DE69709434T2

DE69709434T2 - Immunoassay für H. pylori in Fäkalienproben

Info

Publication number: DE69709434T2
Application number: DE69709434T
Authority: DE
Inventors: Kenneth James Kozak; Christopher Vance Larka; Ching Sui Arthur Yi
Original assignee: Meridian Bioscience Inc
Current assignee: Meridian Bioscience Inc
Priority date: 1996-05-09
Filing date: 1997-05-08
Publication date: 2002-09-19
Anticipated expiration: 2017-05-09
Also published as: USRE38088E1; MX9701877A; ES2132044T3; US5871942A; DE806667T1; JPH1010128A; AU698513B2; DE69709434T3; DE69709434D1; EP0806667B1; ES2132044T1; US5716791A; EP0806667B2; CA2198336C; CA2198336A1; AR006016A1; CN1271408C; CN1165299A; ES2132044T5; AU1502997A

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Helicobacter pylori in Fäkalienproben.
H. pylori ist ein Bakterium, das in dem oberen Gastrointestinaltrakt von Menschen gefunden wird, das in Verbindung gebracht worden ist mit Gastroduodenal-Krankheiten, wie etwa peptische Ulcera, Gastritis und andere Krankheiten. Das Bakterium wurde ursprünglich als ein Campylobacter klassifiziert und dann als ein Heliobacter umklassifiziert auf der Grundlage von detaillierterer Information hinsichtlich seiner Ultrastruktur und Fettsäurezusammensetzung.
Eine Anzahl verschiedener Techniken, sowohl invasiv als auch nicht-invasiv sind verwendet worden, um H. pylori nachzuweisen. Die invasiven Techniken beinhalten gastrische Biopsien und Kulturen. Die nicht-invasiven Techniken schließen einen Harnstoff-Atemtest, bei dem dem Patienten C-13- oder C-14-markierter Harnstoff mit einem Getränk gegeben wird, und den Nachweis von H. pylori Antikörper in Seren unter Verwendung von Antigenen in Enzymen-verknüpften immunosorbenten Assays (ELISA) ein. Beispiele der letzteren Techniken werden in U. S. Patent 5,262,156 von Aleonohammad und in Europäischem Patent 0 329 570 von Blaser gefunden.
Mehrere Haupt-Antigene sind identifiziert und in Immunoassays beim Nachweis von H. pylori-Antikörpern verwendet worden. Jedoch haben diese Assays nicht die Spezifität und Empfindlichkeit, die bei der Serumdiagnose erwünscht wird, aufgewiesen. Newell, D. G., et al. Serodian. Immunother. Infec. Dis., 3 : 1-6 (1989). Ein Problem mit diesen Immunoassays ist Kreuzreaktivität. Studien der dominanten Antigene in H. pylori, insbesondere das vermeintliche Flagellen-Protein, das ein Molekulargewicht von 60 Da hat, haben gezeigt, daß einige dieser Antigene nicht für H. pylori spezifisch sind und ebenso in anderen Bakterien, wie etwa C. jeuni und C. coli gefunden werden. Ein zweites Problem, auf das beim Entwerfen von Immunoassays für H. pylori gestoßen wurde, ist Stamm-Variation. Wesentliche Unterschiede in den Antigenen sind bei verschiedenen Stämmen von H. pylori beobachtet worden. Diese Probleme schließen den Entwurf eines Assay um die Verwendung eines einzelnen Antigens aus. Ebenso schließen sie die Verwendung von monoklonalen Antikörpern aus. Eine Vorgehensweise, die eingeschlagen wurde, um die Spezifität und Selektivität von Antikörper- Immunoassays für H. pylori zu verbessern, ist gewesen, eine Mischung von Antigenen von verschiedenen H. pylori Stämmen zu verwenden, wobei die Mischung mit bestimmten Antigen-Fragmenten angereichert ist. Ein ELISA der H. pylori Antikörper in einem Blutserum nachweist, ist kommerziell erhältlich von Meridian Diagnostics. Dieser Assay verwendet ein bakterielles Ganzzell-Lysat als das Antigen.
Es gibt bestimmte Nachteile hinsichtlich der Verwendung eines ELISA, der Antigene verwendet, um das Vorhandensein von H. pylori Antikörpern nachzuweisen. Insbesondere bleibt der Antikörper-Titer in menschlichen Seren für eine verlängerte Zeit hoch (in einigen Fällen bis zu sechs Monaten), nachdem die Infektion behandelt worden ist. Infolgedessen bedeutet ein positiver Test unter Verwendung dieses ELISA nicht notwendigerweise, daß der Patient gegenwärtig infiziert ist und eine Behandlung auf H. Pylori Infektion benötigt. Behandelnde Ärzte ordnen häufig, wenn sie mit einem positiven ELISA konfrontiert sind, eine gastrische Biopsie an, um das Vorhandensein der Bakterien zu bestätigen, bevor sie eine Antibiotika- Therapie anfangen. Deshalb eliminiert der ELISA auf Antigen-Basis nicht die Notwendigkeit der invasiven Prozedur. Im Gegensatz dazu könnte, wenn ein Immunoassay zum Nachweis von H. pylori Antigen anstelle des Antikörpers entworfen werden könnte, die Notwendigkeit, gastrische Biopsien durchzuführen, um eine Infektion zu bestätigen, signifikant reduziert werden, weil das Antigen im allgemeinen nicht in einem Patienten innerhalb von einigen Tagen seiner Behandlung nachgewiesen werden kann. Somit gibt es einen Bedarf für einen ELISA, der H. pylori Antigen nachweist, und insbesondere gibt es einen Bedarf für einen ELISA zum Nachweis von H. pylori direkt aus Fäkalienproben.
