CN106568752B - 一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，该方法利用包埋有量子点的荧光微球替代常规的酶载体与玉米赤霉烯酮偶联，以偶联产物作为竞争抗原执行直接竞争ELISA。在技术路线中，本发明首先依据发光特性选择了适宜的量子点，进一步设计了基于荧光微球技术的量子点包埋方法，在此基础上，将量子点荧光微球经BSA包被后与玉米赤霉烯酮偶联，从而得到了性能更好的竞争性抗原。该技术方案中，荧光微球通过高聚物载体包埋了大量的量子点，因而具有更高的发光强度，可有效地提高检测的灵敏度；而且，由于荧光微球具有较大的粒径，因此可在一定程度上降低竞争抗原与包被抗体之间过高的亲和力，从而提升检测的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及抗原检测技术领域，进一步涉及基于荧光免疫学分析的抗原检测技术，具体涉及一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法。
背景技术
玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)又称F-2毒素是一个被世界广为关注的毒素，它最初是从有赤霉病的玉米种分离得到的，主要由镰刀菌属的菌株产生，如禾谷镰刀菌和三线镰刀菌、黄色联孢、半裸镰孢等菌种。一般容易受到赭曲霉毒素污染的食品包括：玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物。其中玉米的阳性检出率最高，为45％，最高含毒量可达到2909mg/kg。玉米赤霉烯酮在结构上与内源性雌激素相似，能竞争性地与雌激素受体结合，从而造成动物体内生殖系统紊乱，严重影响动物的生殖机能。妊娠期的动物食用含玉米赤霉烯酮的食物可引起流产、死胎和畸胎。同时，镰刀菌毒素类可引起人畜急、慢性中毒，还具有致畸、致癌和致突变的潜在危害，且在自然界分布极为广泛，被看作是同黄曲霉毒素一样自然发生的最危险的食品污染物。因此，世界各国纷纷制订真菌毒素的限量标准以防止超标毒素进入食物链。随着人们对食品安全问题关注度的提高，国内外毒素的限量标准也在不断降低，使得建立超灵敏的检测方式检测玉米赤霉烯酮对人类健康有着非常重要的意义。
基于免疫学的快速筛查方法因具有通量高、检测快速、成本低等优势，近年来得到广泛的推广和应用。其中竞争酶联免疫吸附法在小分子抗原的检测中扮演了重要角色，常规竞争酶联免疫吸附法采用辣根过氧化物酶催化四甲基联苯胺显色作为信号源，这种简单的催化底物显色作为信号导致了常规竞争酶联免疫吸附法检测范围在μg/mL到ng/mL之间，远远满足不了食品污染检测pg/mL的检测要求。目前，用于提高直接竞争免疫学分析方法检测灵敏度的策略主要有两个方面：一是提高检测信号的灵敏度，如等离子共振免疫吸附法、化学发光免疫吸附法、拉曼散射免疫吸附法及荧光免疫吸附法等；二是降低竞争抗原与抗体的亲和力，如化学合成结构类似物及生物合成模拟表位等。
在传统直接竞争酶联免疫吸附法中，竞争抗原的制备是通过将小分子半抗原与载体蛋白(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)偶联。由于载体蛋白的尺寸较小，导致竞争抗原与相应抗体的亲和力较高，无法被目标物所竞争。相对于载体蛋白，纳米颗粒具有更大的尺寸和重量，在相同的温度下，其布朗运动更慢。使用纳米颗粒作为小分子半抗原的载体可以合成出亲和力更低的竞争抗原，从而更容易被目标分析物竞争，进而获得更高的检测灵敏度。此外，使用纳米材料替代蛋白作为竞争抗原的载体，有效地规避了传统化学合成或生物合成抗原类似物的局限性，如操作复杂繁琐、费时费力以及偶然性大等。基于上述技术优势，纳米颗粒的抗原载体受到了广泛的关注，然而在载体的选择方面，既应当考虑分子层面的偶联效果，同时还应当具有良好的发光特性。近年来，量子点以其宽激发、窄发射、斯托克斯位移大和耐光漂白等优良的光学特性在免疫学分析中得到了广泛应用，有研究者尝试利用量子点代替常规载体HRP、ALP，然而实际研究中发现量子点与抗原的结合效果不理想，相应的发光性能难以保证，同时由于量子点本身性质不稳定，因此易受环境影响而发生荧光淬灭，此外，由于量子点的粒径仍相对较小，因此一方面存在分离纯化不方便的问题，另一方面仍会导致竞争抗原和抗体之间亲和力过高的现象。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，以解决现有技术中针对玉米赤霉烯酮的检测方法灵敏性较低的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术中针对玉米赤霉烯酮的直接竞争ELISA法因显色底物发光性能不佳而导致检测灵敏度较低。
