ES2889902T3 - Métodos de fabricación de composiciones para terapia de restauración de la microbiota (TRM) - Google Patents

Abstract

Un método para fabricar una composición oral para terapia de restauración de la microbiota (TRM), comprendiendo el método: recoger una muestra de heces; purificar la muestra de heces para formar un intermedio purificado, en el que purificar la muestra de heces comprende: añadir un diluyente a la muestra de heces; mezclar la muestra de heces y el diluyente para formar una mezcla; filtrar la mezcla; transferir un filtrado de la etapa de filtrado a un tubo de centrífuga; y centrifugar el filtrado para llegar al intermedio purificado; liofilizar el intermedio purificado para formar una pluralidad de gránulos liofilizados; y encapsular la pluralidad de gránulos liofilizados en una o más cápsulas; en el que el diluyente incluye un crioprotector, en el que el crioprotector incluye polietilenglicol a una concentración de 30-90 g/l en solución salina, y comprendiendo además el método mezclar el intermedio purificado con un excipiente de liofilización, en el que el excipiente de liofilización comprende polietilenglicol, glicerina, trehalosa y sacarosa.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de fabricación de composiciones para terapia de restauración de la microbiota (TRM)

Campo

La presente divulgación se refiere a composiciones y métodos para tratar pacientes.

Antecedentes

Se ha desarrollado una amplia variedad de composiciones y métodos para tratar enfermedades y/o afecciones del tubo digestivo. De las composiciones y métodos conocidos, cada uno tiene determinadas ventajas y desventajas. Existe una necesidad continua de proporcionar composiciones y métodos alternativos para tratar enfermedades y/o afecciones del tubo digestivo.

El documento WO 2014/152484 A1 divulga composiciones liofilizadas que incluyen un extracto de heces humanas y un crioprotector, y métodos para preparar y usar dichas composiciones.

El documento WO 2012/016287 A2 divulga composiciones, por ejemplo, formulaciones, usadas para tratamientos o lavado gástricos, gastrointestinales y/o colónicos, por ejemplo, lavado ortostático, por ejemplo, para inducir la purga (por ejemplo, limpieza) de un tubo gastrointestinal, incluyendo un colon, y métodos para prepararlos y usarlos. El documento US 2015/0093360 A1 divulga composiciones terapéuticas que contienen esporas bacterianas no patógenas, capaces de germinar, para la prevención, control y tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones gastrointestinales y para la salud nutricional general.

Breve sumario

Se proporciona un método como se indica en la reivindicación independiente. Las reivindicaciones dependientes definen modos de realización.

Esta divulgación proporciona diseño, material, método de fabricación y alternativas de uso para composiciones y métodos para tratar pacientes. Se divulga un método de ejemplo para fabricar una composición oral para terapia de restauración de la microbiota (TRM). El método comprende:

recoger una muestra de heces;

purificar la muestra de heces para formar una muestra purificada;

estabilizar la muestra purificada para formar una muestra estabilizada;

convertir la muestra estabilizada en un sólido;

añadir uno o más aditivos y/o excipientes al sólido para formar una composición de tratamiento; y encapsular la composición de tratamiento.

Un método para fabricar una composición oral para terapia de restauración de la microbiota (TRM) de acuerdo con la invención comprende:

recoger una muestra de heces;

purificar la muestra de heces para formar un intermedio purificado, en el que purificar la muestra de heces comprende:

añadir un diluyente a la muestra de heces;

mezclar la muestra de heces y el diluyente para formar una mezcla;

filtrar la mezcla;

transferir un filtrado de la etapa de filtrado a un tubo de centrífuga; y

centrifugar el filtrado para llegar al intermedio purificado;

liofilizar el intermedio purificado para formar una pluralidad de gránulos liofilizados; y

encapsular la pluralidad de gránulos liofilizados en una o más cápsulas.

De forma alternativa o adicionalmente a cualquiera de los modos de realización anteriores, filtrar la mezcla comprende filtrar la mezcla para obtener una muestra que tiene partículas en el intervalo de 50 a 70 micrómetros (pm).

De forma alternativa o adicionalmente a cualquiera de los modos de realización anteriores, centrifugar el filtrado comprende centrifugar el filtrado a una velocidad de modo que la fuerza centrífuga esté en el intervalo de aproximadamente 8-12.000 g durante el intervalo de 15 a 45 minutos.

De forma alternativa o adicionalmente a cualquiera de los modos de realización anteriores, liofilizar el intermedio purificado comprende las etapas de:

mezclar el intermedio purificado con un excipiente de liofilización para formar un intermedio de liofilización; colocar el intermedio de liofilización en una placa que tenga una pluralidad de pocillos;

bajar la temperatura del intermedio de liofilización a una temperatura en el intervalo de -40 a -45 °C; aplicar vacío al intermedio de liofilización y elevar la temperatura del intermedio de liofilización a aproximadamente 0 °C; inicializar una etapa de secado secundario y elevar la temperatura del intermedio de liofilización a aproximadamente 25 °C;

liberar el vacío; y

retirar una pluralidad de gránulos liofilizados de la placa.

De forma alternativa o adicionalmente a cualquiera de los modos de realización anteriores, el excipiente de liofilización comprende al menos un 2,3 % de PEG 3350, un 1 % de glicerina, un 10 % de trehalosa y un 10 % de sacarosa. De forma alternativa o adicionalmente a cualquiera de los modos de realización anteriores, las una o más cápsulas comprenden una cápsula de hipromelosa.

De forma alternativa o adicionalmente a cualquiera de los modos de realización anteriores, que comprenden además precintar las cápsulas.

De forma alternativa o adicionalmente a cualquiera de los modos de realización anteriores, el material de precintado comprende hipromelosa, un copolímero aniónico basado en ácido metacrílico y metacrilato de metilo, ftalato de hipromelosa o succinato de acetato de hipromelosa.

Se divulga un método para fabricar una composición oral para terapia de restauración de la microbiota (TRM). El método comprende:

añadir un diluyente a una muestra de heces purificada, comprendiendo la muestra de heces purificada heces y una solución de crioprotector al 2,3 % y solución de cloruro de sodio al 0,9 %;

mezclar la muestra de heces y el diluyente para formar una mezcla;

filtrar la mezcla;

transferir un filtrado de la etapa de filtrado a un tubo de centrífuga; y

centrifugar el filtrado para llegar al intermedio purificado;

liofilizar el intermedio purificado para formar una pluralidad de gránulos liofilizados; y

encapsular la pluralidad de gránulos liofilizados en una o más cápsulas.

De forma alternativa o adicionalmente a cualquiera de los modos de realización anteriores, filtrar la mezcla comprende filtrar la mezcla para obtener una muestra que tiene partículas en el intervalo de 50 a 70 micrómetros (pm).

De forma alternativa o adicionalmente a cualquiera de los modos de realización anteriores, centrifugar el filtrado comprende centrifugar el filtrado a una velocidad de modo que la fuerza centrífuga esté en el intervalo de aproximadamente 8-12.000 g durante un intervalo de 15 a 45 minutos.

De forma alternativa o adicionalmente a cualquiera de los modos de realización anteriores, liofilizar el intermedio purificado comprende las etapas de:

mezclar el intermedio purificado con un excipiente de liofilización para formar un intermedio de liofilización; colocar el intermedio de liofilización en una placa que tenga una pluralidad de pocillos;

bajar la temperatura del intermedio de liofilización a una temperatura en el intervalo de -40 a -45 °C; aplicar vacío al intermedio de liofilización y elevar la temperatura del intermedio de liofilización a aproximadamente 0 °C; inicializar una etapa de secado secundario y elevar la temperatura del intermedio de liofilización a aproximadamente 25 °C;

liberar el vacío; y

retirar una pluralidad de gránulos liofilizados de la placa.

De forma alternativa o adicionalmente a cualquiera de los modos de realización anteriores, el excipiente de liofilización comprende al menos un 2,3 % de PEG 3350, un 1 % de glicerina, un 10 % de trehalosa y un 10 % de sacarosa. De forma alternativa o adicionalmente a cualquiera de los modos de realización anteriores, las una o más cápsulas comprenden una cápsula de hipromelosa.

De forma alternativa o adicionalmente a cualquiera de los modos de realización anteriores, que comprenden además precintar las cápsulas.

De forma alternativa o adicionalmente a cualquiera de los modos de realización anteriores, el material de precintado comprende hipromelosa, un copolímero aniónico basado en ácido metacrílico y metacrilato de metilo, ftalato de hipromelosa o succinato de acetato de hipromelosa.

De forma alternativa o adicionalmente a cualquiera de los modos de realización anteriores, que comprenden además envasar los gránulos liofilizados encapsulados en envases en cantidades de dosificación individuales.

De forma alternativa o adicionalmente a cualquiera de los modos de realización anteriores, los envases comprenden una película unida de poliéster/polietileno metalizado.

De forma alternativa o adicionalmente a cualquiera de los modos de realización anteriores, que comprenden además colocar los envases en uno o más recipientes a prueba de niños.

De forma alternativa o adicionalmente a cualquiera de los modos de realización anteriores, que comprenden además envasar los gránulos liofilizados encapsulados en envases en cantidades de dosificación individuales.

De forma alternativa o adicionalmente a cualquiera de los modos de realización anteriores, los envases comprenden una película unida de poliéster/polietileno metalizado.

De forma alternativa o adicionalmente a cualquiera de los modos de realización anteriores, que comprenden además colocar los envases en uno o más recipientes a prueba de niños.

No se pretende que el sumario anterior de algunos modos de realización describa cada modo de realización divulgado ni cada implementación de la presente divulgación. Las figuras y la descripción detallada que siguen ejemplifican más en particular estos modos de realización.

Breve descripción de los dibujos

La divulgación se puede entender más completamente considerando la siguiente descripción detallada de diversos modos de realización de la divulgación en relación con los dibujos adjuntos, en los que:

La FIG. 1 es un diagrama de flujo que representa un proceso general para fabricar una composición de TMF estandarizada; y,

la FIG. 2 es un diagrama de flujo que representa otras etapas en un proceso de fabricación representativo. La FIG. 3 es un diagrama de flujo que representa otras etapas en otro proceso de fabricación representativo. La FIG. 4 es un diagrama de flujo que representa otras etapas en otro proceso de fabricación representativo. La FIG. 5 es un diagrama de flujo que representan otras etapas en otro proceso de fabricación representativo. Si bien la divulgación es susceptible de diversas modificaciones y formas alternativas, los detalles de la misma se han mostrado a modo de ejemplo en los dibujos y se describirán en detalle. Se debe entender, sin embargo, que la intención no es limitar la divulgación a los modos de realización particulares descritos. Por el contrario, la intención es cubrir todas las modificaciones, equivalentes y alternativas que caen dentro del alcance de la invención como se define por las reivindicaciones.

Descripción detallada

Para los siguientes términos definidos, se aplicarán estas definiciones, a menos que se proporcione una definición diferente en las reivindicaciones o en otra parte de esta memoria descriptiva.

En el presente documento se supone que todos los valores numéricos están modificados por el término "aproximadamente", se indique explícitamente o no. El término "aproximadamente" se refiere, en general, a un intervalo de números que un experto en la técnica consideraría equivalente al valor enumerado (es decir, que tiene la misma función o resultado). En muchos casos, los términos "aproximadamente" pueden incluir números que se han redondeado a la cifra significativa más cercana.

La enumeración de intervalos numéricos por los valores extremos incluye todos los números dentro de ese intervalo (por ejemplo, 1 a 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4 y 5).

Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contenido lo indique claramente de otro modo. Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, el término "o" se emplea, en general, en su sentido que incluye "y/o" a menos que el contenido lo indique claramente de otro modo.

Se observa que las referencias en la memoria descriptiva a "un modo de realización", "algunos modos de realización", "otros modos de realización", etc., indican que el modo de realización descrito puede incluir uno o más rasgos característicos, estructuras y/o características particulares. Sin embargo, dichas indicaciones no significan necesariamente que todos los modos de realización incluyan los rasgos característicos, estructuras y/o características particulares. Adicionalmente, cuando se describen rasgos característicos, estructuras y/o características particulares en relación con un modo de realización, se debe entender que dichos rasgos característicos, estructuras y/o características también se pueden usar en relación con otros modos de realización, se describan explícitamente o no, a menos que se indique claramente de otro modo.

La siguiente descripción detallada se debe leer con referencia a los dibujos en los que elementos similares en dibujos diferentes están numerados igual. Los dibujos, que no están necesariamente a escala, representan modos de realización ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance de la divulgación.