Während ELISA's zum Nachweis von Mikroorganismen wie etwas C. difficile und Adenovirus in Fäkalienproben bekannt sind, können in Studien von Patienten mit gastrischen Biopsien, die für H. pylori positiv sind, die Bakterien normalerweise nicht kultiviert und aus den Fäkalienproben isoliert werden. Dies und die Probleme der Kreuzreaktivität und Stamm- Variation gaben Anlaß zu ernsthaften Zweifeln, daß ein ELISA entworfen werden könnte, der für H. pylori spezifisch und hinreichend empfindlich wäre, um H. pylori Antigen direkt aus einer Fäkalienprobe nachzuweisen.
Kelly et al., Gastroenterology, Band 107, 1994, 1671-1674 offenbart einen Versuch, H. pylori aus Stuhlproben zu isolieren. Biogenesis, Immunoassay Catalogue, 1994-1995 und Biodesign, Immunological Reagents 1993-1994 offenbaren beide polyklonale Antikörper für das H. pylori Antigen. Clinical Chemistry, Band 22, Nr. 8, 1976, 1243-1255 offenbart das allgemeine Konzept von ELISA-Tests.
Unter einem ersten Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung von H. pylori in Fäkalienproben bereit, das umfaßt:
(a) Verteilen einer Fäkalienprobe, von der vermutet wird, daß sie H. pylori trägt, in einem Probenverdünnungsmittel;
(b) In-Kontak-Bringen der Fäkalienprobe in dem Verdünnungsmittel mit einem ersten polyklonalen Antikörper für H. pylori Antigen, um einen Komplex des Antikörpers und des Antigens zu bilden;
(c) Trennen der Probe von dem Komplex;
(d) Aussetzen des Komplexes gegenüber einem zweiten polyklonalen Antikörper für besagtes Antigen und einem Teil des Antikörpers, der mit dem Komplex reagiert, wobei einer der ersten und zweiten Antikörper an einen festen Träger gebunden ist und der andere mit einem Nachweismittel markiert ist, und
(e) Bestimmen der Menge des markierten Antikörpers und im Gegenzug Bestimmen der Anwesenheit von H. pylori Antigen in besagter Fäkalienprobe.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erste Antikörper an einen Träger gebunden, und der zweite ist mit einem Enzym markiert. Triple-Sandwich-Assays werden ebenso bereitgestellt.
Unter einem zweiten und alternativen Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung von H. pylori in einer Fäkalienprobe bereit, das umfaßt:
(a) Verteilen einer Fäkalienprobe, von der angenommen wird, daß sie H. pylori trägt, in einem Probenverdünnungsmittel;
(b) In-Kontakt-Bringen der Fäkalienprobe in dem Verdünnungsmittel mit einem ersten polyklonalen Antikörper für H. pylori Antigen, der an einen festen Träger gebunden ist, und einem zweiten markierten polyklonalen Antikörper für H. pylori, um einen Komplex der Antikörper und des Antigens zu bilden;
(c) Trennen der Probe und des Komplexes;
(d) Bestimmen der Menge des markierten Antikörpers und im Gegenzug Nachweisen der Anwesenheit von H. pylori-Antigen in der Fäkalienprobe.
Gemäß dem dritten alternativen Gesichtspunkt dieser Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung von H. pylori in einer Fäkalienprobe bereitgestellt, das umfaßt:
(a) Verteilen einer Fäkalienprobe, von der angenommen wird, daß sie H. pylori trägt, in einem Probenverdünnungsmittel;
(b) In-Kontakt-Bringen der Fäkalienprobe in dem Verdünnungsmittel mit einem ersten polyklonalen Antikörper für H. pylori Antigen, der durch eine erste Antikörper-produzierende Spezies hergestellt und an einen festen Träger gebunden ist, um einen Komplex des Antikörpers und des Antigens zu bilden;
(c) Trennen der Probe und des Komplexes;
(d) In-Kontakt-Bringen des Antikörper-Antigen-Komplexes, der in Schritt (b) gebildet worden ist, mit einem primären polyklonalen Antikörper für H. pylori Antigen, der von einer zweiten Antikörper produzierenden Spezies erhalten worden ist, um einen Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex herzustellen.
(e) Entfernen des primären Antikörpers, der nicht in dem Komplex aus Schritt (d) vorhanden ist;
(f) In-Kontakt-Bringen des Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplexes, der in Schritt (d) gebildet worden ist, mit einem sekundären Antikörper, wobei der sekundäre Antikörper ein Antikörper für die zweite Antikörper-produzierende Spezies ist, wodurch der sekundäre Antikörper einen Komplex mit dem Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex bildet; und
(g) Bestimmen der Anwesenheit von H. pylori Antigen in der Fäkalienprobe.
Entsprechend wird unter einem vierten alternativen Gesichtspunkt dieser Erfindung ein Kit zur Bestimmung von H. pylori in einer Fäkalienprobe bereitgestellt, das eine Tüpfelplatte mit daran gebundenem polyklonalen Antikörper für H. pylori Antigen, ein Probenverdünnungsmittel auf Protein-Basis, ein Konjugat eines Enzym-polyklonalen Antikörpers für H. pylori Antigen, Waschpuffer und eine Substratlösung.
