CN103293305A - 口腔螺旋杆菌感染检测方法及用于检测的唾液试板 - Google Patents
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Abstract
口腔螺旋杆菌感染的检测方法，其特征在于：取唾液置于试杯内，并滴加缓冲液充分混匀，吸取混合液滴入唾液测试板的加样窗口，5～15分钟观察结果。检测方法中使用的唾液测试板具有唾液测试条，唾液测试条具有玻璃纤维层，唾液吸收纸层、胶体金纸层、玻璃纤维层、吸收纸层依次首尾相连粘贴在一起，在玻璃纤维层上沿吸收纸层至胶体金纸层方向依次设有对照线、测试线，其中对照线上附有羊多克隆抗体，测试线上附有尿素酶抗体或鞭毛抗体，胶体金纸层上附有尿素酶抗体胶体金或鞭毛抗体胶体金。尿素酶抗体或鞭毛抗体是分别通过有毒型螺旋杆菌释放的尿素酶或鞭毛抗原制备出的抗体。该检测方法检测过程简单，快速，且检测结果灵敏，出现误差的机率小。
Description
技术领域
本发明涉及一种对口腔螺旋杆菌感染进行诊断的检测方法及用于检测的试板，特别涉及联合或单独使用唾液幽门螺旋杆菌抗原法(HPS)、唾液幽门螺杆菌鞭毛抗原检测方法(HPF)对口腔中螺旋杆菌的检测及使用的唾液试板，该检测方法不仅能检测口腔中的螺旋杆菌感染，也同時能检测胃内的螺旋杆菌感染。
背景技术
幽门螺旋杆菌，Helicobacter pylori，简称HP，是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构(WHO/IARC)将幽门螺旋杆菌定为I类致癌原。对于HP的传播途径，多数学者认为是通过消化道进行传播的，很多研究结果表明了HP存在通过口-口传播。本发明人认为口腔是HP在人体内除胃部外又一个可能定居场所，即“HP二个定居点”的二点论。定植于口腔中的HP我们称之谓“口源性螺旋杆菌”。口源性定植螺旋杆菌是否存在，曽是国际医学界有争议的大问题。争议的焦点是口腔中发现的HP，是单纯由于胃液反流造成口腔中出现HP，还是口-口、胃-口传播时在口腔定植的HP。定植的HP分布在牙菌斑或牙周组织(如龈袋)中。再从定植于口腔中的HP源源 不断地随唾液吞咽入胃，而在胃内定植。常规治疗胃HP感染有三联疗法(以铋剂、质子泵抑制剂，或雷尼替丁枸橼酸铋为主加上两种抗生素疗法称为三联疗法)，四联疗法(质子泵抑制剂加铋剂联合两种抗生素的疗法称为四联疗法)，序贯疗法(标准的序贯疗法疗程为10天，前5天应用质子泵抑制剂联合阿莫西林，后5天应用质子泵抑制剂联合克拉霉素和替硝唑/甲硝唑)，复合治疗(质子泵抑制剂联合三种抗生素的疗法，目前主要用于HP对抗生素耐药严重地区的补救治疗)。定植于牙菌斑内的HP因抗生素不能有效地穿过这层“生物胶片膜”(biofilm)，致使标准常规治疗胃HP方法对口腔HP感染作用甚微。生物胶片膜是由口腔中已经死去的链球菌菌体，沿着牙齿的表面堆积起来的，经过钙化之后形成的一层生物胶片膜，好像电影胶片膜，质地非常坚固。在生物胶片膜的形成后期，膜内产生酸性物质，这酸性物质通常可被口腔唾液的碱性所中和。但这酸性物质並不能被碱性的唾液所中和后，此時完整的生物胶片膜和唾液完全隔开，酸性物质促使牙齿的表面产生了破洞，最后成为龋齿。危害半数以上人类的螺旋杆菌除了生活在胃幽门、食管外，就躲在这生物胶片膜中，或称牙斑。
2011年8月举行的第六届全国幽门螺杆菌感染及消化疾病诊治临床论坛报告了一项全国多中心、随机、平行对照研究证明，口腔Hp感染的确存在，口腔Hp感染导致根除治疗失败。造成对口源性螺旋杆菌认识不足或存在误区的主要原因，是目前常用的HP检测技术，难以对口腔中HP做出稳定的检测结果。近年来，在分析HP根除治疗失败原因时，才开始涉及口腔HP感染对胃HP感染的影响问题，对口腔 螺旋杆菌的检测有助于对幽门螺旋杆菌的预防及治疗才提到议事日程上来。
自1983年通过胃镜取活检标本分离培养成功以来，对幽门螺杆菌感染的诊断已发展出了许多方法，包括有细菌学、病理学、血清学、同位素示踪、分子生物学等。但总的讲来，从标本采集角度看，可以分为侵袭性和非侵袭性两大类。侵入性方法主要指必需通过胃镜取活检标本检查的方法，是目前消化病学科的常规方法。它包括细菌的分离培养和直接涂片、快速尿素酶试验，药敏试验。非侵入性方法主要指不通过胃镜取活检标本诊断幽门螺杆菌标本感染的方法。这类方法包括抗体检测、抗原检测、尿素酶13C/14C呼气试验等。
1.聚合酶链反应(PCR)：PCR是检测HP最敏感的技术，特异性强，并且对检测标本的要求低，适用于标本中HP含量少，或因含大量正常菌群而降低培养敏感性时HP的检测。因此，对牙菌斑、唾液、牙周病变黏膜刮取物的HP检测常用PCR法。但PCR法因受引物的影响，容易产生假阴性或假阳性；并因PCR对与HP基因结构密切相关的细菌群，可由于交叉反应而出现假阳性。PCR技术要求高，操作复杂，费用亦高，不宜作为口腔HP感染的常规检测。
