ES2325059T3 - Metodo para diferenciar el sindrome del intestino irritable de la enfermedad inflamatoria intestinal (ibd) y para seguir personas con ibd usando la lactoferrina endogena total como marcador. - Google Patents
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Abstract
Un método in vitro para distinguir el síndrome del intestino irritable de la enfermedad inflamatoria intestinal, comprendiendo el método: proporcionar una muestra fecal obtenida de una persona a diagnosticar; y determinar si dicha muestra contiene un nivel elevado de lactoferrina endógena, en el que si dicha muestra contiene un nivel elevado de lactoferrina endógena se excluyen diagnósticos de síndrome del intestino irritable y otras etiologías no inflamatorias.
Description
Método para diferenciar el síndrome del
intestino irritable de la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD)
y para seguir personas con IBD usando la lactoferrina endógena total
como marcador.
La presente invención se refiere a la
diferenciación clínica y al seguimiento de enfermedades
gastrointestinales. Más particularmente, la presente invención se
refiere a un método para contribuir a la diferenciación del
síndrome del intestino irritable de la enfermedad inflamatoria
intestinal por determinación del nivel de lactoferrina
humana endógena total en muestras clínicas, tales como heces, moco y
bilis, en las que un nivel elevado de lactoferrina excluye
sustancialmente el diagnóstico de IBS y otras etiologías no
inflamatorias, y un kit utilizable en dicho método. La presente
invención se refiere además a un método para cuantificar el nivel de
lactoferrina humana endógena total en muestras clínicas tales como
heces, moco y bilis, para seguir la inflamación gastrointestinal en
personas que tienen la enfermedad inflamatoria
intestinal.
Las enfermedades gastrointestinales son
responsables de una pérdida importante de vidas en todo el mundo.
Por ejemplo, la diarrea es una causa principal de morbilidad y
mortalidad en países en desarrollo con una estimación de mil
millones de casos de enfermedades diarreicas y cinco millones de
muertes en niños al año. En los Estados Unidos, de ocho a doce
millones de personas se tratan cada año para diarreas infecciosas,
que componen el 2,5% de las hospitalizaciones totales y dan como
resultado 10.000 muertes. Otras enfermedades gastrointestinales
incluyen la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) y el
síndrome del intestino irritable (IBS). La evaluación anual de
estos trastornos en los Estados Unidos da como resultado 1 y 3,5
visitas médicas, respectivamente. Los síntomas del IBS activo y los
de la IBD activa son similares y, por consiguiente, las dos
enfermedades se presentan con frecuencia de una forma casi idéntica.
Sin embargo, la IBD puede ser una afección grave potencialmente
mortal y, por lo tanto, es extremadamente importante un diagnóstico
diferencial rápido y exacto.
La IBD, compuesta tanto por la enfermedad de
Crohn (CD) como por la colitis ulcerosa (UC), se caracteriza por
una respuesta inflamatoria inmunomediada crónica que da como
resultado lesiones histológicas en el revestimiento intestinal.
Tanto la CD como la UC presentan grandes números de leucocitos que
migran a la mucosa y hacia la luz intestinal. Ambas enfermedades
oscilan entre las fases activa (es decir, presencia de inflamación
intestinal) e inactiva (es decir, de mínima a ninguna inflamación
intestinal) de actividad de la enfermedad. La IBD activa puede
incluir síntomas tales como diarrea sanguinolenta, dolor abdominal y
fiebre. La fase inactiva presenta de mínima a ninguna inflamación
intestinal y carece de enfermedad gastrointestinal grave.
Los pacientes que tienen IBD activa pero que
presentan signos y síntomas moderados pueden ser difíciles de
distinguir de los pacientes con IBS activo, un trastorno intestinal
de la motilidad y del sistema nervioso intestinal. A diferencia de
la IBD, el IBS no implica inflamación intestinal. En personas con
IBS, el intestino parece normal bajo examen endoscópico y no hay
leucocitos presentes en la mucosa o en las muestras fecales. Los
síntomas pueden imitar los de la IBD e incluir hinchamiento,
diarrea, estreñimiento y dolor abdominal grave y, con frecuencia,
debilitante. Se estima que al menos 35 millones de norteamericanos
padecen IBS.
La similitud en síntomas entre el IBS y la IBD
hacen el diagnóstico rápido muy difícil. Sin embargo, dada la
gravedad potencial de la IBD sin tratar, es crucial un diagnóstico
diferencial. El diagnóstico de enfermedades gastrointestinales, en
general, se sirve de ensayos de diagnóstico tales como ensayos
inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), aglutinación con látex
e inmunoensayo de flujo lateral. Estos ensayos son métodos rápidos
y económicos para detectar marcadores en heces para patógenos
entéricos e inflamación. Un marcador de interés particular que se
ha descubierto que es el más específico para leucocitos en muestras
fecales es la lactoferrina. La lactoferrina humana es una
glicoproteína de 80 kilodaltons. Esta proteína de unión a hierro se
secreta por la mayoría de las membranas mucosas. Es un componente
principal de los gránulos secundarios que se encuentran en
neutrófilos polimorfonucleares (PMN), un componente primario de la
respuesta inflamatoria aguda. Otras células hematopoyéticas, tales
como monocitos y linfocitos, no contienen lactoferrina, mientras que
diversas secreciones corporales contienen niveles en el intervalo
de mg/ml. Durante el proceso de la inflamación, los PMN infiltran
el revestimiento de la mucosa del intestino delgado y grueso. Este
aumento en el número de leucocitos tisulares activados y la
exudación de plasma de la mucosa ulcerada dan como resultado un
aumento en el nivel de lactoferrina que se encuentra en las heces.
La proteína es resistente a proteolisis y, como tal, proporciona un
marcador fecal no invasivo útil de inflamación intestinal.
Se ha usado la lactoferrina humana como un
marcador para leucocitos fecales en varias aplicaciones. Por
ejemplo, se ha usado la lactoferrina fecal como marcador para
leucocitos para distinguir una diarrea no inflamatoria de una
diarrea inflamatoria, como se describe en la Patente de Estados
Unidos Nº 5.124.252. La diarrea no inflamatoria causada por agentes
tales como rotavirus, agentes tipo Norwalk y cólera, causa
típicamente de mínimas a ninguna lesión intestinal y los pacientes
responden fácilmente a la rehidratación oral. Las diarreas
inflamatorias incluyen las causadas por patógenos entéricos tales
como Clostridium difficile, especies de Shigella,
especies de Salmonella, Campylobacter jejuni y
Entamoeba histolytica, y las que no tienen un agente
infeccioso claramente definido tales como la CD y la UC. La Patente
de Estados Unidos Nº 5.124.252 describe un ensayo in vitro
para leucocitos fecales que ayuda a diferenciar una diarrea
inflamatoria de una no inflamatoria. La patente 5.124.252 describe
el ensayo de muestras fecales que se sospecha que contienen
leucocitos con un ensayo que utiliza un anticuerpo para lactoferrina
para determinar la presencia de leucocitos en la muestra fecal.
