ES2243923T3

ES2243923T3 - Procedimientos para la extraccion de antigenos que se encuentran en los microorganismos.

Info

Publication number: ES2243923T3
Application number: ES94308983T
Authority: ES
Inventors: Gregory R. Bogart; Robert J. Bilodeau; Rachael M. Ostroff; Jeffrey W. Steaffens
Original assignee: Thermo Biostar Inc
Current assignee: Inverness Medical Biostar Inc
Priority date: 1993-12-03
Filing date: 1994-12-02
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2014-12-02
Also published as: EP0659437A3; US5494801A; HK1001885A1; EP0659437A2; CA2137034A1; EP0659437B1; DE69434406D1; ATE297756T1; DE69434406T2

Abstract

Un método para extraer un antígeno de un microorganismo contenido en una muestra, consistente en las siguientes etapas: (a) poner en contacto dicha muestra con hipoclorito durante un tiempo suficiente para extraer el antígeno, donde dicho hipoclorito es presentado como una sal sólida de hipoclorito o un reactivo de hipoclorito acuoso no tamponado, y (b) neutralizar a continuación dicha muestra.

Description

Procedimientos para la extracción de antígenos que se encuentran en los microorganismos.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con materiales y métodos para la extracción de antígenos de microorganismos.

Antecedentes de la invención

Diversas técnicas para la extracción de antígenos de microorganismos son bien conocidas para los expertos en este campo. Antígenos celulares tales como carbohidratos, proteínas, lipoproteínas, lipopolisacáridos, polisacáridos, ácidos nucleicos, carbohidratos acomplejados con proteínas, lípidos y otros, han sido extraídos por una variedad de medios químicos o mecánicos. Dichas técnicas de extracción incluyen la ebullición, el autoclavado, la extracción con detergentes, la extracción con ácidos, la digestión con formamida caliente, la extracción con ácido nitroso, la sonicación u otra alteración mecánica, la extracción con fenol/cloroformo o la digestión con enzimas. Si se va a usar un antígeno en un ensayo inmunológico, es importante que el protocolo de extracción conserve las características de unión de ese antígeno.

El ácido nitroso es una técnica de extracción mecánica (Manual of Clinical Microbiology, Tercera Edición, Edwin H. Lennette, Albert Balows, William J. Havsler, Jr. y Joseph P. Traunt, Editores, American Society for Microbiology, Washington, DC (1980)). El método implica tradicionalmente la mezcla de dos reactivos líquidos, un ácido y una solución de sal nitrito. Esta mezcla genera un intermediario de ácido nitroso en solución. Esta solución nitrosa es generalmente neutralizada antes de las etapas posteriores. Los kits de ensayo basados en este método incluyen tres botellas de reactivos independientes diseñadas para administrar un volumen predeterminado, es decir, un número de gotas, de cada reactivo a un tubo de muestra.

Se han descrito variaciones de esta técnica. Por ejemplo, Sand y col. (solicitud de patente WO93/15217) describen una extracción de estreptococos del Grupo A o B con dos reactivos secos y uno líquido. Se secan el nitrito de sodio y la base Tris en almohadillas de filtro separadas y se añade un exceso de volumen de ácido acético para reconstituir primeramente el NaNO_{2} y luego (tras un período de extracción) la base Tris que neutraliza la solución.

La Patente EE.UU. 4.851.337 describe otra modificación del protocolo de extracción con ácido nitroso, en donde un recipiente contiene un ácido polimérico y uno contiene una solución de nitrito. Aunque no reduce el número de reactivos, este método proporciona soluciones pre-medidas que pueden ser rápidamente mezcladas para permitir la extracción del antígeno. El usuario final no necesita medir un número especificado de gotas de reactivo en el tubo de muestra. En este método, se transfiere la solución de nitrito a un tubo que contiene ácido polimérico seco, se mezcla y se añade una torunda de muestra. Después de un período de incubación, se neutraliza la solución por adición de un reactivo de otro tubo.

La Patente EE.UU. 4.673.639 describe otra modificación del protocolo de extracción con ácido nitroso usando microtubos que contienen dos reactivos secos en zonas discretas del tubo. Se reconstituyen los reactivos y se activan por adición de agua y de la torunda que contiene la muestra. Se mantienen los reactivos en el tubo por ligantes o vehículos inertes, tales como dextrano, poliacrilamida, ácido poliacrílico, alcohol polivinílico, PEG, PEO, PVP, goma guar, carboximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilcelulosa, algina, carragenina y goma xantano.

La extracción de antígenos es una etapa importante en la identificación de microorganismos que se relacionan con diversos estados de la enfermedad, tales como estreptococos del Grupo A y estreptococos del Grupo B ("GBS"). Una vez se han extraído los antígenos del organismo, pueden ser usados para aislamiento y purificación de un material específico para posterior producción de anticuerpos o vacunas o una variedad de otros usos. Los antígenos extraídos que son específicos para un organismo dado pueden ser usados para la identificación de ese organismo en una muestra de ensayo. La muestra de ensayo puede ser cualquier muestra clínicamente relevante, tal como suero, sangre, orina, plasma, esputo, semen, frotis de garganta, frotis vaginales y diversas secreciones u otros fluidos. Es de particular interés el uso de una técnica de inmunoensayo para la identificación de un antígeno específico para el diagnóstico de una infección específica.

Se dispone de una variedad de técnicas de inmunoensayo. Todas se basan en la capacidad de un anticuerpo y de su correspondiente antígeno para interaccionar específicamente. La aglutinación con látex se basa en la agregación de partículas, coloreadas o blancas, para la detección de una interacción específica. Se pueden marcar anticuerpos con partículas radiactivas, enzimáticas o metálicas o marcajes fluorescentes, quimioluminiscentes o una variedad de otros marcajes para producir una señal interpretable. En una forma clásica de inmunoensayo, se usa un anticuerpo marcado con una enzima para convertir un substrato incoloro en un producto coloreado, que puede ser medido espectrofotométricamente. Otra técnica de inmunoensayo incluye inmunoensayos ópticos. Estas técnicas se basan en las interacciones únicas de películas delgadas con la luz para medir un cambio de masa en las películas delgadas y se describen en las Patentes EE.UU. Nº 5.541.057 y 5.869.272.

Resumen de la invención

Esta invención se relaciona con métodos y kits para la extracción y detección de antígenos de microorganismos usando un procedimiento mejorado de extracción que combina un reactivo de ácido nitroso con base o hipoclorito, o que se basan en el hipoclorito solo. Antígenos celulares tales como carbohidratos, proteínas, lipoproteínas, lipopolisacáridos, polisacáridos, ácidos nucleicos y carbohidratos acomplejados con proteínas, lípidos y otros, son ejemplos de los tipos de materiales que pueden ser extraídos. Los métodos de la presente invención se enfocan en mejorar la extracción de la muestra para aumentar la disponibilidad del antígeno. La presente invención da lugar a protocolos de extracción rápidos y simples que obvian la necesidad de eliminar los reactivos de extracción antes de la identificación, no dañan el material que se ha de identificar y permiten que una mayor cantidad de antígeno resulte accesible a los reactivos de unión, tales como anticuerpos. Estos métodos consiguen una extracción eficiente de antígenos que permite la identificación del microorganismo en una muestra incluso cuando está presente a bajas concentraciones.

La presente invención también proporciona métodos para la detección de antígenos extraídos. Se hace preferiblemente la extracción por una técnica de inmunoensayo y más preferiblemente por inmunoensayos ópticos, que permiten un diagnóstico rápido, sensible y preciso de microorganismos causantes de enfermedad. En particular, los métodos son útiles para la extracción y la identificación de estreptococos de torundas de muestra. Y, más concretamente, para la extracción e identificación de estreptococos del Grupo B.

