ES2306902T3 - Panel de diagnostico ibd-first chek para la enfermedad inflamatoria del intestino y el sindrome del colon irritable. - Google Patents
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Abstract
Método para someter a prueba una muestra de una persona, comprendiendo el método: obtener una muestra fecal de una persona; determinar si está presente lactoferrina en la muestra; si es así, determinar si están presentes anticuerpos anti-Saccharomyces cerevisiae (ASCA) y anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA) en la muestra.
Description
Panel de diagnóstico IBD-FIRST
CHEK para la enfermedad inflamatoria del intestino y el síndrome del
colon irritable.
Un método para la diferenciación de la
enfermedad inflamatoria del intestino (EII) de la enfermedad del
colon irritable (SCI) seguido de distinguir la colitis ulcerosa de
la enfermedad de Crohn y otras enfermedades gastrointestinales.
Este método altamente diferencial usa por primera vez la presencia
de lactoferrina fecal elevada como marcador de la inflamación
intestinal para diferenciar la EII de la SCI. Los pacientes de los
que se sospecha que padecen EII se analizan entonces para
determinar anticuerpos anti-Saccharomyces cerevisiae (ASCA)
como indicador de la enfermedad de Crohn y anticuerpos
citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA) fecales como indicador de la
colitis ulcerosa. Los pacientes con EII se monitorizan además para
determinar la inflamación intestinal usando la lactoferrina para
evaluar la eficacia del tratamiento médico y predecir la recaída.
El aparato comprende o bien un inmunoensayo ligado a enzimas
cualitativo o bien otro inmunoensayo que utilice anticuerpos para
la medición de la lactoferrina endógena total, ASCA y ANCA en heces
humanas. El personal sanitario puede utilizar el método y aparato
para identificar la EII y distinguir la colitis ulcerosa de la
enfermedad de Crohn.
Se estima que 1 millón de americanos padecen la
enfermedad inflamatoria del intestino (EII) crónica y 20 millones
de americanos padecen el síndrome del colon irritable (SCI). La
EII, que comprende tanto la enfermedad de Crohn (EC) como la
colitis ulcerosa (CU), se caracteriza por una respuesta
inflamatoria crónica que da como resultado un daño histológico en
el revestimiento intestinal. Tanto la EC como la CU muestran
grandes números de leucocitos que migran a la mucosa y hacia el
interior de la luz intestinal. Ambas enfermedades oscilan entre
fases activas (es decir, presencia de inflamación intestinal) e
inactivas (es decir, de mínima o ninguna inflamación intestinal) de
actividad de la enfermedad. La EII activa puede incluir síntomas
tales como diarrea hemorrágica, dolor abdominal y fiebre. La fase
inactiva tiene de mínima a ninguna inflamación intestinal y carece
de enfermedad gastrointestinal grave.
Puede ser difícil distinguir los pacientes que
tienen EII activa pero que muestran síntomas y signos leves de los
pacientes con SCI activa, un trastorno intestinal de la motilidad y
del sistema nervioso intestinal. A diferencia de la EII, la SCI no
implica inflamación intestinal. En las personas con SCI, el
intestino parece normal en el examen endoscópico y no hay
leucocitos presentes en la mucosa o en muestras fecales. Los
síntomas pueden imitar a los de la EII e incluyen distensión
abdominal, diarrea, estreñimiento y dolor abdominal intenso y con
frecuencia debilitante. Se estima que al menos 20 millones de
americanos padecen la SCI.
La similitud en los síntomas entre la SCI y la
EII hace difícil un diagnóstico rápido. Sin embargo, dada la
gravedad potencial de la EII sin tratar, un diagnóstico diferencial
es crucial. El diagnóstico de enfermedades gastrointestinales, en
general, se ve ayudado por pruebas diagnósticas tales como ensayos
de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), aglutinación con
látex e inmunoensayo de flujo lateral. Estas pruebas son métodos
rápidos y baratos para detectar marcadores en las heces para
determinar patógenos entéricos e inflamación. Un marcador de
interés particular que se ha encontrado que es el más específico
para los leucocitos en muestras fecales es la lactoferrina. La
lactoferrina humana es una glicoproteína de 80 kilodalton. Esta
proteína de unión a hierro se secreta por la mayoría de las
membranas mucosas. Es un componente principal de los gránulos
secundarios encontrados en los neutrófilos polimorfonucleares
(PMN), un componente primario de la respuesta inflamatoria aguda.
Otras células hematopoyéticas tales como monocitos y linfocitos, no
contienen lactoferrina, mientras que varias secreciones corporales
contienen niveles en el intervalo de los mg/ml. Durante el proceso
de inflamación, los PMN se infiltran en el revestimiento de la
mucosa del intestino delgado y grueso. Este aumento en el número de
leucocitos en el tejido activados y la exudación de plasma desde la
mucosa ulcerada da como resultado un aumento en el nivel de la
lactoferrina encontrada en las heces. La proteína es resistente a
la proteólisis y, como tal, proporciona un marcador fecal no
invasivo útil de la inflamación intestinal.
La lactoferrina humana se ha usado como marcador
para los leucocitos fecales en varias aplicaciones. Por ejemplo, la
lactoferrina fecal se ha usado como marcador para leucocitos para
distinguir la diarrea no inflamatoria de la diarrea inflamatoria,
tal como se describe en la patente estadounidense número 5.124.252.
La diarrea no inflamatoria provocada por agentes tales como
rotavirus, agentes similares a Norwalk y cólera, provoca
normalmente de mínimo a ningún daño intestinal y los pacientes
responden inmediatamente a la rehidratación oral. Las diarreas
inflamatorias incluyen las provocadas por patógenos entéricos tales
como Clostridium difficile, especies de Shigella,
especies de Salmonella, Campylobacter jejuni y Entamoeba
histolytica y las que no tienen agentes infecciosos claramente
definidos tales como EC y CU. La patente estadounidense número
5.124.252 da a conocer una prueba in vitro para detectar
leucocitos fecales que ayuda a distinguir la diarrea inflamatoria
de la no inflamatoria. La patente '252 da a conocer pruebas de
muestras fecales que se sospecha que contienen leucocitos con un
ensayo que utiliza un anticuerpo para la lactoferrina para
determinar la presencia de leucocitos en la muestra fecal.
La lactoferrina humana también se ha usado como
marcador para el diagnóstico de trastornos gastrointestinales
inflamatorios, pólipos del colon y cáncer colorrectal tal como se
da a conocer en la patente estadounidense número 5.552.292. Sin
embargo, ni el método de la patente '252 ni el de la patente '292
dan a conocer una utilidad para distinguir la SCI de la EII. Las
muestras sometidas a prueba mediante el ensayo de la patente '252
son muestras que se sospecha que contienen leucocitos. Esta
sospecha se debe a que el paciente presenta diarrea. Sin embargo,
el 25-50% de las personas que tienen EII no
presentan diarrea y, por tanto, la patente '252 no se refiere a la
etiología de diagnóstico en tales pacientes. Tal como para la
patente '292, el método dado a conocer utiliza una dilución de
muestra 1:100 que no permite una cuantificación precisa de los
niveles de lactoferrina. Además, la patente '292 da a conocer el
uso de formas parciales de moléculas para las pruebas y no la
lactoferrina endógena total, lo que afecta de nuevo a la precisión
de la cuantificación. El método de la patente '292 tampoco se
refiere a la utilización de los niveles de lactoferrina para
distinguir la EII de la SCI. La población sometida a prueba en la
patente '292, aunque incluía personas con CU y EC, no incluía
personas que tuvieran SCI.