También se ha usado lactoferrina humana como
marcador para el diagnóstico de trastornos gastrointestinales
inflamatorios, pólipos de colon y cáncer colorrectal, como se
describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.552.292. Sin embargo,
ni el método de la patente 5.124.252 ni el de la patente 5.552.292
describen utilidad en la diferenciación entre IBS e IBD. Las
muestras ensayadas por el ensayo de la patente 5.124.252 son
muestras sospechosas de contener leucocitos. Esta sospecha se debe
a que el paciente presenta diarrea. Sin embargo, el
25-50% de las personas que tienen IBD no presentan
diarrea y, por lo tanto, la patente 5.124.252 no se refiere al
diagnóstico de la etiología en dichos pacientes. Como para la
patente 5.552.292, el método descrito utiliza una dilución de la
muestra 1:100 que no permite una cuantificación precisa de los
niveles de lactoferrina. Además, la patente 5.552.292 describe el
uso de formas parciales de moléculas para el ensayo, y no la
lactoferrina endógena total, afectando de nuevo a la precisión de
la cuantificación. El método de la patente 5.552.292 tampoco se
refiere a utilizar los niveles de lactoferrina para distinguir entre
IBD e IBS. La población ensayada en la patente 5.552.292, aunque
incluye a personas con UC y CD, no incluye a personas que tienen
IBS. Por lo tanto, continúa existiendo la necesidad en la industria
del diagnóstico de un método no invasivo para diagnosticar de forma
diferencial la IBD y el IBS, que utilice la lactoferrina humana como
marcador.
Dado que se ha demostrado que la lactoferrina es
un buen marcador para leucocitos fecales, se han desarrollado
ensayos para ayudar a los médicos a determinar la presencia de
lactoferrina fecal. Un ensayo de este tipo es el
LEUKO-TEST®, fabricado por TechLab, Inc. de
Blacksburg, Virginia. El LEUKO-TEST® es un ensayo
de aglutinación con látex para detectar la lactoferrina fecal. No es
invasivo y demuestra una inflamación intestinal activa,
proporcionando de este modo a los médicos que están evaluando a
pacientes con diarrea una información importante en lo que se
refiere a la gravedad de cualquier infección bacteriana
subyacente.
Aun cuando el LEUKO-TEST® es
útil para evaluar enfermedades gastrointestinales, el formato de
aglutinación con látex proporciona algunas limitaciones. En grandes
hospitales con un gran volumen de muestras, se prefiere el
procesamiento en lotes. Un formato tal como el ELISA es más útil
para el procesamiento en lotes que la aglutinación con látex y
tiene la opción de la automatización. También puede indicar la
gravedad de la enfermedad y la eficacia de los tratamientos
médicos, por medición de los niveles de lactoferrina fecal. En el
caso de la IBD, un aumento en la lactoferrina fecal puede
proporcionar un indicador temprano de una enfermedad activa y los
efectos de los tratamientos médicos.
Actualmente, no existen ayudas de diagnóstico
in vitro conocidas para ayudar a los médicos que realizan el
tratamiento, u otro personal clínico, a diferenciar entre IBD e IBS.
Por consiguiente, continúa existiendo la necesidad de una ayuda de
diagnóstico in vitro para ayudar a los médicos que realizan
el tratamiento y otro personal clínico a diferenciar entre estas
dos enfermedades que se presentan comúnmente.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un método no invasivo para diferenciar el síndrome del
intestino irritable (IBS) de la enfermedad inflamatoria
intestinal (IBD), en el que la presencia de lactoferrina
fecal se usa como un marcador de detección para leucocitos fecales,
cuyos niveles elevados excluyen diagnósticos de IBS y otras
etiologías no inflamatorias. Este diagnóstico rápido puede
utilizarse después por los profesionales de la atención sanitaria
para prescribir el tratamiento apropiado. Se describen inmunoensayos
adicionales, por ejemplo, inmunoensayos ligados a enzimas (ELISA),
que utilizan anticuerpos específicos para lactoferrina humana para
la medición de la lactoferrina endógena total en muestras clínicas,
tales como heces, moco y bilis humana, y un kit utilizable en
dichos inmunoensayos. Todavía adicionalmente, se describen métodos
para cuantificar los niveles de lactoferrina de fuentes
endó-
genas, particularmente leucocitos infiltrantes, para seguir la inflamación gastrointestinal en personas que tienen IBD.
genas, particularmente leucocitos infiltrantes, para seguir la inflamación gastrointestinal en personas que tienen IBD.
Se ha demostrado que la lactoferrina fecal tiene
utilidad como marcador para distinguir pacientes con IBD de los que
tienen un IBS menos grave. Para ayudar a los médicos y otro personal
clínico en la utilización de este descubrimiento, se describen en
este documento inmunoensayos para detectar niveles elevados de
lactoferrina fecal y para cuantificar los niveles de lactoferrina
fecal. En concreto, se describen un ensayo inmunoabsorbente ligado
a enzimas (ELISA) cualitativo en el que se utilizan anticuerpos
policlonales contra la lactoferrina humana endógena total para
detectar niveles elevados de lactoferrina fecal. El ensayo
cualitativo permite la exploración de pacientes que presentan
síntomas comunes entre el IBS y la IBD. Si se detectan niveles
elevados de lactoferrina fecal, se excluye el diagnóstico de IBS.
Se entenderá y apreciará por los especialistas en la técnica que
también puede usarse un inmunoensayo cualitativo tal como una
varilla de flujo lateral que utiliza anticuerpos tanto monoclonales
como policlonales contra la lactoferrina endógena total para indicar
la ausencia o presencia de una inflamación gastrointestinal.
El ensayo cualitativo proporciona un ensayo que
es fácil de usar, sencillo de leer y preciso para distinguir la IBD
activa del IBS activo. Para confirmar la equivalencia del ELISA con
dispositivos precedentes, se han comparado los resultados de ensayo
con los resultados de microscopía y con los resultados del ensayo de
aglutinación con látex fabricado por TechLab, Inc. de Blacksburg,
Virginia, bajo el nombre comercial LEUKO-TEST®. Con
este fin, se realizaron dos estudios que implicaban un total de 166
muestras fecales. Cuando se comparaba con la microscopía, el ensayo
de la presente invención presentaba una sensibilidad del 80,0% en el
primer estudio y del 94,1% en el segundo estudio. El ensayo
presentaba adicionalmente una especificidad del 90,0% en el primer
estudio y del 51,7% en el segundo estudio. En los mismos estudios,
cuando se comparaba con el LEUKO-TEST®, los
resultados de sensibilidad eran del 92,5% en el primer estudio y del
89,6% en el segundo estudio. Los resultados de especificidad eran
del 86,4% en el primer estudio y del 57,5% en el segundo
estudio.
Para la evaluación del ensayo cualitativo de la
presente invención como una ayuda de diagnóstico para pacientes con
IBD e IBS, se recogieron muestras fecales de sujetos que tenían IBD
y los resultados de ensayo se compararon con los de sujetos de
control sanos y sujetos que presentaban casos clínicamente definidos
de IBS. El grupo de IBD incluía sujetos que tenían tanto colitis
ulcerosa (UC) como enfermedad de Crohn (CD). Los niveles de
lactoferrina fecal determinados en estos sujetos se usaron para
establecer la densidad óptica predictiva preferida para el ensayo
de DO_{450} de 0,200. Los resultados indicaban que el ensayo era
positivo (es decir, una DO_{450} superior a o igual a 0,200) para
el 86,0% de las muestras fecales de sujetos con IBD activa y era
sistemáticamente negativo (es decir, una DO_{450} menor de 0,200)
para muestras de sujetos con IBS activo y de sujetos de control
sanos. (La "DO_{450}", como se usa en este documento, indica
una densidad óptica medida a 450 nm en un espectrofotómetro de una
sola longitud de onda).
