ES2286000T3 - Dosificacion de proteinas tales como inmunoglobulinas de tipo e (ige) en secreciones nasales. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de detección o de dosificación de IgE, que comprende: - la puesta en contacto de una secreción nasal con un material que permite la adsorción de las IgE que comprende por lo menos una parte compuesta de un material adsorbente seleccionado de entre un material celulósico, un polímero o un complejo macromolecular, de origen natural o sintético, solos o en combinación, colocando directamente el material en contacto con las mucosas nasales de un sujeto, y - la detección o la dosificación, a partir de dicho material, de la presencia de IgE mediante una reacción inmunológica, comprendiendo dicha etapa de detección o de dosificación la incubación del material adsorbente, o la parte de material adsorbente que ha estado en contacto con las secreciones nasales, en una solución que comprende dos series de anticuerpos dirigidos contra las IgE: unos anticuerpos marcados libres por una parte, y unos anticuerpos en fase sólida por otra parte.
Description
Dosificación de proteínas tales como
inmunoglobulinas de tipo E (IgE) en secreciones nasales.
La presente invención se refiere al campo de las
técnicas de la medicina, de la biología y de la bioquímica. Sus
aplicaciones se refieren a los campos de la salud humana o animal.
Más particularmente, la invención describe unos nuevos
procedimientos que permiten determinar la presencia y/o de evaluar
la cantidad de proteínas o glicoproteínas mediante la dosificación
en las secreciones nasales. La invención describe más
específicamente unos procedimientos particularmente útiles para
dosificar la presencia de inmunoglobulinas, particularmente de
inmunoglobulinas de tipo E (IgE) en unas secreciones nasales. La
presente invención describe asimismo unos materiales y equipos para
la puesta en marcha de estos procedimientos, así como sus
aplicaciones, por ejemplo para descifrar o caracterizar el
potencial alérgico de los sujetos.
Es conocido que se realiza una dosificación de
proteínas o glicoproteínas, como las IgE, a partir de secreciones
lacrimales. De este modo, la solicitud de patente francesa
nº FR 9015200 describe una dosificación cuantitativa de las
proteínas en las lágrimas, mediante una tira sobre la que se
adsorben las IgE, seguida de un revelado inmunológico de las IgE
presentes. Dicho procedimiento, a pesar de ser eficaz, presenta sin
embargo determinadas limitaciones. De hecho, es sabido que el ojo es
un órgano relativamente aislado en el plano inmunológico, de modo
que las IgE dosificadas en las lágrimas reflejan esencialmente una
sensibilidad local (es decir, la presencia eventual de alergias
oculares), pero son poco indicativas del estado más general de un
sujeto o sobre otras sensibilizaciones alérgicas locales.
Los otros procedimientos disponibles actualmente
para dosificar las inmunoglobulinas, como las IgE, se basan
esencialmente en la medición de las tasas de IgE en la sangre o el
suero. Dichos procedimientos implican por lo tanto una extracción
de sangre del sujeto. Por otra parte, en la medida en que la
sensibilidad de un sujeto depende no únicamente de las IgE
circulantes, sino también unas IgE fijadas en los tejidos y/o en las
células, las dosificaciones séricas no siempre permiten informar de
forma fiable o completa acerca del estado alérgico de un sujeto. En
particular, dichas dosificaciones, por si mismas, no permiten rendir
cuentas del conjunto de los fenómenos de desarrollo alérgicos en un
sujeto.
Por lo tanto existe una necesidad real en la
técnica anterior de unos procedimientos complementarios, sencillos
y eficaces, que permitan dosificar unas proteínas como unas IgE.
Hasta el momento, la detección de las IgE en las
secreciones nasales ha resultado ser difícil de llevar a cabo
debido a unas variaciones espontáneas del flujo de dichas
secreciones y de la complejidad de los procedimientos de extracción
(aspiración, lavado, frotis y biopsia).
