CN109776563B - 呕吐毒素半抗原及其制备方法、人工抗原、试剂盒及呕吐毒素的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种呕吐毒素半抗原及其制备方法、人工抗原、试剂盒及呕吐毒素的检测方法。其中，所述呕吐毒素半抗原的化学结构式(Ⅰ)如下：

Description

呕吐毒素半抗原及其制备方法、人工抗原、试剂盒及呕吐毒素 的检测方法

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术领域，特别是涉及一种呕吐毒素半抗原及其制备方法、人工抗原、试剂盒及呕吐毒素的检测方法。

背景技术

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DeoxynivaLenol)又称呕吐毒素(Vomitoxin)，其属于霉菌的单端孢菌素族，由某些镰刀霉真菌属产生。呕吐毒素多分布于小麦、大麦、玉米等谷物籽实样本中，含量通常是mg/kg级，由于其具有高的细胞毒素及免疫抑制性质，对人类及动物构成了健康威胁。

传统的呕吐毒素的主要检测方法有薄层色谱法、高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FD)，以及高效液相色谱-质谱检测法(HPLC-MS)，上述方法均存在检测限太低，设备操作复杂等问题。

发明内容

基于此，有必要提供一种快速、准确、方便的呕吐毒素半抗原及其制备方法、人工抗原、试剂盒及呕吐毒素的检测方法。

一种呕吐毒素半抗原，所述呕吐毒素半抗原的化学结构式(Ⅰ)如下：

上述呕吐毒素半抗原为人工构建的新型呕吐毒素半抗原，该抗原最大程度保留了呕吐毒素的官能团的结构特征，经此半抗原制备得到的呕吐毒素人工抗原能够发挥出最佳的构效优势，从而得到特异性强的抗体。

本发明还提供一种呕吐毒素半抗原的制备方法，其包括如下步骤：在pH为2.8-3.2下，将呕吐毒素和对肼基苯甲酸盐酸盐反应。

上述制备方法简单，在pH为2.8-3.2下，将对肼基苯甲酸盐酸盐加入呕吐毒素中反应制备人工半抗原，对肼基苯甲酸盐酸盐起到间隔臂作用，还能够防止大分子载体蛋白对半抗原的屏蔽效应，即在半抗原与载体结合时阻止抗原决定簇被包埋在卷曲凹陷的大分子结构中，不会对呕吐毒素分子抗原决定簇的结构造成不利影响，抗原决定簇的完全外露可以高效产生对应抗体。

其中一个实施例中，所述呕吐毒素与所述对肼基苯甲酸盐酸盐的质量比为295-300:185-200。

本发明还提供一种呕吐毒素人工抗原，所述人工抗原为本发明所述的呕吐毒素半抗原与第一载体蛋白的偶联物。

其中一个实施例中，所述第一载体蛋白为活化牛血清白蛋白。

本发明还提供一种呕吐毒素酶联免疫试剂盒，其包括采用本发明所述的人工抗原为免疫原得到的抗体。

其中一个实施例中，还包括包被有包被原的酶标板。

其中一个实施例中，所述包被原包括本发明所述的呕吐毒素半抗原与第二载体蛋白的偶联物。

其中一个实施例中，所述第二载体蛋白为卵清蛋白。

本发明还提供一种呕吐毒素的检测方法，其包括如下步骤：

将待测样本进行前处理；

用本发明任一实施方式中所述的呕吐毒素酶联免疫试剂盒对经过前处理的待测样本进行酶联免疫法检测；以及

分析检测结果。

本发明呕吐毒素酶联免疫试剂盒检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明一实施例提供了一种新型的呕吐毒素半抗原，所述呕吐毒素半抗原的化学结构式(Ⅰ)如下：

呕吐毒素的相对分子质量为296.32，为小分子物质，小分子物质在免疫反应中，只具有反应原性不具备免疫原性，需要与大分子载体蛋白才具有免疫原性，才能刺激机体发生免疫应答，从而产生抗体。

上述呕吐毒素半抗原为人工构建的新型呕吐毒素半抗原，该抗原最大程度保留了呕吐毒素的官能团的结构特征，经此半抗原制备得到的呕吐毒素人工抗原能够发挥出最佳的构效优势，从而得到特异性强的抗体。