La EII comprende tanto la enfermedad de Crohn
como la colitis ulcerosa. Estas dos enfermedades distintas
requieren un diagnóstico diferencial rápido para un tratamiento
óptimo. La enfermedad de Crohn puede implicar todo el tracto
gastrointestinal e incluye inflamación que se extiende hacia la
mucosa transparietal, mientras que la colitis ulcerosa afecta
solamente al intestino grueso e incluye inflamación del
revestimiento más interno. Los métodos convencionales para
diferenciar entre la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa que
utilizan múltiples exámenes endoscópicos y análisis histológicos
pueden tardar años en confirmar un diagnóstico.
La patente estadounidense número 6.218.129 da a
conocer un método para determinar la presencia de ANCA en suero
como marcador para diagnosticar la EII. Sin embargo, no da a
conocer un método para diagnosticar la colitis ulcerosa en un
paciente al que se le ha diagnosticado EII.
También se conocen en la técnica métodos
serológicos para el diagnóstico diferencial de la EC y la CU. Por
ejemplo, se conoce el uso de la presencia de anticuerpos
anti-Saccharomyces cerevisiae (ASCA) en suero para
diagnosticar EC. Véase Main et al., Antibody to
Saccharomyces cerevisiae (baker's yeast) in Crohn's disease,
BMJ vol. 297 (29 de octubre de 1988); Broker et al., A
Murine Monoclonal Antibody Directed Against a Yeast Cell Wall
Glycoprotein Antigen of the Yeast Genus Saccharomyces, FEMS
Microbiology Letters 118 (1994), 297-304. Se conoce
además en la técnica el uso de la presencia de ASCA en suero para
diagnosticar subtipos clínicos de CU y EC en pacientes que
presentan diagnósticos establecidos. Por ejemplo, la patente
estadounidense número 5.968.741 da a conocer la utilización de la
presencia de ASCA en suero para diagnosticar un subtipo clínico
médicamente resistente de CU en pacientes que presentan un
diagnóstico establecido de CU. De manera similar, la patente
estadounidense número 5.932.429 da a conocer la utilización de la
presencia de ASCA en suero para diagnosticar un subtipo clínico de
EC en pacientes que presentan un diagnóstico establecido de EC.
El documento WO02/39883 da a conocer un método
para diferenciar el síndrome del colon irritable de la enfermedad
inflamatoria del intestino usando lactoferrina fecal como
marcador.
La figura 1 es una representación gráfica de una
curva patrón de anticuerpos anti-Saccharomyces cerevisiae
purificados según una realización de la presente invención; y
la figura 2 es una representación gráfica de una
curva patrón de anticuerpos citoplasmáticos
anti-neutrófilos según una realización de la
presente invención.
La presente invención se refiere a un
inmunoensayo de lactoferrina usado para determinar la presencia de
lactoferrina elevada como indicador de inflamación intestinal que
ayuda así en la diferenciación de la EII de la SCI, e inmunoensayos
para ANCA y ASCA para diferenciar entre la colitis ulcerosa y la
enfermedad de Crohn. Los resultados de las pruebas pueden usarse
para determinar un tratamiento apropiado para los pacientes con
colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn. Pueden usarse inmunoensayos
cualitativos tales como inmunoensayos ligados a enzimas y tiras
reactivas de flujo lateral que utilizan anticuerpos monoclonales y
policlonales frente a ANCA y ASCA humanos para distinguir entre la
colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn. Las secreciones
corporales, tal como se usan en el presente documento, se limitan a
las heces.
En el ensayo cualitativo, las secreciones
corporales se diluyen y se añaden a un pocillo que contiene los
anticuerpos frente a lactoferrina inmovilizados o antígenos de
Saccharomyces cerevisiae o antígenos citoplasmáticos de
neutrófilos. Si están presentes lactoferrina endógena o ASCA o
ANCA, se unirá al pocillo que contiene antígenos o anticuerpos
inmovilizados durante una etapa de incubación. Tras la incubación,
se añaden anticuerpos frente a lactoferrina humana o anticuerpos
polivalentes frente a inmunoglobulina humana acoplados a la enzima
peroxidasa del rábano (conjugado) y se deja que se unan a la
lactoferrina o ANCA o ASCA capturados. El conjugado no unido se
elimina por lavado del pocillo y se añade un sustrato componente
(tetrametilbenzideno y peróxido de hidrógeno) para el desarrollo de
color. Tras la incubación con sustrato, se detiene la reacción
mediante acidificación y se determina la densidad óptica (DO)
espectrofotométricamente a 450 nm.
Las realizaciones particulares descritas en el
presente documento pretenden ser, en todos los sentidos,
ilustrativas más que restrictivas. Las realizaciones alternativas
resultarán evidentes para los expertos en la técnica a la que
pertenece la presente invención sin apartarse de su alcance.
El ensayo de la presente invención se diseñó y
desarrolló para detectar niveles de lactoferrina fecal a un menor
nivel al detectable mediante los dispositivos legalmente
comercializados, específicamente el LEUKO-TEST®. El
límite inferior de detección del LEUKO-TEST® es de
256 ng/ml con lactoferrina humana purificada. En el
LEUKO-TEST®, una dilución de muestra de 1:50 y un
límite mínimo de detección de 256 ng/ml proporciona un límite
inferior de detección en muestras fecales de aproximadamente 12
\mug/ml. Una dilución de muestra de 1:400 y un límite de
detección mínimo para el ensayo de la presente invención de 32
ng/ml también proporcionan un límite inferior de detección en
muestras fecales de aproximadamente 12 \mug/ml. En consecuencia,
se eligió una dilución de muestra 1:400 para el ensayo de la
presente invención. De manera similar, se eligió una densidad
óptica DO_{450} de 0,200 para el ensayo. (Tal como se usa en el
presente documento, DO_{450} indica una densidad óptica obtenida
espectrofotométricamente a 450 nm en un espectrofotómetro de
longitud de onda única).
Se entenderá y apreciará por los expertos en la
técnica que el factor de dilución y las densidades ópticas
preferidos se han determinado basándose en reactivos disponibles
actualmente y que se consideran que son óptimos. Sin embargo,
pueden mejorarse reactivos distintos de los deseados ahora y pasar
a ser deseables con el tiempo. Las variaciones en los reactivos
pueden producir factores de dilución y/o densidades ópticas
preferibles/óptimos distintos de los determinados en el presente
documento. Se contempla que tales variaciones estén dentro del
alcance de la presente invención. La clave para determinar los
valores óptimos se basa en la sensibilidad tal como se describe más
en detalle a continuación.
Para verificar que la dilución de muestra 1:400
proporciona la sensibilidad más deseable con los reactivos
actuales, se analizaron 121 muestras fecales comparando una
dilución 1:400 con una dilución 1:800. (La sensibilidad se calcula
en el presente documento dividiendo el número de muestras tomadas
de los sujetos con EII que producen un resultado positivo en el
ensayo entre el número de muestras tomadas de los sujetos con EII).
Adicionalmente se evaluaron los resultados de las pruebas
comparando valores de DO_{450} de 0,200 con valores de DO_{450}
de 0,300. Se compararon los resultados con microscopia para
determinar leucocitos fecales y con el LEUKO-TEST®.