La presente invención presenta una solución a
estos problemas. La invención describe, de hecho, nuevos
procedimientos y composiciones para la dosificación de proteínas y
glicoproteínas. Dichos procedimientos se centran principalmente en
el material biológico utilizado para dosificar las proteínas, es
decir las secreciones nasales. La presente invención muestra de
hecho que es posible detectar, en las secreciones nasales, la
presencia de proteínas o glicoproteínas, especialmente de
inmunoglobulinas, en particular del tipo E, y que dichas proteínas
se pueden dosificar de un modo sencillo y eficaz. La presente
invención muestra además que esta dosificación, aplicada a unas
IgE, resulta particularmente sensible, y permite marcar de forma
fiable (y complementaria a unas técnicas existentes) sobre el
estado alérgico de un sujeto. Especialmente, las composiciones y los
procedimientos de la invención permiten descifrar ventajosamente
los campos alérgicos en un sujeto, ya sean alergias locales (por
ejemplo, rinofaríngeas) o generales.
Un primer objetivo de la invención reside en un
procedimiento de detección de la IgE que comprende:
- -
- la puesta en contacto de una secreción nasal con un material que permite la adsorción de las IgE, y
- -
- la detección, a partir de dicho material, de la presencia de las Ig E mediante una reacción de tipo inmunológico.
Otro objetivo de la invención reside en un
procedimiento de dosificación de IgE que comprende:
- -
- la puesta en contacto de una secreción nasal con un material que permite la adsorción de las IgE, y
- -
- la dosificación de las IgE adsorbidas sobre el material mediante una reacción de tipo inmunológico.
Dicha forma de realización comprende
ventajosamente una etapa de evaluación de la cantidad (o
concentración) de la proteína o glicoproteína implicada. A este
respecto, la etapa de dosificación anterior comprende más
preferentemente la determinación de la cantidad de la proteína o
glicoproteína implicada que se adsorbe sobre dicho material, la
cantidad medida se lleva a una curva patrón establecida de forma
paralela o de forma previa. Dicho cálculo permite determinar la
concentración real de la proteína o glicoproteína implicada en la
secreción nasal. La curva patrón es preferentemente una curva
establecida a partir de soluciones de referencia que contienen la
proteína o glicoproteína implicadas a unas concentraciones
definidas, dosificadas según el mismo protocolo.
La presente invención describe y se refiere de
este modo a cualquier procedimiento cualitativo o cuantitativo de
detección o de dosificación de moléculas biológicas a partir de
secreciones nasales.
En el marco de la presente invención, el término
secreción nasal se refiere a cualquier sustancia producida en una
ubicación nasal, naso-sinusial (como el moco por
ejemplo), en particular cualquier sustancia liberada o secretada
por las mucosas nasales o naso-sinusiales. Se puede
tratar principalmente de goteos observados en los resfriados,
estornudos, estados alérgicos o de tipo alérgico, moco, hidrorrea o
cualquier otra sustancia o secreción liberada en estado fisiológico
normal o patológico, como nos encontramos en los estados alérgicos.
El término secreción nasal se refiere más particularmente al
moco.
El estudio de las secreciones nasales ha sido
objeto de algunos estudios multidireccionales que se centran o bien
en la bioquímica (pH o composición bioquímica del moco) o bien a
factores celulares (eosinofilia local) o bien a unos ensayos
dinámicos (ensayos de provocación). La invención demuestra
actualmente que las sustancias biológicas de tipo inmunológico se
pueden detectar o dosificar directamente a partir del moco o de
otras secreciones nasales o rino-sinusiales, de
forma simple, sensible y reproductible.
Para la puesta en marcha del procedimiento de la
invención, la puesta en contacto del material con las secreciones
nasales se puede llevar a cabo ya sea colocando directamente el
material adsorbente en contacto con las mucosas nasales, o bien
recogiendo las secreciones nasales, y realizando el contacto en un
dispositivo adecuado (lámina, tubo, caja, hoja, etc..). De forma
preferida, la puesta en contacto del material con las secreciones
nasales se lleva a cabo colocando directamente el material en
contacto con las mucosas nasales del sujeto. Esto se realiza,
típicamente, introduciendo manualmente el material adsorbente (o una
parte del mismo) en un fosa nasal del sujeto.