"Mamífero", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier miembro de la clase Mamíferos, incluyendo, sin limitación, humanos y primates no humanos tales como chimpancés y otras especies de simios y monos; animales de granja tales como bovinos, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamíferos domésticos tales como perros y gatos; animales de laboratorio que incluyen roedores tales como ratones, ratas y cobayas, y similares. El término no denota una edad o sexo en particular. Por tanto, se pretende que los sujetos adultos y recién nacidos, así como los fetos, sean hombres o mujeres, estén incluidos dentro del alcance de este término.

El término "crioconservación", como se usa en el presente documento, se refiere al proceso de enfriar y almacenar células, tejidos u órganos biológicos a temperaturas muy bajas para mantener su viabilidad. Como ejemplo no limitante, la crioconservación puede ser la tecnología de enfriamiento y almacenamiento de células a una temperatura por debajo del punto de congelación (por ejemplo, 196 K) que permite altas tasas de supervivencia de las células tras la descongelación.

El término "crioprotector", como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia que se usa para proteger células o tejidos biológicos de los efectos de la congelación.

Como se usa en el presente documento, el término "microbiota" se puede referir al microbioma humano, la microbiota humana o la microbiota intestinal humana. El microbioma humano (o microbiota humana) es el conjunto de microorganismos que residen en la superficie y en las capas profundas de la piel, en la saliva y la mucosa oral, en la conjuntiva y en el tubo gastrointestinal, el aparato genitourinario o el tracto vaginal de los seres humanos. El microbioma humano está compuesto por bacterias, hongos y arqueas. Algunos de estos organismos realizan tareas que son útiles para el huésped humano, pero se desconoce la función de la mayoría de los organismos que componen el microbioma humano. En circunstancias normales, estos microorganismos no causan enfermedades al huésped humano, sino que participan en cambio en el mantenimiento de la salud. Por eso, esta población de organismos se denomina con frecuencia "flora normal".

La población de microorganismos que viven en el tubo gastrointestinal humano se denomina comúnmente "flora intestinal" o "microbiota intestinal". La flora microbiana del intestino humano engloba una amplia variedad de microorganismos que ayudan en la digestión, la síntesis de vitaminas y la creación de enzimas no producidas por el cuerpo humano.

La frase "terapia de restauración de la microbiota", como se usa en el presente documento, se refiere a una composición que puede incluir, pero no se limita a, materia fecal humana que contiene flora intestinal viable de un paciente o donante, un diluyente y un crioprotector. Las composiciones adicionales incluyen heces liofilizadas y reconstituidas equivalentes o una composición fecal "sintética". La materia fecal humana se analiza para detectar la presencia de microorganismos patógenos antes de su uso en el terapia de restauración de la microbiota. La materia fecal humana se analiza para detectar la presencia de especies de Clostridium, incluyendo C. difícil, norovirus, adenovirus, patógenos entéricos, antígenos para especies de Giardia, especies de Criptosporidios y otros patógenos, incluyendo bacterias acidorresistentes, enterococos, incluyendo, pero sin limitarse a, enterococos resistentes a la vancomicina (ERV), Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM), así como cualquier huevo o cuerpo parasitario, o parásitos formadores de esporas, incluyendo, pero sin limitarse a, Isospora, Clyslospora y Cryptospora.

El proceso de bacterioterapia fecal puede incluir introducir una muestra fecal de un donante sano, o un donante que tenga una o más características deseadas, en un tubo gastrointestinal de un paciente para repoblar una microbiota intestinal sana o deseable. En determinados ejemplos, antes de la introducción de la muestra fecal, se puede alterar la flora intestinal del paciente usando antibióticos, de modo que la microbiota intestinal sana o deseable, una vez introducida en el paciente, pueda poblar fácilmente el tubo gastrointestinal.

La materia fecal humana se filtra antes de su uso en el terapia de restauración de la microbiota.

La presente divulgación se refiere a composiciones, métodos de fabricación y métodos de tratamiento que utilizan el terapia de restauración de la microbiota (TRM) para el tratamiento de infecciones por Clostridium difficile (ICD). La ICD es una infección nosocomial frecuente y con frecuencia se asocia con una morbimortalidad importante, especialmente en pacientes de edad avanzada. Aunque el tratamiento de la ICD es un ejemplo de uso de las composiciones de TRM divulgadas en el presente documento, no se pretende que sea limitante. Se contemplan otras enfermedades y/o afecciones. Algunas de las afecciones médicas que se pueden ver deseablemente afectadas por el tratamiento con composiciones de TRM pueden incluir enfermedades vasculares periféricas y/o cardiovasculares, alergias, obesidad, hipoglucemia, estreñimiento, celiaquía (por ejemplo, enfermedad celíaca), cáncer gastrointestinal (por ejemplo, el cáncer gastrointestinal es al menos uno de cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer de colon, cáncer de vesícula biliar, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer anal y tumores del estroma gastrointestinal), distonía mioclónica, sacroileitis, espondiloartropatía, espondiloartritis, miopatía miotónica proximal; una enfermedad autoinmunitaria síndrome de nefritis, autismo, diarrea del viajero, sobrecrecimiento bacteriano del intestino delgado, pancreatitis crónica, una insuficiencia pancreática, síndrome de fatiga crónica, encefalomielitis miálgica benigna, síndrome de disfunción inmunitaria y fatiga crónica, enfermedad de Parkinson (EP), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), esclerosis múltiple (EM), enfermedades neurológicas degenerativas, convulsiones tonicoclónicas generalizadas o ausencias típicas, enfermedad de Steinert, mononucleosis infecciosa crónica, encefalomielitis miálgica epidémica, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), una reacción alérgica aguda o crónica, obesidad, anorexia, síndrome del intestino irritable (SII o colon irritable) enfermedad de Crohn, enfermedad del intestino irritable (EII), colitis, colitis ulcerosa o colitis de Crohn, mononucleosis infecciosa crónica, encefalomielitis miálgica epidémica, urticarial aguda o crónica, lupus, artritis reumatoide (AR) o artritis idiopática juvenil (AIJ) , síndrome prediabético, fibromialgia (FM), diabetes de tipo I o tipo II, insomnio agudo o crónico, migrañas y trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH).

En el caso de los seres humanos, la presente divulgación engloba métodos de tratamiento de trastornos crónicos asociados con la presencia de microflora entérica anómala. Dichos trastornos incluyen, pero no se limitan a, las afecciones en las siguientes categorías: trastornos gastrointestinales que incluyen síndrome del intestino irritable o colon irritable, enfermedad intestinal funcional (EIF), incluyendo EIF con estreñimiento predominante, EIF con predominio del dolor, EIF en la porción superior del abdomen, dispepsia no ulcerosa (DNU), reflujo gastroesofágico, enfermedad inflamatoria intestinal, incluyendo enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis indeterminada, colitis colagenosa, colitis microscópica, infección crónica por Clostridium difficile, colitis seudemembranosa, colitis mucosa, colitis asociada a antibióticos, estreñimiento idiopático o simple, enfermedad diverticular, enteropatía por SIDA, sobrecrecimiento bacteriano del intestino delgado, enfermedad celíaca, poliposis coli, pólipos colónicos, síndrome seudoobstructivo idiopático crónico; infecciones intestinales crónicas por patógenos específicos que incluyen bacterias, virus, hongos y protozoos; trastornos gastrointestinales víricos, incluyendo gastroenteritis vírica, gastroenteritis por el virus de Norwalk, gastroenteritis por rotavirus, gastroenteritis relacionada con el SIDA; trastornos hepáticos tales como cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, hígado graso o cirrosis criptogénica; trastornos reumáticos tales como artritis reumatoide, artritis no reumatoides, artritis no positiva para el factor reumatoide, espondilitis anquilosante, enfermedad de Lyme y síndrome de Reiter; trastornos inmunomediados tales como glomerulonefritis, síndrome urémico hemolítico, diabetes mellitus juvenil, crioglobulinemia mixta, poliarteritis, fiebre mediterránea familiar, amiloidosis, esclerodermia, lupus eritematoso sistémico y síndrome de Behcet; trastornos autoinmunitarios, incluyendo lupus sistémico, púrpura trombocitopénica idiopática, síndrome de Sjogren, síndrome urémico hemolítico o esclerodermia; síndromes neurológicos tales como síndrome de fatiga crónica, migraña, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, miastenia gravis, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica y otros trastornos degenerativos; trastornos psiquiátricos, incluyendo depresión crónica, esquizofrenia, trastornos psicóticos, enfermedad maniaco depresiva; trastornos regresivos, incluyendo síndrome de Asperger, síndrome de Rett, trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH) y trastorno por déficit de atención (TDA); el trastorno regresivo, autismo; síndrome de muerte súbita del lactante (SMSL), anorexia nerviosa; afecciones dermatológicas tales como urticaria crónica, acné, dermatitis herpetiforme y trastornos de vasculitis; y trastornos y enfermedades cardiovasculares y/o vasculares.

A nivel mundial, el incremento en la prevalencia de organismos farmacorresistentes ha creado muchos desafíos para los médicos que pueden representar riesgos para la salud pública. Las infecciones por organismos farmacorresistentes (por ejemplo, Enterococcus resistente a la vancomicina (ERV)) y la infección por Clostridium difficile comparten factores de riesgo similares. El ERV es un patógeno nosocomial que puede ser una complicación entre los pacientes trasplantados e inmunodeficientes. Los portadores de ERV también pueden tener un riesgo incrementado de infección debido a ERV y también ser una fuente potencial de transmisiones de ERV a otros. La excreción de ERV en las heces se incrementa con la exposición a antimicrobianos y disminuye con la normalización de la microbiota intestinal después de la suspensión de los antimicrobianos. En consecuencia, la normalización de la microbiota intestinal puede no solo ser útil para tratar infecciones por Clostridium difficile (incluyendo infecciones crónicas), estos tratamientos también pueden ser útiles para tratar infecciones por organismos farmacorresistentes (por ejemplo, ERV y/u otros organismos farmacorresistentes, incluyendo los divulgados en el presente documento).

En algunos casos, las composiciones del terapia de restauración de la microbiota (y/o composiciones de bacterioterapia fecal) divulgadas en el presente documento se pueden usar para tratar pacientes con infecciones por organismos farmacorresistentes y/u organismos multirresistentes (OMR). Los organismos farmacorresistentes pueden ser resistentes a agentes antimicrobianos (por ejemplo, antibióticos, antivíricos, antifúngicos, antiparasitarios, otros fármacos, combinaciones de los mismos y similares) y pueden incluir microorganismos farmacorresistentes tales como bacterias, virus, hongos, parásitos, etc. Las infecciones que se pueden tratar con las composiciones para terapia de restauración de la microbiota divulgadas en el presente documento pueden estar a lo largo del tubo digestivo o en otros sistemas del paciente.

Las composiciones para terapia de restauración de la microbiota se pueden usar para tratar infecciones por una variedad de organismos farmacorresistentes tales como enterococos resistentes a la vancomicina (ERV), Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM), bacterias gramnegativas productoras de p-lactamasas de espectro ampliado, Klebsiella pneumoniae, bacterias gramnegativas productoras de carbapenemasas, bacilos gramnegativos multirresistentes (por ejemplo, especies de Enterobacter, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii y Pseudomonas aeruginosa), especies de Enterobacter farmacorresistentes, tuberculosis multirresistente (por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis), estafilococos farmacorresistentes, enterococos farmacorresistentes, gonococos farmacorresistentes, estreptococos farmacorresistentes (por ejemplo, incluyendo Streptococcus pneumoniae), Salmonela farmacorresistente, bacterias gramnegativas farmacorresistentes, Candida farmacorresistente, VIH farmacorresistente, virus de la gripe farmacorresistente, citomegalovirus farmacorresistente, virus del herpes simple farmacorresistente, malaria farmacorresistente, Plasmodium vivax farmacorresistente, Plasmodium falciparum farmacorresistente, Toxoplasma gondii farmacorresistente, y similares, y/u otros organismos farmacorresistentes. Estos son solo ejemplos.

El tratamiento de infecciones por organismos farmacorresistentes con las composiciones del terapia de restauración de la microbiota divulgadas en el presente documento puede incluir tratar pacientes sin antecedentes de infección por un organismo farmacorresistente, tratar pacientes con una única infección anterior por un organismo farmacorresistente, tratar pacientes con dos o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más) infecciones anteriores por un organismo farmacorresistente, etc. En algunos casos, las composiciones del terapia de restauración de la microbiota se pueden usar para tratar a un paciente con tres infecciones anteriores por un organismo farmacorresistente. En otros casos, las composiciones del terapia de restauración de la microbiota se pueden usar para tratar a un paciente con dos infecciones anteriores por un organismo farmacorresistente si las infecciones anteriores dieron como resultado la hospitalización, si las infecciones anteriores o actuales requieren tratamiento con fármacos tóxicos o si las infecciones anteriores eran todas por el mismo organismo.