Los GBS son la causa principal de la morbilidad y mortalidad neonatal y materna. El neonato puede desarrollar una enfermedad de rápida instauración entre el nacimiento y la primera semana del neonato. La enfermedad se caracteriza por distrés respiratorio, sepsis y shock. Se producen entre 1,9 y 3,7 casos por 1.000 nacidos vivos solamente en los EE.UU., con una tasa de mortalidad del 26% al 50%, y un 30% de los niños infectados desarrollará meningitis. De este último grupo, un 50% sufrirá lesión neurológica permanente. Se estima que la infección por GBS cuesta sólo a los EE.UU. más de \textdollar500 millones al año en cuidados para la salud.

El GBS también produce una enfermedad de instauración tardía que aparece en los primeros 3 meses después del nacimiento. Las enfermedades en estos casos se caracterizan por trastornos del sistema nervioso central, meningitis y bacteriemia. Hay una tasa de mortalidad de aproximadamente el 20% para niños con estas enfermedades. La correlación directa de la existencia de GBS cervical/vaginal maternal y la infección de niños ha quedado demostrada. El tratamiento de la madre antes del parto mejora mucho el resultado neonatal y puede eliminar la transmisión vertical de GBS.

Un aumento en la eficacia de extracción de antígenos de Streptococcus del Grupo B (GBS), Streptococcus agalactiae, es crítico para la identificación de este organismo a la sensibilidad clínica requerida. El antígeno específico del grupo GBS se une covalentemente al peptidoglicano de la pared celular y de hecho atraviesa toda la pared celular, haciendo que la extracción de este antígeno sea más difícil que antígenos similares de otros organismos (J. Med. Micro., 18, 139-166, 1984). Los antígenos de Streptococcus del Grupo G, del Grupo F y del Grupo A son también extraídos por estos métodos.

La invención se relaciona con reactivos de extracción que son también agentes mucolíticos efectivos. Estos reactivos de extracción facilitan la extracción de antígenos por un mecanismo de alteración directa de la célula y por lisis del mucus de la muestra. La lisis del mucus expone las células al reactivo de extracción y reduce la unión inespecífi-
ca.

En un método, el solicitante ha determinado que una etapa de incubación en base inmediatamente después de la extracción con ácido nitroso aumenta el antígeno disponible para una técnica de inmunoensayo. En un segundo método, se usa hipoclorito de sodio para la extracción y una vez más facilita la liberación de antígeno para las técnicas de inmunoensayo. La etapa del hipoclorito puede ir seguida de una etapa de extracción con ácido nitroso.

Los métodos de extracción de esta invención están bien adaptados a la preparación de muestras para uso en inmunoensayos ópticos. La invención se relaciona también con métodos y kits para la detección de antígenos extraídos de microorganismos en base a la combinación de estas técnicas de extracción y de inmunoensayos ópticos. Se prefieren tres técnicas. Una se basa en la interacción de la luz blanca con películas para producir un efecto de interferencia visible, otro en la interacción de la luz elipsométricamente polarizada para producir una señal cuantificable y otro en la interacción de la luz linealmente polarizada con las películas delgadas para producir un cambio en la intensidad de la luz.

Así, en un primer aspecto, la invención se relaciona con un método para la extracción de un antígeno de un microorganismo contenido en una muestra, que consiste en las siguientes etapas:

(a) poner en contacto dicha muestra con hipoclorito durante un período de tiempo suficiente para extraer el antígeno, donde dicho hipoclorito está en forma de sal sólida de hipoclorito o de un reactivo acuoso no tamponado de hipoclorito, y

(b) neutralizar a continuación dicha muestra.

En una realización, la muestra contacta con nitrato de sodio antes de la etapa (b). En un ejemplo de esta realización, después de la etapa (a) y antes de la etapa (b), la muestra contacta con ácido nitroso, para generar reactivo(s) durante un período de tiempo suficiente para aumentar la exposición al antígeno.

Por "reactivos que generan ácido nitroso", se quiere decir la combinación de nitrito de sodio y ácido acético u otros químicos equivalentes. Se puede generar ácido nitroso usando otras sales de nitrito. También se puede usar un reactivo líquido para suministrar el nitrito de sodio. Se puede substituir con una variedad de otros ácidos el ácido acético para la reacción con la sal nitrito y la formación del reactivo nitroso. Son ejemplos de otros ácidos que pueden ser usados: ácido cítrico, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido nítrico, ácido fosfórico o ácidos orgánicos débiles.

Por "período de tiempo suficiente para permitir que el ácido nitroso extraiga el antígeno", se quiere decir el tiempo de incubación requerido para liberar suficiente antígeno del microorganismo para hacerlo disponible para la posterior detección. Éste es típicamente de instantáneo a 10 minutos.

Por "base", se entiende un reactivo capaz de generar una solución de pH 12-14. Un reactivo preferido es el hidróxido de sodio; sin embargo, se pueden usar otros reactivos, tales como el hidróxido de potasio, el hidróxido de amonio u otras bases fuertes.

Por "período de tiempo suficiente para aumentar la exposición del antígeno", se quiere decir un tiempo que expone además el antígeno en mayor medida que lo que se consigue por extracción sólo con ácido nitroso, de tal forma que el antígeno está más expuesto y más disponible para la reacción con los reactivos usados para la detección, permitiendo así una mayor detección. Dicha mayor detección permite la detección de cantidades menores de antígeno o proporciona una menor razón de señal a ruido. Este período de tiempo es típicamente de 0,5 a 10 minutos.

Por "neutralización", se entiende la adición de un sistema tampón que alcanza un rango de pH final de 6,0 a 8,0. Son ejemplo de sistemas tampón adecuados MOPSO (detergente TWEEN20™ al 0,2%, suero bovino al 15%, conservante PROCLIN300™ al 0,5% y EGTA 20 mM), TRIS, MOPS y HEPES.

En una realización preferida, los reactivos que generan ácido nitroso consisten en ácido acético entre 0,25 M a 1,0 M y nitrito de sodio entre 0,5 y 2,5 M; el primer contacto se produce durante un período de tiempo de 0,5 a 10 minutos; el segundo contacto se produce durante un período de tiempo de 2 a 10 minutos; la base consiste en NaOH entre 2 N y 6 N y la neutralización se realiza con un tampón que contiene MOPSO entre 1,0 y 2,5 M a pH 6,0.

Se dispone del nitrito de sodio preferiblemente como un reactivo previamente desecado en el tubo de extracción.

En una realización, la invención se relaciona con un método para extraer antígeno de un microorganismo contenido en una muestra y para lisar el mucus de la muestra.

Por "lisar el mucus", se entiende la liberación efectiva del microorganismo de la matriz de la muestra circundante y la reducción simultánea no específica que puede estar asociada con el mucus en una muestra.

En una realización, la muestra reacciona con reactivos que generan ácido nitroso en presencia de un agente quelante y de un agente reductor de los enlaces disulfuro. En una realización preferida, el agente quelante es etilendiaminatetraacetato (EDTA) o EGTA y el agente reductor de enlaces disulfuro es ditiotreitol. La concentración de EDTA o de EGTA es preferiblemente de 0,1 a 100 mM y la concentración de ditiotreitol (DTT) es preferiblemente de 0,1 a 100 mM. El EDTA o EGTA y el DTT son opcionales, pero proporcionan un mayor rendimiento con muestras que contienen mucus.

Por lo tanto, la invención se relaciona con un método para extraer un antígeno de un microorganismo contenido en una muestra por contacto de la muestra con hipoclorito y nitrito de sodio durante un período de tiempo suficiente para extraer suficiente antígeno para hacerlo disponible para la posterior detección y neutralización de la muestra. El método es igualmente efectivo cuando se usa sólo hipoclorito, sin nitrito de sodio.