En una evaluación clínica adicional, el ensayo
cualitativo se comparó con evaluaciones clínicas de sujetos con IBD
e IBS activo. En el grupo de IBD, había noventa y dos sujetos con
enfermedad activa (cincuenta y uno con CD activa y cuarenta y uno
con UC activa) y cincuenta y siete con enfermedad inactiva. En el
grupo activo, un total de ochenta sujetos, o el 87,0%, dieron
positivo con el ensayo. En el grupo inactivo, treinta y dos, o el
56,1%, dieron positivo en el ensayo. De los cincuenta y un sujetos
con IBD con CD activa, cuarenta y cuatro, o el 86,3%, dieron
positivo en el ensayo. De los cuarenta y un sujetos con IBD con UC
activa, treinta y seis, o el 87,8%, dieron positivo con el ensayo.
Los treinta y un sujetos, o el 100%, con IBS activa y los cincuenta
y seis sujetos de control sanos, o el 100%, dieron negativo con el
ensayo.
Los descubrimientos de investigación respaldan
por lo tanto el uso del ensayo cualitativo como una ayuda de
diagnóstico in vitro para detectar niveles elevados de
lactoferrina como marcador de detección para leucocitos fecales y
como indicador de inflamación. Otras enfermedades intestinales,
incluyendo muchas infecciones gastrointestinales y cáncer
colorrectal, dan como resultado con frecuencia niveles elevados de
lactoferrina en muestras fecales, y estas muestras probablemente
darán positivo en el ensayo. Por lo tanto, no puede establecerse un
diagnóstico de IBD activa solamente en base a un resultado positivo
con el ensayo de la presente invención. Sin embargo, un resultado
positivo con el ensayo de la presente invención permitirá la
exclusión de un diagnóstico de IBS u otras etiologías no
inflamatorias.
También se describe un ELISA cuantitativo en el
que se utilizan anticuerpos policlonales contra lactoferrina humana
endógena total para cuantificar los niveles de inflamación
gastrointestinal a través de la comparación con una curva patrón
generada usando lactoferrina humana purificada. Después, estos
niveles pueden utilizarse para seguir los efectos de tratamientos
médicos en pacientes que tienen IBD.
En el ensayo cuantitativo, el nivel de
lactoferrina humana endógena total en muestras clínicas se determina
por comparación con una curva patrón generada usando lactoferrina
humana purificada y analizada por regresión lineal. Los
descubrimientos de investigación muestran que el nivel de
lactoferrina fecal en personas que tienen IBS era inferior que el
nivel medio de lactoferrina fecal determinado en personas sanas,
indicando la ausencia de inflamación gastrointestinal. Sin embargo,
los niveles de lactoferrina fecal en pacientes con IBD determinados
usando el ensayo cuantitativo eran significativamente superiores que
el nivel medio de lactoferrina fecal de personas sanas. Por lo
tanto, el ensayo cuantitativo permitirá el seguimiento de pacientes
que tienen IBD, ya que pueden determinarse los niveles de
lactoferrina fecal a lo largo del transcurso de tratamientos médicos
para determinar si el tratamiento es o no eficaz en la disminución
o eliminación de la inflamación gastrointestinal.
La presente invención se refiere a métodos de
ensayo de diagnóstico para ayudar a diferenciar el síndrome del
intestino irritable (IBS) de la enfermedad inflamatoria
intestinal (IBD).
El método de ensayo de diagnóstico cualitativo
de la presente invención es un inmunoensayo para la detección de
niveles elevados de lactoferrina, un marcador de detección para
leucocitos fecales y un indicador de inflamación intestinal. El
método puede usarse como una ayuda de diagnóstico in vitro
para ayudar a identificar pacientes con IBD activa y descartar los
que tienen IBS activo, que no es inflamatorio. Los inmunoensayos
específicos de lactoferrina pueden usarse para diferenciar IBS de
IBD midiendo el nivel de lactoferrina endógena total. La
"lactoferrina endógena total", como se usa esa expresión en
este documento, comprende lactoferrina procedente de fuentes
endógenas, particularmente leucocitos infiltrantes (es decir,
leucocitos, plasma, bilis y secreciones mucosas).
Los siguientes son ejemplos de procedimientos
que se han utilizado para establecer los ensayos cualitativos y
cuantitativos preferidos de acuerdo con la presente invención. Los
siguientes ejemplos son meramente ejemplares y no se presentan a
modo de limitación.
El ensayo de la presente invención se diseñó y
desarrolló para detectar niveles de lactoferrina fecal a un nivel
inferior al detectable por dispositivos precedentes, específicamente
el LEUKO-TEST®. El límite de detección inferior
del LEUKO-TEST® es de 256 ng/ml con lactoferrina
humana purificada. En el LEUKO-TEST®, una dilución
de muestra de 1:50 y un límite de detección mínimo de 256 ng/ml
proporcionan un límite de detección inferior en muestras fecales de
aproximadamente 12 \mug/ml. Una dilución de muestra de 1:400 y un
límite de detección mínimo para el ensayo de la presente invención
de 32 ng/ml también proporcionan un límite de detección inferior en
muestras fecales de aproximadamente 12 \mug/ml. Por consiguiente,
se seleccionó una dilución de muestra de 1:400 para el ensayo de la
presente invención. De forma similar, se selecciona una densidad
óptica de DO_{450} de 0,200 para el ensayo. (Como se usa en este
documento, la DO_{450} indica una densidad óptica obtenida
espectrofotométricamente a 450 nm en un espectrofotómetro de una
sola longitud de onda).
Se entenderá y apreciará por los especialistas
en la técnica que el factor de dilución y las densidades ópticas
preferidas se han determinado basándose en los reactivos actualmente
disponibles y considerados como óptimos. Sin embargo, pueden
mejorarse y volverse deseables con el tiempo reactivos distintos de
los deseados actualmente. Las variaciones en los reactivos pueden
producir factores de dilución y/o densidades ópticas
preferibles/óptimas distintas de las determinadas en este
documento. Se contemplan que dichas variaciones se incluyan en el
alcance de la presente invención. La clave para determinar los
valores óptimos se basa en la sensibilidad como se describe más
completamente a continuación.
Para verificar que la dilución de muestra 1:400
proporciona la sensibilidad más deseable con los reactivos
actuales, se analizaron 121 muestras fecales que comparaban una
dilución 1:400 con una dilución 1:800. (La sensibilidad se calcula
en este documento dividiendo el número de muestras tomadas de
sujetos con IBD que producen un resultado positivo en el ensayo
entre el número de muestras tomadas de sujetos con IBD). Se
evaluaron adicionalmente los resultados de ensayo comparando los
valores de DO_{450} de 0,200 con los valores de DO_{450} de
0,300. Los resultados se compararon con microscopía para leucocitos
fecales y con el LEUKO-TEST®. Los resultados se
resumen en las Tablas I-VIII a continuación.