En algunos casos, las composiciones del TRM se pueden administrar a un paciente usando un enema u otra técnica adecuada. Sin embargo, puede ser deseable administrar oralmente una composición de TRM. Para preparar una composición de TRM en una forma adecuada para la administración oral, se pueden llevar a cabo una serie de etapas. En general, estas etapas incluyen recoger una muestra fecal, procesar la muestra fecal, liofilizar o "secar por congelación" la muestra fecal procesada (para convertir la muestra fecal procesada de un líquido a un sólido), añadir uno o más aditivos y/o excipientes, y formar una forma oral de la composición de TRM a partir de la materia liofilizada y los aditivos (por ejemplo, un comprimido, cápsula, preparación líquida o similares). En el presente documento se divulgan algunos detalles adicionales con respecto a al menos algunos de estas etapas.

La figura 1 es un diagrama de flujo que representa una porción de un proceso de producción del TRM de ejemplo. Este es solo un ejemplo. Otros ejemplos de cribado de donantes, obtención de muestras de heces humanas y procesamiento de las muestras de heces en un producto de TRM se divulgan en la publicación de patente de EE. UU. comúnmente asignada 2014/0363398 A1. Más en particular, la figura 1 representa esquemáticamente un proceso para recoger e inspeccionar una muestra fecal de un donante. Como primera etapa en el proceso de recogida/inspección, se criban los donantes de heces potenciales. El cribado/preselección se describe con más detalle en el presente documento. Una vez que el donante pasa el cribado, la etapa dos puede incluir recoger las heces del donante usando un kit de recogida de heces humanas como se define en el presente documento, ya sea en el hogar o en una instalación de recolección. El kit puede incluir, pero no se limita a, un recipiente de recogida de heces humanas limpio con tapa, una bolsa grande que se puede cerrar/sellar, un formulario de donación y una hoja de instrucciones para la recogida de heces humanas. La hora y la fecha de recogida, junto con la identidad del donante y el método de transporte, se pueden registrar para hacer un seguimiento del tiempo desde la recogida hasta el procesamiento, y las condiciones de transporte. Como ejemplo no limitante, el recipiente de recogida puede incluir un indicador de la temperatura mínima y máxima a la que está expuesta la muestra. Como otro ejemplo no limitante, se pueden pegar al recipiente una o más pegatinas sensibles a la temperatura que cambian de color a temperaturas por debajo de aproximadamente 4 °C y temperaturas mayores de aproximadamente la temperatura ambiente (aproximadamente 22-29 °C).

La etapa tres puede implicar transportar la muestra a una instalación de procesamiento. Se puede apreciar que, si la muestra se recoge en la instalación de procesamiento, no es necesario transportar la muestra. En algunos casos, puede ser deseable recoger la muestra en la instalación de procesamiento para establecer más claramente la cadena de custodia de la muestra. Con la recepción de la primera donación de heces de cualquier individuo, se establecerá un perfil para cada donante. Las muestras de heces posteriores se pueden someter a una prueba de heces humanas, que se utiliza para emparejar y confirmar la identidad del donante con la donación. En base a muestras recogidas previamente, se genera un perfil de heces humanas para el donante y se puede mantener o mejorar con donaciones repetidas. Cualquier nueva muestra se comparará con este perfil para confirmar que es el mismo donante. Se puede hacer una diferenciación para confirmar la identidad del donante en base a la representación de especies de Bacterioides en las heces humanas. En un ejemplo no limitante, el conjunto de base de muestras de heces usado para crear el perfil se recoge en la instalación de procesamiento para asegurar la identidad del donante en las muestras de perfil. En otro ejemplo no limitante, el conjunto de base de muestras de heces usado para crear el perfil se puede recoger en localizaciones distintas a la instalación de procesamiento, con protocolos de garantía de la identidad del donante apropiados para la situación o localización.

La etapa cuatro del método puede incluir etiquetar la donación como "Cuarentena" y mantener la donación en cuarentena a temperatura ambiente o por debajo de ella durante no más de un intervalo de 24 horas a cinco días antes del procesamiento. Las donaciones se pueden rechazar en situaciones en las que se haya activado el indicador de temperatura o donde el tiempo entre la donación y la recepción exceda las 24 horas. Además, cuando corresponda, los resultados de la prueba de heces humanas deben coincidir con el perfil del donante. Si la prueba de heces humanas no coincide con el perfil del donante, la donación recogida para ese día se descartará y el donante será descalificado.

En un método de la divulgación, la muestra de heces humanas se procesa en aproximadamente 24 horas después de la recogida. En otro método de la solicitud, el momento de la recogida se registra en el momento de la llegada de la muestra de heces a la instalación de procesamiento. La etapa seis puede incluir inspeccionar la donación de heces. La inspección visual se puede completar a la llegada de la muestra de heces a la instalación de procesamiento. En el caso de que la muestra de heces humanas esté suelta, no formada, no sea de un peso suficiente (por ejemplo, menos de aproximadamente 50 g), o por cualquier otro motivo, incluyendo, pero sin limitación, pruebas que indiquen una mala calidad de la muestra o preocupaciones sobre la salud del donante, la muestra se puede rechazar, etiquetar como "Inspección - Rechazada" y se descarta la donación. Además, las respuestas a las preguntas del formulario de recogida de heces humanas se pueden revisar por personal capacitado. Determinadas respuestas en el formulario de recogida pueden requerir un amplio rechazo. Si se acepta la muestra, se puede etiquetar como "Inspección - Aceptada" y se puede trasladar a un proceso de fabricación.

La figura 2 es un diagrama de flujo que representa una porción de un método ilustrativo genérico para preparar una muestra de heces para TRM como una dosificación oral. Se contempla que un producto intermedio dentro del método para preparar una muestra de heces para TRM como una dosificación oral puede ser adecuado para TRM por medio de un enema o sonda nasogástrica. La muestra de heces se puede, en primer lugar, recoger y cribar 100, por ejemplo, en el método descrito con respecto a la figura 1. Una vez que la muestra se ha aceptado, la muestra se puede purificar y concentrar 102. La muestra se puede purificar usando centrifugación, filtración por membrana, o una combinación de las mismas para retirar materia fecal por encima de determinado tamaño de partícula. Se contempla que, dado que la mayoría de las bacterias de interés están en el intervalo de 0,3 micrómetros (pm) a 30 pm, la muestra se puede procesar para retirar partículas mayores de 50-70 pm. La muestra se puede procesar para obtener una concentración de un 75 % a un 90 % de las bacterias. Esto puede permitir una flexibilidad incrementada en la proporción entre excipientes de formulación y bacterias para procesamiento adicional.

La muestra se puede filtrar por membrana de una serie de formas diferentes, que incluyen, pero sin limitarse a, el uso de bolsas de filtro, filtros de presión y/o filtros de vacío. En algunos casos, la muestra se puede filtrar múltiples veces usando una membrana de filtro más pequeña con cada filtrado posterior. En algunos casos, se puede añadir solución salina como diluyente en una proporción de 1:3 (heces con respecto a solución salina), aunque esto no es necesario. Se usa una mezcla de solución salina y un crioprotector (por ejemplo, polietilenglicol (PEG) 3350) como diluyente. La concentración de PEG del diluyente es 30-90 g/litro. La concentración de PEG del diluyente también puede estar aproximadamente entre aproximadamente 25-75 g/litro. En un ejemplo, la proporción entre la mezcla de solución salina/PEG y la muestra de heces es 2:1, o 2 ml de mezcla de solución salina/PEG por 1 gramo de heces humanas. Como ejemplo no limitante, se pueden usar aproximadamente 100 ml de mezcla de solución salina/PEG para 50 g de heces humanas. Si bien la solución salina/PEG puede ser adecuada para su uso como diluyente (y/o crioprotector), no se pretende que esto sea limitante. También se pueden utilizar otros crioprotectores. Por ejemplo, dextrosa, betaína, glicina, sacarosa, poli(alcohol vinílico), Pluronic F-12, manitol, tween 80, etilenglicol, 1,3-propanodiol, hidroxipropilcelulosa, glicerol, mezcla de PEG/glicerol, propilenglicol o combinaciones de los mismos se pueden usar como crioprotectores. Estos materiales se pueden usar solos o en combinación con un disolvente tal como solución salina.

En un ejemplo, la muestra se puede colocar en una bolsa de filtro de 500 pm, con o sin diluyente, y agitar usando, por ejemplo, agitación con Stomacher a 230 rpm durante aproximadamente 2 minutos para obtener un filtrado con un tamaño de partícula de aproximadamente 500 pm o menos. A continuación, este filtrado se puede colocar en una bolsa de filtro que tenga un tamaño de poro más pequeño que 500 pm, por ejemplo, 280 pm. La muestra se puede agitar nuevamente usando, por ejemplo, agitación con Stomacher a 230 rpm con o sin un diluyente durante aproximadamente 4 minutos para obtener un filtrado que tenga un tamaño de partícula de aproximadamente 280 pm o menos. Este filtrado se puede colocar en otra bolsa de filtro que tenga un tamaño de poro más pequeño que, por ejemplo, 280 pm, tal como, pero sin limitarse a 60 pm. La muestra se puede agitar nuevamente usando, por ejemplo, agitación con Stomacher a 230 rpm con o sin un diluyente durante aproximadamente 4 minutos para producir un filtrado que tenga un tamaño de partícula de aproximadamente 50-70 pm o menos.

En otro ejemplo, la muestra se puede colocar en una bolsa de filtro de 500 pm, con o sin diluyente, y agitar usando, por ejemplo, agitación con Stomacher para obtener un filtrado que tenga un tamaño de partícula de aproximadamente 500 pm o menos. A continuación, este filtrado se puede procesar usando un filtro de presión que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 160 pm y procesar el filtrado resultante usando un filtro de presión que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 60 pm. En algunos casos, puede ser necesario procesar la muestra una segunda vez usando un filtro de bolsa que tenga un tamaño de poro entre 160 pm y 500 pm antes de usar el filtro de presión.

En otro ejemplo, la muestra se puede colocar en una bolsa de filtro de 500 pm, con o sin diluyente, y agitar usando, por ejemplo, agitación con Stomacher para obtener un filtrado que tenga un tamaño de partícula de aproximadamente 500 pm o menos. A continuación, este filtrado se puede procesar usando un filtro de vacío que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 160 pm y procesar el filtrado resultante usando un filtro de vacío que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 60 pm. En algunos casos, puede ser necesario procesar la muestra una segunda vez usando un filtro de bolsa que tenga un tamaño de poro entre 160 pm y 500 pm antes de usar el filtro de presión.

Una vez que la muestra se ha procesado para que tenga un tamaño de partícula de aproximadamente 60 pm o menos, la muestra se puede lavar y concentrar adicionalmente usando una centrífuga. En algunos casos, los tubos de centrífuga pueden tener un volumen en el intervalo de 50 a 500 ml o más. La suspensión filtrada se llena hasta aproximadamente de un 20 a un 80 % del volumen del tubo de centrífuga. En un ejemplo, las muestras se pueden centrifugar a 1100 a 3600 revoluciones por minuto (rpm) durante ciclos de 10 a 15 minutos. En otro ejemplo, las muestras se pueden centrifugar a una velocidad de modo que la fuerza centrífuga esté en el intervalo de aproximadamente 8-12.000 g (por ejemplo, aproximadamente 10.000 g) durante 15-45 minutos o 20-30 minutos. La centrífuga se puede aumentar o acelerar gradualmente hasta la velocidad necesaria para crear una fuerza centrífuga en el intervalo de aproximadamente 8-12.000 g (por ejemplo, aproximadamente 10.000 g). Se contempla además que la centrífuga también se pueda reducir o desacelerar lentamente cuando el proceso de centrifugación esté completo. En algunos casos, puede ser deseable desacelerar la centrífuga lo más lentamente posible de modo que el retorno a la presión atmosférica sea lento para proteger las células bacterianas de un posible estallido. Se retira el sobrenadante y la materia restante en el tubo es la composición de TRM intermedia purificada. Esto puede dar como resultado un producto que se ha concentrado en aproximadamente un 60 %. En algunos casos, el proceso de centrifugación puede ser un proceso de dos niveles. Por ejemplo, el producto se puede, en primer lugar, someter a un "precentrifugado" (por ejemplo, 300 g durante 2-5 minutos) para retirar la materia fibrosa fecal y, a continuación, se puede someter a una centrifugación más prolongada para concentrar el producto. Se contempla además que se puedan centrifugar volúmenes de hasta 300 ml sin que dé como resultado una caída en la cantidad de concentración. La composición de TRM resultante es una suspensión bacteriana que tiene un tamaño de partícula de 70 pm o menos y una concentración bacteriana del orden de aproximadamente 1x1010 UFC/g. La composición de TRM resultante también puede ser estable durante 3 semanas en condiciones de refrigeración.