2.快速尿素酶试验(RUT)：HP产生的尿素酶可分解尿素产生NH3和CO2，NH3的产生使pH值升高，使胃黏膜组织呈碱性，据此原理通过加入pH指示剂，通过颜色的改变判断有无HP感染的存在。由于口腔中特定的pH呈弱碱性，及口腔复杂的菌群环境，有可能造成假阳性，使RUT法用于口腔HP检测缺乏价值。
3.细菌培养：从微生物角度来说，细菌培养是口腔HP感染诊断检测的“金标准”。HP培养是一种难度很高的细菌培养技术，由于其条件过于苛求，牙菌斑和唾液中HP细菌量过少，细菌繁殖能力差，选择性分离培养基有时亦难以抑制杂菌过度生长等因素，都可能会影响HP的培养结果。多数研究表明，用细菌培养法检测口腔中的HP，阳性率较低，造成假阴性。
4.组织涂片和切片染色镜检：牙菌斑或牙周病变部位黏膜刮取物，涂片或切片染色后，在光镜下观察到典型的HP形态菌。由于检测标本中HP量少，且存在大量的杂菌，仅凭形态学特征难以鉴定。此项检测结果阴性，不能作为否定口腔HP感染的依据。
5.13C和14C尿素呼气试验(UBT)：由于13C或14C尿素胶囊是在吞咽入胃后溶解并释放出尿素，所以只有胃内HP产生的尿素酶，才能将13C或 14C尿素分解产生13CO2或14CO2，然后通过高灵敏度特定仪器测定呼气中13CO2或14CO2的量来判断有无HP感染。口腔中HP产生的尿素酶，除了有少量随唾液吞咽入胃后可参与此过程外，存留于口腔中的尿素酶不可能直接参与胃内13C或14C尿素的分解。因此，认为UBT不适用于口腔HP感染的检测。
从上述几种检测螺旋杆菌的方法不难看出，现有技术的检测方法对口腔螺旋杆菌的检测都存在着操作复杂，且容易出现假阳性，阴性的问题，不能作为临床使用的检测口腔螺旋杆菌的技术和方法，从而达到对幽门螺旋杆菌的有效治疗和预防。
发明内容
本发明的目的是提供一种螺旋杆菌检测方法，解决一个全新的技术问题，建立一种操作简单的对口腔螺旋杆菌进行检测的检测方法。该检测方法灵敏度高，特异性强，能有效对口腔螺旋杆菌进行检测，有助于对幽门螺旋杆菌的全身治疗和预防。
技术方案为：
口腔螺旋杆菌感染检测方法，采用唾液幽门螺旋杆菌抗原法(HPS)和/或唾液幽门螺杆菌鞭毛抗原检测方法(HPF)进行检测，其过程为：取唾液0.5～1ml置于试杯内，用吸管吸取4滴唾液，滴入取样杯中，滴加2滴缓冲液于取样杯中，更换吸管，充分混匀后，吸取3～4滴混合液，滴入唾液测试板的加样窗口，5～15分钟观察结果，指示窗口显示测试线、对照线，说明HP阳性；指示窗只显示测试线，未出现对照线，说明HP阴性；指示窗测试线、对照线均未出现说明检测无效，需进行重测；在测试前，病人1小时内除白水外不能进食其他食物，且唾液取样后，必需在5分钟内测定；其中HPS检测技术的定性检测人体唾液中相应Hp产生的尿素酶抗原。HPF检测技术的定性检测人体唾液中相应Hp产生的鞭毛培育的鞭毛抗原；HPS和HPF以唾液作为检测标本，主要用于口腔Hp感染的诊断检测用；HPS和HPF检测技术的定性检测人体唾液中螺旋杆菌释放具有毒性的细胞毒素相关抗原(CagA)和变性细胞毒素(VacA)所産生的尿素酶和的鞭毛抗原，这两种蛋白是与幽门溃疡和胃癌有关。
上述使用的缓冲液是PH值为7.4的磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲 液包括0.01M/LNa2HPO4-2H2O，0.0027M/L KCl，0.137M NaCl，0.1％KH2PO4。
本发明的另一个目的提供一种用于对口腔螺旋杆菌进行快速检测的联合或单独使用的唾液试板。
技术方案为：
上述的口腔螺旋杆菌感染检测方法中使用的唾液检测试板，所述唾液测试板具有面板和唾液测试条，唾液测试条具有硝酸纤维层，还包括有唾液吸收纸层、胶体金纸层、吸收纸层，唾液吸收纸层、胶体金纸层、玻璃纤维纸层、吸收纸层依次首尾相连粘贴在一起，所述唾液吸收纸层含有0.05摩尔/升的硼砂；在玻璃纤维层上沿从吸收纸层至胶体金纸层方向依次设有对照线、测试线，其中对照线上附有羊多克隆抗体，测试线上附有尿素酶抗体，所述胶体金纸层由玻璃纤维纸上附有尿素酶抗体胶体金构成；所述尿素酶抗体是通过能释放有毒性的细胞毒素相关抗原CagA和变性细胞毒素VacA的螺旋杆菌释放的尿素酶制备出的单克隆抗体。
每个唾液测试条上均包括有52ug羊多克隆抗体、41ug尿素酶抗体、67ug尿素酶抗体胶体金。
所述唾液测试板具有面板和唾液测试条，唾液测试条具有硝酸纤维层，还包括有唾液吸收纸层、胶体金纸层、吸收纸层，唾液吸收纸层、胶体金纸层、玻璃纤维纸层、吸收纸层依次首尾相连粘贴在一起，所述唾液吸收纸层含有0.05摩尔/升的硼砂；在玻璃纤维层上沿从吸收纸层至胶体金纸层方向依次设有对照线、测试线，其中对照线上附 有羊多克喀抗体，测试线上附有鞭毛抗体，胶体金纸层上附有鞭毛抗体胶体金，其中鞭毛抗体是通过能释放有毒性的细胞毒素相关抗原CagA和变性细胞毒素VacA的螺旋杆菌释放的鞭毛制备出的鞭毛抗体。