Los resultados se resumen en las tablas 1-8 a
continuación.
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En resumen, una dilución de muestra fecal de
1:400 y un ensayo de DO_{450} de 0,200 mostraron el mayor nivel
de sensibilidad con los reactivos actuales. En consecuencia, se
determinó que estas condiciones eran óptimas para el ensayo de la
presente invención. Las muestras fecales normales contienen bajos
niveles de lactoferrina y se ha determinado que las diluciones
1:400 son óptimas para la detección de un aumento en la
lactoferrina con respecto a los niveles de referencia. El uso de
diluciones inferiores a 1:400 puede dar como resultado resultados
de prueba positivos debido a la presencia de niveles de
lactoferrina normales.
Los procedimientos de recogida y manipulación
convencionales usados normalmente para muestras fecales para su
cultivo pueden usarse en la recogida de muestras para el ensayo de
la presente invención. En la realización preferida, van a someterse
a prueba las muestras fecales en el plazo de veinticuatro horas
tras la recogida. Sin embargo, si el ensayo no va de realizarse en
el plazo de cuarenta y ocho horas tras la recogida, se prefiere que
se almacenen las muestras a -20ºC o menos. Adicionalmente, se
prefiere que las muestras recogidas se transporte y diluyan en el
diluyente lo antes posible tras la recogida y, una vez diluidas, que
las muestras se almacenen a entre aproximadamente 2ºC y
aproximadamente 8ºC. Se prefiere que las muestras se mezclen (es
decir, usando una mezcladora con vórtex) meticulosamente antes de
realizar el ensayo de la presente invención. Esto incluye el
mezclado completo de la muestra antes de transferirlas al
diluyente, tal como se describe más en detalle a continuación, así
como un mezclado completo de la muestra diluida antes de realizar
el ensayo.
Se usó el siguiente método para preparar una
muestra diluida a partir de una muestra fecal líquida. Se
establecieron dos tubos de plástico para cada muestra que iba a
someterse a prueba. Para cada muestra, se añadieron posteriormente
950 \mul de 1X diluyente (preparado tal como se describe más en
detalle a continuación) a cada uno de los dos tubos. Usando una
pipeta de transferencia, se añadió una gota (es decir,
aproximadamente 50 \mul) de muestra fecal líquida a uno de los
tubos y se mezcló meticulosamente usando una mezcladora con vórtex.
Posteriormente, se transfirió una gota de la muestra diluida al
segundo tubo que contenía 950 \mul de 1X diluyente (preparado tal
como se describe más en detalle a continuación). El resultado fue
una dilución 1:400 de la muestra en el segundo tubo. Por tanto,
sólo se usó el segundo tubo para el resto del procedimiento de
prueba.
Se usó el siguiente método para preparar una
muestra diluida a partir de una muestra fecal sólida o formada. Se
establecieron dos tubos de plástico para cada muestra que iba a
someterse a prueba. Para cada muestra, se añadieron 1,9 ml de 1X
diluyente (preparado tal como se describe más en detalle a
continuación) a sólo uno de los dos tubos. Posteriormente, se
añadieron 0,10 g de muestra fecal a este tubo (1:10) y se mezclaron
meticulosamente usando una mezcladora con vórtex. Después, se
añadieron 950 \mul de 1X diluyente (preparado tal como se
describe más en detalle a continuación) al segundo tubo y se
transfiere una gota (es decir, aproximadamente 50 \mul) de la
muestra previamente diluida al segundo tubo. El resultado fue una
dilución 1:400 de la muestra en el segundo tubo. Por tanto, sólo se
usó el segundo tubo para el resto del procedimiento de prueba.
La muestra en el segundo tubo preparada según
cualquiera de los procedimientos anteriores se mezcló en una
mezcladora con vórtex durante aproximadamente diez segundos y
posteriormente se almacenó a entre aproximadamente 2ºC y
aproximadamente 8ºC hasta que se realizó el resto del procedimiento
de prueba. Antes de transferir la muestra diluida a un pocillo de
microtitulación según el procedimiento de prueba, tal como se
describe más en detalle a continuación, se mezcló meticulosamente
la muestra en la mezcladora con vórtex de nuevo. Este procedimiento
buscaba garantizar un mezclado meticuloso de la muestra.
Fueron necesarios varios reactivos para llevar a
cabo la realización preferida del ensayo cualitativo de la presente
invención. Estos reactivos incluían 10X diluyente, 1X diluyente,
conjugado, sustrato, control positivo, disolución de tampón de
lavado y disolución de parada. El 10X diluyente era un 10X
concentrado de una disolución de proteínas tamponada que contenía
timerosal al 0,2% como conservante. Se suministró el diluyente como
un 10X concentrado. Por tanto, para preparar el 1X diluyente
necesario para el ensayo de la presente invención, se diluyó un
volumen total de 400 ml añadiendo 40 ml del 10X concentrado a 360
ml de agua desionizada. Se almacenó cualquier 1X diluyente sin usar
a entre aproximadamente 2ºC y aproximadamente 8ºC.
El conjugado usado con el ensayo de la presente
invención comprende preferiblemente anticuerpo policlonal de conejo
específico para la lactoferrina humana conjugado con peroxidasa del
rábano y en una disolución de proteínas tamponada que contenía
timerosal al 0,02% como conservante. El sustrato usado con el
ensayo de la presente invención comprende preferiblemente una
disolución que contiene sustrato de tetrametilbencidina y
peroxidasa. El control positivo usado con el ensayo de la presente
invención comprende preferiblemente lactoferrina humana en una
disolución de proteínas tamponada que contenía timerosal al 0,02%
como conservante. La disolución de parada usada con el ensayo de la
presente invención comprende preferiblemente ácido sulfúrico 0,6
N.
La disolución de tampón de lavado usada con el
ensayo de la presente invención se suministró como un 20X
concentrado que contenía solución salina tamponada con fosfato,
detergente y timerosal al 0,2% como conservante. Para preparar la
1X disolución de lavado necesaria para el ensayo de la presente
invención, se diluyó un volumen total de un litro de concentrado
añadiendo 50 ml del concentrado a 950 ml de agua desionizada. Se
almacenó cualquier 1X disolución de lavado sin usar a entre
aproximadamente 2ºC y aproximadamente 8ºC.
Se prefieren las placas de microensayo que
contienen doce tiras y ocho pocillos por tira para el ensayo de la
presente invención. Cada muestra y cada control requieren un
pocillo recubierto individual. Para preparar las placas, se
recubrió cada tira con anticuerpo policlonal purificado específico
para lactoferrina. Se almacenaron las placas de microensayo con
desecante.
Se almacenaron todos los reactivos a temperatura
ambiente antes de su uso en el ensayo de la presente
invención.
invención.
La presente invención incluye un kit diseñado y
preparado para llevar a cabo el ensayo cuantitativo. En la
realización preferida, el kit contiene 40 ml de l0X diluyente, 7 ml
de conjugado, 14 ml de sustrato, 3,5 ml de control positivo, 50 ml
de disolución de tampón de lavado, 7 ml de disolución de parada y
una placa de microensayo almacenada con desecante. El ensayo de la
presente invención utiliza anticuerpos frente a lactoferrina
humana. La placa de microensayo suministrada con el kit contiene
anticuerpo policlonal frente a lactoferrina inmovilizado. El
anticuerpo de detección consiste en anticuerpo policlonal conjugado
con peroxidasa del rábano.