En algunos modos de realización, la centrifugación sola se puede usar múltiples veces para purificación y concentración. Sin embargo, el tamaño de partícula de la suspensión bacteriana puede estar todavía en un rango (por ejemplo, mayor de 60 pm) que obstruya las puntas de las pipetas. Sin embargo, en algunos casos, se pueden usar puntas de pipeta anchas. Si esto tiene éxito o no depende de la materia fecal de entrada, que es variable. Se contempla además que se podría usar un sistema de separadores y decantadores si el tamaño del lote estuviera en el intervalo de varias decenas de litros o más. Sin embargo, esto puede no ser necesario si el producto de partida se ha procesado previamente.

En otros modos de realización, se puede usar centrifugación en gradiente de densidad para purificación y concentración de una muestra fecal. La centrifugación en gradiente de densidad se puede usar en combinación con las técnicas de filtración descritas anteriormente, o sola. La centrifugación en gradiente de densidad puede separar estrictamente por densidad, mientras que la centrifugación diferencial puede separar por tamaño de partícula y densidad. Para realizar la centrifugación en gradiente de densidad, se puede añadir un medio de gradiente de densidad a la muestra (por ejemplo, muestra bruta diluida o muestra filtrada diluida). El medio de gradiente de densidad puede ser una solución de concentración variable (por ejemplo, sacarosa con concentraciones variables). Por ejemplo, se puede crear un medio de gradiente de densidad superponiendo concentraciones menores de una solución sobre concentraciones más altas de la solución en un tubo de centrífuga. La muestra se puede colocar encima del medio de gradiente de densidad y posteriormente centrifugar. Las partículas de la muestra pueden viajar a través del medio de gradiente de densidad hasta que alcancen el punto en el gradiente en el que su densidad coincide con la de la solución circundante. Por ejemplo, el material objetivo (por ejemplo, bacterias) se puede asentar en el medio del tubo de centrífuga debido a la densidad de las bacterias y al medio de gradiente de densidad. Se puede usar una amplia variedad de medios de gradiente de densidad para la centrifugación, incluyendo, pero sin limitarse a, alcoholes polihídricos (azúcares), polisacáridos, sales inorgánicas, compuestos yodados, sílice coloidal, etc. Otros materiales de gradiente de densidad pueden incluir iohexoles como Nycodenz® (fabricado por Axis-Shield), soluciones de iodixanol, como OptiPrep™ (fabricado por Axis Shield) y/o diversos PEG de peso molecular. Se contempla que se puedan usar concentraciones en el intervalo de un 40 % a un 80 % peso/volumen (p/v) de Nycodenz®. Los medios pueden ser de calidad farmacéutica, biológicamente inertes y/o isosmóticos. En algunos casos, la centrifugación en gradiente de densidad puede purificar las bacterias de las heces de manera más eficiente que la centrifugación diferencial.

En algunos modos de realización, la filtración de flujo tangencial (o filtración de flujo cruzado) se puede usar en combinación con la centrifugación en gradiente de densidad para retirar además cualquier material soluble no deseado. En la filtración de flujo tangencial, la mayor parte del flujo de alimentación puede fluir tangencialmente a través de una superficie de un filtro que dentro del filtro. La filtración de flujo tangencial del material objetivo (por ejemplo, bacterias) puede retirar además impurezas solubles del material objetivo. Durante la filtración de flujo tangencial, se puede expulsar materia fibrosa adicional a medida que la suspensión bacteriana (obtenida de la centrifugación tradicional y/o centrifugación en gradiente de densidad) pasa a través de la superficie del filtro. En algunos casos, cada pasada de la suspensión bacteriana a través del sistema de filtración de flujo tangencial puede ir seguida de un tampón. Se contempla que se puedan procesar volúmenes mayores (por ejemplo, hasta aproximadamente 10 l) de suspensión bacteriana de una vez a través de un sistema de filtración de flujo tangencial. En algunos casos, el filtrado del proceso de filtración de flujo tangencial se puede usar como muestra fecal intermedia purificada. Se contempla que la suspensión filtrada (por ejemplo, filtrado) se pueda diluir con solución salina y/o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En otros casos, el filtrado del proceso de filtración de flujo tangencial se puede procesar adicionalmente usando, por ejemplo, pero sin limitarse a, centrifugación diferencial y/o filtración sin salida.

En algunos modos de realización, puede ser deseable estabilizar la muestra procesada en suspensión 104 en condiciones de refrigeración durante un período de tiempo en el intervalo de una a dos semanas. En algunos casos, la retirada de la materia fecal y el reemplazo con vehículos o excipientes que son solubles en una solución acuosa pueden permitir que las bacterias se suspendan en el líquido y se procesen adicionalmente sin problemas de estabilidad. Las consideraciones para estas soluciones de excipientes pueden ser el pH, la concentración y la isotonicidad o isosmolalidad. Los excipientes se pueden seleccionar en base a formulaciones de proteínas y anticuerpos monoclonales y su función propuesta en la estabilización de productos biológicos. Algunos excipientes de ejemplo que se pueden usar para proporcionar estabilización de líquidos 104 de la muestra pueden incluir, pero no se limitan a: sal (NaCl), sacarosa, trehalosa, monoclorhidrato de L-arginina y/o PEG 3350, como se resume en la tabla 1 a continuación. Se pueden encontrar listas de otros excipientes potenciales en las tablas I y III en Seong Hoon Jeong, Arch Pharm Res Vol 35, No 11, 1871-1886, 2012 y en tablas en Pramanick et al. Pharma Times, Vol 45, No. 3, marzo de 2013.

Tabla 1: Resumen de excipientes ilustrativos

En algunos casos, el excipiente puede incluir sacarosa al 2-20 %, monoclorhidrato de L-arginina al 0,1-5 %, PEG 3550 al 0,5-20 % o combinaciones de los mismos.

Se pueden usar combinaciones de excipientes para proteger células o tejidos biológicos de los efectos de la congelación y/o para proporcionar estabilidad (por ejemplo, minimizar la muerte celular) al producto durante el almacenamiento. La tabla 2 a continuación ilustra algunos ejemplos de formulaciones de excipientes que pueden proporcionar crioprotección y estabilidad durante el almacenamiento. Sin embargo, no se pretende que las formulaciones enumeradas en la tabla 2 sean limitantes. También se pueden usar otras combinaciones y/o cantidades de excipientes.

Tabla 2: Composiciones de la solución de excipientes antes de la adición a la sustancia farmacéutica

Se contempla que las formulaciones de excipientes anteriores, cuando se añaden a la sustancia farmacológica (por ejemplo, muestra fecal o muestra fecal procesada) pueden proporcionar crioprotección y estabilidad durante el almacenamiento a las células biológicas en una formulación líquida y/o sólida. En algunos casos, las formulaciones de excipientes se pueden añadir a la sustancia farmacéutica en una proporción de 1:1. Este es solo un ejemplo. También se contemplan otras proporciones entre excipiente y sustancia farmacológica, por ejemplo, pero sin limitarse a 0,25:1,0,5:1, 1,5:1,2:1, etc.

En algunos de estos y en otros casos, las formulaciones de excipientes pueden incluir:

(a) 0,5-20 % de PEG, (b) 0,1-5 % de glicerina, (c) 10-30 % de PVP, (d) 40-80 % de trehalosa, (e) 40-80 % de sacarosa, (f) 10-30 % de solución tampón fosfato, o (g) combinaciones de los mismos. Se contemplan otras formulaciones.

Se contempla que también se pueden usar excipientes similares para proteger las bacterias durante la filtración por membrana. Por ejemplo, Farber y Sharpe en _Applied and Environmental Microbiology, agosto de 1984, p. 441 -443 afirman que la recuperación bacteriana se mejora en presencia de determinados restos de alimentos (zanahorias, queso, melocotones, atún) - el pH puede ser importante - pH 5,88 a 6,40 para zanahorias, pH 4,75 - 5,02 para queso, pH 5,9 a 6,2 para atún, pH 3,3 a 4,05 para melocotones. La presencia de azúcares, carbohidratos o proteínas puede ser importante; las propiedades de estos alimentos que recubren las bacterias, respaldan la proliferación bacteriana (actividad prebiótica) o respaldan la pared celular bacteriana durante la filtración pueden ser importantes.

Los vehículos adecuados pueden variar con la forma y modo de administración deseados de la composición. Por ejemplo, pueden incluir diluyentes o excipientes tales como cargas, aglutinantes, agentes humectantes, disgregantes, agentes tensioactivos, deslizantes, lubricantes y similares. Típicamente, el vehículo puede ser un sólido (incluyendo un polvo), un líquido o combinaciones de los mismos. Cada vehículo es preferentemente "aceptable" en el sentido de que es compatible con los demás ingredientes de la composición y no perjudicial para el sujeto. El vehículo puede ser biológicamente aceptable e inerte (por ejemplo, permite que la composición mantenga la viabilidad del material biológico hasta que se administra al sitio apropiado).

Las composiciones orales pueden incluir un diluyente inerte o un vehículo comestible. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y usar en forma de comprimidos, grageas o cápsulas, por ejemplo, cápsulas de gelatina. Las composiciones orales también se pueden preparar combinando una composición de la presente divulgación con un alimento. En un modo de realización, se enfría un alimento usado para la administración, por ejemplo, helado. Se pueden incluir agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes como parte de la composición. Los comprimidos, pastillas, cápsulas, grageas y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotex; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo, aroma de naranja u otros aromatizantes adecuados. Estos son solo para propósitos de ejemplo y no se pretende que sean limitantes.

Una vez que la muestra purificada se ha purificado y estabilizado en una suspensión acuosa que puede ser adecuada para la administración a través de una sonda nasogástrica o un enema, la muestra se puede procesar adicionalmente para que sea adecuada para una administración oral, tal como en forma de comprimidos, grageas o cápsulas. Por ejemplo, la solución acuosa se puede convertir en un sólido 106. Se puede encontrar una lista de técnicas de procesamiento bacteriano en Martin et al., Innovative Food Science and Emerging Technologies, 27 (2015) 15-25.

La liofilización o secada por congelación se usa para convertir la muestra de un líquido a un sólido. La muestra se puede proporcionar con un crioprotector tal como, pero sin limitarse a, PEG, leche desnatada, carbón vegetal, ácido ascórbico o una combinación de los mismos para proteger a las bacterias de los efectos de la congelación. La muestra también se puede proporcionar con un lioprotector tal como, pero sin limitarse a, sacarosa, inositol, trehalosa, glicerol o una combinación de los mismos. En algunos casos, la muestra también se puede proporcionar con un material de enriquecimiento que puede proporcionar tamponamiento ácido. De forma alternativa o adicionalmente, el material de enriquecimiento también puede mantener las bacterias más activas, lo que puede facilitar las pruebas analíticas. Algunos ejemplos de materiales de enriquecimiento pueden incluir, pero no se limitan a, leche desnatada, carbón vegetal, gelatina, ácido ascórbico, medios GI o combinaciones de los mismos. De forma alternativa o adicionalmente, se puede añadir un captador de oxígeno a la muestra antes y/o después de la liofilización. Sin quedar vinculado a ninguna teoría, se cree que un captador de oxígeno puede mejorar la estabilidad y/o viabilidad de la muestra. Se contempla que los tubos de liofilización pueden incluir un inserto que se puede usar para expulsar un gránulo liofilizado del tubo de liofilización después del secado por congelación. La anchura del tubo de liofilización puede ser menor que la anchura de la cubierta de una cápsula para el tratamiento oral. Esto puede permitir el desplazamiento de una bandeja de gránulos directamente a las cubiertas de las cápsulas. Se contempla que esto puede reducir o eliminar la necesidad de dimensionar las partículas de la formulación o mezclarla adicionalmente 108 para mejora de las propiedades de flujo en la cápsula. La dosis también se puede determinar por el tamaño del gránulo. En algunos casos, un gránulo producido en el proceso de liofilización puede incluir aproximadamente 4,5x108 UFC (CDC). Una cápsula de tamaño 0 puede acomodar tres gránulos. Por tanto, una cápsula puede incluir aproximadamente 6,7x109 UFC (CDC). Se pueden requerir ocho cápsulas tomadas dos veces al día para que sean equivalentes a una dosis de enema. Además, puede que no sea necesario someter a prueba la homogeneidad del lote de gránulos que se mezclan antes del llenado de la cápsula. En algunos casos, el apisonamiento puede permitir una mayor concentración o número de gránulos dentro de cada cápsula. Por ejemplo, el apisonamiento de los gránulos dentro de la cápsula puede permitir aproximadamente 2-4 veces (por ejemplo, aproximadamente 2,5 veces) el número de gránulos en cada cápsula (por ejemplo, sin apisonamiento cada cápsula puede acomodar 2-4 o aproximadamente 3 gránulos mientras que con apisonamiento cada cápsula puede contener aproximadamente 7-10 o aproximadamente 8 gránulos). Esto puede ayudar a reducir el número de cápsulas que un paciente puede necesitar tomar para lograr la dosis deseada. En algunos casos, los gránulos se pueden moler antes de apisonarlos en la cápsula. Si los gránulos se muelen, puede ser deseable que el polvo tenga un valor de índice de Carr en el intervalo de 15 a 30 para facilitar el llenado de la cápsula. De forma alternativa, los gránulos se pueden moler y comprimir en forma de comprimido. A continuación, se puede presionar un polvo entérico sobre el comprimido para generar una dosis oral que puede ser estable en el entorno ácido del estómago pero que se disuelve en el tubo intestinal.

