EMs的免疫调节检测

(1)生物样本培养

按照图9的步骤进行巨噬细胞和子宫内膜异位症子宫内膜原代细胞相互共培养，收集培养上清液，获取生物样本，其中：

构建与巨噬细胞共培养后子宫内膜异位症子宫内膜原代细胞模型时，共培养皿的上室为巨噬细胞培养皿，将悬浮的THP-1经200ng/mL佛波酯诱导72小时后分化为贴壁M0型巨噬细胞，下室为子宫内膜异位症子宫内膜原代细胞培养皿，将诱导为M0型巨噬细胞的上室置于下室，继续共培养48小时后收集下室培养的上清液(图9中a)；

构建与子宫内膜异位症子宫内膜原代细胞共培养后巨噬细胞模型时，共培养皿的下室为巨噬细胞培养皿，将悬浮的THP-1经200ng/mL PMA诱导72小时后分化为贴壁M0型巨噬细胞，上室为子宫内膜异位症子宫内膜原代细胞培养皿，将上室置于诱导为M0型巨噬细胞的下室，继续共培养48小时后收集下室培养的上清液(图9中b)。

(2)参照实施例1～2的步骤，制备荧光检测阵列，对步骤(1)制备的生物样本进行检测。结果表明，与巨噬细胞共培养后子宫内膜异位症子宫内膜原代细胞中炎症因子分泌增强，表明巨噬细胞促进的子宫内膜异位症子宫内膜原代细胞的炎症水平(图10)；与子宫内膜异位症子宫内膜原代细胞共培养后巨噬细胞中IL-10显著高表达，IL-6表达量降低，TNF-α表达量未发生变化，符合巨噬细胞M2极化特征(图11)。

根据上述内容够可以看出，本发明提供的技术方案可以精准的检测生物样本中子宫内膜异位症蛋白含量，适合子宫内膜异位症的多种方向的检测，在子宫内膜异位症早筛和诊断等方面有良好的应用前景，未来将探究用于其他肿瘤疾。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种用于子宫内膜异位症蛋白检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括复合微球、生物素标记的检测抗体和链霉亲和素偶联的荧光素酶；

所述复合微球包括酰胺化修饰的纳米二氧化硅颗粒，以及包被在所述酰胺化修饰的纳米二氧化硅颗粒外的子宫内膜异位症蛋白捕获抗体。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酰胺化修饰的纳米二氧化硅颗粒的制备方法包括：依次对纳米二氧化硅颗粒进行氨基化修饰和羧基化修饰，将修饰后的纳米二氧化硅颗粒和酰胺反应溶液混合，20℃～37℃震荡4～8h，得到所述酰胺化修饰的纳米二氧化硅颗粒；

所述酰胺反应溶液包括如下浓度的组分：8～10mg/mL吗啉乙磺酸、30～40mg/mL碳二亚胺和50～60mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述氨基化修饰的步骤包括：将纳米二氧化硅颗粒和氨基化修饰溶液混合，20℃～37℃震荡4～8h后无水乙醇洗涤，得到氨基化修饰的纳米二氧化硅颗粒；

所述氨基化修饰溶液包括3-氨丙基三乙氧基硅的无水乙醇溶液；所述3-氨丙基三乙氧基硅的无水乙醇溶液中3-氨丙基三乙氧基硅的体积浓度为2％～6％。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述羧基化修饰的步骤包括：将氨基化修饰的纳米二氧化硅颗粒和羧基化修饰溶液混合，20℃～37℃震荡8～12h后二甲基亚砜洗涤，得到氨基化-羧基化修饰的纳米二氧化硅颗粒；

所述羧基化修饰溶液包括丁二酸酐的二甲基亚砜溶液；所述丁二酸酐的二甲基亚砜溶液中丁二酸酐的浓度为8～12mg/mL。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述子宫内膜异位症蛋白包括IL-10、IL-6和TNF-α中的一种或多种；

所述子宫内膜异位症蛋白捕获抗体包括IL-10捕获抗体、IL-6捕获抗体和TNF-α捕获抗体中的一种或多种；

所述检测抗体包括IL-10检测抗体、IL-6检测抗体和TNF-α检测抗体中的一种或多种；

所述荧光素酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和磷酸二酯酶中的一种或多种。

6.根据权利要求1～5任一项所述的子宫内膜异位症蛋白检测的试剂盒，其特征在于，所述子宫内膜异位症蛋白检测的试剂盒还包括微流控芯片、表面活性剂和链酶亲和素偶联的荧光素酶底物。

7.根据权利要求6所述的子宫内膜异位症蛋白检测的试剂盒，其特征在于，所述微流控芯片包括第一微通道、第二微通道以及汇聚所述第一微通道、第二微通道的总管路；

所述第一微通道用于输送内相流体；所述第二微通道用于输送外相流体。

8.根据权利要求7所述的子宫内膜异位症蛋白检测的试剂盒，其特征在于，所述第一微通道的管径为30～60μm，第二微通道的管径为30～60μm。

9.权利要求1～8任一项所述的试剂盒在制备子宫内膜异位症蛋白检测产品、子宫内膜异位症筛查产品和子宫内膜异位症辅助诊断产品中的一种或多种中的应用。

10.一种基于权利要求1～8任一项所述的试剂盒的非诊断目的的检测子宫内膜异位症蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将含有复合微球的溶液和待检测样本混合，20℃～37℃孵育2～4h后收集沉淀，洗涤，得到复合微球-样本偶联物；

将所述复合微球-样本偶联物和含有生物素标记的检测抗体的溶液混合，20℃～37℃孵育1～2h后收集沉淀，洗涤，得到复合微球-样本-检测抗体偶联物；

将所述复合微球-样本-检测抗体偶联物和含有链霉亲和素偶联的荧光素酶的溶液混合，20℃～37℃孵育30～60min，得到SiO₂三明治复合体微球；

向微流控芯片的第一微通道通入所述SiO₂三明治复合体微球、底物酶和琼脂糖的混合液；向微流控芯片的第二微通道通入含有表面活性剂的溶液；所述微流控芯片包括汇聚所述第一微通道、第二微通道的总管路；

控制第一微通道流速为50μL/h，第二微通道流速为110μL/h，收集总管路的液滴，进行荧光检测；若检测到荧光则说明待检测样本中含有检测子宫内膜异位症蛋白。