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Para realizar el ensayo cualitativo de la
presente invención, se determinó inicialmente el número de pocillos
necesario. Cada muestra o control requería un pocillo y, por
tanto, se determinó el número de pocillos en consecuencia. Después,
se añadió una gota (es decir, aproximadamente 50 \mul) de control
positivo a un único pocillo designado como el pocillo de control
positivo y se añadió una gota (es decir, aproximadamente 50 \mul)
de 1X diluyente a un único pocillo designado como el pocillo de
control negativo. Posteriormente, se añadieron dos gotas (es decir,
aproximadamente 100 \mul) de muestra diluida a 1:400 (preparada
según el procedimiento anterior) a un tercer pocillo y se incubaron
todos los pocillos a aproximadamente 37ºC (\pm 2ºC) durante
aproximadamente treinta minutos. Tras la incubación, se descargó el
contenido de los pocillos de ensayo en una bandeja de desecho.
Después, se lavó cada pocillo usando 1X
disolución de lavado (preparada tal como se describió
anteriormente) y se colocó en una botella rociadora con una
boquilla de punta fina. De esta manera, se dirigió 1X disolución de
lavado al fondo de cada uno de los pocillos con cierta fuerza. Se
llenó cada pocillo con la 1X disolución de lavado y el contenido
del mismo se descargó posteriormente en una bandeja de desecho.
Entonces se invirtió la placa de microensayo y se tiró sobre una
toallita de papel seca. Se realizó este procedimiento de lavado un
mínimo de cuatro veces usando una toallita de papel seca cada vez.
Si se observó cualquier materia particulada en los pocillos, se
continuó con el procedimiento de lavado hasta que se eliminó toda
la materia.
Posteriormente, se añadió una gota (es decir,
aproximadamente 50 \mul) de conjugado a cada pocillo y se
incubaron los pocillos a aproximadamente 37ºC (\pm 2ºC) durante
aproximadamente treinta minutos. Tras la incubación, se descargó el
contenido de los pocillos de ensayo en una bandeja de desecho y se
repitió el procedimiento de lavado. Después, se añadieron dos gotas
(es decir, aproximadamente 100 \mul) de sustrato a cada pocillo y
se golpearon suavemente los pocillos para mezclar el contenido.
Entonces se incubaron los pocillos a temperatura ambiente durante
aproximadamente quince minutos. Se golpearon suavemente los
pocillos un par de veces durante el periodo de incubación.
Después, se añadió una gota (es decir, 50
\mul) de disolución de parada a cada pocillo y se golpearon
suavemente los pocillos. Se dejaron reposar los pocillos a
temperatura ambiente durante aproximadamente dos minutos antes de
la lectura. La adición de disolución de parada convirtió el color
azul en un color amarillo que podía cuantificarse entonces midiendo
la densidad óptica a 450 nm en un lector de microplacas ELISA. Se
hizo un blanco para el instrumento frente al control negativo y se
limpió la parte inferior de cada pocillo antes de medir la densidad
óptica. Se registraron las densidades ópticas (DO_{450} y
DO_{450/620}) para el pocillo de control positivo, el pocillo de
control negativo y cada muestra sometida a prueba.
("DO_{450/620}" tal como se usa en el presente documento
indica una densidad óptica obtenida espectrofotométricamente a
450/620 nm en un espectrofotómetro de longitud de onda dual). Se
promediaron las lecturas de los pocillos por duplicado antes de
interpretar los resultados.
El procedimiento de prueba especificado
representa la realización preferida ya que se obtienen los
resultados óptimos siguiendo el procedimiento especificado porque
los reactivos, concentraciones, condiciones de incubación y
especificaciones de procesamiento se han optimizado para la
sensibilidad y especificidad. En consecuencia, la alteraciones del
procedimiento especificado y/o de las condiciones de prueba
indicadas pueden afectar a la sensibilidad y especificada de la
prueba.
\vskip1.000000\baselineskip
Los controles positivo y negativo deben cumplir
ciertos criterios para que la prueba sea válida. En primer lugar,
el pocillo de control positivo debe tener un color amarillo
visible y, cuando se obtiene una lectura en un espectrofotómetro,
debe tener una DO_{450} Y DO_{450/620} > 0,500. El pocillo
de control negativo debe tener una DO_{450} < 0,200 o una
DO_{450/620} < 0,160. Para garantizar que no se haya producido
remanente, deben repetirse las pruebas si una muestra da un
resultado positivo débil (es decir, < 0,400) y está adyacente a
un pocillo positivo fuerte.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midieron las densidades ópticas a 450 nm en
un espectrofotómetro de longitud de onda única y a 450/620 nm en
un espectrofotómetro de longitud de onda dual. En un
espectrofotómetro de longitud de onda única, una DO_{450} inferior
a 0,200 indicaba un resultado negativo y una DO_{450} superior a
o igual a 0,200 indicaba un resultado positivo. En un
espectrofotómetro de longitud de onda dual, una DO_{450/620}
inferior a 0,160 indicaba un resultado negativo y una DO_{450/620}
superior a o igual a 0,160 indicaba un resultado positivo.
Un resultado de prueba positivo indicaba que la
muestra contenía niveles elevados de lactoferrina en comparación
con un valor de referencia establecido para sujetos control sanos.
Un resultado de prueba negativo indicaba que la muestra no contenía
niveles elevados de lactoferrina con respecto a las muestras de
sujetos control sanos.
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Se sometieron a prueba ciento cuarenta y nueve
sujetos que tenían EII según el procedimiento anterior. Setenta y
siete de los sujetos, o el 51,7%, eran hombres y setenta y dos de
ellos, o el 48,3%, eran mujeres. La razón de hombres con respecto a
mujeres sometidos a prueba se aproxima bastante a la razón 1:1
observada en la población de pacientes con EII general. Las edades
de los sujetos oscilaban desde los 3 años hasta los 78 años y
treinta y dos sujetos, o el 22%, tenían 16 años de edad o eran
menores. Setenta y siete sujetos, o el 51,7%, tenían EC y setenta y
dos de ellos, o el 48,3% tenían CU.
Se sometieron a prueba treinta y un sujetos que
tenían SCI. Seis de los sujetos, o el 19,3%, eran hombres y
veinticinco de ellos, o el 80,7%, eran mujeres. La razón de hombres
con respecto a mujeres sometidos a prueba se aproxima bastante a la
razón 1:3 observada en la población con SCI general. Las edades de
los sujetos oscilaban desde los 19 años hasta los 78 años.
También se sometieron a prueba cincuenta y seis
sujetos sanos como controles. Veintiocho de los sujetos, o el 50%,
eran hombres y veintiocho de ellos, o el 50%, eran mujeres. Las
edades de los sujetos oscilaban desde lactantes hasta los 79 años.
Un resumen de la población de sujetos sometida a prueba se ilustra
en la tabla 9.
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Se tomaron muestras fecales de cada sujeto
incluido y se almacenaron a -70ºC hasta que se sometieron a prueba.