本发明要解决的再一技术问题是现有技术中针对玉米赤霉烯酮的直接竞争ELISA法因竞争性抗原与抗体的亲和力过高而导致检测灵敏度较低。
本发明要解决的又一技术问题是以期通过量子点替代酶载体来执行直接竞争ELISA、以检测玉米赤霉烯酮含量的方法中，量子点的发光性能难以得到保证。
本发明要解决的又一技术问题是以期通过量子点替代酶载体来执行直接竞争ELISA、以检测玉米赤霉烯酮含量的方法中，量子点的化学稳定性较低。
本发明要解决的又一技术问题是以期通过量子点微球替代酶载体来执行直接竞争ELISA、以检测玉米赤霉烯酮含量的方法中，量子点微球与玉米赤霉烯酮的偶联效果不佳。
本发明要解决的又一技术问题是以期通过量子点微球替代酶载体来执行直接竞争ELISA、以检测玉米赤霉烯酮含量的方法中，量子点微球与玉米赤霉烯酮偶联后导致玉米赤霉烯酮的抗原抗体结合性能下降。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，该方法属于直接竞争ELISA法，其中与玉米赤霉烯酮偶联的载体是标记有羧基修饰的量子点的荧光微球。
作为优选，包括以下步骤：
1)在酶标板上包被抗体；
2)制备标记有羧基修饰的量子点的荧光微球；
3)将步骤2)所得产物与玉米赤霉烯酮偶联，即得到竞争抗原；
4)将待测溶液与所述竞争抗原加入至步骤1)包被有抗体的酶标板中，抗原抗体结合反应，而后检测酶标板的荧光强度。
作为优选，步骤2)所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球是通过以下方法制备的：以氯仿为溶剂，配制油酸基团修饰的量子点浓度为15～25mg/mL、PMMA浓度为25～35mg/mL、PMAO浓度为15～25mg/mL的混合溶液，保持25～35min，而后将取十二烷基磺酸钠水溶液与所述混合溶液混合至其中油酸基团修饰的量子点浓度为3～4mg/mL，混合均匀后去除氯仿，固液分离取固相，即得到标记有羧基修饰的量子点的荧光微球。在此基础上进一步优选的：所述混合均匀可以是在超声震荡条件下实现的；所述固液分离可以是通过离心实现的；固液分离取固相后可以用超纯水洗涤，洗涤次数可以是三次，洗涤后的产物可以在超纯水中于4℃保存。
作为优选，所述量子点是CdSe/ZnS量子点。
作为优选，所述量子点的激发波长为365nm、发射波长为540nm。
作为优选，所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，其粒径为250nm，其最大荧光发射波长540nm。
作为优选，氯仿的去除是利用旋蒸实现的。
作为优选，步骤3)具体包括以下操作：利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，将包被产物与玉米赤霉烯酮偶联，即得到竞争抗原。
作为优选，所述利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，包括以下步骤：在磷酸盐缓冲液中将标记有羧基修饰的量子点的荧光微球与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、牛血清白蛋白混合，至溶液中牛血清白蛋白的质量体积分数为0.8％～1.2％，于35～39℃反应25～35min，而后补加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺3～5次，每次补加后于35～39℃反应25～35min，补加全部完成后固液分离取固相，洗涤后溶解于碳酸氢钠溶液中。在以上的优选技术方案中，为了获得高的重复性，牛血清白蛋白采用了饱和标记。在此基础上进一步优选的：补加的次数可以是4次；所述磷酸盐缓冲液的初始浓度可以是0.04～0.06mol/L，其pH可以是5.8～6.2；每次重复补加的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的量可以相等；取固相后可以用超纯水洗涤，洗涤次数可以是三次(该洗涤步骤用于去除多余的BSA)；所述碳酸氢钠溶液的pH可以是8.2～8.6；溶解于碳酸氢钠溶液中以后可以于4℃保存。