El contacto entre la secreción nasal y el
material se lleva a cabo preferentemente durante un periodo
suficiente para permitir la adsorción de proteínas o glicoproteínas
sobre el material. Cuando se lleva a cabo una dosificación de tipo
cuantitativo, el contacto se mantiene preferentemente hasta que se
alcanza un equilibrio entre la cantidad de proteínas o
glicoproteínas adsorbidas sobre el material y su concentración en
las secreciones nasales del sujeto. Generalmente, dicho contacto se
puede mantener durante un periodo comprendido entre pocos segundos
y varios minutos, típicamente entre 1 y 5 minutos, por ejemplo de 1
a 3 minutos. Se entiende que dicho periodo se puede ajustar
fácilmente por el manipulador en función de las condiciones
generales, locales, del tipo de proteína o glicoproteína
investigada y del objetivo buscado (detección, dosificación,
etc....).
El material utilizado en el marco de la presente
invención para adsorber las proteínas y/o glicoproteínas puede ser
cualquier soporte, preferentemente delgado, que se puede poner en
contacto con las secreciones nasales, principalmente introducido en
la fosa nasal sin agredirla. Dicho material puede tener unas formas
diferentes, como por ejemplo puede ser filiforme, en forma de
pastilla o de disco, de esponja quirúrgica, de embudo, de
bastoncillo, de banda, etc... El material que permite la adsorción
comprende preferentemente por lo menos una parte compuesta de un
material adsorbente, preferentemente no agresivo o no tóxico para el
sujeto, cuando la puesta en contacto se lleva a cabo directamente
sobre las mucosas nasales. Se puede tratar principalmente de un
material celulósico (por ejemplo de baja densidad), de polímeros, de
complejos macromoleculares, de origen natural o sintético, solos o
en combinación. Se trata preferentemente de un material
celulósico.
En una forma de realización preferida de la
invención, y en particular para la evaluación de las IgE, el
material adsorbente está constituido de bandas que comprenden por
lo menos una parte de papel celulósico de baja densidad, de fibras
estiradas o no. A título de ejemplos particulares, se pueden citar
principalmente las tiras para el ensayo de Schirmer de los
Laboratorios Faure (Annonay, Francia) (papel tipo Whatman, nº 1) o
de unas tiras realizadas con el papel de referencia nº 2312 de los
Laboratorios Schleicher & Schuell (Dassel, Alemania). Las
referencias nº 566 y nº 1573 de la misma procedencia resultan
igualmente convenientes. A pesar de presentar una sensibilidad
peor, todavía se puede citar, del mismo proveedor, las referencias
nº 1577, 1575, 1506, 1507, 903, 589/2, 589/3, 589/5, 589/6, 572 y
512.
Las tiras pueden tener ventajosamente unas
dimensiones del orden de 55 mm x 5 mm. En el
momento de la extracción, se dejan embeber por ejemplo los 15
primeros milímetros aproximadamente de la tira, algunos minutos son
suficientes para esta operación.
Las tiras pueden estar provistas, o no, de una
separación en el extremo puesto en contacto con las mucosas del
resto de la tira. Pero, de hecho, tras la extracción se puede
guardar la tira entera, incluso durante las etapas posteriores.
Después se puede conservar la tira, tras la extracción, durante
varias semanas antes de la etapa de revelado o de dosificación.
La etapa de detección o de dosificación se puede
llevar a cabo mediante cualquier técnica inmunoquímica conocida
por el experto en la materia, basada en la utilización de
anticuerpos y/o de antígenos específicos, solos o combinados, que
se pueden marcar y revelar mediante diferentes estrategias (marcajes
colorimétricos, enzimáticos, fluorescentes, radioactivos, de tipo
avidina-biotina, etc).
En particular, la etapa inmunológica de
detección o de dosificación puede utilizar unos anticuerpos
dirigidos contra la proteína/glicoproteína implicada para captarla,
y después asegurar la detección, o la determinación cuantitativa,
de los complejos antígeno-anticuerpo así formados.
Dicho procedimiento es preferentemente un procedimiento
"sándwich" del tipo descrito en el artículo de E.
BLOCH-MICHEL y L. HELLEBOID, Revue française de
Laboratoires nº 207, mayo 1990, páginas 43 a 46. Según dicha forma
de realización, el material adsorbente (o la parte de material
adsorbente que está en contacto con las secreciones nasales) se
coloca en una solución, contenida en un tubo o análogo (placa,
caja, frasco, ampolla, etc), que comprende dos series de anticuerpos
dirigidos contra la proteína/glicoproteína implicada: unos
anticuerpos marcados libres por una parte, y unos anticuerpos en
fase sólida (generalmente no marcados) por otra parte. Las proteínas
pasan a la solución y se fijan a los anticuerpos marcados. Cada
complejo obtenido de este modo está fijado sobre un anticuerpo en
fase sólida. La presencia o la cantidad de proteína o glicoproteína
implicada se puede determinar entonces por detección o medición de
la intensidad del marcaje fijado en el tubo.