Las consistencias de las muestras oscilaban desde líquida a
sólida, cuyas cifras se ilustran en la tabla 10 para cada grupo de
sujetos. Tal como puede observarse, cuarenta y cinco de las
muestras de EII eran muestras liquidas, sesenta y dos eran muestras
semisólidas y cuarenta y dos eran muestras sólidas. Una de las
muestras de SCI era una muestra líquida, trece eran muestras
semisólidas y diecisiete eran muestras sólidas. Todas las muestras
de los sujetos control sanos eran sólidas.
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Se determinó el nivel de lactoferrina fecal en
cada muestra usando el ELISA cualitativo para lactoferrina tal como
se describió previamente. Se usó una dilución de muestra de 1:400.
Se notificaron los resultados como positivos si se observó una
densidad óptica superior a o igual a 0,200. Al contrario, se
notificaron los resultados como negativos si se observó una
densidad óptica inferior a 0,200.
Del grupo de sujetos con EII, noventa y dos
sujetos tenían enfermedad activa y cincuenta y siete tenían
enfermedad inactiva. Del grupo activo, un total de ochenta sujetos,
o el 87,0%, dieron un resultado positivo en el ensayo. Del grupo
inactivo, un total de treinta y dos sujetos, o el 56,1%, dieron un
resultado positivo. De los cuarenta y un sujetos que tenían CU
activa, un total de treinta y seis sujetos, o el 87,8%, dieron un
resultado positivo en el ensayo. De los cincuenta y un sujetos que
tenían EC activa, cuarenta y cuatro, o el 86,3%, dieron un
resultado positivo. Los treinta y un pacientes que tenían SCI
activa y los cincuenta y seis sujetos control sanos dieron un
resultado negativo en el ensayo. Un resumen de los resultados de
prueba del ensayo se ilustra en la tabla 11 y diversas
comparaciones individuales se ilustran en las tablas 12, 13 y 14,
tal como se describe más en detalle a continuación.
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Cuando se distinguían muestras de sujetos con
EII activa de muestras de sujetos que tienen SCI o de muestras de
controles sanos, el ELISA mostraba una sensibilidad del 87% y una
especificidad del 100%. Se calculó la sensibilidad dividiendo el
número de personas que tenían EII y dieron un resultado positivo en
el ELISA entre el número de sujetos que tenían EII. Se calculó la
especificidad dividiendo el número de sujetos que tenían EII y
dieron un resultado positivo en el ELISA entre el número de sujetos
que dieron un resultado positivo en el ELISA. Los valores positivo y
negativo de predicción eran del 100% y el 87,9%, respectivamente, y
la correlación era del 93,3%. Estos resultados se resumen en la
tabla 12.
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Cuando se distinguían muestras de sujetos con CU
activa de muestras de sujetos que tenían SCI o de sujetos control
sanos, el ELISA mostraba una sensibilidad del 87,8% y una
especificidad del 100%. Los valores positivo y negativo de
predicción eran del 100% y el 94,6%, respectivamente, y la
correlación era del 96,1%. Estos resultados se resumen en la tabla
13.
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Cuando se distinguían muestras de sujetos que
tenían EC activa de muestras de sujetos que tenían SCI o de
muestras de controles sanos, el ELISA mostraba una sensibilidad del
86,3% y una especificidad del 100%. Los valores positivo y negativo
de predicción eran del 100% y el 92,6%, respectivamente, y la
correlación era del 94,9%. Estos resultados se resumen en la tabla
14.
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Se determinó la variación entre ensayos
analizando ocho muestras fecales negativas para lactoferrina y ocho
positivas para lactoferrina a lo largo de un periodo de tres días.
El % promedio del coeficiente de variación (CV) era del 23,5% para
las muestras positivas y del 7,4% para las muestras negativas. Se
determinó la variación dentro de un ensayo analizando doce muestras
fecales usando seis repeticiones en un lote de kits. El análisis
dentro de un ensayo oscilaba en el % de CV desde el 2,7 hasta el
24,0 con un promedio del 8,7%.
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En el ensayo cuantitativo de la presente
invención, preferiblemente se diluyen en serie diez veces muestras
fecales y se añaden a pocillos de microtitulación que contienen
anticuerpos monoclonales frente a lactoferrina humana
inmovilizados. Si está presente lactoferrina endógena, se unirá a
los anticuerpos durante una incubación a aproximadamente 37ºC. Tras
la incubación, se añade conjugado que comprende anticuerpos
policlonales acoplados a la enzima peroxidasa del rábano y se deja
que se unan a la lactoferrina capturada. Entonces se elimina por
lavado el conjugado no unido del pocillo y se añade un sustrato
componente (por ejemplo, tetrametilbenzideno y peróxido de
hidrógeno) para el desarrollo de color. Tras la incubación con
sustrato, se añade ácido sulfúrico 0,6 N para extinguir la reacción
y se obtiene la absorbancia o densidad óptica (DO)
espectrofotométricamente a 450 nm en un dispositivo de longitud de
onda única. Se determinan las concentraciones de lactoferrina fecal
mediante la comparación con una curva patrón generada usando
lactoferrina humana purificada.
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Se preparó una disolución madre 1 mg/ml de
lactoferrina humana purificada, fabricada por Sigma Immunochemicals
de St. Louis, Missouri, usando 10 mg de lactoferrina disuelta en 10
ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril a pH
7,4. Se realizaron diluciones en serie de dos veces de lactoferrina
usando el intervalo de aproximadamente 6 a 100 ng/ml en diluyente.
Para el análisis, se sometió a ensayo 0,1 ml de cada patrón por
duplicado. Se determinaron las densidades ópticas (DO_{450}) y se
representaron gráficamente frente a la concentración de
lactoferrina para generar curvas patrón. Se determinó la parte
lineal de la curva mediante análisis de regresión lineal usando el
método Log-Log (Microsoft EXCEL, Microsoft R
Office). Se usó la menor dilución de muestra que dio una DO_{450}
dentro de la parte lineal de la curva para determinar la
concentración de lactoferrina. Se obtuvo la concentración final
multiplicando la concentración por el factor de dilución.
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Con el fin de valorar la capacidad del ELISA
cuantitativo para medir el nivel de lactoferrina fecal, se
diluyeron dos muestras fecales recogidas con seis semanas de
diferencia de seis mujeres adultas y cinco hombres adultos y
entonces se les añadió una cantidad conocida de lactoferrina hasta
una concentración de 25 ng/ml. La lactoferrina estimada que se
determinó representa el nivel de lactoferrina determinado a partir
de una curva patrón generada con el ELISA cuantitativo. El % de
variación representa la diferencia entre la cantidad real usada
para realizar las adiciones conocidas a la muestra y la cantidad
estimada. En estas condiciones, las variaciones oscilaban desde el
1,0% hasta el 85,8% para las mujeres y del 8,8% al 47,0% para los
hombres. Los resultados mostraban un mayor porcentaje de variación
en las mujeres adultas en comparación con los hombres adultos. Las
muestras de deposición que mostraron una variación mayor tenían
mayores niveles de lactoferrina antes de las adiciones conocidas.