每个唾液测试条上均包括有52ug羊多克隆抗体、41ug鞭毛抗体、67ug鞭毛抗体胶体金。
HPS和HPF检测方法的特异性：
人体内有数十种不同种类的螺旋杆菌，它们都能释放尿素酶，甚至有些螺旋杆菌属以外的细菌也会释放尿素酶。尿素呼气法(C13，14UBT)和HPS都是以测定尿素酶来判断有无螺旋杆菌感染的一种技术。但是它们之间存在一个根本不同的技术角度，虽然人体内有数十种不同的螺旋杆菌，但只有部分螺旋杆菌释放具有毒性的细胞毒素相关抗原CagA和变性细胞毒素VacA。这两种蛋白是与幽门溃疡和胃癌的发病有关。这是科学界一致认同并无分歧的结论。HPS使用的抗体是专门针对释放这些毒素螺旋杆菌所产生的尿素酶的单克隆抗体，而呼气法对所有螺旋杆菌(包括普通的螺旋杆菌和释放毒素的螺旋杆菌)所产生的尿素酶都会发生反应。也就是说，如果患者胃内只寄生普通的螺旋杆菌，呼气法有時也会显示阳性。這不过是举个例子而已，事实上普通的螺旋杆菌和有毒螺旋杆菌都是共同寄生的。
HPS和HPF技术的交叉反应：
经细菌实验室的检测结果，可能存在于口腔中的细菌：如奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、金黄色葡萄 球菌、奈斯隆迪放线菌、变形杆菌等细菌都可释放尿素酶；非口腔中的细菌：如红嘴鸥弯曲菌、耐辐射球菌RI、短根瘤菌亚型BTAIL等细菌，可能随被此类细菌污染的食物带入口腔，暂时在口腔中生存并释放尿素酶，这些细菌释放的尿素酶与非幽门螺旋杆菌释放的尿素酶和HPS和HPF都不存在交叉反应
HPS和HPF检测方法的具体操作：
本发明解决问题采用的技术方案是：HPS和HPF二种技术，但它们采集唾液与检测方法都是一样的。HPF和HPS二种技术不同点是HPF采用鞭毛抗体，HPS采用尿素酶抗体。
试板：口腔螺旋杆菌感染的检测方法，取唾液0.5～1ml置于试杯内，用吸管吸取4滴唾液，滴入取样杯中，滴加2滴缓冲液于取样杯中，更换吸管，充分混匀后，吸取3～4滴混合液，滴入唾液测试板的加样窗口，5～15分钟观察结果，指示窗口显示紫红色的测试线、对照线，说明HP阳性；指示窗未显示测试线，但出现对照线，说明HP阴性；指示窗测试线、对照线均未出现说明检测无效，需进行重测；该检测方法在测试前病人1小时内除白水外不能进食其他食物，且唾液取样后，必需在5分钟内测定。
试笔：取样，上下牙齿相互轻叩20次左右，使嘴中分泌唾液；从铝袋中取出试笔，拔出笔帽，把试笔朝下，试笔头放在舌头上面1分钟，让唾液浸润试笔头。从口中取出试笔，将试笔置于平坦台面上；用缓冲液瓶在试笔头上缓慢滴加缓冲液，每滴缓冲液被试笔头完全吸收后再滴加下一滴，直到观察窗内的试纸出液。
所述缓冲液是PH值为7.4的磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液包括0.01M/LNa2HPO4-2H2O，0.0027M/L KCl，0.137M NaCl，0.1％KH2PO4。
HPS和HPF技术的制备：
上述检测方法中使用的HPS和HPF唾液测试板或试笔，具有面板和唾液测试条。唾液测试条具有玻璃纤维纸层，还包括有唾液吸收纸层、胶体金纸层、吸收纸层。唾液吸收纸层、胶体金纸层、玻璃纤维纸层、吸收纸层依次首尾相连粘贴在一起，所述唾液吸收纸层含有0.05摩尔/升的硼砂；在玻璃纤维层上沿从吸收纸层至胶体金纸层方向依次设有对照线、测试线，其中对照线上附有羊多克隆抗体，测试线上附有尿素酶抗体或鞭毛抗体，所述胶体金纸层由玻璃纤维纸上附有尿素酶抗体胶体金结构或附有鞭毛抗体胶体金结构；所述尿素酶抗体是通过能释放有毒性的细胞毒素相关抗原CagA和变性细胞毒素VacA的螺旋杆菌释放的尿素酶制备出的单克隆抗体，其中鞭毛抗体是通过能释放有毒性的细胞毒素相关抗原CagA和变性细胞毒素VacA的螺旋杆菌释放的鞭毛制备出的鞭毛抗体。
每个唾液测试条上均包括有52ug羊多克隆抗体、41ug尿素酶抗体、67ug尿素酶抗体胶体金(HPS)或包括有52ug羊多克隆抗体、41ug鞭毛抗体、67ug鞭毛抗体胶体金(HPF)。上述含量从临床测验结果可以作适当地改变。
本发明的有益效果：该检测方法检测过程简单，快速，且检测结果灵敏，出现误差的机率小。
附图说明
图1是测试条板的结构侧视图；
图2是测试条主视图；
图3是测试条的仰视图；
图4是HPS和HPF联合试板的结构图；
图5是数据图谱，说明胃镜采样的组织,病理,HP培养,粪便HPF检测在UBT阳性组,阴性组,检测表现一样(检测第1定居点,胃的HP感染)；
图6是数据图谱，说明在UBT阳性组,阴性组,HP血抗体,HPS,HPF检测表现一样(第2定居点,口腔的HP感染)；