Los anticuerpos pueden ser
mono-o policlonales. Los anticuerpos en fase sólida
pueden ser unos anticuerpos inmovilizados sobre una fase sólida
como especialmente un disco de papel, bolas, etc., o inmovilizados
directamente sobre la superficie interna del tubo de material
plástico (anticuerpos fijados a la pared interior) que sirve como
recipiente para el conjunto de la reacción, etc. La fijación de los
anticuerpos sobre el soporte sólido se puede realizar mediante
cualquier técnica conocida por el experto en la materia (por
absorción, fijación covalente, etc.).
El procedimiento inmunoquímico se puede utilizar
también, en las condiciones descritas anteriormente para los
anticuerpos, las reacciones de antígenos, como los alérgenos, con
los anticuerpos, especialmente en una reacción de tipo
"sándwich" como la descrita anteriormente, en cuyo caso se
utiliza ventajosamente un anticuerpo y un antígeno, uno marcado y
libre, el otro inmovilizado en la fase sólida.
Además de estas reacciones de tipo
"sándwich", la presente invención puede utilizar asimismo
cualquier otro procedimiento de detección o de dosificación
cuantitativa de antígenos en una solución. A este respecto, podemos
citar especialmente diferentes técnicas inmunoenzimáticas (de tipo
ELISA, etc.) o radioinmunológicas (del tipo RIA, etc.).
Preferentemente, durante la etapa de detección o
de dosificación, se agitan los tubos (u otros contenedores) de
reacción con el fin de aumentar la sensibilidad, es decir permitir
la medición de cantidades muy bajas.
Como se ha indicado anteriormente, para una
dosificación cuantitativa de las proteínas o glicoproteínas,
generalmente se pasan los resultados a una curva patrón,
establecida a partir de soluciones de referencia dosificadas según
el mismo protocolo. Dichas soluciones de referencia pueden ser unas
soluciones preparadas artificialmente, por dilución (o diluciones
seriadas) de la proteína o glicoproteína pura. Asimismo, puede
tratarse de muestras biológicas, como por ejemplo una muestra de
lágrima o de sangre (o de suero). A este respecto, en una forma de
realización particular, el procedimiento de la invención comprende
una etapa adicional de comparación de las cantidades medidas en las
secreciones nasales con las cantidades medidas en otra muestra
biológica, como las lágrimas, la sangre o el suero.
Los procedimientos de la invención se pueden
utilizar para detectar o dosificar diferentes tipos de proteínas o
glicoproteínas. Puede tratarse principalmente de inmunoglobulinas
(IgG, IgM, IgE, etc.), de proteínas inflamatorias, o de otras
proteínas o glicoproteínas implicadas en unos fenómenos fisiológicos
o fisiopatológicas, o de marcadores utilizables para la realización
de dosificaciones diagnósticas. Preferentemente, se trata de
inmunoglobulinas, incluso más preferentemente de inmunoglobulinas
de tipo E (IgE). Los resultados presentados en los ejemplos de
hecho muestran que se pueden detectar las IgE en las secreciones
nasales, y que las dosificaciones de la invención ofrecen una gran
sensibilidad, que permite detectar unas variaciones de cantidad de
IgE correlacionadas con un estado alérgico local o general.
A este respecto, un objetivo particular de la
invención se centra en un procedimiento de desciframiento, de
seguimiento y de caracterización de una alergia en un sujeto,
caracterizado porque comprende una etapa de detección y/o de
dosificación de las IgE presentes en las secreciones nasales.
Dicha detección o dosificación se realiza
ventajosamente en las condiciones descritas anteriormente.
El desciframiento indica que el carácter
alérgico del sujeto considerado todavía no se conoce o no se ha
revelado, o está en un estadio precoz todavía no confirmado. El
procedimiento de la invención también es aplicable al seguimiento
y/o a la caracterización de una alergia, es decir al estudio de la
evolución del estado alérgico de un sujeto, o a la determinación
del tipo de alergia presente, principalmente su carácter local o
general.