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En resumen, una dilución de muestra fecal de
1:400 y una DO_{450} de ensayo de 0,200 mostraban el nivel de
sensibilidad más elevado con los reactivos actuales. Por
consiguiente, se determinó que estas condiciones eran óptimas para
el ensayo de la presente invención. Las muestras fecales normales
contienen bajos niveles de lactoferrina y se ha determinado que las
diluciones 1:400 son óptimas en la detección de un aumento en la
lactoferrina sobre los niveles de fondo. El uso de diluciones
inferiores a 1:400 puede dar como resultado resultados de ensayo
positivos debido a la presencia de niveles de lactoferrina
normales.
Los procedimientos de recogida y manipulación
convencionales usados típicamente para muestras fecales para
cultivo pueden usarse en la recogida de muestras para el ensayo de
la presente invención. En la realización preferida, se ensayarán
muestras fecales en las veinticuatro horas siguientes a su recogida.
Sin embargo, si el ensayo no se va a realizar en las cuarenta y
ocho horas siguientes a la recogida, se prefiere que las muestras
se almacenen a
-20ºC o menos. Además, se prefiere que las muestras recogidas se transporten y se diluyan en el Diluyente tan pronto como sea posible después de la recogida y, una vez diluidas, que las muestras se almacenen a entre aproximadamente 2ºC y aproximadamente 8ºC. Se prefiere que las muestras se mezclen (es decir, usando una mezcladora vorticial) minuciosamente antes de realizar el ensayo de la presente invención. Esto incluye la mezcla completa de la muestra antes de la transferencia al Diluyente, como se describe más completamente a continuación, así como la mezcla completa de la muestra diluida antes de realizar el ensayo.
-20ºC o menos. Además, se prefiere que las muestras recogidas se transporten y se diluyan en el Diluyente tan pronto como sea posible después de la recogida y, una vez diluidas, que las muestras se almacenen a entre aproximadamente 2ºC y aproximadamente 8ºC. Se prefiere que las muestras se mezclen (es decir, usando una mezcladora vorticial) minuciosamente antes de realizar el ensayo de la presente invención. Esto incluye la mezcla completa de la muestra antes de la transferencia al Diluyente, como se describe más completamente a continuación, así como la mezcla completa de la muestra diluida antes de realizar el ensayo.
Se usó el siguiente método para preparar una
muestra diluida a partir de una muestra fecal líquida. Se prepararon
dos tubos de plástico para cada muestra a ensayar. Para cada
muestra, se añadieron posteriormente 950 \mul de Diluyente 1X
(preparado como se describe más completamente a continuación) a cada
uno de los dos tubos. Usando una pipeta de transferencia, se añadió
una gota (es decir, aproximadamente 50 \mul) de muestra fecal
líquida a uno de los tubos y se mezcló minuciosamente usando una
mezcladora vorticial. Posteriormente, se transfirió una gota de la
muestra diluida al segundo tubo, que contenía 950 \mul de
Diluyente 1X (preparado como se describe más completamente a
continuación). El resultado era una dilución 1:400 de la muestra en
el segundo tubo. Por lo tanto, se usó solamente el segundo tubo
durante el resto del procedimiento de ensayo.
Se usó el siguiente método para preparar una
muestra diluida a partir de una muestra fecal formada o sólida. Se
prepararon dos tubos de plástico para cada muestra a ensayar. Para
cada muestra, se añadieron 1,9 ml de Diluyente 1X (preparado como
se describe más completamente a continuación) a sólo uno de los dos
tubos. Posteriormente, se añadieron 0,10 g de muestra fecal a este
tubo y se mezclaron minuciosamente usando una mezcladora vorticial.
A continuación, se añadieron 950 \mul del Diluyente 1X (preparado
como se describe más completamente a continuación) al segundo tubo
y se transfirió una gota (es decir, aproximadamente 50 \mul) de la
muestra previamente diluida al segundo tubo. El resultado era una
dilución 1:400 de la muestra en el segundo tubo. Por lo tanto, se
usó solamente el segundo tubo durante el resto del procedimiento de
ensayo.
La muestra en el segundo tubo preparada de
acuerdo con cualquiera de los procedimientos anteriores se mezcló
en una mezcladora vorticial durante aproximadamente diez segundos y
posteriormente se almacenó a entre aproximadamente 2ºC y
aproximadamente 8ºC hasta que se realizó el resto del procedimiento
de ensayo. Antes de transferir la muestra diluida a un pocillo de
microtitulación de acuerdo con el procedimiento de ensayo, como se
describe más completamente a continuación, la muestra se mezcló
minuciosamente en la mezcladora vorticial otra vez. Este
procedimiento buscaba asegurar una mezcla minuciosa de la
muestra.
Eran necesarios varios reactivos para realizar
la realización preferida del ensayo cualitativo de la presente
invención. Estos reactivos incluían Diluyente 10X, Diluyente 1X,
Conjugado, Sustrato, Control Positivo, Solución Tampón de Lavado y
Solución de Parada. El Diluyente 10X era un concentrado 10X de una
solución de proteínas tamponada que contenía timerosal al 0,2% como
conservante. El Diluyente se suministró como un concentrado 10X.
Por lo tanto, para preparar el Diluyente 1X necesario para el ensayo
de la presente invención, se diluyó un volumen total de 400 ml por
adición de 40 ml del concentrado 10X a 360 ml de agua desionizada.
Cualquier diluyente 1X sin usar se almacenó a entre aproximadamente
2ºC y aproximadamente 8ºC.
El Conjugado usado con el ensayo de la presente
invención comprende preferiblemente anticuerpo policlonal de conejo
específico para lactoferrina humana conjugado con peroxidasa de
rábano picante, y en una solución de proteínas tamponada que
contiene timerosal al 0,02% como conservante. El Sustrato usado con
el ensayo de la presente invención comprende preferiblemente una
solución que contiene sustrato de
tetra-metil-bencidina y peroxidasa.
El Control Positivo usado con el ensayo de la presente invención
comprende preferiblemente lactoferrina humana en una solución de
proteínas tamponada que contiene timerosal al 0,02% como
conservante. La Solución de Parada usada con el ensayo de la
presente invención comprende preferiblemente ácido sulfúrico 0,6
N.
La Solución Tampón de Lavado usada con el ensayo
de la presente invención se suministró como un concentrado 20X que
contenía solución salina tamponada con fosfato, detergente y
timerosal al 0,2% como conservante. Para preparar la Solución de
Lavado 1X necesaria para el ensayo de la presente invención, se
diluyó un volumen total de un litro de concentrado por adición de
50 ml del concentrado a 950 ml de agua desionizada. Cualquier
Solución de Lavado 1X sin usar se almacenó a entre aproximadamente
2ºC y aproximadamente 8ºC.
Se prefieren para el ensayo de la presente
invención placas de microensayo que contienen doce tiras y ocho
pocillos por tira. Cada muestra y cada control requieren un solo
pocillo recubierto. Para preparar las placas, cada tira se recubrió
con anticuerpo policlonal purificado específico para lactoferrina.
Las placas de microensayo se almacenaron con desecante.
Todos los reactivos se almacenaron a temperatura
ambiente antes del uso en el ensayo de la presente invención.