图7是数据图谱，说明在UBT阳性组,阴性组,HPS和HPF在二组病人中阳性率步歩増加；
图8是分别采用C13、HPS、HPF和PCR方法测试HP的结果比较图；
图9是分别采用HPS、HPF和PCR方法测试HP的比较图；
图10是分别采用HPS、HPF方法测试HP的比较图。
图中：10.面板、20.唾液测试条、1.玻璃纤维纸层、2.唾液吸收纸层、3.胶体金纸层、4.吸收纸层、5.对照线、6.测试线。
具体实施例
口腔螺旋杆菌感染是胃螺旋杆菌感染难以根治的主要原因，但现在所有检测螺旋杆菌感染的技术和方法都不能对口腔螺旋杆菌感染提供正确，快速的诊断，也就是存在着盲区。在唾液幽门螺旋杆菌抗原法，简称HPS和唾液幽门螺杆菌鞭毛抗原检测技术，简称HPF检测法问世前，尚无直接检测口腔HP感染的实用，方便的方法。而且现在所有检测螺旋杆菌感染的技术和方法都是HP在胃造成症病之后的技术和方法，而HPS和HPF則不是，也就是说人体胃内尚未产生幽门螺旋杆菌感染之前，我们可以用HPS和HPF检测口腔有否HP。所以说HPS和HPF技术是站在一个新的高度上预防HP感染的並得以根治的技术。本发明检测方法中涉及联合或单独使用的检测试板或试笔。
口腔螺旋杆菌感染的检测方法采用唾液法，通过应用胶体金层析式双抗体夹心法原理，以及化学法定性检测人体唾液中螺旋杆菌产生的尿素酶或鞭毛抗原，从而诊断胃和胃体外的螺旋杆菌感染疾病。在 检测人体唾液里尿素酶和鞭毛抗原的时候，尿素酶和鞭毛抗原或与胶体金标记物结合，移动至固定的抗体区域时，尿素酶或鞭毛抗原与胶体金标记结合物又与之发生特异性抗体结合而被截留。聚集在检测带上，通过目测的胶体金标记物得到直观的显色结果；游离标记物则越过检测带，移动至对照带结合，显示对照线。
具体的检测方法，取唾液0.5～1ml置于试杯内，用吸管吸取4滴唾液，滴入取样杯中，滴加2滴缓冲液于取样杯中，更换吸管，充分混匀后，吸取3～4滴混合液，滴入唾液测试板的加样窗口，5～15分钟观察结果，指示窗口显示测试线、对照线，说明HP阳性；指示窗只显示测试线，未出现对照线，说明HP阴性；指示窗测试线、对照线均未出现说明检测无效，需进行重测；该检测方法在测试前病人1小时内除白水外不能进食其他食物，且唾液取样后，必需在5分钟内测定。其中HPS检测技术的定性检测人体唾液中相应Hp产生的尿素酶抗原。HPF检测技术的定性检测人体唾液中相应Hp产生的鞭毛培育的鞭毛抗原；HPS和HPF以唾液作为检测标本，主要用于口腔Hp感染的诊断检测用；HPS和HPF检测技术的定性检测人体唾液中螺旋杆菌释放具有毒性的细胞毒素相关抗原(CagA)和变性细胞毒素(VacA)所産生的尿素酶和的鞭毛抗原，这两种蛋白是与幽门溃疡和胃癌有关。
所述缓冲液是PH值为7.4的磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液包括0.01M/LNa2HPO4-2H2O，0.0027M/L KCl，0.137M NaCl，0.1％KH2PO4。
上述检测方法中使用的唾液测试板，具有面板10和唾液测试条 20，如图1、图2、图3中所示，唾液测试条具有玻璃纤维层1，还包括有唾液吸收纸层2、胶体金纸层3、吸收纸层4，唾液吸收纸层2、胶体金纸层3、玻璃纤维纸层1、吸收纸层4依次首尾相连粘贴在一起，所述唾液吸收纸层2含有0.05摩尔/升的硼砂。在玻璃纤维层1上沿从吸收纸层4至胶体金纸层3方向依次设有对照线5、测试线6。
如果采用HPS法进行口腔中检测，则对照线5上附有羊多克隆抗体，测试线6上附有尿素酶抗体，所述胶体金纸层3由玻璃纤维纸上附有尿素酶抗体胶体金构成；所述尿素酶抗体是通过有毒型螺旋杆菌释放的尿素酶制备出的单克隆抗体。
本实施例中的每个唾液测试条10上均包括有52ug羊多克隆抗体、41ug尿素酶抗体、67ug尿素酶抗体胶体金。
如果采用HPF法进行口腔中检测，则对照线上附有羊多克喀抗体，测试线上附有鞭毛抗体，胶体金纸层上附有鞭毛抗体胶体金，其中鞭毛抗体是通过有毒型螺旋杆菌释放的鞭毛制备出的抗体。
本实施例中每个唾液测试条上均包括有52ug羊多克隆抗体、41ug鞭毛抗体、67ug鞭毛抗体胶体金。
实际上也可以将HPS法检测用的测试条和HPF法检测用的测试条都设置在同一个面板中，形成一个HPS和HPF联合试板，如图4中所示。检测时，将按上述处理方法处理后的唾液分别滴入HPS和HPF的加样窗口内，然后观察结果。
上述尿素酶抗体的制备方法是，将有毒的尿素酶或鞭毛抗原打进老鼠腹腔內，3个月后，老鼠体内产能生尿素酶抗体和鞭毛抗体，再进 一步提纯，就产生了尿素酶抗体和鞭毛抗体。