Unser Immunoassay verwendet polyklonale Antikörper für H. pylori. Diese Antikörper können aus den Seren eines sensibilisierten Tieres erhalten werden. Sensibilisierung kann erreicht werden durch Injizieren des Antigens in eine Antikörper-produzierende Spezies, typischerweise ein Säugetier und vorzugsweise ein Kaninchen, Ziege oder Kuh. Gewöhnlich wird eine anfängliche Injektion gegeben, gefolgt von darauffolgenden Booster-Injektionen, um die Antwort zu maximieren. Optimalerweise wird die Injektionsbehandlung in vielfachen Dosen White New Zealand-Kaninchen verabreicht. Die Menge an injiziertem Antigen muß angemessen sein, um eine Menge an Antikörper auszulösen, die für einen Nachweis ausreichend ist. Die Antikörperproduktion wird unter Verwendung einer Probeblutung und einem indirekten Fluoreszenz-Assay verifiziert.
Es ist gefunden worden, daß H. pylori Zellen vom ATCC-Stamm 43504 besonders nützlich beim Herstellen des polyklonalen Antikörpers sind. Wie zuvor erwähnt, ist eine erhebliche Stamm-Variation bei H. pylori beobachtet worden. Die Unterschiede in dem Organismus sind in verschiedenen geographischen Regionen sowie Gruppen mit bestimmtem Diätschema beobachtet worden. Jedoch sind Antikörper, die durch die Sensibilisierung unter Verwendung von Zellen vom Stamm 43504 erhalten worden sind, als nützlich gefunden worden beim Nachweis des Organismus über geographische Regionen und Gruppen mit bestimmtem Diätschema hinweg. Wenn nötig, könnten zum Beispiel, wenn gefunden wird, daß der ELISA nicht wirksam beim Nachweis des Organismus in bestimmten Populationen ist, Zellen aus mehr als einem Stamm von H. pylori verwendet werden, um den Antikörper zu produzieren.
Dieselben Markierungen, die in bekannten Immunometrie-Assays verwendet werden, können verwendet werden, um unseren polyklonalen Antikörper zu markieren.
Unter diesen können fluorogene Markierungen zum Nachweis mittels Fluorometrie erwähnt werden, wie beschrieben in U. S. Patent Nr. 3,940,475, enzymatische Marker, wie beschrieben in U. S. Patent Nr. 3,654,090 und Radioisotope, wie etwas Iod-125. Einer der häufigsten enzymatischen Marker ist Meerrettich-Peroxidase (HRP) und das Enzym alkalische Phospatase. Beispiel 3 unten veranschaulicht das Markieren von polyklonalen Antikörpern mit HRP.
Der nicht-markierte polyklonale Antikörper, der in unserem Verfahren verwendet wird, um die antigene Substanz aus der Fäkalienprobe, die getestet wird, zu extrahieren, kann auf einem der allgemein in Immunometrie-Assays verwendeten Träger immobilisiert werden. Unter diesen, die verwendet werden können, sind Filterpapier, Plastik-Kügelchen, Polyethylen, Polystyrol, Polypropylen oder andere geeignete Teströhrchen. Die Techniken zum Binden der Antikörper an solche Materialien sind Fachleuten wohlbekannt.
Um die Fäkalienprobe zur Verwendung in dem Assay herzustellen, wird die Probe in einem Probenverdünnungsmittel auf Protein-Basis verteilt. Das Verdünnungsmittel wird formuliert und gepuffert, um Kreuzreaktivität zu minimieren. Als Beispiele von Probenverdünnungsmitteln kann fötales Rinderserum, normales Ziegenserum, Meerschweinchenserum, Pferdeserum, Kasein, Albumin, Gelatine und Rinderserumalbumin (BSA) erwähnt werden. Es ist gefunden worden, daß eine Verdünnung von einem Teil Fäkalienprobe und vier Teilen Verdünnungsmittel nützlich ist. Zusätzlich zur Verwendung der Zusatzstoffe auf Protein-Basis kann eine Kreuzreaktivität durch die Zugabe von Detergenzien und durch Erhöhen oder Verringern des pH oder der Ionenstärke des Verdünnungspuffers reduziert werden. Zum Beispiel enthalten viele Probenverdünnungsmittel Triton X-100 (Handelsmarke) und/oder Tween 20 (Handelsmarke) in Konzentrationen im Bereich zwischen 0,05% und 2%. NaCl kann in den Bereichen zwischen 0-2,9% zugegeben werden, um die Ionenstärke des Puffersystems zu verändern. Diese Veränderungen führen zu einer größeren Spezifität, indem die Wahrscheinlichkeit reduziert wird, daß sich schwache oder nicht-spezifische Wechselwirkungen ausbilden.
Die Kreuzreaktivität kann ebenso bei der Formulierung der Antikörperlösungen und der Waschungen, die in dem Assay verwendet werden, angegangen werden. Der Antikörper kann in einer gepufferten Lösung im Zusammenhang mit einem der zuvor erwähnten Proteinseren bereitgestellt werden. Die in dem Assay verwendeten Waschungen können durch die Zugabe von Salzen und oberflächenaktiven Mitteln formuliert und gepuffert werden, um Kreuzreaktivität zu kontrollieren. Eine bevorzugte Waschung zum Verringern der Kreuzreaktivität ist eine Phosphat-gepufferte Salzlösung.
Die Herstellung des Antigens, Produktion der polyklonalen Antikörper und ein ELISA sind in größerem Detail durch die folgenden, nicht-beschränkenden Beispiele veranschaulicht.

