CN106568941A - 一种检测丙环唑的酶联免疫试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一种检测丙环唑的酶联免疫试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106568941A CN106568941A CN201510657826.XA CN201510657826A CN106568941A CN 106568941 A CN106568941 A CN 106568941A CN 201510657826 A CN201510657826 A CN 201510657826A CN 106568941 A CN106568941 A CN 106568941A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- propiconazole
- solution
- detection
- preparation
- enzyme linked
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明为检测丙环唑的酶联免疫试剂盒及其检测方法,其检测灵敏、准确、快速,操作简便、特异性强,适用于大批样品的检测。所述试剂盒包括:包被丙环唑抗原的酶标板、丙环唑标准品、丙环唑抗体工作液、丙环唑酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。检测丙环唑的酶联免疫试剂盒的原理是固相间接竞争酶联免疫反应,把提取的样品、酶标二抗工作液和抗体工作液加入对应的酶标板微孔中,孵育一段时间后,洗板加入底物液A、底物液B,在酶的作用下显色剂呈现蓝色,加入终止液,颜色由蓝色变为黄色。显色的深浅与标准品或样品中丙环唑的含量成反比例关系。该方法可直接用于检测农作物中丙环唑的残留量。
Description
技术领域
本发明涉及兽药残留检测技术领域,特别是检测大米中丙环唑的酶联免疫试剂盒。
背景技术
丙环唑(propiconazole)是一种具有治疗和保护双重作用的内吸性三唑类新型广谱性杀菌剂,可被根、茎、叶部吸收,并能很快地在植物株体内向上传导,防治子囊菌、担子菌和半知菌引起的病害,特别是对小麦全蚀病、白粉病、锈病、根腐病、水稻恶苗病、纹枯病、香蕉叶斑病等病害具有特效,可有效地防治大多数高等真菌引起的病害,但对卵菌类病害无效。
酶联免疫吸附法是一种准确、可靠、快速、特异的检测方法,适合于大批样品的快速筛选,近年来已广泛应用于食品安全检测行业。本发明旨在建立一种检测丙环唑的酶联免疫试剂盒及其检测方法。
发明内容
为了克服色谱法的不足,本发明提供一种检测丙环唑的酶联免疫试剂盒及其检测方法。该方法灵敏、准确、快速,操作简便、特异性强,适用于大批样品的快速检测。
本发明检测丙环唑的酶联免疫试剂盒,包括酶标板、丙环唑标准品、丙环唑抗体工作液、丙环唑酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。
本发明检测丙环唑的酶联免疫试剂盒的制备,包括以下步骤:酶标板的制备、丙环唑标准品的制备、丙环唑抗体工作液的制备、丙环唑酶标二抗工作液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩稀释液的制备和浓缩洗涤液的制备。
其进一步特征在于:所述的酶标板经由丙环唑抗原包被制备,具体步骤是将丙环唑半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到包被抗原,用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液,将丙环唑包被抗原稀释成1:40000比例,100 μL/孔,37℃避光孵育2 h,取出酶标板甩掉板内液体,加入经稀释的浓缩洗涤液300 μL/孔,洗板2次,30 s/次,然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液,150 μL/孔,37℃放置1.5 h,甩掉封闭液直接拍干,拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干,抽检合格后将酶标板真空密封于4℃条件下保存。
丙环唑标准品浓度分别为0 mg/kg、0.1mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg。
所述丙环唑抗体工作液是采用丙环唑人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体,用抗体稀释液稀释成1:60000比例制备。
所述丙环唑酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释液稀释成1:2000比例,所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液,所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液,所述终止液为2
mol/L的硫酸,所述浓缩稀释液是10倍浓缩稀释液,为0.1
mol/L的PBS,pH值范围7.0-7.5之间,所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液,为含0.5% 吐温-20,0.1 mol/L的PBST,pH值范围7.0-7.5之间。
检测丙环唑的酶联免疫试剂盒及其检测方法,基于抗原抗体的间接竞争酶联免疫反应原理,该方法包括以下步骤:
(1)预处理待测样品,即将待测试的样品处理为液体样品,或者用有机溶剂提取待测样品,并将其复溶于样品稀释液中;
(2)将所需试剂从冷藏环境中取出,置于室温(20~25℃)平衡30 min以上,注意每种液体试剂使用前均须摇匀;
(3)取包被有丙环唑抗原的酶标板,加标准品/样本50 μL/孔到对应的微孔中,加入丙环唑酶标二抗工作液,50 μL/孔,然后加入丙环唑抗体工作液,50 μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30