假定此病人唾液中有尿素酶或鞭毛抗原，当它流向胶体金纸时，和其中的尿素酶抗体-尿素酶抗体胶体金相结合或和其中的鞭毛抗体金相结合，然而流进测试线时和其中的尿素酶抗体或鞭毛抗体再结合成了一个三明治夹心的组合体即尿素酶抗体胶体金-尿素酶-尿素酶抗体，或即鞭毛抗体胶体金-鞭毛抗原-鞭毛抗体。这组合体在测试线处沉淀下来，形成一条紫红色线，即为阳性。而游离的胶体金标记物移动至质控区(C，羊多克隆)与相应的抗体发生特异性结合显示质控线(C线)。假定此病人唾液中没有尿素酶或鞭毛抗原，这样不会形成三名治夹心的组合体，测试线处没有东西沉淀下来，就没有紫红色线出现，即为阴性。
HPS和HPF检测技术的定性检测人体唾液中相应HP产生的尿素酶抗原和鞭毛抗原。HPS，HPF以唾液作为检测标本，主要用于口腔HP感染的诊断检测，临床研究显示具有较高的敏感性和特异性，操作简便、快捷，可在实验室外进行检测等特点。我们曾用HPS对志愿者，患者唾液作检测试验与血液HP抗体作比较，符合率很高，下面还将作较详细的介绍。
HPS和HPF技术的临床试验
A.第1组病人(无胃痛，反酸症状)
91名病人同時檢测C13，血HP抗体，HPS，HPF，大便HP鞭毛抗原检测(注意：這里HPF用於大便HP鞭毛抗原检测，而不在口腔中检测唾液的HP)。
表1
表1.第1组病人(無胃痛，反酸症状)
把所有每一个病人对上述五种检定结果排列起来，此时我们看到的只是什乱无章的东西。但通过下表分析，就可显示规律性；
第1组病人(無胃痛，反酸症状)
表2 13C阳性(n＝34)
| HP血抗体 | HPS | HPF | HPF粪便 | |
| ″+″ | 28 | 29 | 26 | 32 |
| ″-″ | 6 | 5 | 8 | 2 |
| 合计 | 34 | 34 | 34 | 34 |
| 阳性率(％) | 82.4％ | 85.3％ | 76.5％ | 94.1％ |
| 成对比较 | ||||
| P值 | 0.7419 | 0.5486 | 0.2585 | |
| 0.3549 | 0.4275 | |||
| 0.0399 |
注意：Fisher’s统计检验。
表3 C13阴性(n＝57)
| HP血抗体 | HPS | HPF | HPF粪便 | |
| ″+″ | 17 | 25 | 21 | 8 |
| ″-″ | 40 | 32 | 36 | 49 |
| 合计 | 57 | 57 | 57 | 57 |
| 阳性率(％) | 29.8％ | 43.9％ | 36.8％ | 14.0％ |
| 成对比较 |
[0065]
| P值 | 0.1204 | 0.4268 | 0.0416 | |
| 0.4451 | 0.0004 | |||
| 0.0052 |
注意：Fisher’s统计检验
经过统计学(Fisher’s)处理后，血HP抗体与C13比较＜0.0347，HPS与C13比较＜0.0300，HPF与C13比较＜0.0241，而大便HPF与C13比较＞0.1094
此时浮出了二条规律性；
(1)C13和大便HPF表现一样，
(2)HPS，HPF，血HP抗体的表现一样，但和C13和大便HPF表现不一样。
此表告诉我们，所谓表现不一样有多少可靠性？
它们的标准误，可靠性的范围(置信区间)，以及各自的T值。
表4 13C阳性(n＝81)
注意：Fisher’s统计检验
换一个角度耒看看：也就是用McNemar统计法，当C13为阳性时，HPS，HPF，血HP抗体和大便HPF表现怎样？
HPS，HPF，血HP抗体阳性率各为82.4％，85.3％，76.5％
此时显示了另一系列规律性；
(1)它们可以测定胃HP感染，胃向口腔逆向运动有可能存在，
(2)HPS，HPF，血HP抗体的表现仍有一致性。
再换一个角度耒看看：也就是用McNemar统计法，当C13为阴性时，HPS，HPF，血HP抗体和大便HPF表现怎样？
此时再出现一系列规律性；
(1)HPS，HPF，血HP抗体高阳性率(和C13和大便HPF比较)，
(2)HPS，HPF，血HP抗体又表现出一致性。
B.第二组(有胃痛，反酸症况)：110名病人，年龄17-77(平均49)岁，女77例，男33例。同时检测C13、血HP抗体、HPS、HPF、胃镜、胃黏膜RUT、胃黏膜组织切片染色镜检、胃黏膜HP培养。
病患同时接受C14，血HP抗体，HPS，HPF，胃镜，胃黏膜RUT组织，胃黏膜组织切片染色镜检病理，HP培养检测。
表5
表5 笫2组病人
把所有每一个病人对上述8种检定结果排列起来，此时我们看到的只是什乱无章的东西。
表6.第2小组(有症状病人)
13C阳性(n＝81)
注意：Fisher’s统计检验。
表7 13C阴性(n＝29)
Fisher’s统计检验
经过统计学(Fisher’s)处理后，血HP抗体与C13比较＜0.0002，HPS与C13比较＜0.0001，HPF与C13比较＜0.0059，而和胃镜，组织，病理，HP培养检测比较均＞0.05，
此时浮出了规律性；