En otros casos, puede ser deseable conservar la muestra a través de secado de espuma por evaporación. Se contempla que se puedan usar excipientes y equipos tradicionales con este proceso. Las concentraciones de excipiente más altas y los parámetros de proceso óptimos para producir espuma durante el procesamiento pueden dar como resultado formulaciones con bajo contenido de agua. Cuanto menor sea el contenido de agua; mayor será la probabilidad de estabilidad a temperatura ambiente. Una vez que la muestra se haya secado 106, la muestra se puede procesar adicionalmente para lograr un tamaño de partícula deseado y/o mezclar 108 para preparar la muestra para el procesamiento del producto oral.

Aún en otros modos de realización, la muestra líquida puede estar microencapsulada por lípidos para protegerla de la bilis, los alginatos y/o los polímeros. Una vez que la muestra se ha encapsulado, la muestra se puede procesar adicionalmente para lograr un tamaño de partícula deseado y/o mezclar 108 para preparar la muestra para el procesamiento del producto oral.

Después de que la muestra se ha procesado hasta un tamaño de partícula deseado y/o mezclado 106 para preparar la muestra para el procesamiento del producto oral, la muestra se encapsula 110. Se contempla que el proceso de encapsulación puede proporcionar protección a pH bajo 112. Por ejemplo, el proceso de encapsulación puede prevenir o prevenir sustancialmente que las cubiertas de las cápsulas, comprimidos y/o grageas se descompongan en el entorno ácido del estómago, de modo que la composición de TRM se libere en la porción deseada del tubo intestinal. Se contempla que puede ser necesaria una cápsula con recubrimiento entérico para proporcionar protección en el estómago y tener la disgregación de la cápsula en el intestino delgado y grueso. En algunos casos, las cápsulas se pueden recubrir en paila con el recubrimiento entérico. Los materiales de recubrimiento entérico pueden incluir ácidos grasos, ceras, goma laca, plásticos y fibras vegetales. El recubrimiento en paila de hidroxipropil metilcelulosa (HPMC), o también llamado cápsulas de hipromelosa, protegerá a pH bajo y también ayudará a proteger de la humedad. Algunas cápsulas adecuadas pueden incluir DRcaps™ y Vcaps™ disponibles de Capsugel®. Asimismo, las cápsulas AR que tienen una composición de un 60 % de HPMC y un 40 % de HPMCP (ftalato de hipromelosa) pueden tener las mismas propiedades. Los tipos de cápsulas que no son de gelatina pueden contener menos agua (las cápsulas de gelatina normalmente de un 10 a un 12 % de agua, en comparación con otras cápsulas de polímero que tienen de un 3 a un 4 % o menos de agua). Puede ser necesario el precintado de la cápsula con polímeros que son insolubles en entornos de pH bajo, como se analizará con más detalle a continuación. En otros casos, las cápsulas se pueden apilar de modo que se usen 2 o más cápsulas para encerrar la muestra. Por ejemplo, la muestra se puede colocar en una cápsula y, a continuación, esa cápsula se coloca en otra cápsula más grande. Una cápsula apilada (por ejemplo, dos o más cápsulas) y/o precintada puede sobrevivir en un entorno ácido (por ejemplo, el estómago) durante al menos dos o más horas y disolverse en el tubo intestinal más neutro.

En algunos casos, en ausencia de un precinto que asegure los componentes de la cápsula juntos, la cápsula se puede abrir o romper de forma indeseable en el estómago. Por ejemplo, una cápsula no precintada se puede abrir en menos de 30 minutos o incluso menos de 15 minutos después de que se ingiera. Esto puede provocar que el producto se libere prematuramente dentro del estómago en lugar de en los intestinos, donde es más deseable. Por el contrario, una cápsula que se ha precintado con un polímero resistente a pH bajo puede que no se disgregue por completo y/o libere el producto durante 5 horas o más. Esto puede permitir que la cápsula pase intacta a través del estómago y permitir que el producto se libere en los intestinos donde se desea la bacteria. Se contempla además que la liberación de la composición de TRM en el entorno más neutro de los intestinos, en oposición al entorno ácido del estómago (en el intervalo de un pH de 1,2) pueda permitir que sobrevivan más bacterias. Precintar la cápsula puede incluir colocar un precinto de polímero resistente a pH bajo sobre la región donde se superponen la primera porción de cápsula y la segunda porción de cápsula.

En algunos modos de realización, se pueden usar superdisgregrantes para expandir la forma farmacéutica (por ejemplo, cápsula o comprimido) para mejorar la probabilidad de que las bacterias entren en contacto con la pared intestinal. Por ejemplo, la celulosa reticulada se hincha de 4 a 8 veces en 10 segundos, el almidón reticulado se hincha de 7 a 12 veces en menos de 30 segundos y el ácido algínico reticulado experimenta un rápido hinchamiento en un medio acuoso o una acción de absorción capilar.

Se puede desear la presencia de prebióticos para garantizar la proliferación bacteriana en el sitio de acción en el intestino. Estos son materiales que se pueden añadir a la formulación de la cápsula o dosificar por separado en el mismo momento de administración. Algunos aditivos adecuados pueden incluir galactooligosacáridos, derivados de inulina tales como fructooligosacáridos, celulosa, dextrinas, quitinas, pectinas, betaglucanos, ceras, lignina, fitoquímicos (compuestos vegetales bioactivos no nutritivos presentes en frutas, verduras, granos, y otros alimentos vegetales), carotenoides, fenólicos, alcaloides, compuestos nitrogenados y organosulfurados. Se contempla que los excipientes de L-arginina y PEG, en determinados intervalos de concentración, puedan producir secreción de agua y electrolitos cuando se administra el medicamento. Esto puede potenciar la capacidad de las bacterias para adherirse y proliferar en el intestino. Otros excipientes que producen este efecto también pueden mejorar el efecto terapéutico.

Un producto oral se puede envasar de una serie de formas diferentes, que incluyen, pero sin limitarse a, un envase alveolado o un frasco. En algunos casos, se puede colocar un captador de oxígeno y/o un desecante en el frasco y/o en el envase alveolado. El envase alveolado y/o el frasco pueden incluir rasgos característicos configurados para hacer que el envase sea a prueba de niños. Por ejemplo, un frasco se puede proporcionar con una tapa a prueba de niños y el envase alveolado se puede proporcionar con una funda exterior a prueba de niños. En algunos casos, el envase alveolado puede incluir gráficos diseñados para guiar al paciente sobre cómo usar el envase. Por ejemplo, el envase alveolado puede proporcionar orientación sobre cuántas pastillas tomar en un día dado y/o a qué hora del día tomar las pastillas. El envasado puede incluir dispositivos de monitorización para monitorizar las condiciones de envío. Como ejemplo no limitante, los recipientes de envasado pueden incluir un indicador de la temperatura mínima y máxima a la que está expuesto el producto. Como otro ejemplo no limitante, se pueden pegar al recipiente una o más pegatinas sensibles a la temperatura que cambian de color a temperaturas por debajo de aproximadamente 4 °C y temperaturas mayores de aproximadamente la temperatura ambiente (aproximadamente 22-29 °C).

Las figuras 3 y 4 son diagramas de flujo que representan dos métodos ilustrativos 201,300 para preparar una muestra de heces para TRM como una dosificación oral. En algunos modos de realización, la dosificación oral se puede preparar a partir de una muestra de heces frescas (figura 3) y en otros modos de realización, la dosificación oral se puede preparar a partir de una sustancia que ya se ha procesado (figura 4). Como se usa en el presente documento, una muestra de heces frescas se denominará sustancia farmacológica A y una muestra que se ha procesado previamente se denominará sustancia farmacológica B. Se contemplan otras sustancias farmacológicas que incluyen sustancias derivadas de cultivos de microbiota fecal. Con referencia en primer lugar a la figura 3, la muestra de heces se puede recoger y cribar en primer lugar, por ejemplo, en el método descrito con respecto a la figura 1. Una vez que la muestra se ha aceptado, la muestra se puede pesar en una bolsa de filtración, como se muestra en la etapa 200. Se contempla que se puedan usar múltiples recipientes de recogida (por ejemplo, donantes iguales o diferentes y recogidas en diversos momentos) que están dentro de sus datos de caducidad (por ejemplo, agrupados). La muestra se puede purificar usando centrifugación, filtración por membrana o una combinación de las mismas para retirar materia fecal por encima de un determinado tamaño de partícula. Se contempla que, dado que la mayoría de las bacterias de interés están en el intervalo de 0,3 micrómetros (gm) a 30 gm, la muestra se puede procesar para retirar partículas mayores que en el intervalo de 50-70 gm. La muestra se puede procesar para obtener una concentración de bacterias de aproximadamente un 60 %. Esto puede permitir una flexibilidad incrementada en la proporción entre excipientes de formulación y bacterias para su procesamiento adicional.

S puede añadir una solución filtrante, o diluyente, a la bolsa filtrante, como se muestra en la etapa 202. En algunos casos, se puede usar solución salina como diluyente. Por ejemplo, se puede añadir una solución de cloruro de sodio al 0,9 % (NaCl) a la bolsa de filtro en una proporción de aproximadamente 3 mililitros (ml) por gramo de sustancia farmacológica A. Se contempla que otros diluyentes, otras concentraciones de diluyentes y tasas de dilución se puedan usar, como se desee. Se usa una mezcla de solución salina y un crioprotector (por ejemplo, polietilenglicol (PEG) 3350) como diluyente. La concentración de PEG del diluyente es 30-90 g/litro. La concentración de PEG del diluyente también puede estar aproximadamente entre aproximadamente 25-75 g/litro. En un ejemplo, la proporción entre la mezcla de solución salina/PEG y la muestra de heces es 2:1, o 2 ml de mezcla de solución salina/PEG por 1 gramo de heces humanas. Sin embargo, en algunos casos, como cuando la sustancia farmacológica A se procesa específicamente para liofilización, el diluyente puede no incluir un crioprotector. A continuación, la muestra se puede filtrar con membrana en una serie de formas diferentes, que la etapa paso 204. En algunos casos, la muestra se puede filtrar múltiples veces usando una membrana de filtro más pequeña con cada filtrado posterior. En un ejemplo, la muestra se puede colocar en una bolsa de filtro de 500 gm y agitar usando, por ejemplo, agitación con Stomacher a 230 rpm durante aproximadamente 2 minutos para obtener un filtrado que tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 500 gm o menos. A continuación, este filtrado se puede colocar en una bolsa de filtro que tenga un tamaño de poro más pequeño que 500 gm, por ejemplo, 280 gm. La muestra se puede agitar nuevamente usando, por ejemplo, agitación con Stomacher a 230 rpm con o sin un diluyente durante aproximadamente 4 minutos para obtener un filtrado que tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 280 pm o menos. Este filtrado se puede colocar en otra bolsa de filtro que tenga un tamaño de poro más pequeño que, por ejemplo, 280 pm, tal como, pero sin limitarse a, 50-70 pm. La muestra se puede agitar nuevamente usando, por ejemplo, agitación con Stomacher a 230 rpm con o sin un diluyente durante aproximadamente 4 minutos para producir un filtrado que tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 50-70 pm o menos.