本发明一实施例还提供了一种呕吐毒素半抗原的制备方法，其包括如下步骤：在pH为2.8-3.2下，将呕吐毒素和对肼基苯甲酸盐酸盐反应。

在其中一个实施例中，所述呕吐毒素与所述对肼基苯甲酸盐酸盐的质量比为295-300:185-200。进一步地，所述呕吐毒素与所述对肼基苯甲酸盐酸盐的质量比为296:188。

在其中一个实施例中，称取呕吐毒素(DON)标准样品296mg，溶于2mL的1mol/L柠檬酸缓冲液中，用盐酸调pH至3.0，加入对肼基苯甲酸盐酸盐188mg中，在室温下搅拌3h。3000转/min离心得到黄色沉淀，经真空干燥后得到半抗原，反应式如下：

上述制备方法简单，在pH为2.8-3.2下，将对肼基苯甲酸盐酸盐加入呕吐毒素中反应制备人工半抗原，对肼基苯甲酸盐酸盐起到间隔臂作用，还能够防止大分子载体蛋白对半抗原的屏蔽效应，即在半抗原与载体结合时阻止抗原决定簇被包埋在卷曲凹陷的大分子结构中，不会对呕吐毒素分子抗原决定簇的结构造成不利影响，抗原决定簇的完全外露可以高效产生对应抗体。

本发明一是实施例还提供一种呕吐毒素人工抗原，所述人工抗原为本发明一实施例所述的呕吐毒素半抗原与第一载体蛋白结合的偶联物。

在其中一个实施例中，所述第一载体蛋白为活化牛血清白蛋白(CBSA)。

包含本发明一实施方式中的呕吐毒素半抗原的呕吐毒素人工抗原抗原决定簇的完全外露可以高效产生对应抗体。

在其中一个实施例中，人工抗原的制备方法如下：

S1、称取本发明所述的呕吐毒素半抗原30mg，溶解于0.5mL的水中，制得呕吐毒素半抗原溶液。

S2、分别称取乙基二甲氨基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)20.0mg、N-羟基琥珀酰亚胺11.6mg，溶解于0.5mL的水中得到混合液，将混合液逐滴加入到S1制得的呕吐毒素半抗原溶液中，得到溶液A。

S3、制备活化牛血清白蛋白(CBSA)溶液：

将100μL质量浓度为10％的乙二胺溶液、5mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和5mg的乙基二甲氨基碳化二亚胺盐酸盐加入2mL浓度为5mg/mL的含牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲液(pH＝7.4)中，室温搅拌6h，之后透析得到4mL的CBSA溶液。

S4、在CBSA溶液中滴加溶液A，然后在4℃下缓慢搅拌反应20h得产物B。

S5、将产物B用pH 7.2的0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS)在4℃下透析72h，得到人工抗原，即为免疫原。

其中，CBSA为蛋白BSA与乙二胺联结而得到。将乙二胺联结到载体蛋白BSA上，这样大大增加载体蛋白的游离氨基数目，从而增加了载体蛋白上的氨基和呕吐毒素半抗原上的羧基的结合率。该方法可以大幅度提高抗体的成功获取率。

本发明还提供一种呕吐毒素酶联免疫试剂盒，其包括本发明一实施例所述的人工抗原为免疫原得到的抗体。

所述抗体优选为一抗工作液，具体的，所述一抗工作液的制备方法包括：以所述呕吐毒素人工抗原为免疫原免疫动物得到抗血清，从所述抗血清中纯化得到呕吐毒素单克隆抗体，再将单克隆抗体按照一定比例稀释成稀释液，即得到一抗工作液。优选地，免疫动物为BALb/c小鼠。可以理解，本发明的一抗工作液采用本领域常规的单抗制备方法即可，将末次免疫后血清效价为1:90000以上的实验Balb/c小鼠处死，分离血清，制备好后分装冻存。