(1)C13和胃镜，组织，病理，HP培养检测表现一样；看到第一定居奌，胃HP感染，
(2)HPS，HPF，血HP抗体的表现一样，但和C13表现不一样，看到第二定居奌，口腔HP感染。
把它们的数据放在95％可靠性的范围(置信区间)的图谱表现，可以看刭二群不同的图象；HPS，HPF，血HP抗体为一组(第二定居奌)，C13和胃镜，组织，病理，HP培养检测抗体为另一组(第二定居奌)。
换一个角度耒看看：也就是用McNemar统计法，当C13为阳性时，HPS，HPF，血HP而和胃镜，组织，病理，HP培养检测比较表现怎样？血HP抗体，HPS，HPF阳性率各为96.3％，95.6％，92.6％
此时显示了另一列规律性；
(1)它们可以测定胃HP感染，胃向口腔逆向运动可能存在，
(2)HPS，HPF，血HP抗体的表现有一致性，
(3)C13和胃镜，组织，病理，HP培养检测表现也有一致性。再换一个角度耒看看；也就是用McNemar统计法，当C13为阴性时，HPS，HPF，血HP而和胃镜，组织，病理，HP培养；检测比较表现怎样？
HPS，HPF，血HP抗体阳性率各为75.9％，72.4％，75.9％
此时显示了另一个规律性；
(1)HPS，HPF，血HP抗体高阳性率(比C13，，胃镜，组织，病理，HP培养检测)
(2)HPS，HPF，血HP抗体的表现有一致性，
(3)C13和胃镜，组织，病理，HP培养检测表现也有一致性。把它们放在标准误，可靠性的范围(Confidence Interval)，以及各自的T值看一看。
把它们的数据放在95％可靠性的范围(Confidence Interval)的图谱表现(统计法，当C13为阳性时，HPS，HPF，血HP而和胃镜，组织，病理，HP培养检测)，你们可以看刭二群不同的图象；HPS，HPF，血HP抗体为一组(第二定居奌)，C13和胃镜，组织，病理，HP培养检测抗体为另一组(第二定居奌)，但二组不同的图象可以重合，这说明HPS可以测定胃HP感染。
3.结论：
1)通常诊断胃HP感染的枝术在诊断口腔HP感染时出现盲区。
2)HPS能测到口腔HP感染，HPF则能反证HP在口腔中存在。
3)因为胃有逆向运动，HPS也能在唾液中测到胃HP感染。
上述数据形成的图谱见图5、6、7；
其中图5说明胃镜采样的组织,病理,HP培养,粪便HPF检测在UBT阳性组,阴性组,检测表现一样(检测第1定居点,胃的HP感染)。
图6说明在UBT阳性组,阴性组,HP血抗体,HPS,HPF检测表现一样(第2定居点,口腔的HP感染)。
图7说明在UBT阳性组,阴性组,HPS和HPF在二组病人中阳性率步歩増加。也就是说口腔HP感染在无胃痛,反酸症状,UBT阴性组,有胃痛,反酸症状,UBT阴性组,无胃痛,反酸症状,UBT阳性组,有胃痛,反酸症状,UBT阳性组逐步上升。
表10.说明在UBT阳性组，阴性组，HPS和HPF在二组病人中阳性率步步增加。也就是说口腔HP感染在无胃痛，反酸症状，UBT阴性组，有胃痛，反酸症状，UBT阴性组，无胃痛，反酸症状，UBT阳性组，有胃痛，反酸症状，UBT阳性组逐步上升。
C.HP口腔定值，临床PCR证据；
把29名入选C13为阳性,同时HPS,HPF也为阳性的病人,收集他们的牙斑,制成核酸后从北京空运到美国PCR实验室作PCR和HPS,HPF的平行研究。结果表明PCR和HPS,HPF的符合率在96%，见图8，其中阳性患者组1(胃和口腔同时有HP感染)n=29。
将33名C13为阴性病人,收集他们的牙斑作PCR和HPS,HPF作平行研究;结果表明PCR和HPS,HPF的符合率也有97%，见图9。C13(口腔同时有HP感染,但胃没有)阴性,HPS,HPF阳性患者组2,n=33。
這说明HP在口腔中的出现并不一定是随食物带进来的，也不是胃内HP倒流入口腔的(C13为阴性病人)，只能说HP在口腔中已定值了。同时用PCR反证了HPS，HPF所检测到的口腔HP感染是可靠的。
结论；
1)HP口腔定值的结论可以成立。
2)第二定居奌可以独立于第一定居点而存在。
3)HP口腔定值可能先于胃内定值。这是HP流行病中长期处于猜想 苦无证据的问题。
阴性对照病人:我们一共收到7个全阴性对照病人(HPS,HPF为2,C13阴性),他们的PCR标本都是阴性。见图10，其中阴性患者组3,n=7；HPS,HPF<2为阴性。
结论；1,第二定居奌可以独立于第一定居奌而存在。2,HP口腔定值可能先于胃内定值。
D，临床试验(第2部份)；口腔幽门螺杆菌感染与胃幽门螺杆菌感染的相关性探讨