Por "hipoclorito", se entiende un reactivo suministrado en forma de solución acuosa de hipoclorito de sodio, aunque se puede substituir con otras sales de hipoclorito. Se pueden adquirir comercialmente soluciones de hipoclorito de sodio que contienen hasta un 10% de hipoclorito disponible. El hipoclorito sólido (que contiene un 40% de hipoclorito disponible) puede substituir a las soluciones comerciales. Se podría obtener una mayor concentración final de hipoclorito usando el material sólido para producir el reactivo líquido disolviendo simplemente el sólido en agua desionizada. También sería posible suministrar el reactivo de hipoclorito como reactivo seco en un tubo de extracción, si se desea. Este método funciona de forma óptima cuando se usa una solución acuosa de más del 6% de hipoclorito.

Un período de tiempo útil en este aspecto es generalmente de hasta 30 minutos.

En una realización preferida, el hipoclorito es de un 0,1% a un 10%, el nitrito de sodio es de entre 0,5 y 2,5 M, el contacto es durante un período de tiempo de 2 a 30 minutos y la neutralización es con un tampón que contiene MOPSO de 1,0 a 2,5 M a pH 7,0.

En una realización, la invención se relaciona con un método de extracción de un antígeno a partir de un microorganismo contenido en una muestra poniendo primeramente en contacto la muestra con hipoclorito y nitrito de sodio durante un período de tiempo suficiente para permitir que el hipoclorito extraiga el antígeno, poniendo en segundo lugar la muestra en contacto con reactivos que generan ácido nitroso durante un período de tiempo suficiente para aumentar la exposición del antígeno como se ha descrito antes y neutralizando la muestra.

Por "período de tiempo suficiente para permitir que el hipoclorito extraiga el antígeno", se entiende el tiempo de incubación requerido para liberar el antígeno del microorganismo y hacerlo disponible para su posterior detección.

Por "reactivos que generan ácido nitroso", se entiende la incubación con ácido acético o un ácido comparable y nitrito de sodio, según se ha especificado anteriormente.

Por "período de tiempo suficiente para aumentar la exposición del antígeno", se entiende un período de tiempo que expone aún el antígeno en un mayor grado que lo conseguido por extracción con hipoclorito y nitrito de sodio, de tal forma que el antígeno está más expuesto y más disponible para reacción con los reactivos usados para la detección, posibilitando así una mayor detección. El protocolo de hipoclorito/ácido nitroso permite una mayor exposición del antígeno, ya que el nivel de hipoclorito disponible puede caer (aunque la estabilidad de la solución de hipoclorito a la temperatura ambiente o por debajo de ella es excelente, a altas temperaturas el hipoclorito decae lentamente). La exposición a ácido nitroso después de esta caída potencial en los niveles de hipoclorito asegura la continuidad del proceso de extracción. El orden de adición para el hipoclorito y el ácido acético (usado para generar ácido nitroso) puede ser revertido mientras se mantenga el mismo tipo de mayor exposición del antígeno.

En una realización preferida, el hipoclorito es de entre el 0,1% y el 10%, el nitrito de sodio es de entre 0,5 y 2,5 M, el primer contacto es durante un período de tiempo de 2 a 30 minutos y la neutralización es con un tampón que contiene MOPSO 1,5 M a pH 7,0; los reactivos que generan ácido nitroso consisten en ácido acético entre 0,25 y 2,0 M y el segundo contacto es durante un período de tiempo de 0,5 a 30 minutos.

Se describe un método para lisar el mucus de una muestra por contacto de la muestra con hipoclorito y nitrito de sodio durante un período de tiempo suficiente para lisar el mucus de la muestra y neutralizar la muestra. El método es igualmente efectivo cuando se usa sólo hipoclorito, sin nitrito de sodio.

Este efecto mucolítico del hipoclorito es sorprendente. La acción mucolítica del hipoclorito libera de forma efectiva el microorganismo de la matriz de la muestra circundante y extrae luego también los antígenos deseados y reduce simultáneamente la unión inespecífica que puede asociarse con el mucus en una muestra. En el Ejemplo 4, se presenta la descripción de un kit que contiene estos reactivos. El efecto mucolítico del hipoclorito es también observado en el método del hipoclorito/nitroso.

En una realización preferida, la muestra reacciona con hipoclorito y nitrito de sodio en presencia de un agente quelante y un agente reductor de disulfuro. El hipoclorito puede ser usado solo.

En realizaciones preferidas de los métodos de extracción y de métodos para lisar el mucus en una muestra, el antígeno es seleccionado entre el grupo consistente en carbohidratos, proteínas, lipoproteínas, lipopolisacáridos, polisacáridos, ácidos nucleicos, carbohidratos acomplejados con proteínas, lípidos, ADN y ARN; el organismo es una especie de Streptococcus, más preferiblemente Streptococcus del Grupo B, Streptococcus del Grupo G, Streptococcus del Grupo A o Streptococcus del Grupo F.

La invención se relaciona con un kit para la extracción de antígenos de microorganismos según el método de la invención, cuyo kit incluye tubo(s) de extracción que contiene(n) nitrito de sodio desecado, una alícuota de solución de hipoclorito, sal de hipoclorito sólida, una alícuota de tampón neutralizante, una alícuota de ácido acético y una alícuota de EDTA y ditiotreitol.

Se describe un método para la detección de antígenos extraídos de microorganismos contenidos en una muestra, cuyo método incluye el contacto de la muestra con reactivos que generan ácido nitroso durante un período de tiempo suficiente para que el ácido nitroso extraiga el antígeno, la posterior reacción de la muestra con base durante un período de tiempo suficiente para aumentar la exposición del antígeno, la neutralización de la muestra, el contacto de la muestra con una superficie de ensayo que se une específicamente al antígeno y la detección de la unión del antígeno a la superficie de ensayo por un método analítico adecuado.

Por "superficie de ensayo que se une específicamente al antígeno", se entiende una superficie que puede ser usada en un método de detección por inmunoensayo óptico o una superficie adecuada para otro método analítico, tal como: pocillos de microtitulación, tubos de ensayo, perlas de poliestireno, perlas de micropartículas, membranas u otras superficies conocidas para los expertos en la técnica revestidas de anticuerpo, ácido nucleico o antígeno.

Por "método analítico adecuado", se entiende un método de detección óptica; enzimoinmunoensayos en pocillos de microtitulación, tubos de ensayo, membranas o perlas; radioinmunoensayos; ensayos quimioluminiscentes; ensayos fluorescentes; ensayos de aglutinación, y otras técnicas conocidas para los expertos en este campo. Como métodos analíticos adecuados, se incluyen: métodos de difracción, SPR, elipsometría, efectos de interferencia con película fina, espectrofotometría, reflectometría, cambios en la intensidad o el grado de polarización, microscopía de tunelización por barrido ("STM"), microscopía de fuerza atómica ("AFM"), reflectancia interna total, interferometría, sensores piezoeléctricos y otros métodos ópticos y electroquímicos relacionados.

Preferiblemente, la muestra contacta con un marcaje secundario o componente generador de señal después de la etapa de neutralización.

Un "marcaje secundario" en un inmunoensayo óptico produce un aumento de la masa. Éste podría incluir un anticuerpo marcado enzimáticamente en combinación con un substrato para la enzima que produce un producto insoluble y precipitante. O podría incluir materiales que se unan al analito apropiado por medio de un reactivo de unión secundario específico adherido a un látex formador de película. Para otros métodos, el marcaje es seleccionado para adaptarse al método analítico. Por ejemplo, se usa un radiomarcaje en un RIA, una enzima en combinación con un substrato cromogénico en un EIA, un marcaje fluorescente en un FIA o IFA y otros conocidos para los expertos en la técnica. El marcaje secundario es directa o indirectamente responsable de la generación de una señal. En general, el marcaje secundario se une a un agente de unión específico para el analito de interés.