Los resultados se ilustran en las tablas 15 y 16 a
continuación.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Un segundo método para realizar las adiciones
conocidas era usando los mismas dos muestras de deposición
recogidas con seis semanas de diferencia de seis mujeres adultas y
cinco hombres adultos diluidas y con adiciones conocidas de
lactoferrina hasta una concentración de 4 \mug/ml. La
lactoferrina estimada representa el nivel de lactoferrina
determinado a partir de una curva patrón generada mediante el ELISA
cuantitativo. El % variación representa la diferencia entre la
cantidad real usada para realizar las adiciones conocidas a la
muestra y el valor estimado. En estas condiciones, la variación
oscilaba desde el 11,3% hasta el 84,9% para las mujeres y desde el
5,0% hasta el 39,2% para los hombres. Los resultados eran similares
a los obtenidos con muestras con adiciones conocidas con 25 ng/ml
de lactoferrina tal como se describió anteriormente, mostrando un
mayor porcentaje de variación en mujeres adultas en comparación con
hombres adultos. Los resultados se ilustran en las tablas 17 y 18
a continuación.
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Se usó el ELISA cuantitativo de la presente
invención para hacer un seguimiento de los niveles de lactoferrina
de un único paciente que padecía colitis ulcerosa durante un
recrudecimiento de la enfermedad activa hasta la remisión. El
paciente mostraba niveles extremadamente altos de lactoferrina (por
ejemplo, 9749,37 \mug/ml en heces) durante el pico de la
enfermedad activa, cayendo rápidamente los niveles (por ejemplo,
hasta 7,42 \mug/ml en heces) tras un tratamiento farmacológico
antiinflamatorio. Los niveles aumentaron drásticamente de nuevo
durante una recaída y se estabilizaron ligeramente por encima de
los de las personas control sanas (por ejemplo, 11,06 \mug/ml en
heces) durante periodos de remisión. Por tanto, los niveles de
lactoferrina determinados según el ELISA cuantitativo de la
presente invención representan de manera precisa la actividad de la
enfermedad en respuesta al tratamiento médico.
En este ejemplo, se obtuvo una muestra fecal y
se diluyó 20 veces en serie. Se añadieron 100 \mul de la muestra
diluida a un pocillo de prueba de un placa de microensayo
recubierta con extracto de Saccharomyces cerevisiae.
Entonces se incubó la muestra a 37ºC para permitir que los
anticuerpos frente a Saccharomyces cerevisiae se unieran al
extracto de Saccharomyces cerevisiae. Tras la incubación, se
añadieron anticuerpos policlonales anti-Ig humana
acoplados a la enzima peroxidasa del rábano (conjugado) al pocillo
de prueba y se dejó que se unieran al ASCA capturado. Entonces se
eliminó por lavado el conjugado no unido del pocillo y se añadió un
sustrato componente (tetrametilbenzideno y peróxido de hidrógeno)
para el desarrollo de color. Tras la incubación con sustrato, se
añadió ácido sulfúrico 0,1 M para extinguir la reacción y se obtuvo
la densidad óptica (DO) espectrofotométricamente a 450 nm usando un
espectrofotómetro de longitud de onda única.
Se usó el método descrito anteriormente en un
estudio clínico para someter a prueba un total de 86 pacientes con
EII (el 55,8% de hombres y el 44,2% de mujeres). La razón
aproximada de 1 a 1 de hombres con respecto a mujeres era similar a
la razón observada en las poblaciones de pacientes con EII. El
grupo de pacientes con SCI oscilaba en edad desde los 19 hasta los
78 años y era el 9% de hombres y el 91% de mujeres. Esta razón de
hombres con respecto a mujeres (1:10) refleja el aumento de
incidencia para el SCI en mujeres tal como se observa en las
poblaciones de pacientes. El grupo de pacientes control sanos (CS)
oscilaba en edad desde los 20 hasta los 79 años de edad y eran el
33,3% de hom-
bres y el 66,6% de mujeres. Un resumen de la población de pacientes en el estudio clínico se muestra en la tabla 19.
bres y el 66,6% de mujeres. Un resumen de la población de pacientes en el estudio clínico se muestra en la tabla 19.
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En el estudio clínico, había 37 pacientes con
colitis ulcerosa, 49 pacientes con enfermedad de Crohn, 22
pacientes con colon irritable y 12 controles sanos. Se recogieron
muestras fecales de cada sujeto incluido y se almacenaron a -70ºC
hasta que se sometieron a prueba. Se determinaron las densidades
ópticas para cada muestra usando el método descrito anteriormente.
Se notificaron los resultados como positivos para el ASCA fecal si
se observó una densidad óptica superior a o igual a 0,200. Se
notificaron los resultados como negativos para el ASCA fecal si se
observó una densidad óptica inferior a o igual a 0,199. También se
determinaron otros datos clínicos, tales como la consistencia de la
deposición. La tabla 20, a continuación, contiene los datos
clínicos y resultados de prueba para los pacientes sanos que
participaron en este estudio clínico. La tabla 21, a continuación,
contiene los datos clínicos y resultados de prueba para los
pacientes con colitis ulcerosa que participaron en este estudio
clínico. La tabla 22, a continuación, contiene los datos clínicos y
resultados de prueba para los pacientes con enfermedad de Crohn
que participaron en este estudio. La tabla 23, a continuación,
contiene los datos clínicos y resultados de prueba para los
pacientes con síndrome del colon irritable que participaron en este
estudio.
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Había un total de 49 pacientes con enfermedad de
Crohn y 37 con colitis ulcerosa. En el grupo con enfermedad de
Crohn, un total del 55,1% de los pacientes era positivo para ASCA
fecal. En el grupo con colitis ulcerosa, el 13,5% era positivo. De
los 22 pacientes con SCI, un único paciente (4,6%) era positivo
para ASCA fecal. Los 12 controles sanos eran negativos. Un resumen
de los resultados positivos para ASCA fecal se muestra en la tabla
24.
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Cuando se distinguía la enfermedad de Crohn de
la colitis ulcerosa, el ASCA fecal mostraba una sensibilidad del
55,1% y una especificidad del 86,5%. Los valores positivo y
negativo de predicción eran del 84,4% y el 59,3%, respectivamente,
y la correlación era del 68,6% tal como se muestra a continuación
en la tabla 25.
Cuando se distinguía la enfermedad de Crohn de
colitis ulcerosa, síndrome del colon irritable y controles sanos,
el ASCA fecal mostraba una sensibilidad del 55% y una
especificidad del 91,6%. Los valores positivo y negativo de
predicción eran del 82% y el 75%, respectivamente, y la correlación
era del 77% tal como se muestra a continuación en la tabla 26.
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Se obtuvieron las densidades ópticas medias para
cada grupo y se sometieron a prueba las diferencias para determinar
la significación estadística usando una prueba de la t de dos
colas que da un resultado de valor p. De los 33 pacientes que
dieron un resultado positivo para el ASCA fecal, había 27 con EC, 5
con CU y 1 con SCI. La sensibilidad, especificidad y correlación
global eran del 55,1%, el 91,5% y el 76,7%, respectivamente. La EC
positiva para ASCA mostró una mayor media \pm DE de A450 de 1,183
\pm 0,794 en comparación con 0,382 \pm 0,113 para CU y la única
A450 de 0,0091 \pm 0,0038 para SCI. Había una diferencia
significativa entre la EC y todos los demás grupos de sujetos. Un
resumen del análisis estadístico se enumera en la tabla 27.
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La sensibilidad de la prueba del ASCA fecal
también se determinó usando diluciones en serie de dos veces de
anticuerpos ASCA altamente purificados. Para el análisis, se
generaron curvas patrón usando el diluyente del kit. La prueba era
positiva de manera constante a una concentración de 0,62 \mug/ml
tal como se determinó mediante un valor de absorbancia de punto de
corte de \geq 0,200. Los resultados individuales se muestran a
continuación en la tabla 28. Las curvas patrón se muestran en la
figura 1.