min;
(4)小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,用洗涤工作液260 μL/孔,充分洗涤4~5次,每次间隔10 s,用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破);
(5)加入底物液A 50 μL/孔,底物液B 50 μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15~20 min;
(6)加入终止液50 μL/孔,轻轻振荡混匀,设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630
nm检测,测定每孔吸光度值(请在5 min内读完数据);
(7)以的标准品浓度(ppb)的对数为横坐标,标准品百分吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线,对照标准曲线计算样品中丙环唑的含量。
本发明检测丙环唑的酶联免疫试剂盒及其检测方法的测定原理:样品中的丙环唑与酶标板上固定的抗原特异性竞争抗体,加入酶标二抗,与抗体反应,通过酶催化显色剂显色,根据显色的深浅来判断样品中丙环唑的含量。如果样品中的丙环唑含量少,显色深;反之,则显色浅。本发明的试剂盒检测方法操作简便,检测灵敏、准确、快速,适用于大批量样品的快速检测。
具体实施方式
丙环唑蛋白质偶联物的制备:
采用琥珀酸酐法得到带羧基的丙环唑半抗原衍生物,之后取0.05 mmol与载体蛋白BSA按10:1的结合比混合在0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)中,然后加入0.15 mmol碳二亚胺,搅拌置室温反应24 h,最后于0.2 mol/L pH 7.6的PBS缓冲液中透析两天,除去未反应的半抗原,将得到的蛋白质偶联物溶液于-20℃保存备用。
丙环唑抗体的制备:
选用健康成年纯种BALA/C小鼠,取与蛋白质偶联制备的免疫抗原50μg与等量完全弗氏佐剂混合采用腹腔注射进行初次免疫,之后每隔3周用相同剂量免疫抗原加等量不完全弗氏佐剂采用腹腔注射进行二次、三次免疫,每次免疫6天后尾静脉采血测定抗血清效价至一定滴度后,用相同剂量不加佐剂进行末次免疫,3天后取脾制备脾细胞悬浮液与骨髓瘤细胞进行细胞融合,筛选出所需要的杂交瘤细胞系进行克隆化,选择处于对数生长期的杂交瘤细胞进行冻存,用于腹水制备,先腹腔注射0.5
ml液体石蜡于BALB/C鼠致敏,2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞,接种细胞7-10天后可产生腹水,待腹水尽可能多时用注射器抽取腹水,反复收集数次,4000
rpm离心15 min,收集上清,采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水对单克隆抗体进行纯化,冷冻干燥得冻干粉后于-20 ℃保存备用。
制备包被有丙环唑包被抗原的酶标板:
包被抗原是将丙环唑半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到的,用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液,将丙环唑抗原稀释成1:40000比例,100
µL/孔,37℃放置2 h,取出酶标板甩掉板内液体,用稀释后的浓缩洗涤液300 µL/孔,洗板2次,30 s/次,然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭,150 µL/孔,37℃放置1.5 h,弃去封闭液,拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干,抽检合格后将酶标板真空密封后置4℃下保存。
丙环唑标准品配制浓度分别为0 mg/kg、0.1mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg。
丙环唑抗体工作液的制备:采用丙环唑人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体,用抗体稀释液稀释成1:60000比例制备。
丙环唑酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释液稀释成1:2000比例,底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液,底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液,终止液为2
mol/L的硫酸,浓缩稀释液是10倍浓缩稀释液,为0.1
mol/L的PBS,pH值范围7.0-7.5之间,浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液,为含0.5% 吐温-20,0.01mol/L的PBST,pH值范围7.0-7.5之间。
基于上述制备的试剂,本发明用于检测丙环唑的酶联免疫试剂盒包括如下材料:
(1)96孔酶标板×1块;
(2)标准液×6瓶:(1mL/瓶) 0 mg/kg、0.1mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg;
(3)抗体工作液
7 mL;
(4)酶标二抗工作液 7 mL;
(5)底物液A
7 mL;
(6)底物液B
7 mL;
(7)终止液
7 mL;
(8)10×浓缩稀释液 40 mL;
(9)10×浓缩洗涤液 40 mL;
本发明的试剂盒用于检测农作物样本中丙环唑残留量时,通过以下步骤实施:样品预处理、用本发明试剂盒进行检测、分析结果。
(1)用本发明试剂盒检测待测样品中丙环唑残留量
取包被有丙环唑抗原的酶标板,加标准品/样本50 µL/孔到对应的微孔中;加入酶标二抗工作液,50