Por "componente generador de señal", se entiende un componente que permite la producción de una señal detectable por un método analítico adecuado. El marcaje secundario puede generar intrínsecamente señal, como en un RIA, o el marcaje secundario puede actuar sobre otro material para generar señal, como en un EIA, donde una enzima convierte un substrato (sin señal) en un producto (señal). La enzima convierte un cromóforo en una forma que tiene un mayor coeficiente de extinción a una longitud de onda específica. En este ejemplo, la señal es un cambio de color visible o una medición espectrofotométrica. La señal medida es función del método de detección usado y debe resultar clara para un experto en la técnica.

Se describe un método para la detección de antígenos extraídos de microorganismos contenidos en una muestra, consistente en las etapas de reacción de la muestra con hipoclorito durante un período de tiempo suficiente para extraer el antígeno, neutralización de la muestra contacto de la muestra con una superficie de ensayo que se une específicamente al antígeno y detección de la unión del antígeno por un método analítico adecuado.

La muestra reacciona preferiblemente con reactivos que generan ácido nitroso después de la etapa de contacto con el hipoclorito.

Preferiblemente, el método analítico es seleccionado entre el grupo consistente en elipsometría, elipsometría comparativa, espectrofotometría, reflectometría, efectos de interferencia con películas finas, resonancia plasmónica superficial, reflexión interna total, interferómetros, reflectancia total atenuada, sensores piezoeléctricos, reflexión interna incompleta, cambios en la rotación de la polarización o cambios en la intensidad de la luz polarizada, sensores de guía de ondas, AFM, STM e inmunoensayos que utilizan partículas radiactivas, enzimáticas o metálicas, marcajes fluorescentes o quimioluminiscentes o aglutinación.

La invención se relaciona con un kit de ensayo para la detección de antígenos extraídos de microorganismos que utiliza los métodos de la invención y que constan de tubo(s) de extracción que contienen nitrito de sodio seco, una alícuota de solución de hipoclorito o de sal sólida de hipoclorito, una alícuota de solución de ácido acético, una alícuota de un tampón neutralizante, una alícuota de EDTA y ditiotreitol, una alícuota de marcaje secundario, una alícuota de substrato precipitante, una alícuota de solución de lavado, pipetas de transferencia de muestra y una superficie de ensayo.

Por "substrato precipitante", se entiende un substrato capaz de interaccionar con un reactivo intensificador de masa o un marcaje secundario para producir un producto precipitante insoluble.

Por "solución de lavado", se entiende agua, una solución tamponada, una solución que contiene detergente u otro reactivo de este tipo.

En una realización preferida, el hipoclorito es producido disolviendo una sal sólida de hipoclorito a la concentración final deseada.

Breve descripción de las figuras

Se describirán brevemente los dibujos en primer lugar.

Dibujos

La Fig. 1 es una representación diagramática que muestra las etapas del método para uso del dispositivo de ensayo simple.

Descripción de las realizaciones preferidas

Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención.

Se usan tres métodos de detección por inmunoensayo óptico diferentes en las realizaciones preferidas de esta invención. Estos métodos se basan en el estudio de películas finas. Aunque estas técnicas son óptimas, una variedad de otros métodos pueden ser útiles con estas técnicas de extracción. La selección de la superficie de ensayo apropiada para el método de detección empleado debe resultar obvia para cualquiera experto en la técnica. Por ejemplo, el método de ensayo por difracción descrito por Gustafson en la Patente EE.UU. 4.876.208 ó por Nicoli en la Patente EE.UU. 4.647.544, o métodos relacionados, sería un método de detección adecuado para esta invención. La superficie de ensayo utilizada contendría la red difractora requerida para generar la señal apropiada. Otros métodos de detección adecuados son: resonancia plasmónica superficial, según se describe en las Patentes EE.UU. 4.828.387 y 4.931.384 y otras publicaciones; las técnicas de reflexión interna total, interferómetros, reflectancia total atenuada, sensores piezoeléctricos, microscopía de fuerza atómica ("AFM"), microscopía de tunelización por barrido ("STM"), reflexión interna incompleta, espectrofotometría, reflectometría y una variedad de sensores de guía de ondas. Cualquier tipo de método de inmunoensayo se beneficiaría de los métodos de preparación de antígeno de la presente invención.

Uno de los métodos ópticos preferidos se basa en la interacción de la luz blanca con una serie de películas finas. En este caso, las películas finas son usadas para crear una interferencia destructiva de luz blanca, dando así lugar a un cambio de color visible sobre la superficie del substrato óptico. Los componentes de esta superficie de ensayo ópticamente activa incluyen un substrato óptico, una película fina óptica, una capa de unión y un material receptivo. Se selecciona el substrato óptico para obtener el nivel deseado de reflectividad. Ésta puede ser una propiedad intrínseca del material del substrato, o se puede modificar el substrato por capas adicionales para obtener las propiedades deseadas. La película fina óptica es seleccionada en base a los índices de refracción de la película fina y al substrato y el color deseado para el cambio de color final. Sin embargo, se hacen ajustes críticos en el espesor de la película fina óptica en base al tipo de la capa de unión y del material receptivo usados en el ensayo final. Se selecciona la capa de unión, preferiblemente, a partir de una serie de siloxanos ramificados. El material receptivo se basa en el antígeno o el analito que han de ser detectados.

El nitruro de silicio es una de tales películas finas ópticas y puede ser depositado sobre las pastillas de silicio usando un procedimiento de deposición por vapor bien entendido por los expertos en la técnica de los semiconductores o de la óptica. Una variedad de materiales ópticos pueden substituir a la capa de nitruro de silicio y se describen en las Patentes EE.UU. 5.541.057 y 5.869.272, antes citadas.

Los otros métodos se basan en la interacción de la luz elipsométricamente o linealmente polarizada con las películas finas sobre el substrato óptico. La selección de un substrato se basa una vez más en la reflectividad deseada para el instrumento que se va a usar. El uso de una película fina óptica es opcional en la detección instrumentada de cambios en la película fina. Pero la capa de unión y el material receptivo usados son los mismos que para el primer método óptico. Las superficies de ensayo reaccionadas son luego examinadas en cuanto a un cambio en la intensidad de luz de la zona reaccionada en relación a la zona no reaccionada. Este cambio en la intensidad de luz puede representar un cambio en la longitud de onda, el grado o intensidad de elipticidad, el grado o intensidad de polarización, el grado o intensidad de luz elípticamente polarizada o el grado o intensidad de luz linealmente polarizada. Para una descripción más detallada, véanse las Patentes EE.UU. 5.541.057 y 5.869.272, antes citadas.

La capa de unión es preferiblemente seleccionada entre una serie de reactivos consistentes en siloxanos estructurados ramificados, dendrímeros, polímeros estrella, polímeros autoensamblables moleculares, siloxanos poliméricos o látex formadores de película. Una capa de unión preferida es un siloxano ramificado con estructura en T y se produce por una técnica de revestimiento por rotación. Se puede preparar una dilución 1:300 (v/v) del polímero en T (T-Polymer-Aminoalkyl T-structure branch point polydimethyl siloxane, Petrarch, Bristol, Pa) en 2-metil-2-butanol. Se aplica la capa de unión a la pastilla de silicio por un método de revestimiento por rotación y se cura durante 24 horas a 140ºC antes de su uso. Se prefiere generalmente una capa final de 100-160\ring{A}. Para el revestimiento por rotación, se pone una muestra de 300 microlitros de esta solución en una pastilla de ensayo de silicio virgen de 100 mm mediante una micropipeta, aunque son igualmente útiles sistemas de administración por aerosol o pulverización automatizados, mientras que la pastilla está girando a 7.000 rpm en un revestidor por rotación fotorresistente. El revestimiento por rotación puede procesar rápidamente un gran número de substratos. El proceso es también fácilmente automatizado.

Se depositan los materiales receptivos sobre las capas de unión aplicadas al substrato óptico a partir de una solución tamponada. Tampones que cubren un rango de pH de 5,0 a 9,0 han demostrado proporcionar un revestimiento de capa receptiva efectivo. Se puede usar una amplia variedad de formulaciones de tampón. Los materiales receptivos pueden ser depositados sobre la capa de unión por incubación a un amplio rango de temperaturas y durante períodos variables de tiempo. Una de tales capas receptivas, y aquélla que sería preferida para un inmunoensayo, es un anticuerpo. Se estabiliza entonces el anticuerpo con un revestimiento proteico protector.