El procedimiento de la invención se puede
utilizar para dosificar simultáneamente varias proteínas o
glicoproteínas de interés, o varios tipos de proteínas o
glicoproteínas de interés. Se puede tratar principalmente de las
IgE totales, o bien de determinadas IgE específicas de antígenos
(alérgenos) determinados. Según una aplicación preferida, el
procedimiento de la invención comprende una detección o una
dosificación de las IgE presentes en las secreciones nasales, sin
distinción de especificidad antigénica (IgE totales).
Por lo tanto el procedimiento puede aplicarse no
únicamente a la dosificación de las IgE nasales totales, sino
también a la dosificación de las IgE específicas, principalmente a
unas concentraciones bajas. A fortiori, se puede proceder a una
dosificación cuantitativa de las IgE específicas.
Para las IgE específicas, se utilizan
ventajosamente unos alérgenos o reactógenos que pueden estar
insolubilizados, de la forma descrita para los anticuerpos, o no,
marcados o no.
Por otra parte, el procedimiento según la
invención puede permitir establecer no únicamente unos diagnósticos
en los casos de alergias locales (del tipo rinofaríngeas) sino
también en el caso de las alergias generales. En este último caso,
la sensibilidad aumentada del procedimiento permite la
cuantificación de las IgE exudadas. A este respecto, el
procedimiento de la invención se puede utilizar principalmente para
descifrar o seguir la evolución de las alergias como el asma, el
eczema, rinitis, sinusitis alérgicas, etc.
Como se ha indicado anteriormente, la invención
también es aplicable a la dosificación nasal de sustancias que
reflejan un estado inflamatorio o patológico y principalmente a unas
sustancias susceptibles de encontrarse en las secreciones nasales
en unas áreas de concentraciones bajas y preferentemente bastantes
poco extensas.
Los materiales y procedimientos de la invención
se pueden utilizar para detectar o dosificar unas proteínas o
glicoproteínas en las secreciones nasales de cualquier persona,
adulto o niño, sano o que presenta una patología. Además, la
invención se puede aplicar también a la detección o a la
dosificación de proteínas o glicoproteínas en las secreciones
nasales de cualquier otro mamífero (particularmente caninos,
bovinos, ovinos, equinos, porcinos, etc.).
La presente invención se refiere asimismo a unos
equipos para la utilización de los procedimientos descritos
anteriormente. Dichos equipos comprenden ventajosamente unas
soluciones que permiten la realización de una reacción
inmunológica, y particularmente por lo menos un anticuerpo
anti-IgE. Dicho anticuerpo puede ser una policlonal
o monoclonal, puede estar marcado o no. Los equipos de la invención
comprenden más preferentemente un dispositivo para realizar la
reacción inmunológica, como por ejemplo un tubo, unos pocillos, una
caja o un frasco. Por otra parte, los equipos de la invención
pueden además comprender un material adsorbente, utilizable para
realizar la extracción.
En una forma de realización particular, los
equipos según la invención comprenden un tubo (o análogo)
recubierto de anticuerpos anti-IgE y una solución
de anticuerpos anti-IgE acoplados a una enzima (por
ejemplo la peroxidasa). Más preferentemente, comprenden además un
material adsorbente (principalmente una tira) impregnada de IgE
patrón y/o una solución de lavado y/o un sustrato cromógeno de la
enzima (por ejemplo la OPD). Dichos equipos se pueden utilizar
fácilmente para detectar o dosificar las IgE a partir de secreciones
nasales, según la presente invención.
Otro objetivo de la invención se centra asimismo
en la utilización de un material que permite la adsorción de
proteínas o glicoproteínas para la detección o la dosificación de
proteínas o glicoproteínas a partir de una secreción nasal de un
sujeto, por puesta en contacto directo de dicho material con una
mucosa nasal de dicho sujeto. El material es preferentemente como
se ha definido anteriormente, y se utiliza para detectar la
presencia o para dosificar las inmunoglobulinas.