Beispiel 1

Herstellung des Helicobacter pylori (H. pylori) Antigen:

H. pylori (ATCC-Stamm 43504) wurde zur Isolierung auf Tryptischem-Soja-Agar (TSA) ausgestrichen, der mit 5% defibriniertem Schafsblut supplementiert war. Die Platte wurde bei 37ºC in einer mikro-aerophilen Umgebung für 6-7 Tage inkubiert. Das resultierende bakterielle Wachstum wurde mittels Kolonie-Morphologie, Urease-, Katalase- und Oxidase- Reaktionen und Gram-Färbung beurteilt. Akzeptables Wachstum wurde auf vier TSA- mit- Schafsblut-Agarplatten subkultiviert und bei 370C in einer mikro-aerophilen Umgebung für 3- 4 Tage wachsen gelassen.
Jede Platte wurde mit 5 ml 0,85% NaCl überflutet, und das bakterielle Wachstum wurde mittels eines Platten-Ausstreichers geerntet. Die Bakterien wurden bei 10.000 xg für 15 Minuten bei 2-8ºC zentrifugiert. Jedes Pellet wurde in 3 ml 0,85% NaCl resuspendiert und in einen Zentrifugenbehälter kombiniert. Die bakterielle Suspension wurde bei 10.000 xg für 1 S Minuten bei 2-8ºC zentrifugiert. Das Pellet wurde resuspendiert und zentrifugiert wie zuvor. Das endgültige Pellet wurde auf 3% des ursprünglichen Gesamtvolumens in 20mM Phosphatpuffer resuspendiert. Die bakteriellen Zellen wurden in einen eisgekühlten Behälter übertragen und 5mal für 3 Minuten bei der maximalen Einstellung, die kein Schäumen verursacht, beschallt, wobei für 30 Sekunden zwischen den Zyklen Pause gemacht wurde. Die beschallten bakteriellen Zellen wurden bei 57.000 xg für 15 Minuten bei 2-8ºC zentrifugiert. Der bakterielle Überstand wurde gesammelt und das Pellet verworfen.