Se pueden poner las superficies de ensayo revestidas de anticuerpo en dispositivos de ensayo simples antes del ensayo. El uso del dispositivo de ensayo está descrito a continuación (Patentes EE.UU. 5.541.057 y 5.869.272, antes citadas).

Una vez extraído el antígeno, puede ser necesario hacer reaccionar el antígeno inmovilizado con un marcaje secundario para facilitar la detección. En los métodos ópticos de película fina, esto significa aumentar la masa generada sobre la superficie en función de la cantidad de analito sobre la superficie. En una realización preferida, se mezcla el antígeno extraído a 5:1 (muestra:marcaje secundario) con una dilución 1:100 de la preparación de marcaje secundario que contiene MOPSO 50 mM, pH 7,0, caseína tratada con álcali al 3%, detergente TWEEN20™ al 0,2% y conservante PROCLIN300™ al 0,5%. La dilución exacta usada varía con la preparación de marcaje secundario y el método de detección. Es aceptable un rango de razones de muestra a marcaje secundario. Se incuba la mezcla de muestra/marcaje secundario durante 5 minutos a temperatura ambiente, se aplican luego 20 \mul de la mezcla al dispositivo de ensayo y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente, o alternativamente durante 10 minutos directamente sobre la superficie. Los tiempos de incubación pueden variar con la concentración y la proporción del marcaje secundario.

Para la intensificación de masa de un inmunoensayo óptico, se puede conjugar una preparación de anticuerpos a HRP, peroxidasa de rábano picante, usando el método del peryodato de Nakane. Una enzima en combinación con un substrato precipitante formará una capa adicional de material que aumenta el efecto de la película fina que se está midiendo. Se pueden combinar reactivos de unión secundarios con otros tipos de materiales que introducen masa adicional en la película fina formada sobre la superficie en función de la concentración de analito (Patentes EE.UU. 5.541.057 y 5.869.272, antes citadas).

Haciendo referencia a la Fig. 1, se muestra un método mediante el cual se usa un solo dispositivo de ensayo. Específicamente, en la etapa 1, se obtiene una muestra y se aplica a la superficie de ensayo. Dicha aplicación es realizada con el dispositivo abierto. En la etapa 2, se deja incubar a la muestra de tal forma que cualquier analito presente en la muestra reaccione con la capa de anticuerpo. En la etapa 3, se lava la muestra de la superficie de ensayo y se deja que el exceso de líquido fluya al filtro por debajo de la pirámide que sujeta el dispositivo de ensayo. En esta etapa, la posición del material de filtro superior es en I. En la etapa 4, se cierra el dispositivo y se abrocha, de tal forma que el filtro pueda secar la superficie de ensayo. En la etapa 5, se aplica una gota de substrato precipitante TMB al dispositivo se deja incubar durante 5-10 minutos y se aclara luego de nuevo como antes. En este punto, se mueve el material de filtro superior de la posición I a la II y se cierra de nuevo el dispositivo para dejar que se seque la superficie de ensayo. En este punto, se vuelve a abrir el dispositivo y se lee el resultado.

Cuando se desean resultados instrumentalizados, se realiza el protocolo de lavado a sequedad aclarando la superficie de ensayo bajo una corriente de agua desionizada y secando bajo una corriente de nitrógeno.

Ejemplo 1

Se compararon tres métodos de extracción con un método nitroso estándar en cuanto a su capacidad para liberar polisacáridos específicos de grupo de GBS. Se determinaron las eficacias relativas de las técnicas de extracción usando un inmunoensayo óptico visual basado en la interferencia de la luz. También es posible el análisis elipsométrico de estas superficies. Para todos los resultados aquí descritos, se usó la cepa CDC número CDCSS893 de GBS.

Se usó la preparación de anticuerpos policlonales para revestir la película delgada óptica de Si_{3}N_{4} de 495 \ring{A} revestida de polímero T; la pastilla de silicio era una fracción de IgG purificada por afinidad y por proteína G. El inmunógeno usado para producir anticuerpos eran células completas inactivadas de GBS. La concentración de anticuerpo de revestimiento estaba en el rango de 100 a 500 \mug de anticuerpo por pastilla de 100 mm. Las pastillas fueron revestidas a 2-8 grados C durante 2 a 48 horas. La concentración preferida de revestimiento de anticuerpo era de 200 \mug por pastilla de 100 mm en un tampón que contenía HEPES 0,1 M, pH 8,0.

Para evaluar la eficacia de cada uno de los métodos de extracción, se utilizaron frotis vaginales clínicamente negativos. Algunos de estos frotis fueron contaminados con células de GBS y se evaluó la recuperación de GBS en una matriz de muestra clínicamente relevante, es decir, una muestra que contenía mucus, sangre, etc. Los frotis vaginales recogidos durante la gestación están frecuentemente contaminados con mucus, sangre y un amplio espectro de microorganismos. Así, era de particular interés la capacidad del reactivo de extracción para extraer los antígenos relevantes, sirviendo al mismo tiempo como agente mucolítico. Un efecto mucolítico u otro mecanismo para la destrucción de la matriz de la muestra reduce o elimina la unión inespecífica y también aumentaría la recuperación de antígenos extraídos. Se realizaron estudios similares de sensibilidad analítica con frotis estériles y limpios sin matriz. Los resultados eran idénticos a los descritos en el estudio con una matriz de muestra clínicamente relevante.

Se hizo una comparación de un método de extracción con ácido nitroso estándar en relación a modificaciones con base o hipoclorito de esta técnica. Además, se examinó un método de extracción sólo con hipoclorito. En la Tabla 1 se muestran los resultados. Se examinó el protocolo modificado con base a dos niveles de ácido acético: 0,25 M y 1,6 M.

Como se ha descrito previamente, se contaminaron frotis vaginales clínicamente negativos con la cantidad designada de células de GBS y se procesaron luego los frotis mediante el protocolo de extracción.

En el método estándar de ácido nitroso, se usa una mezcla de 120 \mul de ácido acético 0,25 M y 100 \mul de nitrito de sodio 2,3 M (previamente secado en el tubo de extracción) para generar ácido nitroso. El ácido acético resulta extraer de manera efectiva el antígeno en el rango de 0,1 M a 1,0 M. Se extrae el antígeno del organismo durante 5 minutos, aunque es aceptable un margen de desde instantáneo hasta 30 minutos. Se neutraliza la solución usando 120 \mul de un tampón que contiene MOPSO 1,5 M, pH 7,3, detergente TWEEN20™ al 0,2%, suero bovino al 15%, conservante PROCLIN300™ al 0,5% y EGTA 20 mM. Se desea un margen de pH final de 7,0 a 7,5.

La modificación con base de esta técnica estándar de extracción con ácido nitroso consiste en una mezcla de 120 \mul de ácido acético 0,25 M o 1,6 M, dependiendo del experimento, que contiene EDTA 10 mM y DTT 5 mM, y 100 \mul de nitrito de sodio 2,3 M (previamente secado en el tubo de extracción), que se usa para generar ácido nitroso. El ácido acético extrae el antígeno en un margen de 0,25 M a 1,0 M para esta modificación de la técnica nitrosa. Se extrae el antígeno del organismo durante 5 minutos. El pH de la etapa ácida debe estar entre 4,0 y 5,0. Es aceptable un margen de desde instantáneo hasta 10 minutos. Se observa una extracción adicional cuando se añaden 100 \mul de NaOH 2 N y se deja incubar durante 1 minuto. Es aceptable un margen de 2 N a 6 N para el NaOH, mientras que el período de incubación puede ser de 0,5 a 10 minutos. El pH de la etapa básica debe ser de 12 a 14. Se neutraliza la solución usando 250 \mul de un tampón que contiene MOPSO 2,0 M, pH 6,0, detergente TWEEN20™ al 0,2%, suero bovino al 15%, conservante PROCLIN300™ al 0,5% y EGTA 20 mM. Se desea un margen de pH final de 6,0
a 7,5.