En otro ejemplo, la muestra se puede colocar en una bolsa de filtro de 500 pm, con o sin un diluyente, y agitar usando, por ejemplo, agitación con Stomacher para obtener un filtrado que tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 500 pm o menos. Este filtrado se puede procesar a continuación usando un filtro de presión que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 160 pm y procesar el filtrado resultante usando un filtro de presión que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 60 pm. En algunos casos, puede ser necesario procesar la muestra una segunda vez usando un filtro de bolsa que tenga un tamaño de poros entre 160 pm y 500 pm antes de usar el filtro de presión.

En otro ejemplo, la muestra se puede colocar en una bolsa de filtro de 500 pm, con o sin un diluyente, y agitar usando, por ejemplo, agitación con Stomacher para obtener un filtrado que tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 500 pm o menos. Este filtrado se puede procesar a continuación usando un filtro de vacío que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 160 pm y procesar el filtrado resultante usando un filtro de vacío que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 60 pm. En algunos casos, puede ser necesario procesar la muestra una segunda vez usando un filtro de bolsa que tenga un tamaño de poros entre 160 pm y 500 pm antes de usar el filtro de presión.

Una vez que la muestra se ha procesado para que tenga un tamaño de partícula de aproximadamente 50-70 pm o menos, la muestra se puede colocar a continuación en recipientes de almacenamiento intermedio, como se muestra en la etapa 206. Un ejemplo de recipiente de almacenamiento intermedio aceptable es un recipiente estéril de plástico de 250 ml con tapa. En algunos casos, la suspensión filtrada se puede almacenar en el refrigerador a 5 ± 3°C durante hasta 5 días, aunque esto no se requiera. La suspensión filtrada se puede combinar y mezclar en recipientes más grandes, como se muestra en la etapa 208. Un ejemplo de recipiente de almacenamiento inmediato aceptable es un recipiente de plástico estéril de múltiples litros con tapa.

A continuación, se pueden colocar alícuotas de la suspensión filtrada mezclada en tubos de centrífuga, de 50 a 500 ml de volumen, como se muestra en la etapa 210. La suspensión filtrada se llena hasta aproximadamente un 20 a un 80 % del volumen del tubo de centrífuga. En algunos casos, se pueden usar tubos de centrífuga con un volumen mayor de 500 ml. A continuación, la suspensión filtrada se puede lavar y concentrar adicionalmente usando una centrífuga, como se muestra en la etapa 212. En un ejemplo, las muestras se pueden centrifugar a 1100 a 3600 revoluciones por minuto (rpm) durante ciclos de 10 a 15 minutos. En otro ejemplo, las muestras se pueden centrifugar a una velocidad de modo que la fuerza centrífuga esté en el intervalo de aproximadamente 8-12.000 g (por ejemplo, aproximadamente 10.000 g) durante 15-45 minutos o 20-30 minutos. La centrífuga se puede aumentar o acelerar gradualmente hasta la velocidad necesaria para crear una fuerza centrífuga en el intervalo de aproximadamente 8­ 12.000 g (por ejemplo, aproximadamente 10.000 g). Se contempla además que la centrífuga también se pueda reducir o desacelerar lentamente cuando el proceso de centrifugación esté completo. En algunos casos, puede ser deseable desacelerar la centrífuga lo más lentamente posible para que el retorno a la presión atmosférica sea lento para proteger las células bacterianas de un posible estallido. Se retira el sobrenadante y el material restante en el tubo es la composición intermedia purificada del TRM. Esto puede dar como resultado un producto que se ha concentrado en aproximadamente un 60 %.

En algunos casos, el proceso de centrifugación puede ser un proceso de dos niveles. Por ejemplo, el producto se puede someter en primer lugar a un "precentrifugado" (por ejemplo, 300 g durante 2-5 minutos) para retirar materia fibrosa fecal y, a continuación, se puede someter a una centrifugación más prolongada para concentrar el producto. Se contempla además que se puedan centrifugar volúmenes de hasta 300 ml sin que dé como resultado una caída en la cantidad de concentración. En algunos casos, se pueden centrifugar volúmenes mayores de 300 ml. Por ejemplo, como se analiza anteriormente, el volumen de la centrífuga se puede seleccionar como un porcentaje (por ejemplo, en el intervalo de un 60 %) del volumen del recipiente. La composición de TRM resultante es una suspensión bacteriana que tiene un tamaño de partícula de 70 pm o menos y una concentración bacteriana del orden de aproximadamente 1x1010 UFC/g. La viabilidad bacteriana del intermedio purificado se puede medir por medio de un método de reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) cuantitativa con monoazida de propidio (PMA). La composición de TRM resultante también puede ser estable durante 3 semanas en condiciones de refrigeración.

En algunos modos de realización, la centrifugación sola se puede usar múltiples veces para purificación y concentración. Sin embargo, el tamaño de partícula de la suspensión bacteriana puede estar todavía en un intervalo (por ejemplo, mayor de 60 pm) que obstruya las puntas de las pipetas. Si esto tiene éxito o no depende de la materia fecal de entrada, que es variable. Se contempla además que se podría usar un sistema de separadores y decantadores si el tamaño del lote estuviera en el intervalo de varias decenas de litros o más.

La composición intermedia del TRM se puede transferir opcionalmente a un tubo intermedio y, si es necesario, enviar a una instalación de liofilización, como se muestra en la etapa 214. El intermedio purificado se puede enviar en un contenedor precalificado para condiciones de refrigeración, 5 ± 3°C al liofilizador de contrato, si es necesario, para liofilización.

El intermedio purificado se puede mezclar en una proporción 1:1 con una solución de excipiente de liofilización, como se muestra en la etapa 216. La solución de excipiente de liofilización puede estar compuesta por un 2,3 % de PEG 3350, un 1 % de glicerina, un 10 % de trehalosa y un 10 % de sacarosa. Sin embargo, se pueden usar otros excipientes de liofilización. Antes de añadir la solución de excipiente al intermedio purificado, la solución de excipiente de liofilización (sin glicerina) se filtra a través de un filtro de 0,2 pm. La glicerina se esteriliza en autoclave a 121 °C durante un mínimo de 15 minutos y se añade asépticamente. Una vez mezclados los excipientes de liofilización y el intermedio purificado (suspensión de liofilización), se coloca una alícuota única de doscientos microlitros (200 pl) de la suspensión de liofilización en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, como se muestra en la etapa 218 y se liofiliza, como se muestra en la etapa 220.

El proceso de liofilización se describirá con más referencia a la figura 5, que ilustra un diagrama de flujo de un proceso de liofilización ilustrativo 220. Para realizar la liofilización, una vez llena, la placa de 96 pocillos se puede envolver en un escudo biológico estéril, como se muestra en la etapa 402 También se contemplan otros tamaños de placa. Después de envolver todas las placas, se pueden transportar y cargar inmediatamente en el liofilizador, como se muestra en la etapa 404. El liofilizador se puede sellar e iniciar el ciclo de liofilización. El producto se congela bajando la temperatura del estante del producto a un intervalo de aproximadamente -40 °C a -45 °C, como se muestra en la etapa 406. Una vez que el producto se congela, se produce el secado primario (sublimación) aplicando vacío y elevando la temperatura del estante hasta 0 °C, como se muestra en la etapa 408. Se inicia una etapa de secado secundario para reducir adicionalmente el contenido de agua y llevar el producto a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C), como se muestra en la etapa 410. El vacío se libera al final de la etapa de secado secundario y el producto se retira del liofilizador, como se muestra en la etapa 412. El producto se puede colocar dentro de una cámara anaeróbica para la recogida de las alícuotas liofilizadas. Las alícuotas liofilizadas están en forma de gránulos y se transfieren a un envasado con desecante, como se muestra en la etapa 414. Los envases llenos se pueden purgar con gas nitrógeno y termosellar, como se muestra en la etapa 416. Volviendo ahora a la figura 3, si la composición intermedia del TRM se ha enviado fuera del sitio para su liofilización, los gránulos liofilizados se pueden enviar de vuelta al fabricante de la composición de TRM, en un contenedor precalificado para condiciones de refrigeración, como se muestra en la etapa 222.

En algunos casos, puede ser deseable que el material liofilizado o los gránulos tengan una temperatura de transición vítrea (Tg) mayor de 30 °C. En algunos ejemplos, la temperatura de transición vítrea puede estar en el intervalo de 30 a 75 °C. Esto puede dar como resultado un producto final estable a temperatura ambiente. La temperatura de transición vítrea también se puede usar como herramienta para cribar el producto recibido del proceso de liofilización y/o para verificar la estabilidad del producto final. Por ejemplo, la Tg se puede usar para predecir la estabilidad del producto durante el almacenamiento. En algunos casos, una Tg de 50 °C por encima de la temperatura de almacenamiento puede permitir que el producto intermedio liofilizado y/o el medicamento oral final se almacenen durante un período de tiempo sin una pérdida significativa de bacterias.

T ras la recepción del intermedio liofilizado, se puede retirar del envasado y llenar en cápsulas, como se muestra en la etapa 224. También se puede tomar una muestra del intermedio liofilizado y se mide la viabilidad total por medio de un método de PMA-qPCR. La encapsulación se puede realizar en un área purgada con nitrógeno a temperatura ambiente para minimizar la exposición del intermedio liofilizado al oxígeno. Los intermedios de liofilización se encapsulan en una cápsula de hipromelosa. Se pueden cargar múltiples intermedios liofilizados en una cápsula de hipromelosa dependiendo del tamaño de la cápsula (por ejemplo, tamaños 1,0 o 00).

A continuación, la cápsula se puede precintar, como se muestra en la etapa 226. En algunos casos, las cápsulas se pueden precintar con hipromelosa. En algunos casos, el material de preciento puede ser un copolímero aniónico basado en ácido metacrílico y metacrilato de metilo, tal como, pero sin limitarse a, Eudragit® LI00. En otros casos, el material de preciento puede ser ftalato de hipromelosa o succinato de acetato de hipromelosa. Estos son solo ejemplos. El material de precinto puede ser cualquier material que sea resistente a entornos de pH bajo (por ejemplo, el estómago) y se degrade en entornos de pH alto (por ejemplo, el tubo intestinal). Se aplica un espesor de precinto constante a cada cápsula para que el rendimiento de disgregación cumpla el límite de aceptación. Las cápsulas se almacenan en condiciones de refrigeración, 5 ± 3°C en un recipiente de plástico de granel purgado con nitrógeno o se envasa con desecante. El producto farmacéutico encapsulado y precintado se puede envasar con desecante y termosellar, como se muestra en la etapa 228. En algunos casos, el producto farmacéutico encapsulado y precintado se puede envasar en cantidades de dosificación individuales en una película unida de poliéster/polietileno metalizado. Esto puede minimizar la exposición del producto farmacéutico al oxígeno y/o la humedad que pueden provocar la degradación del producto. La película unida de poliéster/polietileno metalizado puede tener una tasa de transmisión de vapor de agua de 0,02 g/100 in2 y una tasa de transmisión de oxígeno de 0,0402/ml/100 in2 en 24 horas. Los envases de película unida se pueden proporcionar al paciente en un recipiente a prueba de niños para satisfacer la necesidad de un envasado de suministros clínicos a prueba de niños. El recipiente a prueba de niños puede ser un vial de farmacia verde de 40 dracmas (2,5 onzas) con una tapa a prueba de niños. El vial puede estar hecho de polipropileno translúcido resistente a la luz. La tapa de polietileno de baja densidad (LDPE) a prueba de niños ayuda a evitar el acceso no autorizado al requerir que el usuario presione y gire la tapa para abrir el recipiente.

Con referencia ahora a la figura 4, un método ilustrativo 300 para preparar una muestra de heces previamente purificada (sustancia farmacológica B) para TRM como una dosificación oral. La sustancia farmacológica B puede ser una preparación congelada de microbiota fecal, preparada como una forma farmacéutica de enema que incluye heces humanas y una solución de polietilenglicol 3350 al 2,3 % (u otro crioprotector) y solución de cloruro de sodio al 0,9 % para irrigación en una proporción de 1 g de heces por 3 ml de solución. Por ejemplo, la sustancia farmacéutica B se puede haber procesado de una manera similar a las etapas 200 a 212 descritas anteriormente, con la adición de un crioprotector en la etapa 202. Después del proceso de centrifugación descrito en la etapa 212, el intermedio purificado (por ejemplo, ahora la sustancia farmacéutica B) se puede refrigerar, congelar o usar para tratamiento.