La presente invención incluye un kit diseñado y
preparado para realizar el ensayo cuantitativo. En la realización
preferida, el kit contiene 40 ml de Diluyente 10X, 7 ml de
Conjugado, 14 ml de Sustrato, 3,5 ml de Control Positivo, 50 ml de
Solución Tampón de Lavado, 7 ml de Solución de Parada y una placa de
microensayo almacenada con desecante. El ensayo de la presente
invención utiliza anticuerpos contra lactoferrina humana. La placa
de microensayos suministrada con el kit contiene anticuerpo
policlonal inmovilizado contra lactoferrina. El anticuerpo de
detección consiste en un anticuerpo policlonal conjugado con
peroxidasa de rábano picante.
Para realizar el ensayo cualitativo de la
presente invención, se determinó inicialmente el número de pocillos
necesarios. Cada muestra o control requería un pocillo y, por lo
tanto, el número de pocillos se determinó en consecuencia. A
continuación, se añadió una gota (es decir, aproximadamente 50
\mul) de Control Positivo a un solo pocillo designado como
Pocillo de Control Positivo y se añadió una gota (es decir,
aproximadamente 50 \mul) de Diluyente 1X a un solo pocillo
designado como Pocillo de Control Negativo. Posteriormente, se
añadieron dos gotas (es decir, aproximadamente 100 \mul) de
muestra diluida 1:400 (preparado de acuerdo con el procedimiento
anterior) a un tercer pocillo y todos los pocillos se incubaron a
aproximadamente 37ºC (\pm2ºC) durante aproximadamente treinta
minutos. Después de la incubación, el contenido de los pocillos de
ensayo se desechó en un recipiente de desecho.
A continuación, se lavó cada pocillo usando
Solución de Lavado 1X (preparada como se ha descrito anteriormente)
y dispuesta en un frasco lavador con una boquilla de punta fina. De
esta forma, la Solución de Lavado 1X se dirigía hacia el fondo de
cada uno de los pocillos con cierta fuerza. Cada pocillo se rellenó
con la Solución de Lavado 1X y el contenido del mismo se desechó
posteriormente en un recipiente de desecho. La placa de microensayo
se invirtió y se sacudió después en una toalla de papel secante.
Este procedimiento de lavado se realizó un mínimo de cuatro veces
usando una toalla de papel secante cada vez. Si se observaba
cualquier materia particulada en los pocillos, se continuaba con el
procedimiento de lavado hasta que se eliminaba la materia.
Posteriormente, se añadió una gota (es decir,
aproximadamente 50 \mul) de Conjugado a cada pocillo y los
pocillos se incubaron a aproximadamente 37ºC (\pm2ºC) durante
aproximadamente treinta minutos. Después de la incubación, se
desechó el contenido de los pocillos de ensayo en un recipiente de
desecho y se repitió el procedimiento de lavado. A continuación, se
añadieron dos gotas (es decir, aproximadamente 100 \mul) de
sustrato a cada pocillo y los pocillos se golpearon suavemente para
mezclar el contenido. Los pocillos se incubaron después a
temperatura ambiente durante apro-
ximadamente quince minutos. Los pocillos se golpearon suavemente varias veces durante el periodo de incubación.
ximadamente quince minutos. Los pocillos se golpearon suavemente varias veces durante el periodo de incubación.
A continuación, se añadió una gota (es decir, 50
\mul) de Solución de Parada a cada pocillo y los pocillos se
golpearon suavemente. Los pocillos se dejaron reposar a temperatura
ambiente durante aproximadamente dos minutos antes de la lectura.
La adición de Solución de Parada convertía el color azul en un color
amarillo que después podía cuantificarse midiendo la densidad
óptica a 450 nm en un lector de ELISA de microplacas. El
instrumento se calibró frente al control negativo y la parte
inferior de cada pocillo se limpiaba antes de medir la densidad
óptica. Se registraron las densidades ópticas (DO_{450} y
DO_{450/620}) para el Pocillo de Control Positivo, el Pocillo de
Control Negativo y cada muestra ensayada. (La "DO_{450/620}",
como se usa en este documento, indica una densidad óptica obtenida
espectrofotométricamente 450/620 nm o en un espectrofotómetro de
doble longitud de onda). Se calculó el promedio de lecturas de
pocillos por duplicado antes de que se interpretaran los
resultados.
El procedimiento de ensayo especificado
representa la realización preferida ya que se obtienen resultados
óptimos siguiendo el procedimiento especificado puesto que los
reactivos, concentraciones, condiciones de incubación y
especificaciones de procesamiento se han optimizado para
sensibilidad y especificidad. Por consiguiente, las alteraciones
del procedimiento especificado y/o de las condiciones de ensayo
indicadas pueden afectar a la sensibilidad y especificidad del
ensayo.
El control positivo y negativo debe cumplir
ciertos criterios para que el ensayo sea válido. En primer lugar,
el Pocillo de Control Positivo debe ser de un color amarillo visible
y, cuando se lea en un espectrofotómetro, debe tener una DO_{450}
y una DO_{450/620} > 0,500. El Pocillo de Control Negativo debe
tener una DO_{450} < 0,200 o una DO_{450/620} < 0,160.
Para asegurar que no se ha producido arrastre de impurezas, el
ensayo debería repetirse si una muestra da un resultado positivo
débil (es decir, < 0,400) y está adyacente a un pocillo positivo
fuerte.
Se midieron las densidades ópticas a 450 nm en
un espectrofotómetro de una sola longitud de onda y a 450/620 nm en
un espectrofotómetro de doble longitud de onda. En un
espectrofotómetro de una sola longitud de onda, una DO_{450} de
menos de 0,200 indicaba un resultado negativo y una DO_{450} de
más de o igual a 0,200 indicaba un resultado positivo. En un
espectrofotómetro de doble longitud de onda, una DO_{450/620} de
menos de 0,160 indicaba un resultado negativo y una DO_{450/620}
de más de o igual a 0,160 indicaba un resultado positivo. Un
resultado de ensayo positivo indicaba que la muestra contenía
niveles elevados de lactoferrina cuando se comparaba con un valor
de referencia establecido para sujetos de control sanos. Un
resultado de ensayo negativo indicaba que la muestra no contenía
niveles elevados de lactoferrina con respecto a muestras de sujetos
de control sanos.
Ciento cuarenta y nueve sujetos que tenían IBD
se ensayaron de acuerdo con el procedimiento anterior. Setenta y
siete de los sujetos, o el 51,7%, eran masculinos y setenta y dos de
ellos, o el 48,3%, eran femeninos. La relación de sujetos
masculinos respecto a femeninos ensayados se aproxima estrechamente
a la relación 1:1 observada en la población general de pacientes
con IBD. Las edades de los sujetos oscilaban de 3 años a 78 años y
treinta y dos sujetos, o el 22%, eran de 16 años de edad o más
jóvenes. Setenta y siete sujetos, o el 51,7%, tenían CD y setenta y
dos de ellos, o el 48,3%, tenían UC.
Se ensayaron treinta y un sujetos que tenían
IBS. Seis de los sujetos, o el 19,3%, eran masculinos y veinticinco
de ellos, o el 80,7%, eran femeninos. La relación de sujetos
masculinos respecto a femeninos ensayados se aproxima estrechamente
a la relación 1:3 observada en la población general con IBS. Las
edades de los sujetos oscilaban de 19 años a 78 años.
También se ensayaron cincuenta y seis sujetos
sanos como controles. Veintiocho de los sujetos, o el 50%, eran
masculinos y veintiocho de ellos, o el 50%, eran femeninos. Las
edades de los sujetos oscilaban desde lactantes hasta los 79 años.