选择2008年6月至11月、2010年1月至4月，对浙江大学医学院附属邵逸夫医院等5个单位共276例，分3组对HPS法与UBT法检测结果进行分析比较。第1组114例，其中邵逸夫医院32例，广东省中山市第一人民医院31例，浙江省嘉兴市圣和胃肠病诊所51例，均为有上消化道症状的初诊患者，其中男61例，女53例，年龄47(17～77)岁，排除了4周内服过抗生素、铋剂、质子泵抑制剂等对HP检测有影响的药物，经胃镜检查为慢性浅表性胃炎，少数患者伴糜烂或局灶性萎缩。114例均进行HPS检测，其中邵逸夫医院的32例同期进行13C-UBT 检测，其余82例均同期进行14C-UBT检测。第2组129例，其中浙江大学医学院附属第一医院58例，邵逸夫医院71例，均为胃镜下快速尿素酶试验(RUT)和/或胃黏膜切片染色镜检HP阳性，采用PPI三联7天疗法方案(奥美拉唑20mg，2次/日；阿莫西林1000mg，2次/日；克拉霉素0.5g，2次/日；对青霉素过敏者采用甲硝唑0.5g替换阿莫西林)规范抗HP治疗后4周进行复查的患者，其中男68例，女61例，年龄43(21～76)岁。129例均进行HPS检测，其中58例同期进行14C-UBT检测，71例同期进行13-UBT检测。第3组33例，为浙江省嘉兴市的志愿者，均无消化道症状，4周内未因其它疾病服用过抗生素及其它药物，其中男8例，女25例，年龄32岁(23～45)岁。33例均进行HPS检测，并同期进行14C-UBT检测。
研究方法
HPS检测方法HPS测试板由美利泰格诊断试剂有限公司(嘉兴)提供。受试者在测试当天晨起后避免刷牙及漱口，并禁食和禁水，留取的唾液标本在5分钟以内，立即在现场进行检测。检测方法及结果判断：取唾液0.5～1ml置于试杯内，用吸管吸取4滴唾液，滴入取样杯中，滴加2滴缓冲液于取样杯中，更换吸管，充分混匀后，吸取3～4滴混合液，滴入唾液测试板的加样窗口，5～15分钟观察结果，如指示窗口显示T线、C线，说明HP阳性；如指示窗只显示C线，未出现T线，说明HP阴性；如指示窗T线、C线均未出现说明检测无效，需进行重测。
13C和14C-UBT按13C、14C-UBT常规方法进行检测，13C-UBT结果判断DOB (delta over baseline)≥5判断为HP阳性；14C-UBT测试值≥200dpm/mmolCO2判断为HP阳性。
统计学处理采用X2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
3组HPS法和UBT法(包括13C-UBT与14C-UBT阳性标准见研究方法)的检测结果，见表。
表14 两种方法检测结果比较(例)
注：*X2＝7.26，P＜0.05；°X2＝8.14，P＜0.05；#X2＝14.21，P＜0.005)
从表14中可以看出，HPS阳性检出率，3组分别为77.19％(88/114)、75.97％(98/129)、81.82％(27/33)，3组比较差异无统计学意义(X2＝0.47，P＞0.05)；UBT阳性检出率，3组分别为52.63％(60/114)、34.11％(44/129)、21.21％(7/33)，3组比较差异有统计学意义(X2＝14.21，P＜0.005)，差异表现在第1组与第2组、第1组与第3组比较(X2＝8.48、10.19，均P＜0.005)，第2组与第3组比较差异无统计学意义(X2＝2.03，P＞0.05)；在UBT阳性者中，HPS阳性检出率，3组分别81.67％(49/60)、88.64％(39/44)、100％(7/7)，3组比较差异无统计学意义(X2＝2.25，P＞0.05)。以上结果显示：(1)3组唾液中均存在高HPS阳性检出现象；(2)UBT阳性者大多同时HPS阳性；(3)经PPI三联7天疗法方案规范抗HP治疗后4周复查组(129例)，UBT的阳性率为34.11％(44/129)，HPS阳性率为75.97％(98/129)。以上结果显示，两种方法HPS与13C/14C-UBT检测结果比较；
(1)口腔可能是Hp在胃以外的“第二定居点”；
(2)胃Hp感染者大多同时存在口腔Hp感染；
(3)提示口腔Hp感染，不但影响胃Hp感染根除治疗的疗效，而且口服药物对口腔Hp感染的治疗几乎无效。
本发明的HPS检测技术具有以下优点：
HPS检测技术的灵敏度高：
HPS检测技术的灵敏度极高，其灵敏度在10ng/ml左右。尿素酶是螺旋杆菌所释放的蛋白质，从实验室角度讲，是没有办法控制它的浓度高低的。在没有办法控制其浓度时，怎么去测定HPS的灵敏度 呢？我们应用了BSA技术，同时通过光透射方法，把同一等级的蛋白质分子大小作为刻度去测定尿素酶浓度，再在这个尿素酶浓度的刻度下去测定螺旋杆菌对HPS的最低灵敏度。10ng/ml是非常高的灵敏度，数个有毒螺旋杆菌释放的尿素酶就能在十分钟以内使HPS显示出阳性结果。
尿素酶是螺旋杆菌所释放的蛋白质，从实验室角度讲，是没有办法控制它的浓度高低的。我们应用了BSA技术，同时通过光透射方法，把同一等级的蛋白质分子大小作为刻度去测定尿素酶浓度，再在这个尿素酶浓度的刻度下去测定螺旋杆菌对HPS的最低灵敏度。
尿素酶灵敏度实验试验材料：
尿素酶：从幽门螺旋杆菌中提纯出来的.