Comenzando en la etapa 302, la preparación congelada se puede descongelar, si es necesario, y colocar en una bolsa de filtración. Se contempla que se puedan usar múltiples recipientes de recogida (por ejemplo, donantes iguales o diferentes y recogidas en diversos momentos) que están dentro de sus datos de vencimiento. La muestra se puede purificar usando centrifugación, filtración por membrana o una combinación de las mismas para retirar materia fecal por encima de un determinado tamaño de partícula. Se contempla que, dado que la mayoría de las bacterias de interés están en el intervalo de 0,3 micrómetros (pm) a 30 pm, la muestra se puede procesar para retirar partículas mayores que en el intervalo de 50-70 pm. La muestra se puede procesar para obtener una concentración de bacterias de aproximadamente un 60 %. Esto puede permitir una mayor flexibilidad en la proporción entre excipientes de formulación y bacterias para procesamiento adicional.

Se puede añadir una solución de filtro, o diluyente, a la bolsa de filtro, como se muestra en la etapa 304. En algunos casos, se puede usar solución salina como diluyente. Por ejemplo, se puede añadir una solución de cloruro de sodio al 0,9 % (NaCl) a la bolsa de filtro en una proporción de aproximadamente 3 mililitros (ml) por gramo de sustancia farmacológica B. Se contempla que otros diluyentes, otras concentraciones de diluyente y tasas de dilución se puede usar, como se desee. A continuación, la muestra se puede filtrar con membrana de una serie de formas diferentes, que incluyen, pero sin limitarse a, el uso de bolsas de filtro, filtros de presión y/o filtros de vacío, como se muestra en la etapa 306. En algunos casos, la muestra se puede filtrar múltiples veces usando una membrana de filtro más pequeña con cada filtrado posterior. En un ejemplo, la muestra se puede colocar en una bolsa de filtro de 500 pm y agitar usando, por ejemplo, agitación con Stomacher a 230 rpm durante aproximadamente 2 minutos para obtener un filtrado que tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 500 pm o menos. A continuación, este filtrado se puede colocar en una bolsa de filtro que tenga un tamaño de poro más pequeño de 500 pm, por ejemplo, 280 pm. La muestra se puede agitar nuevamente usando, por ejemplo, agitación con Stomacher a 230 rpm con o sin un diluyente durante aproximadamente 4 minutos para obtener un filtrado que tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 280 pm o menos. Este filtrado se puede colocar en otra bolsa de filtro que tenga un tamaño de poro más pequeño que, por ejemplo, 280 pm, tal como, pero sin limitarse a, 50-70 pm. La muestra se puede agitar nuevamente usando, por ejemplo, agitación con Stomacher a 230 rpm con o sin un diluyente durante aproximadamente 4 minutos para producir un filtrado que tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 50-70 pm o menos.

En otro ejemplo, la muestra se puede colocar en una bolsa de filtro de 500 pm, con o sin diluyente, y agitar usando, por ejemplo, agitación con Stomacher para obtener un filtrado que tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 500 pm o menos. Este filtrado se puede procesar a continuación usando un filtro de presión que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 160 pm y procesar el filtrado resultante usando un filtro de presión que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 60 pm. En algunos casos, puede ser necesario procesar la muestra una segunda vez usando un filtro de bolsa que tenga un tamaño de poros entre 160 pm y 500 pm antes de usar el filtro de presión.

En otro ejemplo, la muestra se puede colocar en una bolsa de filtro de 500 pm, con o sin un diluyente, y agitar usando, por ejemplo, agitación con Stomacher para obtener un filtrado que tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 500 pm o menos. Este filtrado se puede procesar a continuación usando un filtro de vacío que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 160 pm y procesar el filtrado resultante usando un filtro de vacío que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 60 pm. En algunos casos, puede ser necesario procesar la muestra una segunda vez usando un filtro de bolsa que tenga un tamaño de poros entre 160 pm y 500 pm antes de usar el filtro de presión.

Una vez que la muestra se ha procesado para que tenga un tamaño de partícula de aproximadamente 50-70 pm o menos, la muestra se puede colocar a continuación en recipientes de almacenamiento intermedio, como se muestra en la etapa 308. Un ejemplo de recipiente de almacenamiento intermedio aceptable es un recipiente estéril de plástico de 250 ml con tapa. En algunos casos, la suspensión filtrada se puede almacenar en el refrigerador a 5 ± 3 °C durante hasta 5 días, aunque esto no se requiere. La suspensión filtrada se puede combinar y mezclar en recipientes más grandes, como se muestra en la etapa 310. Un ejemplo de recipiente de almacenamiento inmediato aceptable es un recipiente de plástico estéril de múltiples litros con tapa.

A continuación, se pueden colocar alícuotas de la suspensión filtrada mezclada en tubos de centrífuga, de 50 a 500 ml de volumen, como se muestra en la etapa 312. La suspensión filtrada se llena hasta aproximadamente de un 20 a un 80 % del volumen del tubo de centrífuga. En algunos casos, se pueden usar tubos de centrífuga con un volumen mayor de 500 ml. A continuación, la suspensión filtrada se puede lavar y concentrar adicionalmente usando una centrífuga, como se muestra en la etapa 314. En un ejemplo, las muestras se pueden centrifugar a 1100 a 3600 revoluciones por minuto (rpm) durante ciclos de 10 a 15 minutos. En otro ejemplo, las muestras se pueden centrifugar a una velocidad de modo que la fuerza centrífuga esté en el intervalo de aproximadamente 8-12.000 g (por ejemplo, aproximadamente 10.000 g) durante 15-45 minutos o 20-30 minutos. La centrífuga se puede aumentar o acelerar gradualmente hasta la velocidad necesaria para crear una fuerza centrífuga en el intervalo de aproximadamente 8­ 12.000 g (por ejemplo, aproximadamente 10.000 g). Se contempla además que la centrífuga también se puede reducir o desacelerar lentamente cuando el proceso de centrifugación esté completo. En algunos casos, puede ser deseable desacelerar la centrífuga lo más lentamente posible para que el retorno a la presión atmosférica sea lento para proteger a las células bacterianas de un posible estallido. Se retira el sobrenadante y el material restante en el tubo es la composición intermedia purificada del TRM. Esto puede dar como resultado un producto que se ha concentrado aproximadamente en un 60 %.

En algunos casos, el proceso de centrifugación puede ser un proceso de dos niveles. Por ejemplo, el producto se puede someter en primer lugar a un "precentrifugado" (por ejemplo, 300 g durante 2-5 minutos) para retirar materia fibrosa fecal y, a continuación, se puede someter a una centrifugación más prolongada para concentrar el producto. Se contempla además que se puedan centrifugar volúmenes de hasta 300 ml sin que dé como resultado una caída en la cantidad de concentración. En algunos casos, se pueden centrifugar volúmenes mayores de 300 ml. Por ejemplo, como se analiza anteriormente, el volumen de la centrífuga se puede seleccionar como un porcentaje (por ejemplo, en el intervalo de un 60 %) del volumen del recipiente. La composición de TRM resultante es una suspensión bacteriana que tiene un tamaño de partícula de 70 pm o menos y una concentración bacteriana del orden de aproximadamente 1x1010 UFC/g. La viabilidad bacteriana del intermedio purificado se puede medir por medio de un método de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) con monoazida de propidio (PMA). La composición de TRM resultante también puede ser estable durante 3 semanas en condiciones de refrigeración.

En algunos modos de realización, la centrifugación sola se puede usar múltiples veces para purificación y concentración. Sin embargo, el tamaño de partícula de la suspensión bacteriana puede estar todavía en un intervalo (por ejemplo, mayor de 60 pm) que obstruya las puntas de las pipetas. Si esto tiene éxito o no depende de la materia fecal de entrada, que es variable. Se contempla además que se podría usar un sistema de separadores y decantadores si el tamaño del lote estuviera en el intervalo de varias decenas de litros o más.

La composición intermedia del TRM se puede transferir opcionalmente a un tubo intermedio y, si es necesario, enviar a una instalación de liofilización, como se muestra en la etapa 316. El intermedio purificado se puede enviar en un contenedor precalificado para condiciones de refrigeración, 5 ± 3 °C al liofilizador de contrato, si es necesario, para liofilización.

El intermedio purificado se puede mezclar en una proporción 1:1 con una solución de excipiente de liofilización, como se muestra en la etapa 318. La solución de excipiente de liofilización puede estar compuesta por un 2,3 % de PEG 3350, un 1 % de glicerina, un 10 % de trehalosa y un 10 % de sacarosa. Sin embargo, se pueden usar otros excipientes de liofilización. Antes de añadir la solución de excipiente al intermedio purificado, la solución de excipiente de liofilización (sin glicerina) se filtra a través de un filtro de 0,2 pm. La glicerina se esteriliza en autoclave a 121 °C durante un mínimo de 15 minutos y se añade asépticamente. Una vez mezclados los excipientes de liofilización y el intermedio purificado (suspensión de liofilización), se coloca una alícuota única de doscientos microlitros (200 pl) de la suspensión de liofilización en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, como se muestra en la etapa 320 y se liofiliza, como se muestra en la etapa 322.

El proceso de liofilización se describirá con más referencia a la figura 5, que ilustra un diagrama de flujo de un proceso de liofilización ilustrativo 220/322. Para realizar la liofilización, una vez llenada, la placa de 96 pocillos se puede envolver en un escudo biológico estéril, como se muestra en la etapa 402. También se contemplan otros tamaños de placa. En algunos modos de realización, también se puede usar una bandeja que no tenga pocillos. Esto puede maximizar el volumen disponible para recibir la suspensión liofilizada, lo que puede incrementar la eficiencia en el proceso de liofilización. Después de envolver todas las placas, se pueden transportar y cargar inmediatamente en el liofilizador, como se muestra en la etapa 404. El liofilizador se puede sellar e iniciar el ciclo de liofilización. El producto se congela bajando la temperatura del estante del producto a un intervalo de aproximadamente -40 °C a -45 °C, como se muestra en la etapa 406. Una vez que el producto se congela, se produce el secado primario (sublimación) aplicando vacío y elevando la temperatura del estante hasta 0 °C, como se muestra en la etapa 408. Se inicia una etapa de secado secundario para reducir adicionalmente el contenido de agua y llevar el producto a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C), como se muestra en la etapa 410. El vacío se libera al final de la etapa de secado secundario y el producto se retira del liofilizador, como se muestra en la etapa 412. El producto se puede colocar dentro de una cámara anaeróbica para recoger las alícuotas liofilizadas. Las alícuotas liofilizadas están en forma de gránulos y se transfieren a un envasado con desecante, como se muestra en la etapa 414. Los envases llenos se pueden purgar con gas nitrógeno y termosellar, como se muestra en la etapa 416. Volviendo ahora a la figura 4, si la composición intermedia del TRM se ha enviado fuera del sitio para su liofilización, los gránulos liofilizados se pueden enviar de vuelta al fabricante de la composición de TRM, en un contenedor precalificado para las condiciones de refrigeración, como se muestra en la etapa 324.

En algunos casos, puede ser deseable que los gránulos liofilizados tengan una temperatura de transición vítrea (Tg) mayor de 30 °C. En algunos ejemplos, la temperatura de transición vítrea puede estar en el intervalo de 30 a 75 °C. Esto puede dar como resultado un producto final que es estable a temperatura ambiente. La temperatura de transición vítrea también se puede utilizar como herramienta para cribar el producto recibido del proceso de liofilización y/o para verificar la estabilidad del producto final. Por ejemplo, la Tg se puede usar para predecir la estabilidad del producto durante el almacenamiento. En algunos casos, una Tg de 50 °C por encima de la temperatura de almacenamiento puede permitir que el producto intermedio liofilizado y/o el producto farmacéutico oral final se almacenen durante un período de tiempo sin una pérdida significativa de bacterias.

T ras la recepción del intermedio liofilizado, se puede retirar del envasado y llenar en cápsulas, como se muestra en la etapa 326. También se puede tomar una muestra del intermedio liofilizado y la viabilidad total se mide mediante un método de PMA-qPCR. La encapsulación se puede realizar en un área purgada con nitrógeno a temperatura ambiente para minimizar la exposición del intermedio liofilizado al oxígeno. Los intermedios de liofilización se encapsulan en una o más cápsulas de hipromelosa. Se pueden cargar múltiples intermedios liofilizados (por ejemplo, múltiples gránulos) en una cápsula de hipromelosa dependiendo del tamaño de la cápsula (por ejemplo, tamaños 1,0 o 00).