Beispiel 2

Herstellung von Kaninchen-polyklonalem Antikörper:

Der bakterielle Überstand, erhalten in Beispiel 1, wurde zu gleichen Teilen mit Freundschem vollständigen Adjuvans verdünnt (Gesamt-Immunogen ist 1,0 ml), um 1 · 10&sup8; Zellen pro ml bereitzustellen. Diese Lösung wurde vollständig vermischt, und 0,2-0,5 ml der Lösung wurden intramuskulär in das rechte Hinterbein injiziert, und 0,1-0,25 ml der Lösung wurden subkutan an jede von acht bis zehn Stellen auf dem Rücken injiziert. Darauffolgende Injektionen waren im Abstand von einem Monat unter Verwendung von Freundschem unvollständigen Adjuvans, und die Injektionsstellen waren auf subkutanen Rücken beschränkt.
Eine Versuchsblutung wurde nach drei Monaten entnommen. Die Blutung wurde aus der zentralen Ohrvene eine Woche nach der dritten Injektion entnommen. Diese Blutung wurde über Nacht bei 2-8ºC inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Blut bei 5.000 xg für 15 Minuten bei Zimmertemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt, und das Pellet verworfen. Der Überstand wurde mittels eines indirekten Fluoreszenz-Assay (IFA) getestet. Der IFA wurde durchgeführt, indem 10 ul einer H. pylori Suspension auf Glas-Objektträgern gebracht und Hitze-fixiert wurden. Die Objektträger wurden mit 3% Rinderserumalbumin (BSA) für 5 Minuten blockiert, dann mit einer Waschung Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) und 0,5% Tween 20 (PBS/Tween-Waschung) gewaschen. 50 ul der Versuchsblutungen und normales Kaninchenserum, als eine Kontrolle, verdünnt 1 : 10 in Phosphat-gepufferter Salzlösung mit Natriumazid (PBSA) wurden zugegeben und in einer feuchten Umgebung für 30 Minuten inkubiert. Nach Waschen mit PBS/Tween-Waschung, wurde Ziegen-anti-Kaninchen konjugiert an FITC (Fluorescein-Isothiozyanat) 1 : 10 in PBSA verdünnt, und 50 ul wurden zu jedem Napf hinzugegeben. Die Objektträger wurden 30 Minuten in einer dunklen feuchten Umgebung inkubiert. Die Objektträger wurden wieder gewaschen. Fluoreszenz-Assay- Einbettungsmittel und ein Deckgläschen wurden zugegeben und mit einem Fluoreszenz- Mikroskop betrachtet. Kaninchen, deren Seren eine Fluoreszenz-Intensitätswert von 4+ aufwiesen, wurden dann Volumen-ausgeblutet.
Die Volumen-Ausblutung wurde auf ähnliche Weise wie die Versuchsblutung erhalten, außer daß 50 ml jedem Kaninchen entnommen wurden. Das Blut wurde inkubiert und zentrifugiert, ebenso wie die Probeblutung.
Das Gesamtvolumen der Seren wurde bestimmt und ein gleiches Volumen Phosphatpuffer- Salzlösung (PBS) wurde zugegeben. Eine 40% Ammoniumsulfat-Fällung wurde durchgeführt, um nicht-notwendiges Protein zu entfernen, und bei 2-8ºC für 24 Stunden inkubiert. Die Mischung wurde in ein Zentrifugenröhrchen überführt und bei 10.000 xg 30 Minuten bei Zimmertemperatur zentrifugiert. Resuspendieren des Pellets in PBS auf näherungsweise ein Drittel des ursprünglichen Volumens. Die Suspension wurde gegen 200mal das gesamte Suspensionsvolumen von 0,0175 Kaliumphosphat, pH 6,5 bei 2-8ºC dialysiert. Nach der Dialyse wurde die Suspension bei 10.000 xg für 20 Minuten bei Zimmertemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt, und das Pellet wurde verworfen.
Eine DEAE (Diethylaminoethylcellulose)-Säule wurde mit 0,0175M Kaliumphosphat, pH 6,5 bei Zimmertemperatur äquilibriert. Der Überstand wurde auf die Säule gebracht, und die ausfließenden Fraktionen gesammelt. Eine Proteinkonzentration (OD&sub2;&sub8;&sub0;) wurde bestimmt, und alle Fraktionen größer als 0,200 wurden vereinigt. Der vereinigte Antikörper wurde in dem ELISA getestet.

Beispiel 3

Meerrettich-Peroxidase-Konjugation:

Die Konjugation verwendete 10mg DEAE-aufgereinigten Kaninchen-anti-H. Pylori- Antikörper. Der Antikörper wurde auf ein Endvolumen von 2,5 ml mittels Aufkonzentrierung oder durch die Zugabe von 10 mM Natriumhydrogencarbonat, pH 9,6 gebracht. Eine PD-10- Säule (Pharmacia) wurde mit 10 mM Natriumhydrogencarbonat, pH 9,6, äquilibriert. Der Antikörper wurde zur Säule zugegeben, und neun Fraktionen von 1,0 ml wurden entnommen. Eine Proteinkonzentration (OD&sub2;&sub8;&sub0;E. O. = 1,4) von jeder Fraktion wurde genommen, und diejenigen mit einem Wert oberhalb von 0,200 wurden vereinigt. "OD&sub2;&sub8;&sub0;E. O." bezieht sich auf den Extinktionskoeffizienten für das gegebene Protein, wenn die optische Dichte einer 1%- Lösung mit einer 1-cm-Weglänge bei einer Wellenlänge von 280 unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen wird.
Eine gesonderte PD-10-Säule wurde mit 1 mM Natriumacetattrihydrat pH 4,3 äquilibriert. Die minimale Menge Meerrettich-Peroxidase (HRP), die verwendet wurde, war 1,172 mg HRP für jedes 1 mg Antikörper. 1-1/2-Mal das berechnete Minimum an HRP wurde ausgewogen und zu 1,0 ml entionisiertem Wasser zugegeben. Eine Proteinkonzentration (OD&sub4;&sub0;&sub3;E. O. = 2,275) wurde durchgeführt und HRP-verdünnt auf 10 mg/ml mit entionisiertem Wasser. 0,1 M Natrium-m-Periodat wurde in einer Konzentration von 0,2 ml für jede 4 mg HRP zugegeben. Diese Reaktion ließ man für 20 Minuten bei Zimmertemperatur unter sanftem Schütteln fortschreiten. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 50 ul 2M Ethylenglycol für jeden ml HRP bei 4 mg beendet. Die HRP wurde durch die PD-10 mit 1 mM Natriumacetattrihydrat pH 4,3 eluiert.
Das Konjugationsverhältnis war 1 mg Antikörper auf 1 172 mg HRP. Der Antikörper wurde mit 10 mM Natriumhydrogencarbonat pH 9,6 eingestellt und die HRP mit 1 mM Natriumacetattrihydrat pH 4,3. Die beiden wurden einem vorgesehenen Kolben kombiniert und pH - eingestellt mit 0,2 M Natriumhydrogencarbonat, pH 9,6 bis 9,6. Geschützt vor dem Licht, wurde die Mischung für zwei Stunden auf einem Rotator bei 85-95 RPM bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach zwei Stunden wurden 0,1 ml 4 mg/ml Natriumtetrahydridoborat für jede 8 mg Antikörper zugegeben. Die neue Mischung wurde bei 4ºC für zwei Stunden auf einem Rotator inkubiert. Das Konjugat wurde durch eine PD-10-Säule laufengelassen, die mit PBS äquilibriert worden war, und Fraktionen, die das Konjugat enthielten, wurden gesammelt. Die Fraktionen wurden vereinigt und auf näherungsweise 1,0 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde auf eine Sephacryl S-200 (Handelsmarke)-Säule, äquilibriert mit PBS, bei einer Durchflußrate von 10 ml/h gebracht. 2,0 ml Fraktionen wurden gesammelt, und eine Proteinkonzentration von sowohl dem Antikörper als auch der HRP wurden durchgeführt. Die Fraktionen mit einem simultanen Peak sowohl bei OD&sub2;&sub8;&sub0; als auch OD&sub4;&sub0;&sub3; wurden vereinigt und auf näherungsweise 1,0 mg/ml konzentriert.
Beispiel 4 unten veranschaulicht einen sogenannten "Vorwärts"-Assay, bei dem der an den Träger gebundene Antikörper zuerst mit der zu testenden Probe in Kontakt gebracht wird, um das Antigen aus der Probe durch Bildung eines Antikörper/Antigen-Komplexes zu extrahieren, und in-Kontakt-Bringen des Komplexes mit einer bekannten Menge markierter Antikörper. Jedoch werden Fachleute erkennen, daß der Immunometrie-Assay ebenso als ein sogenannter "Simultan" oder "Reverse"-Assay durchgeführt werden kann. Ein Simultan-Assay beinhaltet einen einzelnen Inkubationsschritt, während der an den festen Träger gebundene Antikörper und der markierte Antikörper beide zu der zu testenden Probe zur selben Zeit zugegeben werden. Nachdem die Inkubation vollständig ist, wird der feste Träger gewaschen, um die verbleibende Probe und nicht-komplexierten markierten Antikörper zu entfernen. Die Anwesenheit des mit dem festen Träger assoziierten, markierten Antikörpers wird dann bestimmt. Ein Reverse-Assay beinhaltet die schrittweise Zugabe von zunächst einer Lösung markierten Antikörpers zu der Fäkalienprobe, gefolgt von der Zugabe des an den Träger gebundenen, nicht-markierten Antikörpers. Nach einer zweiten Inkubation wird der Träger auf herkömmliche Weise gewaschen, um ihn von der restlichen Probe und dem nicht-umgesetzten markierten Antikörper zu befreien.