作为优选，步骤3)中的固液分离是以12000～15000rpm的转速离心8～12min。
作为优选，标记有羧基修饰的量子点的荧光微球与玉米赤霉烯酮之间的偶联是利用活泼酯法实现的。
作为优选，经BSA包被的标记有羧基修饰的量子点的荧光微球与玉米赤霉烯酮之间的偶联是利用活泼酯法实现的。
作为优选，所述偶联包括以下步骤：在无水四氢呋喃环境下，取二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、玉米赤霉烯酮混合活化；收集活化后的玉米赤霉烯酮，按照活化后的玉米赤霉烯酮与所述包被产物上牛血清白蛋白二者摩尔比为1:8～1:12将玉米赤霉烯酮与所述包被产物混合，在pH为8.4～8.8、室温条件下反应10～14h，收集产物，洗涤后溶解于水中。
在以上技术方案中，为获得不同亲和力的竞争性抗原，可以通过控制玉米赤霉烯酮与牛血清白蛋白包被的量子点微球上的牛血清白蛋白的摩尔比来实现，具体用量及操作条件可依据活泼酯法的一般技术常识进行适应性选择；当然，玉米赤霉烯酮与牛血清白蛋白包被的量子点微球上的牛血清白蛋白之间具体标记摩尔可以比分别为5:1、1:1、1:5、1:10、1:20，优选为1:10。
作为优选，所述抗原抗体反应的条件是在35～39℃反应25～35min。
作为优选，步骤4)中竞争性抗原及待测样品的加入量均为40～60μL/孔；更优的是50μL/孔。
作为优选，经抗原抗体反应后，先用含0.05％吐温20的0.01M磷酸盐缓冲液洗涤酶标板三次，再用0.01M的磷酸盐缓冲液洗涤酶标板1次，再检测荧光强度。
在以上技术方案中，检测得到的荧光强度即用于反应待测样品中玉米赤霉烯酮的含量，实际操作中可利用已知浓度且呈梯度分布的玉米赤霉烯酮标准溶液，通过以上方法绘制百分荧光率(百分荧光率(％)＝F/F0×100％，其中F0为第一个标准(0标准)的荧光强度值，F为标准品或样本的荧光强度值的平均值)——玉米赤霉烯酮浓度的标准曲线，再利用待测样品的荧光强度计算出相应的百分荧光率，然后从标准曲线中计算待测样品的玉米赤霉烯酮含量。具体操作方法可依据本技术领域的一般技术常识进行适应性选择。上述梯度分布的玉米赤霉烯酮的标准液，可以分别选择0.00pg/mL、0.06pg/mL、0.12pg/mL、0.25pg/mL、0.50pg/mL、1.00pg/mL、2.00pg/mL、4.00pg/mL、8.00pg/mL、16.00pg/mL。
在以上技术方案中，各试剂在使用前可以先于室温平衡30min以上再使用。所述PMAO是马来酸酐/1-十八碳烯交替共聚物，所述PMMA是聚甲基丙烯酸甲酯，二者均可自市面购得。所述油酸基团修饰的量子点可以依据本领域的常规技术制备获得。
本方法适用于玉米赤霉烯酮的定量检测，特别是适合于痕量玉米赤霉烯酮的检测。样品处理可以按照本技术领域相关国标方法执行。
采用本发明技术方案具有如下有益效果：
1、本发明通过微乳液法将单个的荧光量子点包埋至聚合物微球中，制备出了发光强度更高的荧光量子点微球，其发光强度较相应的量子点提高了2800倍；此外，由于量子点包裹在微球的内部，受外界环境(溶剂、热、电、磁等)影响小，在壳结构的保护下性质更稳定，在一定程度上避免了荧光的淬灭以及微球的聚沉。同时，量子点微球的粒径约为几十到几百纳米，分离纯化较量子点简便，低转速(<10000rpm)离心就能实现常规溶液中的微球分离。
2、本发明方法通过使用油溶性量子点制备高发光的量子点荧光微球用于代替量子点直接用于常规免疫学荧光标记，大大地提高了荧光信号输出的强度，有利于提高检测灵敏度。
3、本发明方法通过使用粒径更大的量子点微球替代小的蛋白粒子作为玉米赤霉烯酮的偶联载体，可以获得不同亲和力的竞争抗原，且亲和力变化范围更宽，有助于提高直接竞争免疫学分析的检测灵敏度。
4、本发明技术通过利用高发光的量子点微球替代传统酶催化的化学显色信号，减少了酶催化的步骤，因此操作更简单，检测时间更短。
本发明提供了一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，该方法利用包埋有量子点的荧光微球(Quantum dot beads,QBs)替代常规的酶载体与玉米赤霉烯酮偶联，以偶联产物作为竞争抗原执行直接竞争ELISA。在技术路线中，本发明首先依据发光特性选择了适宜的量子点，进一步设计了基于荧光微球技术的量子点包埋方法，在此基础上，将量子点荧光微球经BSA包被后与玉米赤霉烯酮偶联，从而得到了性能更好的竞争性抗原。