µL/孔,然后加入丙环唑抗体工作液,50 µL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30
min;小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,用洗涤工作液300 µL/孔,充分洗涤4次,浸泡15-30 s,用吸水纸拍干;加入底物液A 50 µL/孔,底物液B 50
µL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15 min;加入终止液50 µL/孔,轻轻振荡混匀,设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630
nm检测,测定每孔吸光度值(请在5 min内读完数据);对比待测样品与标准品的吸光度值大小,定量分析待测样品中丙环唑残留量。
(2)分析结果
百分吸光度值的计算,标准品或样本的百分吸光度值等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值,再乘以100%,即
百分吸光度值(%) =B/B0×100%
其中B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值,B0—0 ppb标准溶液的平均吸光度值。
以丙环唑的标准品浓度(ppb)的对数为横坐标,标准品百分吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线,求出直线方程。将样本的百分吸光度值代入标准曲线中,从标准曲线上读出样本所对应的浓度,乘以其对应的稀释倍数即为样本中丙环唑的实际浓度。
Claims (7)
1.检测丙环唑的酶联免疫试剂盒及其检测方法,包括酶标板、丙环唑标准品、丙环唑抗体工作液、丙环唑酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。
2.检测丙环唑的酶联免疫试剂盒及其检测方法,包括以下步骤:酶标板的制备、丙环唑标准品的制备、丙环唑抗体工作液的制备、丙环唑酶标二抗工作液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩稀释液的制备和浓缩洗涤液的制备。
3.根据权利要求2所述的检测丙环唑的酶联免疫试剂盒及其检测方法,其特征在于:所述的酶标板制备方法为将丙环唑半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到丙环唑包被抗原,用0.05
mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液,将包被抗原稀释成1:40000比例,100 μL/孔,37℃孵育2 h,取出酶标板甩掉板内液体,加入稀释后的浓缩洗涤液300 μL/孔,洗板2次,30 s/次,然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭,150 μL/孔,37℃放置1.5 h,弃去封闭液直接拍干,拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干,抽检合格后将酶标板真空密封于4℃条件下保存。
4.根据权利要求2所述的检测丙环唑的酶联免疫试剂盒及其检测方法,其特征在于:丙环唑标准品的浓度分别为0 mg/kg、0.1mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg。
5.根据权利要求2所述的检测丙环唑的酶联免疫试剂盒及其检测方法,其特征在于:所述的丙环唑抗体工作液是采用丙环唑人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体,用抗体稀释液稀释成1:60000比例制备。
6.根据权利要求2所述的一种检测丙环唑的酶联免疫试剂盒及其检测方法,其特征在于:所述的丙环唑酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释液稀释成1:2000比例,所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液,所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液,所述终止液为2 mol/L的硫酸,所述浓缩稀释液是10倍浓缩稀释液,其为0.1 mol/L的PBS,pH值范围7.0-7.5之间,所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液,其为含0.5% 吐温-20,0.01 mol/L的PBST,pH值范围7.0-7.5之间。
7.权利要求2所述的检测丙环唑的酶联免疫试剂盒及其检测方法,基于抗原抗体的间接竞争酶联免疫反应原理,该方法的特征在于:预处理待测样品,取包被有丙环唑抗原的酶标板,按序分别加入标准品/样本、丙环唑酶标二抗工作液、丙环唑抗体工作液各50 μL/孔到对应的微孔中,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30 min,将孔内液体甩干,用洗涤工作液充分洗涤4~5次,每次间隔10 s,拍干后加入底物液A 50 μL/孔,底物液B 50 μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15~20 min,加入终止液50 μL/孔,轻轻振荡混匀,设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630
nm检测,测定每孔吸光度值(请在5