Beispiel 4

ELISA-Test:

Der Antikörper wurde in PBS seriell zwischen 20 ug/ml und 2,5 ug/ml verdünnt. Ein 0,100 ml Aliquot jeder Verdünnung wurde zu einem Immunlon-II-Strip (Dynatech) zugegeben, abgedeckt und über Nacht bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Platte wurde einmal mit PBS/Tween-Waschung gewaschen. Sie wurde mit 1% BSA/PBS für 1 Stunde bei Zimmertemperatur blockiert. Wieder einmal gewaschen mit PBS/Tween-Waschung. Mehrere positive und negative Proben wurden 1 : 5 in 0,1% BSA/PBS verdünnt. Jede Probe (0,100 ml) wurde zu einem Napf der Strips zugegeben, abgedeckt und 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Platte wurde dann 5-mal mit Merifluor C/G-Waschung gewaschen. Ein zuvor akzeptierter Kaninchen-anti-H. Pylori, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase, wurde auf 10 ug/ml verdünnt und 0,100 ml zu jedem Napf zugegeben. Die Platte wurde abgedeckt und bei Zimmertemperatur für 1 Stunde inkubiert. Wieder 5-mal gewaschen mit PBS/Tween-Waschung, dann für 10 Minuten bei Zimmertemperatur mit 0,100 ml Trimethylbensidin (TMB)-Lösung entwickelt. Beendet mit 0,050ml 2NH&sub2;SO&sub4; und abgelesen nach zwei Minuten. Die Verdünnung, die das größte Signal und den niedrigsten Hintergrund ergab, wurde als die optimale Verdünnung gewählt.
Quantitative Bestimmungen können gemacht werden durch Vergleich des Maßes an markiertem Antikörper mit demjenigen, das erhalten wird für Kalibrationsproben, die bekannte Mengen Antigen enthalten. Tabelle 1 unten zeigt die optische Dichte, die erhalten wird, wenn vier Proben, von denen jede eine vorbestimmte Anzahl Organismen enthält durch den Assay geführt wird.

Tabelle 1

Anzahl Organismen

pro ml OD450/630

3 · 10&sup7; 2,547
1,9 · 10&sup7; 0,662
4,6 · 10&sup6; 0,182
1,1 · 10&sup6; 0,038
Die Resultate des Durchlaufs von sechs klinischen Proben durch den Assay werden in Tabelle 2 gezeigt.
Sogenannte Triple-Sandwich-Assays können ebenso zum Nachweis von H. Pylori in Fäkalienproben in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendet werden. Triple-Assays sind auf dem Gebiet bekannt, und die grundlegende Methodologie kann auf den Nachweis von H. Pylori in Fäkalienproben angewandt werden. Ein Triple-Assay wird typischerweise durch Verteilen einer Fäkalienprobe, von der angenommen wird, daß sie H. Pylori trägt, in einem Probenverdünnungsmittel, das Kreuzreaktivität minimiert, und durch Zugabe der verdünnten Probe zu einem immobilisierten Antikörper für H. Pylori, der aus einer ersten Spezies eines Antikörper produzierenden Tieres erhalten worden ist, durchgeführt. Die Probe wird inkubiert, um den Antikörper-Antigen-Komplex zu bilden. Nach dem Waschen von überschüssiger Probe von dem immobilisierten Träger wird ein H. Pylori Antikörper, bekannt als ein primärer Antikörper und erhalten aus einer zweiten Spezies eines Antikörper produzierenden Tieres, zu dem Antikörper-Antigen-Komplex zugegeben und inkubiert, um einen Antikörper- Antigen-Antikörper-Komplex zu bilden. Nach Bildung dieses Komplexes und Entfernen des nicht-umgesetzten Antikörpers wird der Komplex mit einem Antikörper umgesetzt, der als ein sekundärer Antikörper bekannt ist, welcher ein Antikörper auf die zweite Antikörperproduzierende Spezies ist, wie etwa Anti-(Kaninchen, Kuh oder Ziege)-Immunoglobulin. Der sekundäre Antikörper wird auf herkömmliche Weise markiert, typischerweise mit einem Enzym, und mit dem Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex inkubiert, um einen Triple- Antikörper-Komplex oder -Sandwich zu bilden. Nach Entfernen des nicht-umgesetzten sekundären Antikörpers wird das Antigen auf eine herkömmliche Weise getestet. Bei Verwendung einer Enzymmarkierung wird ein Substrat zu dem Komplex des Antigens und der drei Antikörper zugegeben, und die Reaktion des Substrats mit dem verknüpften Enzym wird überwacht, um die Menge des Antigens zu bestimmen, die in der Probe vorliegt. Bei dem Triple-Sandwich-Assay, wie bei dem grundlegenden Sandwich-Assay, werden die Waschungen und die Antikörper-Lösungen formuliert oder gepuffert, um Kreuzreaktivität nach Bedarf zu kontrollieren

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung von H. pylori in einer Fäkalienprobe, das umfaßt:

(a) Verteilen einer Fäkalienprobe, von der vermutet wird, daß sie H. pylori trägt, in einem Probenverdünnungsmittel;

(b) In Kontakt bringen der Fäkalienprobe in dem Verdünnungsmittel mit einem ersten polyklonalen Antikörper für H. pylori Antigen, um einen Komplex des Antikörpers und des Antigens zu bilden;