该技术方案中，荧光微球通过高聚物载体包埋了大量的量子点，因而具有更高的发光强度，可有效地提高检测的灵敏度。此外，由于量子点包裹在微球的内部，受外界环境(溶剂、热、电、磁等)影响小，在壳结构的保护下性质更稳定，在一定程度上避免了荧光的淬灭以及微球的聚沉。同时，量子点微球的粒径约为几十到几百纳米，分离纯化较量子点简便，低转速(<10000rpm)离心就能实现常规溶液中的微球分离；而且，由于荧光微球具有较大的粒径，因此可在一定程度上降低竞争抗原与包被抗体之间过高的亲和力，从而提升检测的灵敏度。
附图说明
图1是本发明方法原理示意图；
图2是本发明实施例1中玉米赤霉烯酮直接酶联免疫吸附法的标准曲线；
图3是本发明实施例1中玉米样本中玉米赤霉烯酮直接竞争荧光免疫学分析的标准曲线。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
在以下试验中，磷酸盐缓冲液(PBS，0.05M，pH 7.4)的配置方法如下：NaCl 40g，Na2HPO4 13.5g，KH2PO4 1.0g，KCl 1.0g溶于1L超纯水中。用0.1M NaOH调pH值至8.0～9.0。
实施例中所涉及的鼠源性IgG类单克隆抗体：抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体，均由无锡中德伯尔生物技术有限公司提供，本实验所涉及的玉米赤霉烯酮及其他试剂均购买自Sigma公司。
实施例1
1、羧基修饰的量子点荧光微球
10mg油酸基团修饰后的量子点(该量子点的激发波长为365nm，发射波长为540nm)溶解在0.5mL的氯仿中，再加入15mg的甲基丙烯酸甲酯和10mg的1-马来酸酐聚合物，半小时后该混合液重新溶解在2.5mL的磺酸钠水溶液中最终浓度约3.3mg/mL，该混合液在超声条件下混匀，混匀后用旋蒸的方法除去氯仿这个非极性有机溶剂后得到水溶性羧基修饰的量子点荧光微球通过离心的方式将量子点荧光微球分离下来，分离后的量子点荧光微球用超纯水洗涤三次。洗涤后的量子点荧光微球重新溶解在超纯水中4℃保存。
2、牛血清白蛋白包被的量子点微球的制备
将水溶性羧基修饰的量子点荧光微球溶解于pH 6.0，0.05mol/L磷酸盐缓冲液中，加入适量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐后，加入质量体积分数为1％的牛血清白蛋白，37℃反应半小时，半小时后继续加入等量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，重复补加四次，该牛血清白蛋白饱和包被的量子点荧光微球在14000rpm下离心10min，去掉上清后用超纯水洗涤三次去除多余的血清白蛋白，离心后的量子点荧光微球复溶在pH 8.4的碳酸氢钠溶液中，4℃保存。
3、以辣根过氧化物酶为标记酶、以四甲基联苯胺作为显色底物的玉米赤霉烯酮直接竞争酶联免疫吸附法
传统酶联免疫吸附法试剂盒用于检测玉米和玉米产品中的玉米赤霉烯酮残留量时，通过以下步骤实施：样品前处理、用传统试剂盒进行检测、分析结果。
(1)样品前处理
样品前处理按国标进行。
(2)用传统酶联免疫吸附法试剂盒进行检测上述样品中玉米赤霉烯酮残留量
取包被有抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的酶标板，加标准品/样本50μL/孔到对应的微孔中；加入辣根过氧化物酶标记的玉米赤霉烯酮工作液，50μL/孔，用盖板膜盖板后置室温37℃避光环境中反应45min；小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液340μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；加入四甲基联苯胺显色液，100μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应15min；加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处检测，测定每孔吸光度值(请在5min内读完数据)；对比待测样品与标准品的吸光度值大小，定量分析待测样品中的玉米赤霉烯酮的残留量。
(3)分析结果