La técnica de extracción con hipoclorito utiliza 120 \mul de solución de hipoclorito disponible al 10% en forma de hipoclorito de sodio. Este método funciona óptimamente cuando se usa una solución de hipoclorito a más del 6%. Se extrae el antígeno del organismo durante 5 minutos. Es aceptable un margen de desde instantáneo hasta 30 minutos. Se neutraliza la solución de hipoclorito después de la etapa de incubación con 120 \mul de MOPSO 1,5 M, pH 7,3, detergente TWEEN20™ al 0,2%, suero bovino al 15%, conservante PROCLIN300™ al 0,5% y EGTA 20 mM. Cuando se combina el hipoclorito con nitrito de sodio, se usan 100 \mul de nitrito de sodio 2,3 M (secado en el tubo de extracción).

En el método de extracción con hipoclorito/ácido nitroso, se continúa la extracción por adición de 120 \mul de ácido acético 0,5 M que contiene EDTA 10 mM y DTT 5 mM a la solución de hipoclorito y nitrito de sodio y se incuba durante 5 minutos. Se ve que el ácido acético extrae el antígeno GBS en el margen de 0,25 M a 2,0 M para esta modificación de la técnica nitrosa. Se neutraliza la solución usando 300 \mul (con ácido acético 2 M) de un tampón que contiene MOPSO 1,5 M, pH 7,0, detergente TWEEN20™ al 0,2%, suero bovino al 15%, conservante PROCLIN300™ al 0,5% y EGTA 20 mM. Se desea un margen de pH final de 6,0 a 7,5.

Se mezcla el antígeno extraído a 5:1 (muestra:conjugado) con una dilución 1:100 de la preparación de conjugado que contiene MOPSO 50 mM, pH 7,0, caseína tratada con álcali al 3%, detergente TWEEN20™ al 0,2% y conservante PROCLIN300™ al 0,5%. La dilución exacta de la preparación de conjugado usada varía con la preparación de conjugado. Es aceptable un rango de razones de muestra a conjugado. Se incuba la mezcla de muestra/conjugado durante 5 minutos a temperatura ambiente, se aplican entonces 20 \mul de la mezcla al dispositivo de ensayo y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente, o, alternativamente, durante 10 minutos sobre la superficie. Los tiempos de incubación pueden variar con la concentración del conjugado y la razón muestra:conjugado.

Cuando se usa la superficie de ensayo de interferencia visual (véase la Figura 1), se lava la muestra de la superficie mediante una corriente de agua desionizada y se cierra la tapa del dispositivo de ensayo. Esto hace que un material absorbente contacte con la superficie y seque la superficie de ensayo. El dispositivo es abierto de nuevo para exponer la superficie de ensayo. Se aplica entonces un substrato precipitante a la superficie de ensayo y se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se mueve la parte corrediza de la tapa del dispositivo para aportar material absorbente seco y, una vez se ha lavado el substrato de la superficie de ensayo, se cierra la tapa para repetir el proceso de secado. Se abre el dispositivo y se interpreta el resultado.

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TABLA 1

Protocolo de extracción	3x10^{6*}	3x10^{5*}	3x10^{4*}	1x10^{4*}	0
Nitroso estándar	++	+	+/-	+/-	+/-
Modificado con base^{a}	++	++	+	+/-	-
Modificado con base^{b}	+++	++	+	+	-
Hipoclorito/ácido Nitroso	+++	++	+	+	-
Hipoclorito solo	++	++	+	+	-
* Número de células por ensayo.
\begin{minipage}[t]{160mm} ^{a} No hubo período de incubación después de la adición de base. Se usó una elevada concentración de ácido acético (1,6 M) en el protocolo de extracción. \end{minipage}
\begin{minipage}[t]{160mm} ^{b} No hubo período de incubación después de la adición de base. Se usó una baja concentración de ácido acético (0,25 M) en el protocolo de extracción. \end{minipage}

\vskip1.000000\baselineskip

Los estudios analíticos de sensibilidad que examinan el efecto de una base fuerte sobre la extracción continuada de GBS indicaron que había una mayor recuperación del antígeno específico de GBS en relación a una extracción estándar con ácido nitroso. Además, la extracción con ácido nitroso modificada con base parece tener un efecto mucolítico sobre la matriz de la muestra. Así, el protocolo modificado con base era, en conjunto, más efectivo que el protocolo nitroso estándar. Se observó alguna pérdida de intensidad de señal cuando se combinó la modificación con base con una extracción con ácido nitroso muy fuerte (uso de ácido acético 1,6 M) y la neutralización del extracto era más difícil de conseguir. Por lo tanto, se prefieren niveles de ácido acético menores de 0,75 M cuando se combina con la modificación con la base. El nivel inferior de ácido usado era también más tolerante a variaciones en la cantidad de neutralizador o de exceso de ácido añadido. Los resultados de la Tabla 1 indicaron que el aumento observado en la detección del antígeno era debido al protocolo modificado con base y no a un mayor nivel de ácido nitroso. También se demostró que el efecto de la base se produce rápidamente. No se requirió un período de incubación a un elevado pH para provocar el efecto.

El protocolo de extracción con hipoclorito/nitroso dio la mejor eficacia de extracción. La sensibilidad analítica era mejor que para el nitroso solo. La mayor ventaja de la técnica era el perfeccionamiento en la eficacia de extracción del antígeno en una matriz de muestra clínicamente relevante. Los frotis de muestras clínicamente negativas dieron respuestas negativas netas, es decir, una reducida unión inespecífica. El protocolo de hipoclorito/nitroso era más tolerante que el protocolo modificado con base a la variación de volúmenes de reactivo en exceso. Así, el método era más robusto. El hipoclorito solo mostró también una mayor sensibilidad analítica en relación al método del ácido nitroso y exhibía el efecto mucolítico deseado.

Estos dos métodos, el modificado con base y el hipoclorito/nitroso, extraen antígeno de estreptococos del Grupo A (GAS), antígeno de estreptococos del Grupo B (GBS), antígeno de estreptococos del Grupo F y antígeno de estreptococos del Grupo G. Estas técnicas de extracción extraen también fácilmente el antígeno GBS de colonias que no son beta-hemolíticas y que, por lo tanto, no son fácilmente identificadas por técnicas de cultivo estándar.

Ejemplo 2 Extracción con hipoclorito de organismos estreptocócicos

Se usaron reactivos comerciales de serotipificación para estreptococos de los Grupos A, B, C, F y G para evaluar la utilidad del reactivo hipoclorito/nitroso para extraer los antígenos polisacáridos específicos de grupo. Se usaron placas de agar Tripticase soja que contenían un 5% de sangre de oveja para preparar colonias aisladas puras de cada organismo. Se usó un aparato de toma de muestras de madera para tomar muestras de varias colonias. Se extrajeron los frotis con el protocolo de hipoclorito/nitroso descrito en el Ejemplo 1. Se estudiaron los antígenos extraídos con el reactivo apropiado de serotipificación según el protocolo del fabricante.