Otro objetivo de la invención se centra asimismo
en la utilización de un material que permite la adsorción de
proteínas o glicoproteínas para la fabricación de un producto o
equipo para la utilización de un procedimiento de diagnóstico,
desciframiento, seguimiento o caracterización de una alergia en un
sujeto.
Otros aspectos y ventajas de la presente
invención se pondrán de manifiesto a la luz de los ejemplos
siguientes, que deben considerarse como ilustrativos y no
limitativos. Dichos ejemplos ilustran particularmente el principio
de dosificación de las IgE totales mediante una técnica
inmunoenzimática en unas secreciones nasales extraídas con la ayuda
de una tira de papel.
La detección inmunoenzimática se lleva a cabo
mediante una técnica de tipo de "sándwich" utilizando dos
anticuerpos monoclonales anti-IgE. La reacción se
desarrolla en dos etapas:
- -
- una reacción inmunológicas: las IgE a dosificar (o detectar) se incuban 3 h a una temperatura de 18- 25ºC en unos tubos en presencia de dos anticuerpos monoclonales anti-IgE de los que uno está fijado a la pared de los tubos y el otro, en fase líquida, está marcado con peroxidasa. La incubación está seguida de una fase de lavado de los tubos.
- -
- un revelado enzimático: se añade en los tubos un sustrato cromógeno del tipo OPD (ortofenilendiamina). Después de la incubación 30 minutos a 18-25ºC, se añade un agente bloqueante (ácido sulfúrico) y se lee la coloración obtenida en el espectrofotómetro.
A lo largo de la misma serie de dosificación, se
efectúa un blanco reactivo (tubo sin IgE), unos patrones (tubos que
contienen unas cantidades conocidas de IgE) y un control
positivo.
Se utilizan los reactivos siguientes en la
realización del procedimiento:
- -
- tiras de papel para efectuar la extracción nasal,
- -
- tubos de poliestireno recubiertos de anticuerpos anti-IgE
- -
- tiras impregnadas de IgE patrón
- -
- tiras impregnadas de control positivo
- -
- soluciones de anticuerpo anti-IgE marcado con peroxidasa
- -
- solución de lavado
- -
- cromógeno (OPD en comprimidos con diluyente)
- -
- Agente bloqueante (ácido sulfúrico).
El procedimiento se realiza como se detalla a
continuación.
Para la reacción inmunológica, las tiras puestas
en contacto previamente con las secreciones nasales (o las tiras
patrón o control) se colocan en los tubos (excepto el tubo en blanco
reactivo). Se añaden 300 \mul de anticuerpo conjugado con la
peroxidasa y se mantienen los tubos bajo agitación durante 3 horas
a temperatura ambiente, a una velocidad de 360 rpm. Se aspira el
medio de reacción de todos los tubos, y se reparte la solución de
lavado en los tubos (2 ml por tubo) y las tiras se retiran de los
tubos. La solución se aspira de nuevo y se repite dos veces la
operación de lavado. Después se aspiran las soluciones
cuidadosamente.
Para el revelado enzimático, se reparten 300
\mul de solución de revelado en cada tubo. Después de la
incubación de 30 minutos a temperatura de ambiente y protegido de
la luz, se introduce 1 ml de agente bloqueante en cada tubo. Se
agitan los tubos (por ejemplo en un agitador tipo Vortex). Se lee la
coloración obtenida a una longitud de onda de 492 nm contra el
blanco reactivo.
Se han realizado diferentes ensayos preliminares
en personas, en estado patológico o sano, con el fin de dosificar
las IgE presentes en sus secreciones nasales (incluyendo las
naso-sinusiales).
Los resultados obtenidos se pueden resumir como
sigue:
En una primera serie de experimentos, se ha
comparado el ensayo de las IgE nasales de la invención, en cincuenta
sujetos, con los ensayos de provocación nasal (térmica y
eosinófila). Los resultados obtenidos muestran que el ensayo de las
IgE nasales de la invención es más sensible que el ensayo de
provocación eosinófila, y más selectivo que el ensayo de
provocación térmica.