用传统酶联免疫吸附法试剂盒中的13个玉米赤霉烯酮标准品浓度0ng/mL、0.01ng/mL、0.03ng/mL、0.06ng/mL、0.13ng/mL、0.25ng/mL、0.50ng/mL、1.00ng/mL、2.00ng/mL、4.00ng/mL、8.00ng/mL、16.00ng/mL、32.00ng/mL。在450nm处测量吸光度值。
百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100％，即百分吸光度值(％)＝B/B0×100％其中B为标准溶液或样本溶液的平均吸光度值，B0为0ng/mL标准溶液的平均吸光度值。
以标准品百分吸光率为纵坐标，以玉米赤霉烯酮标准品浓度(ng/mL)的半对数为横坐标绘制标准曲线，求出直线方程。标准曲线为y＝-17.31ln(x)+50.11,R2＝0.9931,见附图2。该方法的IC50被定义为百分吸光率为50％时所对应的玉米赤霉烯酮的浓度。通过该标准曲线计算得IC50为1.01ng/mL。当进行实际样本检测时，将样本的百分吸光率(B/B0×100％)值代入标准曲线中，从标准曲线上读出所对应样本的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中玉米赤霉烯酮的实际浓度。
4、本发明在检测玉米、小麦及大米等样品中玉米赤霉烯酮的含量的应用
直接竞争荧光免疫吸附法用于检测玉米、小麦及大米等样品中的玉米赤霉烯酮残留量时，通过以下步骤实施：样品前处理、用直接竞争荧光免疫吸附法进行检测、分析结果。
(1)样品前处理
样品前处理按国标进行。
(2)用直接竞争荧光免疫吸附法进行检测上述样品中玉米赤霉烯酮残留量
取包被有抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的酶标板，加标准品/样本50μL/孔到对应的微孔中；加入量子点荧光微球标记玉米赤霉烯酮工作液，50μL/孔，用盖板膜盖板后置室温37℃避光环境中反应45min；小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液340μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；设定多功能酶标仪激发为365nm，发射为540nm处检测，测定每孔荧光强度值值；对比待测样品与标准品的荧光强度值大小，定量分析待测样品中的玉米赤霉烯酮的残留量。
(3)分析结果
用直接竞争荧光免疫吸附法中的10标准品浓度0.00pg/mL、0.06pg/mL、0.12pg/mL、0.25pg/mL、0.50pg/mL、1.00pg/mL、2.00pg/mL、4.00pg/mL、8.00pg/mL、16.00pg/mL在激发波长365nm发射波长540nm处测量荧光强度值。
百分荧光率的计算，标准品或样本的百分荧光率等于标准品或样本的百分荧光值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的荧光值，再乘以100％，即百分荧光值(％)＝F/F0×100％其中F为标准溶液或样本溶液的平均荧光值，F0为0pg/mL标准溶液的平均荧光值。
以标准品百分荧光率为纵坐标，以玉米赤霉烯酮标准品浓度(pg/mL)的半对数为横坐标绘制标准曲线，求出直线方程。该方法的IC50被定义为百分荧光率为50％时所对应的玉米赤霉烯酮的浓度。当进行实际样本检测时，将样本的百分荧光率(F/F0×100％)值代入标准曲线中，从标准曲线上读出所对应样本的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中玉米赤霉烯酮的实际浓度。
4.1玉米样本中玉米赤霉烯酮的检测
取包被有抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的酶标板，加标准品/样本50μL/孔到对应的微孔中；加入量子点荧光微球标记玉米赤霉烯酮工作液，50μL/孔，用盖板膜盖板后置室温37℃避光环境中反应45min；小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液340μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；设定多功能酶标仪激发为365nm，发射为540nm处检测，测定每孔荧光强度值值；对比待测样品与标准品的荧光强度值大小，定量分析待测样品中的玉米赤霉烯酮的残留量。具体实验结果如下：线性标准曲线为y＝-16.26ln(x)+53.107，R2＝0.9984，见附图3。通过标准曲线计算得该方法的半数抑制浓度IC50(即F/F0×100％＝50％)为1.19pg/mL。