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También se realizaron pruebas para determinar
qué tipo de inmunoglobulinas (anticuerpos) estaba presente en una
muestra fecal y en suero. El tipificado de inmunoglobulinas se
realizó para la IgA humana, IgA_{sec} humana, IgD humana, IgM
humana e IgG humana. El tipificado de inmunoglobulinas se realizó
en una muestra fecal de 6 pacientes con enfermedad de Crohn y 2 con
colitis ulcerosa y en una muestra control en suero usando
conjugados específicos de tipo Ig absorbidos previamente. La
muestra control en suero se obtuvo de un paciente con una alergia
confirmada a Saccharomyces cerevisiae.
De los pacientes con enfermedad de Crohn, 5
pacientes mostraron una respuesta a la IgA e IgA_{sec}, 4
pacientes mostraron una respuesta a la IgM y un único paciente
mostró una respuesta a la IgG. De los 2 pacientes con colitis
ulcerosa, un único paciente reaccionó con el conjugado de Ig. El
control en suero sólo mostró una respuesta a las inmunoglobulinas
individuales IgM e IgG. Una respuesta a la IgA e IgA_{sec} se
produjo en las muestras fecales pero no en la muestra en suero
control. Un resumen de los resultados se muestra en la tabla
29.
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Se usó el inmunoensayo específico para ANCA para
diferenciar la colitis ulcerosa y otras enfermedades
gastrointestinales tales como la enfermedad de Crohn y el síndrome
del colon irritable midiendo el nivel de ANCA fecal total. Un
inmunoensayo cualitativo tal como un inmunoensayo ligado a enzimas
que utiliza tanto anticuerpos monoclonales como policlonales frente
al ANCA humano endógeno indicó la ausencia o presencia de colitis
ulcerosa. En el ensayo cualitativo de ejemplo, se diluyó la muestra
fecal 10 veces y se añadió a un pocillo que contenía los antígenos
de neutrófilos inmovilizados. Si estaba presente ANCA, se unía a
los antígenos durante la incubación a 37ºC. Tras la incubación, se
añadieron anticuerpos policlonales anti-Ig humana
acoplados a la enzima peroxidasa del rábano (conjugado) y se dejó
que se uniera al ANCA capturado. Entonces se eliminó por lavado el
conjugado no unido del pocillo y se añadió un sustrato componente
(tetrametilbenzideno y peróxido de hidrógeno) para el desarrollo de
color. Tras la incubación con sustrato, se añadió ácido sulfúrico
0,1 M para extinguir la reacción y se obtuvo la densidad óptica (DO)
espectrofotométricamente a 450 nm.
Usando el procedimiento descrito anteriormente,
se incorporaron un total de 98 pacientes con EII y estaban
compuestos por el 51% de hombres y el 49% de mujeres con un
intervalo de edad de 0 a 69 años. La razón aproximada de 1 a 1 es
similar a la razón observada en poblaciones de pacientes con EII.
El grupos de pacientes con SCI tenía un intervalo de edad de 5 a 39
años con el 57% de hombres y el 43% de mujeres. Los controles sanos
eran el 55% de hombres y el 45% de mujeres y comprendían el
intervalo de edad de 20 a 79 años. Los números individuales para
cada grupo de edad se muestran en la tabla 30.
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Había 51 pacientes con colitis ulcerosa, 47
pacientes con enfermedad de Crohn, 7 pacientes con colon irritable
y 11 adultos sanos reclutados para el estudio. Se recogieron
muestras fecales de cada paciente incluido y se almacenaron a -70ºC
hasta que se sometieron a prueba. La consistencia de las muestras
oscilaba desde sólida hasta líquida. Se determinó el nivel de ANCA
fecal usando el ELISA para ANCA cualitativo tal como se describió
anteriormente. Se definió la actividad de la enfermedad usando la
lactoferrina fecal elevada como indicador de la inflamación
intestinal. Se usó una dilución de 1:10 en el ANCA-CHEK
(ELISA cualitativo) y se notificaron los resultados como positivos
(valores de absorbancia \geq 0,140) o negativos (valores de
absorbancia < 0,140). Se determinaron las densidades ópticas
medias, la desviación estándar y los valores P (prueba de la T de
Student de dos colas con varianza desigual) para los pacientes con
colitis ulcerosa positivos para ANCA. De los 26 pacientes que
dieron un resultado positivo para ANCA fecal, había 4 con EC, 21
con CU y 1 persona sana. La CU positiva para ANCA mostró una
DO_{450} media \pm DE de 0,311 \pm 0,166. La DO media para los
pacientes con CU era significativamente diferente de SCI y las
personas sanas (valor p < 0,0005). Un resumen del análisis
estadístico se enumera en la tabla 31.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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En el grupo con EII, había 47 con enfermedad de
Crohn y 51 con colitis ulcerosa. En el grupo con colitis ulcerosa,
el 41% era positivo. En el grupo con enfermedad de Crohn, un total
del 9% de los pacientes era positivo mediante el ANCA-CHEK.
De las 11 personas sanas, 1 era positiva y los 7 pacientes con SCI
eran negativos mediante la prueba ANCA-CHEK. Un resumen de
los resultados positivos para el ANCA-CHEK se muestra en la
tabla 32 y los resultados individuales se enumeran en las tablas 33
a 34.
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Cuando se distinguía la colitis ulcerosa de la
enfermedad de Crohn, el ANCA-CHEK mostraba una sensibilidad
del 41% y una especificidad del 92%. Los valores positivo y
negativo de predicción eran del 84% y el 59%, respectivamente, y la
correlación era del 65% (Tabla 33).
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Cuando se distinguía la colitis ulcerosa del
síndrome del colon irritable y las personas sanas, el
ANCA-CHEK mostraba una sensibilidad del 41% y una
especificidad del 92%. Los valores positivo y negativo de
predicción eran del 81% y el 67%, respectivamente, y la correlación
era del 70% (Tabla 34).
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Se determinó la sensibilidad del
ANCA-CHEK usando diluciones en serie de dos veces de suero
humano positivo para ANCA. Para el análisis, se generaron curvas
patrón usando el diluyente de muestra. La prueba era positiva de
manera constante hasta un título de 0,063 tal como se determina
mediante un valor de absorbancia de punto de corte de \geq 0,200.
Los resultados individuales se muestran a continuación en la tabla
35 y las curvas patrón se muestran en la figura 2.
La tabla 36, a continuación, contiene los datos
clínicos y resultados de prueba para los pacientes con colitis
ulcerosa que participaron en el estudio. La tabla 37, a
continuación, contiene los datos clínicos y resultados de prueba
para los pacientes con enfermedad de Crohn que participaron en el
estudio. La tabla 38, a continuación, contiene los datos clínicos y
resultados de prueba para los pacientes con síndrome del colon
irritable que participaron en el estudio. La tabla 39, a
continuación, contiene los datos clínicos y resultados de prueba
para los pacientes sanos que participaron en el estudio.