\vskip1.000000\baselineskip

Organismo	ATCC CEPA #	Aglutinación observada
B	12386	++++
F	12393	+++
G	12394	++
A	19615	+
C	12388	-

\vskip1.000000\baselineskip

Se optimizó el protocolo de hipoclorito/ácido nitroso descrito en el Ejemplo 1 para la extracción de polisacárido específico del Grupo B. El proceso de optimización conllevaba el examen de concentraciones variables de ácido acético, hipoclorito, NaNO_{2} y neutralizador (y el pH para el neutralizador). Además, se examinaron el orden de adición de los reactivos y los tiempos de incubación para cada etapa. En general, se varía un reactivo mientras se mantienen los otros constantes. Se procesaron frotis contaminados con una cantidad conocida de células GBS a través de un gran número de estos diversos protocolos y se estudiaron después en condiciones idénticas con la superficie de ensayo de interferencia. Se compararon los resultados para determinar el efecto sobre las muestras negativas, las que daban un débil positivo y las que daban un fuerte positivo. Una vez seleccionados amplios rangos para todos los reactivos, se usaron experimentos adicionales para finalizar la composición de los reactivos. Así, las condiciones son bastante específicas para el GBS. Se podría seguir un procedimiento similar para cualquier organismo. Estos tipos de estudios de optimización son bien entendidos por los expertos en este tipo de desarrollo de ensayo. Sin ninguna optimización para los otros organismos, se observa la extracción del polisacárido específico de grupo. Las condiciones parecen bien adecuadas para la extracción de los Grupos B y F.

Ejemplo 3 Extracción con hipoclorito/ácido nitroso de GBS combinada con un ensayo EIA de membrana

Se empleó una prueba de antígeno GBS comercial en combinación con el protocolo de extracción con hipoclorito/ácido nitroso del Ejemplo 1. Se realizó el ensayo de membrana según el protocolo del fabricante. Se preparó una suspensión celular de GBS en suero salino estéril al 0,85% a una densidad celular de 3 x 10^{8} células/ml. Se hicieron diluciones celulares por dilución seriada en suero salino estéril. Se añadió una alícuota de 100 \mul a los tubos de extracción y se extrajo después como se ha descrito. Se comparó este método de extracción con el protocolo de extracción recomendado por el fabricante, que se basa en ácido nitroso.

\newpage

Método de ensayo	conc. celular*	extracción del fabricante	extracción con hipoclorito
EIA membrana	3 x 10^{6}	++	+++
	3 x 10^{5}	+	+
	3 x 10^{4}	-	-
* Número de células por ensayo.

Sin optimización para el sistema de ensayo en membrana, el protocolo de extracción con hipoclorito/ácido nitroso aumenta la señal observada para una concentración celular de 3 x 10^{6}.

Ejemplo 4 Comparación de la sensibilidad analítica de un ensayo de GBS de interferencia óptica que incluye el protocolo de extracción con hipoclorito/ácido nitroso con ensayos comerciales de GBS

Se comparó el kit de ensayo OIA™ para estreptococos B con kits de ensayo para GBS comerciales en cuanto a sensibilidad analítica.

El kit de ensayo OIA™ para estreptococos B para el estudio de frotis vaginales en cuanto a la detección de GBS consiste en los siguientes componentes:

tubos de extracción que contienen nitrito de sodio seco, ácido acético en una botella cuentagotas, solución de hipoclorito en una botella cuentagotas, neutralizador en una botella cuentagotas, una botella cuentagotas que contiene marcaje secundario, una botella cuentagotas de substrato precipitante, una botella de solución de lavado, pipetas de transferencia desechables y un dispositivo de ensayo de un solo uso que contiene una superficie de ensayo con una pastilla de silicio revestida de nitruro de silicio.

Componentes del kit de ensayo OIA™ para estreptococos B

Los tubos de extracción contienen nitrito de sodio (NaNO_{2}) 2,3 M seco, 100 \mul.

Reactivo de extracción 1A: Contiene hipoclorito de sodio (<15% de cloro disponible).

Reactivo de extracción 1B: Contiene ácido acético 0,5 M, pH 3.

Reactivo 2 (reactivo de neutralización): Contiene MOPSO 1,5 M, EGTA 20 mM, detergente TWEEN20™ 0,2%, (suero bovino al 15%) y conservante PROCLIN300™ al 0,5%.

Reactivo 3 (marcaje secundario): Contiene anticuerpo (conejo) anti-estreptococo del grupo B tamponado conjugado a peroxidasa de rábano picante ("HRP"). Dilución 1:100 de Ab en MOPSO 50 mM, pH 7,0, caseína tratada con álcali al 3%, TWEEN20™ al 0,2% y conservante PROCLIN300™ al 0,5%.

Reactivo 4 (solución de lavado): H_{2}O con conservante PROCLIN300™ al 0,1%.

Reactivo 5 (substrato precipitante): Tetrametilbencidina (TMB) y peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2}).

Dispositivos de ensayo: Superficie revestida con anticuerpo anti-estreptococo del Grupo B (conejo).

Control positivo: Antígeno estreptocócico del Grupo B purificado.

Pipetas de transferencia.

Procedimiento de ensayo

1. Sacar el/los reactivo(s) del almacenamiento refrigerado y dejar que se templen a temperatura ambiente (18º-30º). Mantener el Reactivo 4 a temperatura ambiente (18º-30ºC) después de abrirlo. Se pueden mantener los dispositivos de ensayo a temperatura ambiente o refrigerados a 2º-30ºC.

2. Sacar un tubo de extracción que contiene reactivo seco del kit y ponerlo hacia arriba en una gradilla o soporte.

3. Marcar los dispositivos de ensayo con la información apropiada del paciente. Poner los dispositivos de ensayo sobre una superficie nivelada mientras se esté realizando el ensayo.

4. Añadir 3 gotas de Reactivo 1A al tubo de extracción y agitar suavemente para disolver el reactivo seco en el fondo.

5. En 1 minuto, poner control positivo o una torunda que contenga una muestra en el tubo. Mezclar la solución con la torunda de tal forma que el líquido se mueva hacia dentro y hacia fuera de la punta de fibra. Dejar que la torunda repose en la solución de extracción durante un mínimo de 3 minutos y no más de 5 minutos.

6. Sujetar el eje de la torunda hacia un lado y añadir 3 gotas de Reactivo 1B directamente al tubo de extracción. Usar la torunda para mezclar el reactivo con el extracto. Dejar que la torunda repose en la solución de extracción durante un mínimo de 3 minutos y no más de 5 minutos.

7. Sujetar el eje de la torunda hacia un lado y añadir 3 gotas de Reactivo 2 directamente al tubo de extracción. Usar la torunda para mezclar el reactivo con el extracto.

8. Apretar los lados del tubo de extracción a medida que se retira la torunda, exprimiendo todo el fluido posible en el tubo. Desechar la torunda y retener los contenidos del tubo. Retener todo el fluido posible de la torunda.

Nota: Si se obtiene un volumen insuficiente de muestra cuando se exprime el fluido de la torunda, se pueden añadir 1 ó 2 gotas de Reactivo 2 adicional al tubo de extracción. Mezclar bien con la torunda y repetir la Etapa 8.

9. Añadir 1 gota de Reactivo 3 al extracto y mezclar bien con un vórtex o sacudiendo el tubo. No dejar reposar más de 5 minutos.

10. Usar una pipeta de transferencia limpia para poner 1 gota (0,05 ml) de la solución directamente en el centro de la superficie del dispositivo de ensayo correspondiente. No cubrir la totalidad de la superficie del dispositivo de ensayo.

11. Esperar durante 10 minutos.

12. Lavar la superficie de ensayo vigorosamente con un fuerte chorro de solución de lavado de Reactivo 4 teniendo cuidado de no exceder la capacidad del material absorbente que rodea al dispositivo. Es muy importante un lavado vigoroso de 3-4 segundos de duración.

Nota: Es muy importante un lavado vigoroso para asegurar un aclarado completo y a conciencia de la superficie de ensayo antes de la siguiente etapa del procedimiento. Un lavado insuficiente de la superficie de ensayo puede dejar restos que pueden dar lugar a un débil anillo alrededor del punto de control del procedimiento. Aunque este efecto del anillo no sería interpretado como un resultado positivo debido a la falta de sombra coloreada en el área del anillo, un lavado vigoroso obtendrá una superficie de ensayo limpia.