4.2小麦样本中玉米赤霉烯酮的检测
取包被有抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的酶标板，加标准品/样本50μL/孔到对应的微孔中；加入量子点荧光微球标记玉米赤霉烯酮工作液，50μL/孔，用盖板膜盖板后置室温37℃避光环境中反应45min；小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液340μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；设定多功能酶标仪激发为365nm，发射为540nm处检测，测定每孔荧光强度值值；对比待测样品与标准品的荧光强度值大小，定量分析待测样品中的玉米赤霉烯酮的残留量。具体实验结果如下：线性标准曲线为y＝-17.96ln(x)+52.8,R2＝0.9993。通过标准曲线计算得该方法的半数抑制浓度IC50(即F/F0×100％＝50％)为1.17pg/mL。
4.3大米样本中玉米赤霉烯酮的检测
取包被有抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的酶标板，加标准品/样本50μL/孔到对应的微孔中；加入量子点荧光微球标记玉米赤霉烯酮工作液，50μL/孔，用盖板膜盖板后置室温37℃避光环境中反应45min；小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液340μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；设定多功能酶标仪激发为365nm，发射为540nm处检测，测定每孔荧光强度值值；对比待测样品与标准品的荧光强度值大小，定量分析待测样品中的玉米赤霉烯酮的残留量。具体实验结果如下：线性标准曲线为y＝-18.11ln(x)+53.018，R2＝0.9984。通过标准曲线计算得该方法的半数抑制浓度IC50(即F/F0×100％＝50％)为1.18pg/mL。
结论：结合以上第3节和第4节可以发现本发明中所提到的新方法对玉米赤霉烯酮残留量的检测灵敏度(IC50＝1.18pg/mL)比常规直接竞争酶联免疫法(IC50＝1.01ng/mL)提高了约855((1.01ng/mL)/(1.18pg/mL)＝855)倍，并且本发明方法在酶联免疫吸附试验过程中步骤简便，耗时较短，体现出用于检测的便捷性，更适合用于快速检测。
实施例2
一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，该方法包括以下步骤：
1)在酶标板上包被抗体；
2)制备标记有羧基修饰的量子点的荧光微球；
3)将步骤2)所得产物与玉米赤霉烯酮偶联，即得到竞争抗原；
4)将待测溶液与所述竞争抗原加入至步骤1)包被有抗体的酶标板中，抗原抗体结合反应，而后检测酶标板的荧光强度。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤2)所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球是通过以下方法制备的：以氯仿为溶剂，配制油酸基团修饰的量子点浓度为15mg/mL、PMMA浓度为25mg/mL、PMAO浓度为15mg/mL的混合溶液，保持25min，而后将取十二烷基磺酸钠水溶液与所述混合溶液混合至其中油酸基团修饰的量子点浓度为3mg/mL，混合均匀后去除氯仿，固液分离取固相，即得到标记有羧基修饰的量子点的荧光微球。
所述量子点是CdSe/ZnS量子点。
所述量子点的激发波长为365nm、发射波长为540nm。
所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，其粒径为250nm，其最大荧光发射波长540nm。
氯仿的去除是利用旋蒸实现的。
步骤3)具体包括以下操作：利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，将包被产物与玉米赤霉烯酮偶联，即得到竞争抗原。