BSA(牛血清白蛋白标准溶液)：规格2.0mg/ml(Pierce #23209)
1.BSA用PBS(磷酸盐缓冲液)稀释10倍(最终浓度为0.2mg/ml)。
2.尿素酶和BSA(0.2mg/ml)与NuPAGE LDS样品缓冲液(x 4，Invitrogen #NP0007)、DTT(二硫苏糖醇)混合在一起，制备不同浓度的样品。
尿素酶1 l+H2O 13 l+LDS样品缓冲液5 l+1M DTT 1 l
尿素酶2 l+H2O 12 l+LDS样品缓冲液5 l+1M DTT 1 l
BSA(0.2mg/ml)1 l+H2O 13 l+LDS样品缓冲液5 l+1M DTT 1 l
BSA(0.2mg/ml)2 l+H2O 12 l+LDS样品缓冲液5 l+1M DTT 1 l
BSA(0.2mg/ml)4 l+H2O 10 l+LDS样品缓冲液5 l+1M DTT 1 l
BSA(0.2mg/ml)6 l+H2O 8 l+LDS样品缓冲液5 l+1M DTT 1 l
BSA(0.2mg/ml)8 l+H2O 6 l+LDS样品缓冲液5 l+1M DTT 1 l
BSA(0.2mg/ml)10 l+H2O 4 l+LDS样品缓冲液5 l+1M DTT 1 l
BSA(0.2mg/ml)12 l+H2O 2 l+LDS样品缓冲液5 l+1M DTT 1 l
3.将尿素酶样品和BSA样品煮沸5分钟。
4.在SDS-PAGE凝胶(NuPAGE 4-12％ Bis-Tris凝胶，Invitrogen #NP0336BOX)上点样。5 l分子量标准品(精确分子量蛋白质标准品，BioRad #161-0374)
5.凝胶用CBB染色.
6.尿素酶的浓度通过对比尿素酶染色带和BSA染色带的强度估算出来。
7.用PBS稀释后的尿素酶准备灵敏度试验用的试验溶液。
Claims (6)
1.口腔螺旋杆菌感染检测方法，其特征在于：采用唾液幽门螺旋杆菌抗原法(HPS)和/或唾液幽门螺杆菌鞭毛抗原检测方法(HPF)进行检测，其过程为：取唾液0.5～1ml置于试杯内，用吸管吸取4滴唾液，滴入取样杯中，滴加2滴缓冲液于取样杯中，更换吸管，充分混匀后，吸取3～4滴混合液，滴入唾液测试板的加样窗口，5～15分钟观察结果，指示窗口显示测试线、对照线，说明HP阳性；指示窗只显示测试线，未出现对照线，说明HP阴性；指示窗测试线、对照线均未出现说明检测无效，需进行重测；在测试前，病人1小时内除白水外不能进食其他食物，且唾液取样后，必需在5分钟内测定；其中HPS检测技术的定性检测人体唾液中相应Hp产生的尿素酶抗原；HPF检测技术的定性检测人体唾液中相应Hp产生的鞭毛培育的鞭毛抗原；HPS和HPF以唾液作为检测标本，主要用于口腔Hp感染的诊断检测用；HPS和HPF检测技术的定性检测人体唾液中螺旋杆菌释放具有毒性的细胞毒素相关抗原(CagA)和变性细胞毒素(VacA)所産生的尿素酶和的鞭毛抗原，这两种蛋白是与幽门溃疡和胃癌有关。
2.如权利要求1中所述的口腔螺旋杆菌感染检测方法，其特征在于：所述缓冲液是PH值为7.4的磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液包括0.01M/LNa2HPO4-2H2O，0.0027M/L KCl，0.137M NaCl，0.1％KH2PO4。
3.权利要求1中所述的口腔螺旋杆菌感染检测方法中使用的唾液检测试板，所述唾液测试板具有面板和唾液测试条，唾液测试条具有硝酸纤维层，其特征在于：还包括有唾液吸收纸层、胶体金纸层、吸收纸层，唾液吸收纸层、胶体金纸层、玻璃纤维纸层、吸收纸层依次首尾相连粘贴在一起，所述唾液吸收纸层含有0.05摩尔/升的硼砂；在玻璃纤维层上沿从吸收纸层至胶体金纸层方向依次设有对照线、测试线，其中对照线上附有羊多克隆抗体，测试线上附有尿素酶抗体，所述胶体金纸层由玻璃纤维纸上附有尿素酶抗体胶体金构成；所述尿素酶抗体是通过能释放有毒性的细胞毒素相关抗原CagA和变性细胞毒素VacA的螺旋杆菌释放的尿素酶制备出的单克隆抗体。
4.如权利要求3中所述的唾液测试板，其特征在于：每个唾液测试条上均包括有52ug羊多克隆抗体、41ug尿素酶抗体、67ug尿素酶抗体胶体金。
5.权利要求1中所述的口腔螺旋杆菌感染检测方法中使用的唾液检测试板，其特征在于：所述唾液测试板具有面板和唾液测试条，唾液测试条具有硝酸纤维层，其特征在于：还包括有唾液吸收纸层、胶体金纸层、吸收纸层，唾液吸收纸层、胶体金纸层、玻璃纤维纸层、吸收纸层依次首尾相连粘贴在一起，所述唾液吸收纸层含有0.05摩尔/升的硼砂；在玻璃纤维层上沿从吸收纸层至胶体金纸层方向依次设有对照线、测试线，其中对照线上附有羊多克喀抗体，测试线上附有鞭毛抗体，胶体金纸层上附有鞭毛抗体胶体金，其中鞭毛抗体是通过能释放有毒性的细胞毒素相关抗原CagA和变性细胞毒素VacA的螺旋杆菌释放的鞭毛制备出的抗体。
6.如权利要求5中所述的唾液测试板，其特征在于：每个唾液测试条上均包括有52ug羊多克隆抗体、41ug鞭毛抗体、67ug鞭毛抗体胶体金。
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| MULAMOOTTIL | Specimen Collection | |
| Agha et al. | Patients of Helicobacter pylori Infection with Iron Deficiency Anemia. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130911 |