Se ilustra un resumen de la población de sujetos ensayados en la
Tabla IX.
Se recogieron muestras fecales de cada sujeto
inscrito y se almacenaron a -70ºC hasta que se ensayaron. Las
consistencias de las muestras oscilaban de líquida a sólida,
ilustrándose números de las mismas en la Tabla X para cada grupo de
sujetos. Como puede observarse, cuarenta y cinco de las muestras de
IBD eran muestras líquidas, sesenta y dos eran muestras
semi-sólidas y cuarenta y dos eran muestras sólidas.
Una de las muestras de IBS era una muestra líquida, trece eran
muestras semi-sólidas y diecisiete eran muestras
sólidas. Todas las muestras de sujetos de control sanos eran
sólidas.
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El nivel de lactoferrina fecal en cada muestra
se determinó usando el ELISA cualitativo de lactoferrina como se ha
descrito anteriormente. Se usó una dilución de muestra de 1:400. Los
resultados se describieron como positivos si se observaba una
densidad óptica de más de o igual a 0,200. Por el contrario, los
resultados se describieron como negativos si se observaba una
densidad óptica de menos de 0,200.
Del grupo de sujetos con IBD, noventa y dos
sujetos tenían enfermedad activa y cincuenta y siete tenían
enfermedad inactiva. Del grupo activo, un total de ochenta sujetos,
o el 87,0%, dieron positivo en el ensayo. Del grupo inactivo, un
total de treinta y dos sujetos, o el 56,1%, dieron positivo en el
ensayo. De los cuarenta y un sujetos que tenían UC activa, un total
de treinta y seis sujetos, o el 87,8%, dieron positivo en el ensayo.
De los cincuenta y un sujetos que tenían CD activa, cuarenta y
cuatro, o el 86,3%, dieron positivo en el ensayo. Los treinta y un
pacientes que tenían IBS activo y los cincuenta y seis sujetos de
control sanos dieron negativo en el ensayo. Se ilustra un resumen
de los resultados de ensayo del experimento en la Tabla XI y se
ilustran diversas comparaciones individuales en las Tablas XII,
XIII y XIV, como se describe más completamente a continuación.
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Cuando se estaban distinguiendo muestras de
sujetos con IBD activa de muestras de sujetos que tenían IBS o de
muestras de controles sanos, el ELISA presentaba una sensibilidad
del 87% y una especificidad del 100%. La sensibilidad se calculó
dividiendo el número de personas que tenían IBD y que daban positivo
en el ELISA entre el número de sujetos que tenían IBD. La
especificidad se calculó dividiendo el número de sujetos que tenían
IBD y que daban positivo en el ELISA entre el número de sujetos que
daban positivo en el ELISA. Los valores predictivos positivo y
negativo eran del 100% y del 87,9%, respectivamente, y la
correlación era del 93,3%. Estos resultados se resumen en la Tabla
XII.
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\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se estaban distinguiendo muestras de
sujetos con UC activa de muestras de sujetos que tenían IBS o de
sujetos de control sanos, el ELISA presentaba una sensibilidad del
87,8% y una especificidad del 100%. Los valores predictivos
positivo y negativo eran del 100% y del 94,6%, respectivamente, y la
correlación era del 96,1%. Estos resultados se resumen en la Tabla
XIII.
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Cuando se estaban distinguiendo muestras de
sujetos que tenían CD activa de muestras de sujetos que tenían IBS
o de muestras de controles sanos, el ELISA presentaba una
sensibilidad del 86,3% y una especificidad del 100%. Los valores
predictivos positivo y negativo eran del 100% y del 92,6%,
respectivamente, y la correlación era del 94,9%. Estos resultados
se resumen en la Tabla XIV.
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Se determinó la variación
inter-ensayo por análisis de ocho muestras fecales
negativas para lactoferrina y ocho positivas para lactoferrina a lo
largo de un periodo de tres días. El % de coeficiente de variación
(CV) promedio era del 23,5% para las muestras positivas y del 7,4%
para las muestras negativas. La variación
intra-ensayo se determinó por análisis de doce
muestras fecales usando seis repeticiones en un lote de kits. El
análisis intra-ensayo oscilaba en % de CV del 2,7
al 24,0, con un promedio del 8,7%.
En el ensayo cuantitativo de la presente
invención, preferiblemente se realizaron diluciones seriadas de diez
veces de las muestras fecales y se añadieron a pocillos de
microtitulación que contenían anticuerpos policlonales
inmovilizados contra lactoferrina humana. Si existe lactoferrina
endógena, se unirá a los anticuerpos durante una incubación a
aproximadamente 37ºC. Después de la incubación, se añade un
conjugado compuesto por anticuerpos policlonales acoplados a la
enzima peroxidasa de rábano picante y se deja que se una a la
lactoferrina capturada. Después, se lava del pocillo el conjugado
no unido y se añade un sustrato componente (por ejemplo,
tetra-metil-bencidina y peróxido de
hidrógeno) para el desarrollo de color. Después de la incubación con
sustrato, se añade ácido sulfúrico 0,6 N para interrumpir la
reacción y se obtiene la absorbancia o la densidad óptica (DO)
espectrofotométricamente a 450 nm en un dispositivo de una sola
longitud de onda. Se determinan las concentraciones de lactoferrina
fecal por comparación con una curva patrón generada usando
lactoferrina humana purificada.
Una solución madre de 1 mg/ml de lactoferrina
humana purificada fabricada por Sigma Immunochemicals de St. Louis,
Missouri, se preparó usando 10 mg de lactoferrina disuelta en 10 ml
de solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril a un pH de
7,4. Se realizaron diluciones seriadas de dos veces de lactoferrina
usando el intervalo de aproximadamente 6 a 100 ng/ml en Diluyente.
Para el análisis, se ensayaron 0,1 ml de cada patrón por duplicado.
Se determinaron las densidades ópticas (DO_{450}) y se
representaron frente a la concentración de lactoferrina para
generar curvas patrón. La porción lineal de la curva se determinó
por análisis de regresión lineal usando el método
Log-Log (Microsoft EXCEL, Microsoft R Office). La
menor dilución de muestra que daba una DO_{450} dentro de la
porción lineal de la curva se usó para determinar la concentración
de lactoferrina. La concentración final se obtuvo multiplicando la
concentración por el factor de dilución.
Para evaluar la capacidad del ensayo
cuantitativo para medir el nivel de lactoferrina fecal, se diluyeron
dos muestras fecales recogidas con una diferencia de seis semanas
de seis adultos femeninos y cinco masculinos, y después se les
añadió lactoferrina a una concentración de 25 ng/ml. La
"Lactoferrina estimada" que se determinó representa el nivel
de lactoferrina determinada a partir de una curva patrón generada
con el ELISA cuantitativo. El % de Variación representa la
diferencia entre la cantidad "Real" usada para la adición a la
muestra y la cantidad "Estimada". En estas condiciones, las
variaciones oscilaban del 1,0% al 85,8% para sujetos femeninos y
del 8,8% al 47,0% para sujetos masculinos. Los resultados mostraban
un porcentaje de variación superior en adultos femeninos en
comparación con adultos masculinos. Las muestras de heces que
mostraban una variación mayor tenían niveles superiores de
lactoferrina antes de la adición. Los resultados se ilustran en las
Tablas XV y XVI a continuación.