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En resumen, la presente invención se refiere a
un método para la diferenciación de la enfermedad inflamatoria del
intestino (EII) de la enfermedad del colon irritable (SCI) seguido
de distinguir la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn de otras
enfermedades gastrointestinales. Este método altamente diferencial
usa por primera vez la presencia de lactoferrina fecal elevada como
marcador de la inflamación intestinal para diferenciar la EII del
SCI. Los pacientes de los que se sospecha que padecen EII se
analizan entonces para determinar los anticuerpos
anti-Saccharomyces cerevisiae (ASCA) fecales como indicador
de la enfermedad de Crohn y los anticuerpos citoplasmáticos
antineutrófilos {ANCA) fecales como indicador de la colitis
ulcerosa. Los pacientes con EII se monitorizan adicionalmente para
determinar la inflamación intestinal usando la lactoferrina fecal
para evaluar la eficacia del tratamiento médico y predecir una
recaída. El aparato consiste en o bien un inmunoensayo ligado a
enzimas cualitativo o bien otro inmunoensayo que utilice
anticuerpos específicos frente a lactoferrina endógena total, ASCA
y ANCA en heces humanas.
El personal sanitario puede usar el método y el
aparato para identificar la EII y distinguirla la colitis ulcerosa
y la enfermedad de Crohn de otras enfermedades gastrointestinales.
La presente invención se ha descrito en relación a realizaciones
particulares, que pretenden ser en todos los aspectos ilustrativas
más que restrictivas. Las realizaciones alternativas resultarán
evidentes para los expertos en la técnica a la que pertenece la
presente invención sin apartarse de su alcance.
Claims (29)
1. Método para someter a prueba una muestra de
una persona, comprendiendo el método: obtener una muestra fecal de
una persona; determinar si está presente lactoferrina en la
muestra; si es así, determinar si están presentes anticuerpos
anti-Saccharomyces cerevisiae (ASCA) y anticuerpos
citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA) en la muestra.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
la presencia de lactoferrina elevada se usa para ayudar en el
diagnóstico de la enfermedad inflamatoria del intestino.
3. Método según la reivindicación 2, en el que
la ausencia de lactoferrina elevada se usa para ayudar en el
diagnóstico del síndrome del colon irritable.
4. Método según la reivindicación 3, en el que
si la muestra contiene anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos,
puede llegarse sustancialmente a la conclusión de un diagnóstico de
colitis ulcerosa.
5. Método según la reivindicación 4, en el que
si la muestra contiene anticuerpos anti-Saccharomyces
cerevisiae puede llegarse sustancialmente a la conclusión de un
diagnóstico de la enfermedad de Crohn.
6. Método según la reivindicación 3, en el que
la presencia de anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos se usa
para ayudar en la diferenciación de colitis ulcerosa de la
enfermedad de Crohn.
7. Métodos según la reivindicación 4, en los que
la presencia de anticuerpos anti-Saccharomyces cerevisiae
se usa para ayudar en la diferenciación de la enfermedad de Crohn
de la colitis ulcerosa.
8. Método según la reivindicación 1, en el que
la lactoferrina, los anticuerpos anti-Saccharomyces
cerevisiae y los anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos se
miden usando uno de inmunoensayos ligados a enzimas, pruebas de
membrana de flujo lateral e inmunoensayos que utilizan anticuerpos o
fragmentos de captura.
9. Método según la reivindicación 1, en el que
la presencia de lactoferrina se determina mediante un ELISA
cuantitativo.
10. Método según la reivindicación 1, en el que
la presencia de lactoferrina se mide cuantitativamente.
11. Método según la reivindicación 1, que
comprende además: diluir la muestra.
12. Método según la reivindicación 11, que
comprende además: poner en contacto la muestra con anticuerpos
policlonales frente a lactoferrina endógena inmovilizados para crear
una muestra tratada.
13. Método según la reivindicación 12, que
comprende además: poner en contacto dicha muestra tratada con
anticuerpos policlonales ligados a enzimas para crear una muestra
legible.
14. Método según la reivindicación 13, que
comprende además: determinar la densidad óptica de dicha muestra
legible a 450 nm.
15. Método según la reivindicación 14, que
comprende además: generar una curva patrón de lactoferrina
purificada.
16. Método según la reivindicación 15, que
comprende además: comparar dicha densidad óptica de dicha muestra
legible con dicha curva patrón para determinar la concentración de
lactoferrina endógena en dicha muestra.
17. Método según la reivindicación 11, que
comprende además: poner en contacto la muestra con antígenos de
Saccharomyces cerevisiae para crear una muestra tratada.
18. Método según la reivindicación 17, que
comprende además: poner en contacto la muestra tratada con
anticuerpos polivalentes frente a inmunoglobulina humana conjugada
con un enzima para crear una muestra legible.
19. Método según la reivindicación 18, que
comprende además: determinar la densidad óptica de la muestra
legible.
20. Método según la reivindicación 11, que
comprende además: poner en contacto la muestra con antígenos
citoplasmáticos de neutrófilos para crear una muestra tratada.
21. Método según la reivindicación 20, que
comprende además: poner en contacto la muestra tratada con
anticuerpos polivalentes frente a inmunoglobulina humana para crear
una muestra legible.
22. Método según la reivindicación 21, que
comprende además: determinar una densidad óptica de la muestra
legible a 450 nm.
23. Método según la reivindicación 22, en el que
la presencia de los anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos se
usa para ayudar en la diferenciación de colitis ulcerosa de la
enfermedad de Crohn y otras enfermedades gastrointestinales.
24. Método para distinguir la enfermedad
inflamatoria del intestino del síndrome del colon irritable y para
diferenciar la colitis ulcerosa de la enfermedad de Crohn,
comprendiendo el método: obtener una muestra fecal de una persona;
determinar si está presente lactoferrina en la muestra; si es así,
determinar si están presentes anticuerpos anti-Saccharomyces
cerevisiae (ASGA) y anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos
(ANCA) en la muestra, diagnosticar a la persona síndrome del colon
irritable si no está presente lactoferrina elevada en la muestra;
diagnosticar a la persona enfermedad inflamatoria del intestino si
está presente lactoferrina en la muestra; diagnosticar a la
persona enfermedad de Crohn si están presentes anticuerpos
anti-Saccharomyces cerevisiae en la muestra; y diagnosticar
a la persona colitis ulcerosa si están presentes anticuerpos
citoplasmáticos antineutrófilos en la muestra.
25. Método según la reivindicación 24, en el que
la muestra es heces.
26. Método según la reivindicación 24, en el que
la muestra es uno de sangre completa, suero, plasma, saliva,
secreciones mucosas, líquido corporal y tejido corporal.
27. Método según la reivindicación 24, en el que
si está presente lactoferrina en la muestra, se monitoriza a la
persona para determinar los niveles cambiantes de lactoferrina como
indicador de la eficacia del tratamiento médico.
28. Kit para someter a prueba una muestra fecal
de una persona que va a diagnosticarse, comprendiendo el kit: una
pluralidad de placas de microensayo, en el que al menos una placa
contiene anticuerpos policlonales frente a lactoferrina humana
inmovilizados, al menos una placa contiene antígenos
citoplasmáticos de neutrófilos y al menos una placa contiene
antígeno de Saccharomyces cerevisiae; un anticuerpo
policlonal ligado a enzimas frente a lactoferrina humana;
anticuerpos polivalentes frente a inmunoglobulina humana; un
sustrato enzimático para el desarrollo de color.
29. Kit según la reivindicación 28, que
comprende además: una disolución de parada para extinguir la
reacción.
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