所述利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，包括以下步骤：在磷酸盐缓冲液中将标记有羧基修饰的量子点的荧光微球与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、牛血清白蛋白混合，至溶液中牛血清白蛋白的质量体积分数为0.8％，于35℃反应25min，而后补加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺3次，每次补加后于35℃反应25min，补加全部完成后固液分离取固相，洗涤后溶解于碳酸氢钠溶液中。
所述偶联包括以下步骤：在无水四氢呋喃环境下，取二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、玉米赤霉烯酮混合活化；收集活化后的玉米赤霉烯酮，按照活化后的玉米赤霉烯酮与所述包被产物上牛血清白蛋白二者摩尔比为1:8将玉米赤霉烯酮与所述包被产物混合，在pH为8.4、室温条件下反应10h，收集产物，洗涤后溶解于水中。
实施例3
一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，该方法包括以下步骤：
1)在酶标板上包被抗体；
2)制备标记有羧基修饰的量子点的荧光微球；
3)将步骤2)所得产物与玉米赤霉烯酮偶联，即得到竞争抗原；
4)将待测溶液与所述竞争抗原加入至步骤1)包被有抗体的酶标板中，抗原抗体结合反应，而后检测酶标板的荧光强度。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤2)所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球是通过以下方法制备的：以氯仿为溶剂，配制油酸基团修饰的量子点浓度为25mg/mL、PMMA浓度为35mg/mL、PMAO浓度为25mg/mL的混合溶液，保持35min，而后将取十二烷基磺酸钠水溶液与所述混合溶液混合至其中油酸基团修饰的量子点浓度为4mg/mL，混合均匀后去除氯仿，固液分离取固相，即得到标记有羧基修饰的量子点的荧光微球。
步骤3)具体包括以下操作：利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，将包被产物与玉米赤霉烯酮偶联，即得到竞争抗原。
所述利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，包括以下步骤：在磷酸盐缓冲液中将标记有羧基修饰的量子点的荧光微球与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、牛血清白蛋白混合，至溶液中牛血清白蛋白的质量体积分数为1.2％，于39℃反应35min，而后补加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺5次，每次补加后于39℃反应35min，补加全部完成后固液分离取固相，洗涤后溶解于碳酸氢钠溶液中。
所述偶联包括以下步骤：在无水四氢呋喃环境下，取二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、玉米赤霉烯酮混合活化；收集活化后的玉米赤霉烯酮，按照活化后的玉米赤霉烯酮与所述包被产物上牛血清白蛋白二者摩尔比为1:12将玉米赤霉烯酮与所述包被产物混合，在pH为8.8、室温条件下反应14h，收集产物，洗涤后溶解于水中。
实施例4
一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，该方法包括以下步骤：
1)在酶标板上包被抗体；
2)制备标记有羧基修饰的量子点的荧光微球；
3)将步骤2)所得产物与玉米赤霉烯酮偶联，即得到竞争抗原；
4)将待测溶液与所述竞争抗原加入至步骤1)包被有抗体的酶标板中，抗原抗体结合反应，而后检测酶标板的荧光强度。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
所述量子点是CdSe/ZnS量子点。
所述量子点的激发波长为365nm、发射波长为540nm。
所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，其粒径为250nm，其最大荧光发射波长540nm。