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Un segundo método para la adición era usar las
mismas dos muestras de heces recogidas con una diferencia de seis
semanas de seis adultos femeninos y cinco masculinos, diluirlas y
añadirles lactoferrina a una concentración de 4 \mug/ml. La
"Lactoferrina estimada" representa el nivel de lactoferrina
determinado a partir de una curva patrón generada mediante el ELISA
cuantitativo. El % de Variación representa la diferencia entre la
cantidad "Real" usada para la adición a la muestra y el valor
"Estimado". En estas condiciones, la variación oscilaba del
1,3% al 84,9% para sujetos femeninos y del 5,0% al 39,2% para
sujetos masculinos. Los resultados eran similares a los obtenidos
con muestras a las que se añadió lactoferrina 25 ng/ml, como se ha
descrito anteriormente, mostrando un porcentaje de variación
superior en adultos femeninos en comparación con adultos
masculinos. Los resultados se ilustran en las Tablas XVII y XVIII a
continuación.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se usó el ELISA cuantitativo de la presente
invención para realizar un seguimiento de los niveles de
lactoferrina de un solo paciente que padecía colitis ulcerosa
durante un "estallido" de enfermedad activa tras una remisión.
El paciente mostraba niveles extremadamente elevados de lactoferrina
(por ejemplo, 9749,37 \mug/ml de heces) durante el nivel máximo
de la enfermedad activa, disminuyendo los niveles rápidamente (por
ejemplo, hasta 7,42 \mug/ml de heces) después de una terapia
farmacológica anti-inflamatoria. Los niveles se
elevaron espectacularmente de nuevo durante una recaída y
alcanzaron un nivel ligeramente superior al de personas de control
sanas (por ejemplo, 11,06 \mug/ml de heces) durante periodos de
remisión. Por lo tanto, los niveles de lactoferrina determinados de
acuerdo con el ELISA cuantitativo de la presente invención
representaban con precisión la actividad de la enfermedad en
respuesta a un tratamiento médico.
En resumen, la presente invención se refiere a
métodos no invasivos para diferenciar entre el síndrome del
intestino irritable y la enfermedad inflamatoria intestinal usando
la presencia de lactoferrina fecal como un marcador de detección
para leucocitos fecales y un kit usado para dicho método. La
presente invención se refiere adicionalmente a inmunoensayos que
utilizan anticuerpos específicos contra lactoferrina humana para la
medición de lactoferrina endógena total en heces humanas. Todavía
adicionalmente, la presente invención se refiere a un inmunoensayo
cuantitativo para seguir los niveles de lactoferrina fecal en un
paciente que tiene IBD.
Los inmunoensayos de la presente invención son
sensibles, específicos y fáciles de realizar. Los ensayos detectan
lactoferrina, una proteína estable que sirve como marcador de
detección para leucocitos fecales y un indicador de inflamación
intestinal, y los niveles cuantitativos de lactoferrina fecal para
seguir a pacientes que tienen IBD. Los ensayos son rápidos y pueden
completarse en aproximadamente setenta y cinco minutos. Los
resultados de investigación respaldan el uso del ELISA cualitativo
como una ayuda de diagnóstico in vitro para ayudar a
distinguir a pacientes con IBD activa de aquellos con IBS activo.
Los resultados de investigación respaldan adicionalmente el uso del
ELISA cuantitativo para seguir los niveles de lactoferrina fecal en
pacientes que tienen enfermedades inflamatorias.
Claims (13)
1. Un método in vitro para distinguir el
síndrome del intestino irritable de la enfermedad inflamatoria
intestinal, comprendiendo el método: proporcionar una muestra fecal
obtenida de una persona a diagnosticar; y determinar si dicha
muestra contiene un nivel elevado de lactoferrina endógena, en el
que si dicha muestra contiene un nivel elevado de lactoferrina
endógena se excluyen diagnósticos de síndrome del intestino
irritable y otras etiologías no inflamatorias.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
que comprende además diluir dicha muestra fecal.
3. El método de acuerdo con la reivindicación
2, en el que dicho paso de dilución de dicha muestra fecal
comprende diluir dicha muestra con un factor de dilución de
1:400.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dicha lactoferrina endógena comprende la lactoferrina
total procedente de plasma y/o bilis y/o leucocitos y/o secreciones
mucosas.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dicha lactoferrina endógena se determina
cualitativamente.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dicho paso de determinar si dicha muestra contiene un
nivel elevado de lactoferrina endógena incluye poner en contacto
dicha muestra con anticuerpos policlonales inmovilizados contra
lactoferrina humana para generar una muestra tratada.
7. El método de acuerdo con la reivindicación
6, en el que dicho paso de determinar si dicha muestra contiene un
nivel elevado de lactoferrina endógena incluye además poner en
contacto dicha muestra tratada con anticuerpos policlonales ligados
a enzimas para generar una muestra legible.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7,
en el que dicho paso de determinar si dicha muestra contiene un
nivel elevado de lactoferrina endógena incluye además determinar una
densidad óptica de dicha muestra legible a 450 nm, en el que dicha
densidad óptica se corresponde con un nivel de lactoferrina endógena
en la muestra.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 8,
en el que si dicha densidad óptica de dicha muestra legible es
superior a 0,200, dicha muestra fecal contiene un nivel elevado de
lactoferrina endógena.
10. Un método in vitro para diferenciar
el síndrome del intestino irritable de la enfermedad inflamatoria
intestinal, que comprende un ensayo de diagnóstico que determina el
nivel de lactoferrina endógena en una muestra, comprendiendo dicho
ensayo: proporcionar una muestra fecal humana; diluir dicha muestra;
poner en contacto dicha muestra con anticuerpos policlonales
inmovilizados contra lactoferrina endógena para generar una muestra
tratada; poner en contacto dicha muestra tratada con anticuerpos
policlonales ligados a enzimas para generar una muestra legible; y
determinar la densidad óptica de dicha muestra legible a 450 nm para
determinar si dicha muestra legible contiene un nivel elevado de
lactoferrina endógena en comparación con un valor de referencia
para sujetos de control sanos; en el que si dicha muestra legible en
dicho ensayo contiene un nivel elevado de lactoferrina endógena, se
excluye un diagnóstico de síndrome del intestino irritable.
11. El método de acuerdo con la reivindicación
10, en el que si dicha densidad óptica de dicha muestra legible es
superior a o igual a 0,200 en dicho ensayo, dicha muestra fecal
contiene un nivel elevado de lactoferrina endógena en comparación
con un valor de referencia para sujetos de control sanos.
12. El método de acuerdo con 10, en el que dicho
ensayo es un inmunoensayo ligado a enzimas.
13. El método de acuerdo con 10, en el que dicha
lactoferrina endógena comprende la lactoferrina total de plasma y/o
bilis y/o leucocitos y/o secreciones mucosas.