13. Confirmar que el dispositivo secante esté en posición #1. Cerrar el dispositivo de ensayo aplicando presión en las esquinas. Dejar cerrado durante 10 segundos para eliminar la humedad residual de la superficie.

Nota: Secar con una superficie limpia cada vez que sea necesario secar. El secante debe estar en la posición I cuando se seca por vez primera. Si está en la posición II, mover a la posición I para el segundo secado. Un secado repetido en la misma posición puede comprometer los resultados de ensayo.

14. Abrir la tapa y aplicar 1 gota de Reactivo 5 directamente en el centro de la superficie de ensayo del dispositivo de ensayo y dejar reposar durante 10 minutos.

Nota: Si la colocación de la primera gota no se hizo directamente en el centro del dispositivo de ensayo, poner la gota de Reactivo 5 directamente sobre el área de la primera gota.

15. Repetir la Etapa Nº 12, lavando la superficie de ensayo vigorosamente con un chorro fuerte de solución de lavado de Reactivo 4. Véase la Nota del procedimiento en la Etapa Nº 12.

16. Mover el secante de la tapa del dispositivo de ensayo a la posición #2. Cerrar el dispositivo de ensayo aplicando presión en las esquinas. Dejar cerrado durante 10 segundos para eliminar la humedad residual de la superficie. Abrir la tapa y examinar la superficie de ensayo en cuanto a un cambio de color.

Interpretación de los resultados de ensayo

Tras completarse cada prueba, se debe examinar la superficie de ensayo bajo una fuente de luz brillante. La luz debe ser reflejada por la superficie de ensayo para observar los resultados de la prueba.

Un control interno del procedimiento está presente en cada superficie de ensayo. Aparece como un pequeño punto azul/púrpura en el centro de la superficie de ensayo al completarse cada prueba. Un resultado de ensayo negativo mostrará sólo el control interno del procedimiento. Un resultado de ensayo positivo mostrará el control interno en el círculo de reacción. Con resultados muy fuertemente positivos, el control interno puede ser menos aparente en el círculo de reacción.

Resultado positivo o débilmente positivo

Aparece un círculo de reacción sólido coloreado en azul/púrpura de cualquier intensidad en el centro de la superficie de ensayo.

Resultado negativo

Para un resultado negativo, no se observaría ningún color sólido azul/púrpura en toda la superficie de ensayo, sólo el pequeño punto de control del procedimiento. Se produce un resultado no válido cuando no se observa punto de control del procedimiento. Repetir el procedimiento siguiendo las instrucciones cuidadosamente.

La superficie de ensayo que ha reaccionado y el cambio de color asociado a una reacción positiva no se deteriorarán con el tiempo. Por lo tanto, se puede considerar que el dispositivo de ensayo es un registro permanente. Si se ha conservar un dispositivo de ensayo como referencia, habría que retirar el material secante de la tapa y desecharlo en un recipiente de riesgo biológico. El dispositivo será cerrado para su almacenamiento.

Otros kits comparados con el sistema de ensayo óptico eran un método de sonda de ADN, un método de EIA de membrana y un método de aglutinación de látex. Todas las pruebas fueron realizadas según el protocolo del fabricante.

Método de ensayo	Sensibilidad analítica
Pruebas OIA™	5 x 10^{3} CFU/ensayo
Sonda de ADN	5 x 10^{4} CFU/ensayo
EIA de membrana	5 x 10^{5} CFU/ensayo
Látex	3 x 10^{6} CFU/ensayo

El método OIA es de 10 a 1.000 veces más sensible en base a la sensibilidad analítica que cualquier ensayo GBS comercial.

Claims

1. Un método para extraer un antígeno de un microorganismo contenido en una muestra, consistente en las siguientes etapas:

(a) poner en contacto dicha muestra con hipoclorito durante un tiempo suficiente para extraer el antígeno, donde dicho hipoclorito es presentado como una sal sólida de hipoclorito o un reactivo de hipoclorito acuoso no tamponado, y

(b) neutralizar a continuación dicha muestra.

2. El método de la reivindicación 1, que además consiste en poner en contacto la muestra con nitrito de sodio antes de la etapa (b).

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, donde el período de tiempo en la etapa (a) es suficiente para lisar el mucus de dicha muestra.

4. El método de la reivindicación 1 ó 2, donde el hipoclorito está presente a una concentración de entre el 0,1% y el 10%.

5. El método de la reivindicación 2, donde dicha muestra contacta con hipoclorito y nitrito de sodio simultáneamente.

6. El método de la reivindicación 2, donde, a continuación de la etapa (a) y antes de la etapa (b), dicha muestra contacta con reactivo(s) que genera(n) ácido nitroso durante un período de tiempo suficiente para aumentar la exposición del antígeno.

7. El método de la reivindicación 6, donde dicho(s) reactivo(s) que genera(n) ácido nitroso consisten en ácido acético.

8. El método de la reivindicación 7, donde dicho nitrito de sodio está presente en una concentración de 0,5 M a 2,5 M y dicho ácido acético está presente en una concentración de 0,25 M a 2 M.

9. El método de la reivindicación 1 ó 2, donde dicha muestra contacta con hipoclorito en presencia de un agente quelante y un agente reductor del enlace disulfuro.

10. El método de la reivindicación 9, donde dicho agente quelante es EDTA o EGTA presente en una concentración de 0,1 mM a 100 mM y dicho agente reductor del enlace disulfuro es ditiotreitol presente en una concentración de 0,1 mM a 100 mM.

11. El método de la reivindicación 6, donde dicha neutralización es realizada con un tampón consistente en MOPSO a una concentración de 1 a 2,5 M a un pH de 7.

12. El método de la reivindicación 6, donde el período de tiempo en la etapa (a) es de 2 minutos a 30 minutos.

13. El método de la reivindicación 1 ó 2, donde dicho organismo es del género Streptococcus.

14. El método de la reivindicación 13, donde el organismo es seleccionado entre el grupo consistente en Streptococcus del Grupo A, Streptococcus del Grupo B, Streptococcus del Grupo G y Streptococcus del Grupo F.

15. El método de la reivindicación 1 ó 2, donde dicho antígeno es seleccionado entre el grupo consistente en carbohidratos, proteínas, lipoproteínas, lipopolisacáridos, polisacáridos, ácidos nucleicos, carbohidratos acomplejados con proteínas, lípidos, ADN y ARN.

16. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que además consiste en detectar un antígeno extraído, incluyendo dicha detección las etapas de poner en contacto la muestra con una superficie de ensayo que se une específicamente a dicho antígeno y detectar la unión de dicho antígeno por un método analítico adecuado.

17. El método de la reivindicación 16, donde dicho método analítico es seleccionado entre el grupo consistente en elipsometría, elipsometría comparativa, efectos de interferencia con películas finas, resonancia plasmónica superficial, reflexión interna total, espectrofotometría, reflectometría, interferometría, reflectancia total atenuada, sensores piezoeléctricos, reflexión interna incompleta, cambios en la rotación de la polarización, cambios en la intensidad de la luz polarizada, sensores de guía de ondas, microscopía de fuerza atómica, microscopía de tunelización por barrido e inmunoensayo.

18. El método de la reivindicación 16, donde dicha muestra contacta con un marcaje secundario o un componente generador de señal después de dicha etapa de neutralización.

19. Un kit adecuado para extraer un antígeno de un microorganismo contenido en una muestra según el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, consistente en tubo(s) de extracción que contiene(n) nitrito de sodio seco, una alícuota de solución de hipoclorito o de sal sólida de hipoclorito, una alícuota de tampón neutralizante, una alícuota de ácido acético y una alícuota de EDTA y ditiotreitol.

20. Un kit según la reivindicación 19 adecuado para detectar un antígeno extraído de un microorganismo contenido en una muestra, que además incluye una alícuota de un substrato precipitante, una alícuota de marcaje secundario y una alícuota de una solución de lavado, pipetas de transferencia de muestra y una superficie de ensayo.