A continuación, la cápsula se puede precintar, como se muestra en la etapa 328. En algunos casos, las cápsulas se pueden precintar con hipromelosa. En algunos casos, el material del precinto puede ser Eudragit LI00, ftalato de hipromelosa o acetato/succinato de hipromelosa. Estos son solo ejemplos. El material del precinto puede ser cualquier material que sea resistente a entornos de pH bajo (por ejemplo, el estómago) y se degrade en entornos de pH alto (por ejemplo, el tubo intestinal). Se aplica un espesor de precinto constante a cada cápsula para que el rendimiento de disgregación cumpla el límite de aceptación. Las cápsulas se almacenan en condiciones de refrigeración, 5 ± 3 °C en un recipiente de plástico de granel purgado con nitrógeno o envasadas con desecante. El producto farmacéutico encapsulado y precintado se puede envasar con desecante y termosellar, como se muestra en la etapa 330. En algunos casos, el producto farmacéutico encapsulado y precintado se puede envasar en cantidades de dosificación individuales en una película unida de poliéster/polietileno metalizado. Esto puede minimizar la exposición del producto farmacéutico al oxígeno y/o la humedad, lo que puede provocar la degradación del producto. La película unida de poliéster/polietileno metalizado puede tener una tasa de transmisión de vapor de agua de 0,02 g/100 in2 y una tasa de transmisión de oxígeno de 0,0402/ml/100 in2 en 24 horas. Los envases de película unida se pueden proporcionar al paciente en un recipiente a prueba de niños para satisfacer la necesidad de un envasado de suministros clínicos a prueba de niños. El recipiente a prueba de niños puede ser un vial de farmacia verde de 40 dracmas (2,5 onzas) con una tapa a prueba de niños. El vial puede estar hecho de polipropileno translúcido resistente a la luz. La tapa de polietileno de baja densidad (LDPE) a prueba de niños ayuda a evitar el acceso no autorizado al requerir que el usuario presione y gire la tapa para abrir el recipiente.

Ejemplos

La divulgación se puede aclarar adicionalmente mediante referencia a los siguientes ejemplos, que sirven para ejemplificar algunos modos de realización y no para limitar la divulgación.

Ejemplo 1: Determinación de las temperaturas de colapso para una muestra de TRM

Formulaciones

Se identificaron los resultados de la temperatura de colapso para doce formulaciones para terapia de restauración de la microbiota de muestra. La temperatura de colapso se puede usar para ayudar a desarrollar formulaciones óptimas y parámetros del ciclo de liofilización para secar por congelación este tipo de producto en una cantidad de tiempo razonable sin comprometer su integridad física o química. Se ejecutó un ciclo de liofilización estándar para estas formulaciones y contenía suspensiones de células microbianas anaeróbicas.

Ejemplo 2: Materiales y métodos para microscopía de secado por congelación

Se utilizaron doce formulaciones para la prueba. Cada base consistía en leche desnatada al 10 %, ácido ascórbico al 1 %, gelatina al 1,4 % y carbón vegetal al 0,3 %. Los ingredientes eran productos químicos de calidad alimentaria, USP o NF. A continuación, se complementó la base con cada uno de los siguientes aditivos:

• T rehalosa 10 % y sacarosa 10 %

• Sacarosa 10 % e inositol 5 %

• T rehalosa 10 % y glicerol 1 %

• Rafinosa 10 % e inositol 5 %

• Rafinosa 10 % y glicerol 1 %

• Glucosa 5 % e inositol 5 %

• PEG 1 % y sacarosa 10 %

• PEG 1 % y glicerol 1 %

• T rehalosa 10 %, sacarosa 10 % y glicerol 1 %

• Sacarosa 10 % y lactosa 8 %

• T rehalosa 10 % e inositol 5 %

• PEG 1 % y lactosa 8 %

Se prepararon las formulaciones. El instrumento de microscopía de secado por congelación consistía en un microscopio de luz polarizada Olympus BX53 con una platina térmica Linkam FDCS196, un controlador del sistema T 95, una bomba de nitrógeno líquido LNP y una bomba de vacío Edwards E2M1.5.

Se colocó una alícuota de 20 microlitros (gL) de una muestra de 100 mililitros (ml) sobre un portaobjetos de vidrio que se había colocado en la platina térmica después de aplicar una pequeña gota de aceite de silicona. Se colocó un pequeño cubreobjetos sobre la muestra y se selló la cámara. A continuación, se enfrió la muestra a -45 grados Celsius (°C) a 10 °C/minuto. Se registró la temperatura a la que el material se congeló durante la etapa de enfriamiento. Una vez que la temperatura descendió a -45 °C, se inició el vacío. A continuación, se calentó la muestra de producto a 1 °C/minuto. Se monitorizó la muestra de producto continuamente durante el ciclo para observar los frentes de secado y sublimación. Una vez que se observaron pruebas de colapso, se registró la temperatura. La tabla 3 es un resumen de la temperatura de congelación y la temperatura de colapso para cada una de las formulaciones.

Tabla 3. Temperaturas de congelación y temperaturas de colapso registradas para cada formulación

Los ciclos de liofilización están influenciados por una variedad de factores que incluyen el porcentaje de sólidos en las formulaciones, el tamaño y el diámetro del vial, las temperaturas de colapso, las presiones de la cámara, las temperaturas de los estantes, la resistencia del producto, etc. Se determina la presión de la cámara y la temperatura de los estantes necesarios para completar el proceso de secado primario por las características térmicas de la formulación, principalmente la temperatura de colapso. La temperatura de secado primaria es más fría que la temperatura de colapso para tener en cuenta el calentamiento del producto que se produce debido por la resistencia incrementada de la capa seca en crecimiento. Se diseñaron tres ciclos basados en la combinación de factores anteriores. Todos los tiempos de ciclo tardaron de menos de 48 horas en completarse. La tabla 4 es un resumen de la temperatura de secado y las presiones de la cámara para los ciclos de liofilización en base a las temperaturas críticas de colapso.

Tabla 4. Temperaturas de secado primarias y presiones de cámara para los ciclos de liofilización basadas en temperaturas críticas de colapso

Se diseñó un ciclo de liofilización basado en los datos recogidos durante los estudios de microscopía de secado por congelación. Se llevó a cabo un ciclo piloto de liofilización para cada una de las formulaciones para someter a prueba la estructura de la torta y la supervivencia de una mezcla de células bacterianas. La recogida de células y la dispensación de la suspensión se completaron en base a los protocolos establecidos por Gibson Bioscience para obtener intervalos microbianos de 10e7 a 10e8 unidades formadoras de colonias por alícuota de 100 microlitros de la mezcla. Las cepas de microorganismos utilizadas se seleccionaron de la primera fase del estudio e incluyeron los siguientes anaerobios: Bacteroides uniformis ATCC 8492™, Alistipes putredinis ATCC 29800™, Ruminococcus gnavus ATCC 29149™ y Bacteroides ovatus ATCC 8484™.

El número de células viables (UFC) antes y después de la liofilización se determinó mediante el método de dilución en serie. Las diluciones consistieron en los siguientes niveles: 10e3, 10e5, 10e7 y 10e9. Se rehidrataron las muestras de gránulos en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato. Todas las muestras se sembraron en placas de agar sangre anaeróbico de los CDC prerreducido y agar bilis esculina selectiva de Bacteroides por duplicado. Se incubaron las placas de agar a 35-37 °C durante 48 horas en una atmósfera anaeróbica.

Los ciclos de liofilización produjeron estructuras de torta de buena calidad para todas las formulaciones. Los gránulos eran de aspecto sólido y uniforme. Cada gránulo liofilizado se disolvió en 30 segundos tras la rehidratación en 1,0 ml de solución salina tamponada con fosfato. Se calcularon las tasas de supervivencia como un porcentaje del número total de unidades formadoras de colonias bacterianas después del secado por congelación dividido entre el número total de unidades formadoras de colonias bacterianas antes del secado por congelación. Las unidades formadoras de colonias se basaron en la mezcla de los 4 organismos. La viabilidad y el porcentaje de supervivencia de las unidades formadoras de colonias totales para cada formulación se resumen en las tablas 5 y 6.

Tabla 5. Viabilidad y porcentaje de supervivencia de las unidades formadoras de colonias totales para cada formulación inoculada directamente en agar sangre anaeróbico de los CDC

*Basado en datos transformados logarítmicamente

Tabla 6. Viabilidad y porcentaje de supervivencia de las unidades formadoras de colonias totales para cada formulación inoculada directamente en agar bilis esculina selectivo de Bacteroides.

* Basado en datos transformados logarítmicamente

En base a los datos recopilados, los anaerobios seleccionados mostraron la tasa de supervivencia más alta cuando se utilizó la combinación de trehalosa y sacarosa o sacarosa e inositol en la formulación de base. Esto fue así para la recuperación tanto con agar sangre anaeróbico de los CDC como con agar bilis esculina selectivo de Bacteroides. Estos resultados indican que la combinación de trehalosa y sacarosa o sacarosa e inositol proporciona la mejor protección para Bacteroides sp. durante la liofilización.

Ejemplo 3: Estabilidad bacteriana del producto sólido durante el almacenamiento

Se realizó un estudio para determinar la estabilidad de la cápsula encapsulada envasada después de la fabricación y tras el almacenamiento. Para caracterizar el componente activo (bacterias) presente en el producto farmacéutico sólido, se empleó un método microbiológico estándar de sembrado en placa, un método molecular de PMA-qPCR sin cultivo y la secuenciación del gen 16s rRNA de muestras tratadas con PMA y sin PMA. Los datos de sembrado en placa y estabilidad de viabilidad total indican que un producto encapsulado, envasado y liofilizado (usando un primer proceso de liofilización) es más estable en condiciones de almacenamiento más frías (5 ± 3 °C) que a temperaturas de almacenamiento y humedad relativa más altas (25 ± 2 °C/60 % ± 5 % h.r. y 30 ± 2 °C/65 % ± 5 % h.r.). Los datos de estabilidad de viabilidad total y de sembrado en placa para un producto encapsulado envasado liofilizado (usando un segundo proceso de liofilización) indican que el producto encapsulado envasado es estable a temperaturas de almacenamiento de 5 ± 3 °C y 25 ± 2 °C.

Se debe entender que esta divulgación es, en muchos aspectos, solo ilustrativa. Se pueden realizar cambios en los detalles, en particular en cuestiones de conformación, tamaño y disposición de las etapas sin exceder el alcance de la divulgación. El alcance de la invención, por supuesto, se define en el idioma en el que se expresan las reivindicaciones adjuntas.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un método para fabricar una composición oral para terapia de restauración de la microbiota (TRM), comprendiendo el método:

recoger una muestra de heces;

purificar la muestra de heces para formar un intermedio purificado, en el que purificar la muestra de heces comprende:

añadir un diluyente a la muestra de heces;

mezclar la muestra de heces y el diluyente para formar una mezcla;

filtrar la mezcla;

transferir un filtrado de la etapa de filtrado a un tubo de centrífuga; y

centrifugar el filtrado para llegar al intermedio purificado;

liofilizar el intermedio purificado para formar una pluralidad de gránulos liofilizados; y

encapsular la pluralidad de gránulos liofilizados en una o más cápsulas;

en el que el diluyente incluye un crioprotector, en el que el crioprotector incluye polietilenglicol a una concentración de 30-90 g/l en solución salina, y

comprendiendo además el método mezclar el intermedio purificado con un excipiente de liofilización, en el que el excipiente de liofilización comprende polietilenglicol, glicerina, trehalosa y sacarosa.

2. El método de la reivindicación 1, en el que filtrar la mezcla comprende filtrar la mezcla para obtener una muestra que tiene partículas en el intervalo de 50 a 70 micrómetros (pm).

3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que centrifugar el filtrado comprende centrifugar el filtrado a una velocidad de modo que la fuerza centrífuga esté en el intervalo de aproximadamente 8-12.000 g durante un intervalo de 15 a 45 minutos.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que liofilizar el intermedio purificado comprende las etapas de:

mezclar el intermedio purificado con un excipiente de liofilización para formar un intermedio de liofilización; colocar el intermedio de liofilización en una placa que tiene una pluralidad de pocillos;

bajar la temperatura del intermedio de liofilización a una temperatura en el intervalo de -40 a -45 °C; aplicar vacío al intermedio de liofilización y elevar la temperatura del intermedio de liofilización a aproximadamente 0 °C;

inicializar una etapa de secado secundario y elevar la temperatura del intermedio de liofilización a aproximadamente 25 °C;

liberar el vacío; y

retirar una pluralidad de gránulos liofilizados de la placa.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el polietilenglicol es PEG 3350.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que una o más cápsulas comprenden una cápsula de hipromelosa.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además precintar las cápsulas.

8. El método de la reivindicación 7, en el que el material de precinto comprende hipromelosa, un copolímero aniónico basado en ácido metacrílico y metacrilato de metilo, ftalato de hipromelosa, succinato de acetato de hipromelosa o combinaciones de los mismos.