本发明提供的呕吐毒素酶联免疫试剂盒还包括：包被有包被原的酶标板。

在其中一个实施例中，所述包被原包括呕吐毒素与对肼基苯甲酸盐酸盐得到的化合物与第二载体蛋白的偶联物，也即本发明的呕吐毒素半抗原与第二载体蛋白结合的偶联物。

用0.05mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液按照1:40000将包被原稀释，然后按照100ul/孔加入酶标板中，37℃孵育2h，取出酶标板甩掉板内液体，加入稀释后的浓缩洗液300ul/L孔，洗板2次，30s/c次，然后加入0.5％牛血清白蛋白(BSA)封闭，150ul/孔，37℃放置1.5h,弃去封闭液直接拍干，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封于4℃条件下保存。

在其中一个实施例中，所述第二载体蛋白为卵清蛋白。第一载体蛋白与第二载体蛋白的种类不同，有助于进一步地提高所述呕吐毒素酶联免疫试剂盒反应的特异性。

可以理解的是，本发明提供的呕吐毒素酶联免疫试剂盒还包括呕吐毒素酶标二抗工作液，优选地，呕吐毒素酶标二抗工作液为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗工作液。

在其中一个实施例中，本发明提供的呕吐毒素酶联免疫试剂盒还包括底物液A、底物液B、终止液。具体地，所述底物液A为含有0.5mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，所述底物液B为含有0.03％四甲基联苯二胺的柠檬酸溶液，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。

在其中一个实施例中，本发明提供的呕吐毒素酶联免疫试剂盒还包括10×浓缩稀释液和10×浓缩洗涤液，10×浓缩稀释液为0.1mol/L的PBS，pH值范围为7.0-7.5、10×浓缩洗涤液为含0.5％吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围为7.0-7.5。

进一步地，本发明提供的呕吐毒素酶联免疫试剂盒还包括呕吐毒素标准品，优选地，标准品的浓度分别为0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、4.05μg/L。

本发明还提供一种呕吐毒素的检测方法，其包括如下步骤：

S1、将待测样本进行前处理。

待测样本为米粉、小麦、大麦、玉米、面粉、燕麦等粮食样本。

在其中一个实施例中，待测样本进行前处理的方法为：

取5.0g粉碎的样本置入100mL具塞三角瓶中，加入25mL去离子水，于振荡器上剧烈振荡10分钟混匀，转速为150r/min，然后于4000r/min离心5min，静置3min，再用定量滤纸过滤，得滤液，取滤液1mL，再加入4mL去离子水，振荡5S,取50μL备用。

S2、用本发明一实施例中所述的呕吐毒素酶联免疫试剂盒对经过前处理的待测样本进行酶联免疫法检测。

在其中一个实施例中，步骤S2中用呕吐毒素酶联免疫试剂盒对经过前处理的待测样本进行酶联免疫法检测是指向包被了包被原的酶标板中加入标准品或待测样本(50μL)至对应的微孔中，再加入呕吐毒素酶标一抗工作液和呕吐毒素酶标二抗工作液，轻轻震荡均匀，之后盖板、吸板、加入底物液显色及终止液测定每孔OD值。

S3、分析检测结果。

百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100％，即：

B-标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀-0(μg/kg)标准溶液的平均吸光度值

标准曲线的绘制和计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，以呕吐毒素标准品浓度(μg/kg)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中呕吐毒素实际含量。

本发明呕吐毒素酶联免疫试剂盒的检测基于抗原抗体的间接竞争酶联免疫反应原理：在包被有包被原的酶标板上加入待测样本溶液，随后加入呕吐毒素酶标一抗工作液和呕吐毒素酶标二抗工作液，待测样本溶液中残留的呕吐毒素与酶标板上包被的包被原竞争一抗，与一抗结合的包被原所形成的抗原-抗体结合物再与酶标二抗工作液进一步结合反应后，加入底物液A、底物液B，酶标二抗上的辣根过氧化物酶与底物液A、B反应呈现蓝色，加入终止液，颜色由蓝色变为黄色，显色的深浅与样品(或标准品)中呕吐毒素的含量成负相关，再与标准曲线比较即可得出待测样本溶液中呕吐毒素的含量。

本发明呕吐毒素酶联免疫试剂盒检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

设备：

微孔板酶标仪450nm/630nm

涡旋仪(或选用振荡器)

离心机(或选用漏斗)