En una segunda serie de experimentos, se ha
comparado el ensayo de las IgE nasales de la invención con la
prueba cutánea, en 17 sujetos que han realizado una consulta por
unas manifestaciones rinofaríngeas que evocan alergia. En 10
pacientes, cuando la prueba cutánea ha sido negativa, el ensayo de
la invención ha permitido poner en evidencia una elevación
importante de las IgE en las secreciones nasales. Dichos
experimentos parecen indicar que los ensayos de la invención
permiten una detección más fiable que las pruebas cutáneas
anteriores. Dichos resultados también parecen confirmar la
predominancia de la hipersensibilidad local sobre la
hipersensibilidad general.
Los resultados obtenidos muestran además que las
IgE recogidas en las tiras se pueden dosificar directamente y de
forma proporcional a su concentración en el medio a dosificar, sin
que sea necesario calcular el peso o la cantidad recogida. Dicho
fenómeno se debe al hecho de que se estable muy rápidamente (en
pocos minutos) un equilibrio entre las IgE que se adsorben sobre el
papel y las que permanecen en la solución. Después, cuando se
incuba el papel con la solución de anticuerpos
anti-IgE, las IgE abandonan el papel para formar un
complejo antígeno-anticuerpo que entonces se puede
dosificar.
La dosificación según la invención resulta
ventajosa ya que se puede llevar a cabo en una sola etapa, y
permite, por agitación de los tubos, la detección de cantidades muy
bajas de proteínas (inferiores a 2 kUI/l).
En una tercera serie de experimentos, se ha
practicado el ensayo de las igE nasales de la invención en un grupo
control que incluye 9 personas (5 mujeres y 4 hombres) de edades
comprendidas entre 25 y 55 años y en un grupo de 17 pacientes (7
mujeres y 10 hombres) de 7 a 61 años.
El grupo control está compuesto de personas que
no presentan ni síntomas de rinitis ni síntomas de alergia ni
presentan ningún antecedente personal o familiar. El segundo grupo
está compuesto de personas que han acudido a la consulta con unos
síntomas de rinitis crónica que se ha manifestado durante un periodo
de tiempo superior a tres meses.
Las tiras se han puesto en contacto con las
mucosas de los sujetos durante 60 segundos, después se han enviado
al laboratorio (bajo 15 días) para el análisis en las condiciones
descritas anteriormente.
Los resultados obtenidos describen una densidad
óptica media en las secreciones nasales de los sujetos control de
0,136, y una densidad óptica media en las secreciones nasales de
los sujetos sintomáticos de 1,752. El ensayo de las IgE nasales
practicado según la invención ha permitido por lo tanto poner en
evidencia una diferencia significativa en la secreción local de IgE
entre el grupo control y el grupo de pacientes y por lo tanto
distinguir claramente los sujetos alérgicos de los sujetos
sanos.
Claims (8)
1. Procedimiento de detección o de dosificación
de IgE, que comprende:
- -
- la puesta en contacto de una secreción nasal con un material que permite la adsorción de las IgE que comprende por lo menos una parte compuesta de un material adsorbente seleccionado de entre un material celulósico, un polímero o un complejo macromolecular, de origen natural o sintético, solos o en combinación, colocando directamente el material en contacto con las mucosas nasales de un sujeto, y
- -
- la detección o la dosificación, a partir de dicho material, de la presencia de IgE mediante una reacción inmunológica, comprendiendo dicha etapa de detección o de dosificación la incubación del material adsorbente, o la parte de material adsorbente que ha estado en contacto con las secreciones nasales, en una solución que comprende dos series de anticuerpos dirigidos contra las IgE: unos anticuerpos marcados libres por una parte, y unos anticuerpos en fase sólida por otra parte.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la etapa de dosificación comprende la
determinación de la cantidad de IgE implicada que está adsorbida
sobre dicho material, comparándose la cantidad medida con una curva
patrón.
3. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el material
adsorbente comprende por lo menos una parte compuesta de un
material adsorbente celulósico no agresivo o tóxico para el
sujeto.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el material
adsorbente está constituido por una soporte, filiforme, o en forma
de pastilla o de disco, de esponja quirúrgica, de embudo, de
bastoncillo o de tira.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los
anticuerpos están marcados mediante un marcaje colorimétrico,
enzimático, fluorescente, radioactivo y/o de tipo
avidina-biotina.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa de
detección o de dosificación se realiza mediante un procedimiento
inmunológico ELISA.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los
anticuerpos son unos anticuerpos monoclonales o policlonales.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, para la detección o la dosificación de
las IgE totales.
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