步骤3)具体包括以下操作：利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，将包被产物与玉米赤霉烯酮偶联，即得到竞争抗原。
所述抗原抗体反应的条件是在39℃反应35min。
实施例5
一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，该方法属于直接竞争ELISA法，其中与玉米赤霉烯酮偶联的载体是标记有羧基修饰的量子点的荧光微球。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于该方法属于直接竞争ELISA法，其中与玉米赤霉烯酮偶联的载体是标记有羧基修饰的量子点的荧光微球。
2.根据权利要求1所述的一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)在酶标板上包被抗体；
2)制备标记有羧基修饰的量子点的荧光微球；
3)将步骤2)所得产物与玉米赤霉烯酮偶联，即得到竞争抗原；
4)将待测溶液与所述竞争抗原加入至步骤1)包被有抗体的酶标板中，抗原抗体结合反应，而后检测酶标板的荧光强度。
3.根据权利要求2所述的一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于步骤2)所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球是通过以下方法制备的：以氯仿为溶剂，配制油酸基团修饰的量子点浓度为15～25mg/mL、PMMA浓度为25～35mg/mL、PMAO浓度为15～25mg/mL的混合溶液，保持25～35min，而后将取十二烷基磺酸钠水溶液与所述混合溶液混合至其中油酸基团修饰的量子点浓度为3～4mg/mL，混合均匀后去除氯仿，固液分离取固相，即得到标记有羧基修饰的量子点的荧光微球。
4.根据权利要求3所述的一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于所述量子点的激发波长为365nm、发射波长为540nm。
5.根据权利要求3所述的一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，其粒径为250nm，其最大荧光发射波长540nm。
6.根据权利要求3所述的一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于氯仿的去除是利用旋蒸实现的。
7.根据权利要求2所述的一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于步骤3)具体包括以下操作：利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，将包被产物与玉米赤霉烯酮偶联，即得到竞争抗原。
8.根据权利要求7所述的一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于所述利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，包括以下步骤：在磷酸盐缓冲液中将标记有羧基修饰的量子点的荧光微球与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、牛血清白蛋白混合，至溶液中牛血清白蛋白的质量体积分数为0.8％～1.2％，于35～39℃反应25～35min，而后补加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺3～5次，每次补加后于35～39℃反应25～35min，补加全部完成后固液分离取固相，洗涤后溶解于碳酸氢钠溶液中。
9.根据权利要求7所述的一种灵敏检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于所述偶联包括以下步骤：在无水四氢呋喃环境下，取二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、玉米赤霉烯酮混合活化；收集活化后的玉米赤霉烯酮，按照活化后的玉米赤霉烯酮与所述包被产物上牛血清白蛋白二者摩尔比为1:8～1:12将玉米赤霉烯酮与所述包被产物混合，在pH为8.4～8.8、室温条件下反应10～14h，收集产物，洗涤后溶解于水中。
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