天平：感量0.01g

刻度移液管：10mL

聚苯乙烯离心管：50mL(或具塞三角瓶)

微量移液器：单道10μL～100μL、100μL～1000μL、多道30μL～300μL试剂：

去离子水

标准品溶液的制备

将呕吐毒素溶于pH 7.2的0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液中，分别得到浓度为0.05μg/L、0.15μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、4.05μg/L的标准品溶液，将pH7.2的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液作为标准品溶液的阴性对照液，即为0μg/L呕吐毒素标准品溶液。

样本前处理步骤：

取5.0g粉碎的样本置入100mL具塞三角瓶中，加入25mL去离子水，于振荡器上剧烈振荡10分钟混匀，转速为150r/min，然后于4000r/min离心5min，静置3min，再用定量滤纸过滤，得滤液，取滤液1mL，再加入4mL去离子水，振荡5S,取50μL备用。

洗涤液的配置：

将1份10×浓缩洗涤液按1:9体积比的去离子水稀释，用于酶标板的洗板。

呕吐毒素酶联免疫试剂盒的检测方法：

1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20～25℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、取出需要数量的酶标板(含包被原)，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2～8℃。该步骤中切勿冷冻。

3、洗涤液在使用前也需回温。

4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

5、分别加标准品、样本各50μL/孔到对应的微孔中，再加入呕吐毒素酶标一抗工作液和呕吐毒素酶标二抗工作液各50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。

6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液250μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；进一步地，拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破。

7、显色：加入底物液A液50μL/孔，再加底物液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境反应15min。

8、测定：加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm/630nm双波长检测，在5min内读完数据，测定每孔OD值。

9、定量分析

百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100％，即：

B-标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

AB₀-0(μg/kg)标准溶液的平均吸光度值

标准曲线的绘制和计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，以呕吐毒素标准品浓度(μg/kg)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中呕吐毒素实际含量。

试剂盒灵敏度包括方法灵敏度及方法的检测限，方法灵敏度为4μg/kg，线性相关系数为0.9999，样品最低检测限为100μg/kg，回收率为110±15％，试剂盒的变异系数均小于10％。检测的准确率可以达到95％以上。

呕吐毒素酶联免疫试剂盒的特异性是通过相应的物质交叉反应试验来确定，结果如下：

分别配置呕吐毒素、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇的标准品，按照呕吐毒素酶联免疫试剂盒的检测方法中的步骤进行，按照如下公式：

计算交叉反应率，结果如下。

呕吐毒素(脱氧雪腐镰刀菌烯醇)……………………100％

3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇…………………………70％

15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇………………………59％

由此说明，本发明制备的呕吐毒素酶联免疫试剂盒检测呕吐毒素类的广谱性好。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种呕吐毒素半抗原，其特征在于，所述呕吐毒素半抗原的化学结构式(Ⅰ)如下：

2.一种权利要求1所述的呕吐毒素半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：在pH为2.8-3.2下，将呕吐毒素和对肼基苯甲酸盐酸盐反应，得到所述呕吐毒素半抗原。

3.根据权利要求2所述的呕吐毒素半抗原的制备方法，其特征在于，所述呕吐毒素与所述对肼基苯甲酸盐酸盐的质量比为295-300:185-200。

4.一种呕吐毒素人工抗原，其特征在于，所述人工抗原为权利要求1所述的呕吐毒素半抗原与第一载体蛋白的偶联物。

5.根据权利要求4所述的呕吐毒素人工抗原，其特征在于，所述第一载体蛋白为活化牛血清白蛋白。

6.一种呕吐毒素酶联免疫试剂盒，其特征在于，包括采用权利要求4所述的人工抗原为免疫原得到的抗体。

7.根据权利要求6所述的呕吐毒素酶联免疫试剂盒，其特征在于，还包括包被有包被原的酶标板。

8.根据权利要求7所述的呕吐毒素酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述包被原包括权利要求1所述的呕吐毒素半抗原与第二载体蛋白的偶联物。

9.根据权利要求8所述的呕吐毒素酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述第二载体蛋白为卵清蛋白。

10.根据权利要求6所述的呕吐毒素酶联免疫试剂盒，其特征在于，还包括呕吐毒素酶标二抗工作液。