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Families Citing this family (36)
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|---|---|---|---|---|
| CA2502976C (en) * | 2002-10-25 | 2012-05-22 | Techlab, Inc. | Inflammatory bowel disease and irritable bowel syndrome ibd-first chek diagnostic panel |
| US20060154276A1 (en) | 2004-05-13 | 2006-07-13 | Prometheus Laboratories Inc. | Methods of diagnosing inflammatory bowel disease |
| US7759079B2 (en) * | 2004-05-13 | 2010-07-20 | Prometheus Laboratories Inc. | Methods of diagnosing inflammatory bowel disease |
| US7943328B1 (en) | 2006-03-03 | 2011-05-17 | Prometheus Laboratories Inc. | Method and system for assisting in diagnosing irritable bowel syndrome |
| US20100094560A1 (en) * | 2006-08-15 | 2010-04-15 | Prometheus Laboratories Inc. | Methods for diagnosing irritable bowel syndrome |
| US20080085524A1 (en) * | 2006-08-15 | 2008-04-10 | Prometheus Laboratories Inc. | Methods for diagnosing irritable bowel syndrome |
| WO2010056682A2 (en) | 2008-11-11 | 2010-05-20 | Prometheus Laboratories Inc. | Methods for prediction of inflammatory bowel disease (ibd) using serologic markers |
| NZ595471A (en) | 2009-04-14 | 2014-01-31 | Nestec Sa | Inflammatory bowel disease prognostics |
| AU2010266028B2 (en) | 2009-06-25 | 2015-04-30 | Société des Produits Nestlé S.A. | Methods for diagnosing irritable bowel syndrome |
| WO2011060098A1 (en) | 2009-11-10 | 2011-05-19 | Prometheus Laboratories Inc. | Methods for predicting post-surgery risk associated with ileal pouch-anal anastomosis |
| EP3181684B1 (en) | 2010-02-01 | 2019-05-29 | Rebiotix Inc. | Bacteriotherapy for clostridium difficile colitis |
| ES2380664B2 (es) | 2010-10-19 | 2012-09-13 | Certest Biotec, S.L. | Método y dispositivo para el diagnóstico rápido de enfermedades en muestras fecales. |
| BR112013020981A2 (pt) | 2011-02-17 | 2016-10-11 | Nestec Sa | ensaios para a detecção de auto-anticorpos para os fármacos anti-tnf<244> |
| US20120276060A1 (en) * | 2011-04-29 | 2012-11-01 | Techlab, Inc. | Fecal lactoferrin as a biomarker for determining disease severity and for treating infection in patients with clostridium difficile disease |
| US10295535B2 (en) * | 2011-04-29 | 2019-05-21 | Techlab, Inc. | Clostridium difficile dehydrogenase and toxin as a biomarker for monitoring infection in patients with clostridium difficile disease and differentiating carrier state from active disease |
| WO2015067913A1 (en) | 2013-11-07 | 2015-05-14 | Diagnodus Limited | Biomarkers |
| SG194710A1 (en) | 2011-05-10 | 2013-12-30 | Nestec Sa | Methods of disease activity profiling for personalized therapy management |
| EP2734543B1 (en) * | 2011-07-24 | 2018-10-03 | Carmel-Haifa University Economic Corp. | Lactoferrin fragments and use thereof |
| US20120258477A1 (en) * | 2011-07-25 | 2012-10-11 | Northwestern University | Fecal neopterin concentration measurement as an indicator of disease activity in inflammatory bowel disease |
| AU2012325798B2 (en) | 2011-10-21 | 2015-11-26 | Société des Produits Nestlé S.A. | Methods for improving inflammatory bowel disease diagnosis |
| WO2013082288A1 (en) * | 2011-11-29 | 2013-06-06 | The Regents Of The University Of California | Glucorticoid receptor gene nr3c1 methylation in irritable bowel syndrome and other stress disorders |
| WO2013132347A2 (en) | 2012-03-06 | 2013-09-12 | Calpro As | Improved elisa immunoassay for calprotectin |
| WO2013132338A2 (en) | 2012-03-06 | 2013-09-12 | Calpro As | Competitive immunoassay for calprotectin |
| CN103575903B (zh) * | 2012-08-07 | 2016-01-20 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种人乳铁蛋白夹心elisa检测试剂盒及其应用 |
| RU2504779C1 (ru) * | 2012-10-08 | 2014-01-20 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ростовский государственный медицинский университет" Минздравсоцразвития России | Способ оценки эффективности лечения больных язвенным колитом |
| JP6330032B2 (ja) | 2013-06-05 | 2018-05-23 | レビオティクス インコーポレイテッドＲｅｂｉｏｔｉｘ，Ｉｎｃ． | 微生物叢回復療法組成物を製造、処理、および梱包するための方法 |
| US9782445B2 (en) | 2013-06-05 | 2017-10-10 | Rebiotix, Inc. | Microbiota restoration therapy (MRT), compositions and methods of manufacture |
| US9511099B2 (en) | 2013-06-05 | 2016-12-06 | Rebiotix, Inc. | Microbiota restoration therapy (MRT), compositions and methods of manufacture |
| US10383901B2 (en) | 2013-06-05 | 2019-08-20 | Rebiotix, Inc. | Microbiota restoration therapy (MRT), compositions and methods of manufacture |
| US9511100B2 (en) | 2013-06-05 | 2016-12-06 | Rebiotix, Inc. | Microbiota restoration therapy (MRT), compositions and methods of manufacture |
| US9694039B2 (en) | 2013-06-05 | 2017-07-04 | Rebiotix, Inc. | Microbiota restoration therapy (MRT), compositions and methods of manufacture |
| ES2889902T3 (es) | 2015-06-09 | 2022-01-14 | Rebiotix Inc | Métodos de fabricación de composiciones para terapia de restauración de la microbiota (TRM) |
| US10905726B2 (en) | 2015-06-09 | 2021-02-02 | Rebiotix, Inc. | Microbiota restoration therapy (MRT) compositions and methods of manufacture |
| US10799539B2 (en) | 2015-06-09 | 2020-10-13 | Rebiotix, Inc. | Microbiota restoration therapy (MRT) compositions and methods of manufacture |
| US10828340B2 (en) | 2015-06-09 | 2020-11-10 | Rebiotix, Inc. | Microbiota restoration therapy (MRT) compositions and methods of manufacture |
| HUE037916T2 (hu) * | 2015-11-20 | 2018-09-28 | Geroa Diagnostics S L | Laktoferrin Alzheimer-kór diagnózisában és prognózisában történõ alkalmazására |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4444879A (en) * | 1981-01-29 | 1984-04-24 | Science Research Center, Inc. | Immunoassay with article having support film and immunological counterpart of analyte |
| US5124252A (en) | 1989-11-28 | 1992-06-23 | University Of Virginia Alumni Patents Foundation | In vitro test for fecal leukocytes |
| US5552292A (en) * | 1993-01-18 | 1996-09-03 | Ikagaku Co., Ltd. | Method of screening for colorectal cancer |
| US5455160A (en) | 1993-05-27 | 1995-10-03 | Fagerhol; Magne K. | Diagnostic test and kit for disease or disorders in the digestive system |
| US5681699A (en) | 1994-02-11 | 1997-10-28 | Cedars-Sinai Medical Center | Methods of diagnosing ulcerative colitis and Crohn's disease |
| US6174664B1 (en) * | 1997-02-05 | 2001-01-16 | University Of Pittsburgh | Screening method for inflammatory diseases using neutrophil defensins and lactoferrin |
| US6358939B1 (en) * | 1999-12-21 | 2002-03-19 | Northern Lights Pharmaceuticals, Llc | Use of biologically active vitamin D compounds for the prevention and treatment of inflammatory bowel disease |
-
2001
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