(c) Trennen der Probe und des Komplexes;

(d) Aussetzen des Komplexes gegenüber einem zweiten polyklonalen Antikörper für das Antigen und einem Teil des Antikörper, der mit dem Komplex reagiert, wobei einer der ersten und zweiten Antikörper an einen festen Träger gebunden ist und der Andere mit einem Nachweismittel markiert ist; und

(e) Bestimmen der Anwesenheit des markierten Antikörpers und im Gegenzug Bestimmen der Anwesenheit von H pylori Antigen in der Fäkalienprobe.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der erste Antikörper an einen festen Träger gebunden ist und der zweite Antikörper mit einem Nachweismittel markiert ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der erste Antikörper mit einem Nachweismittel markiert ist, das bevorzugterweise ausgewählt ist aus alkalischer Phosphatase und beta-Galaktosidase-Rettichperoxidase und der Zweite an einen festen Träger gebunden ist.

4. Verfahren nach jedem voranstehenden Anspruch, wobei das Probenverdünnungsmittel ein proteinbasiertes Verdünnungsmittel ist, bevorzugterweise ein Verdünnungsmittel, das ein Protein, ausgewählt aus fötalem Rinderserum, normalem Ziegenserum, Meerschweinchenserum, Pferdeserum, Kasein, Albumin, Gelatine und Rinderserumalbumin ist.

5. Verfahren nach jedem voranstehenden Anspruch, wobei der polyklonale Antikörper durch Sensibilisieren eines Antikörper produzierenden nicht-menschlichem Säugers mit H. pylori Zellen erhalten wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zellen Zellen von einer Vielzahl von H. pylori Stämmen sind.

7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zellen Zellen vom Stamm ATCC 43504 sind.

8. Verfahren nach jedem voranstehenden Anspruch, wobei nach Aussetzen des Komplexes gegenüber dem zweiten Antikörper der Komplex mit einem Puffer gewaschen wird, der die Kreuz-Reaktivität verringert oder auf andere Weise die Spezifität des Assays verbessert.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Waschlösung Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung ist.

10. Verfahren zur Bestimmung von H. pylori in einer Fäkalienprobe, das umfaßt:

(a) Verteilen einer Fäkalienprobe, von der angenommen wird, daß sie H. pylori trägt, in einem Probenverdünnungsmittel;

(b) In Kontakt bringen der Fäkalienprobe in dem Verdünnungsmittel mit einem ersten polyklonalen Antikörper für H. pylori Antigen, der an einen festen Träger gebunden ist und einem zweiten markierten polyklonalen Antikörper für H. pylori, um einen Komplex der Antikörper und des Antigens zu bilden;

(c) Trennen der Probe und des Komplexes;

(d) Bestimmen der Anwesenheit des markierten Antikörpers und im Gegenzug Nachweisend der Anwesenheit von H. pylori Antikgen in der Fäkalienprobe.

11. Verfahren zur Bestimmung von H. pylori in einer Fäkalienprobe, das umfaßt:

(b) In Kontakt bringen der Fäkalienprobe in dem Verdünnungsmittel mit einem ersten polyklonalen Antikörper für H. pylori Antigen, der durch eine erste Antikörper-produzierende Spezies hergestellt ist und an einen festen Träger gebunden ist, um einen Komplex des Antikörpers und des Antigens zu bilden;

(c) Trennen der Probe und des Komplexes;

(d) In Kontakt bringen des Antikörper-Antigenkomplexes, der in Schritt (b) gebildet wurde, mit einem primären polyklonalen Antikörper gegen H. pylori Antigen, der aus einer zweiten Antikörper produzierenden Spezies erhalten wurde, um einen Antikörper-Antigen-Antikörperkomplex herzustellen;

(e) Entfernen des primären Antikörpers, der nicht in dem Komplex aus Schritt (d) vorhanden ist;

(f) In Kontakt bringen des Antikörper-Antigen-Antikörperkomplexes, der in Schritt (d) gebildet wurde, mit einem sekundären Antikörper, wobei det sekundäre Antikörper ein Antikörper für die zweite Antikörper-produzierende Spezies ist, wodurch der sekundäre Antikörper einen Komplex mit dem Antikörper- Antigen-Antikörperkomplex bildet; und

(g) Bestimmen der Anwesenheit von H. pylori Antigen in der Fäkalienprobe.

12. Kit zur Bestimmung von H. pylori in einer Fäkalienprobe, das eine Tüpfelplatte mit daran gebundenen polyklonalen Antikörper für H. pylori Antigen, ein proteinbasiertes Probenverdünnungsmittel, ein Konjugat eines Enzym-polyklonalen Antikörpers für H. pylori Antigen, Waschpuffer und eine Substratlösung einschließt.