min内读完数据),以的标准品浓度(ppb)的对数为横坐标,标准品百分吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线,对照标准曲线计算样品中丙环唑的含量。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510657826.XA CN106568941A (zh) | 2015-10-13 | 2015-10-13 | 一种检测丙环唑的酶联免疫试剂盒及其检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510657826.XA CN106568941A (zh) | 2015-10-13 | 2015-10-13 | 一种检测丙环唑的酶联免疫试剂盒及其检测方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106568941A true CN106568941A (zh) | 2017-04-19 |
Family
ID=58508625
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510657826.XA Withdrawn CN106568941A (zh) | 2015-10-13 | 2015-10-13 | 一种检测丙环唑的酶联免疫试剂盒及其检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN106568941A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112225725A (zh) * | 2020-09-04 | 2021-01-15 | 华南农业大学 | 一种丙环唑半抗原、完全抗原和其抗体及其制备和应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104655847A (zh) * | 2013-11-20 | 2015-05-27 | 南京亿特生物科技有限公司 | 检测阿德呋啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法 |
-
2015
- 2015-10-13 CN CN201510657826.XA patent/CN106568941A/zh not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104655847A (zh) * | 2013-11-20 | 2015-05-27 | 南京亿特生物科技有限公司 | 检测阿德呋啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112225725A (zh) * | 2020-09-04 | 2021-01-15 | 华南农业大学 | 一种丙环唑半抗原、完全抗原和其抗体及其制备和应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104655846A (zh) | 一种检测孕酮的酶联免疫试剂盒及其检测方法 | |
CN104655847A (zh) | 检测阿德呋啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法 | |
CN102206270B (zh) | 石房蛤毒素人工抗原和抗体及其制备方法和应用 | |
CN105510589A (zh) | 检测多菌灵的酶联免疫试剂盒及其检测方法 | |
CN105067599A (zh) | 一种检测胃泌素释放肽前体的化学发光免疫检测试剂盒 | |
CN105319368A (zh) | 检测玉米赤霉烯酮的酶联免疫试剂盒及其检测方法 | |
CN105572336A (zh) | 检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法 | |
CN106568961A (zh) | 一种检测百草枯的酶联免疫试剂盒及其检测方法 | |
CN106610431A (zh) | 一种检测苯霜灵的酶联免疫试剂盒及其检测方法 | |
CN115541882B (zh) | 一种提高人类免疫缺陷病毒抗体检测试纸条的制备方法、试剂盒 | |
CN106568941A (zh) | 一种检测丙环唑的酶联免疫试剂盒及其检测方法 | |
CN106610432A (zh) | 一种检测灭多威的酶联免疫试剂盒及其检测方法 | |
CN105319353A (zh) | 一种检测二氢吡啶类药物残留的酶联免疫试剂盒的制备 | |
CN106610426A (zh) | 一种检测乙草胺的酶联免疫试剂盒及其检测方法 | |
CN105301245A (zh) | 一种用于检测盐酸赛庚啶的酶联免疫试剂盒的制备 | |
CN111289753B (zh) | 一种检测香豆素与茚满二酮类杀鼠剂的酶联免疫试剂盒及其制备和应用 | |
CN102680677A (zh) | 一种检测氧氟沙星的酶联免疫试剂盒及检测方法 | |
CN106568964A (zh) | 一种检测丁草胺的酶联免疫试剂盒及其检测方法 | |
CN113125729A (zh) | 一种检测橘青霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法 | |
CN104569398B (zh) | 检测乙氧基喹啉的酶联免疫试剂盒及其应用 | |
CN105572343A (zh) | 一种检测毒死蜱的酶联免疫试剂盒及其检测方法 | |
CN113125728A (zh) | 一种检测杂色曲霉毒素的酶联免疫试剂盒制备 | |
CN105510588A (zh) | 一种检测草甘磷的酶联免疫试剂盒及其检测方法 | |
CN108226476A (zh) | 一种检测马杜霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法 | |
CN105277705A (zh) | 一种检测双胍类药物残留的试剂盒的制备及其检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20170419 |
|
WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |