ES2234909T5 - Ensayo de alérgenos con micromatrices - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la detección de una inmunoglobulina que se une a un alergeno en una muestra, caracterizado porque uno o más alergenos únicos purificados se inmovilizan en un chip micromatriz, después de lo cual la muestra se incuba con los alergenos inmovilizados de forma que las inmunoglobulinas que son específicas de los alergenos se unen al alergeno específico, tras lo cual se detectan las inmunoglobulinas que está unidas a los alergenos inmovilizados específicos.

Description

DESCRICPCIÓN

Ensayo de alérgenos con micromatrices

La presente invención trata de un procedimiento para la detección de una inmunoglobulina IgE que se une a un alérgeno en una muestra, así como a un procedimiento para el diagnóstico in vitro de alergias en un paciente.

5 Una alergia es una reacción producida por el sistema inmunológico del organismo a una sustancia que normalmente se consideraría como inocua. Es esta respuesta la que causa los síntomas que se clasifican como reacciones alérgicas. Por tanto, la alergia no es un fallo del sistema inmunológico sino que es una sobreactividad del mismo. La respuesta de una persona alérgica a un alérgeno puede producir un amplio abanico de síntomas. Algunas personas sufren síntomas tales como asma, eczema, exantemas, picor de ojos, sinusitis, nariz tapada o rinorrea y fiebre del

10 heno, sin embargo se pueden producir síntomas más serios. Con alergias tales como, por ejemplo, las que se producen frente a los venenos, las nueces y los mariscos se puede producir un estado potencialmente mortal denominado choque anafiláctico. Esto sucede cuando el cuerpo produce una reacción tan intensa que la garganta se inflama, la presión arterial disminuye y la persona tiene dificultades para respirar. En algunos casos, este tipo de reacción puede ser mortal.

15 En los países desarrollados (es decir, en Europa, Norteamérica y Japón) la incidencia de alergias es cada vez mayor. Se ha estimado que afecta a un intervalo del 20-50% de la población. En la actualidad se sabe que las alergias son el resultado de un desequilibrio en el compartimento de los linfocitos T del sistema inmunológico. Más exactamente, las alergias se acompañan de un aumento de la actividad de los linfocitos T denominados colaboradores de tipo 2 (Th2) con respecto a los linfocitos T colaboradores de tipo 1 (Th1), lo que da lugar a un

20 incremento de la producción de IgE.

La IgE (inmunoglobulina E) es al menos una de las sustancias que causan reacciones alérgicas. LA IgE específica de un alérgeno normalmente no se detecta en sangre y sólo se produce cuando una persona se sensibiliza frente a una sustancia. Las sustancias que causan alergia (denominadas alérgenos) producen una IgE específica que es única y sólo reaccionara con su alérgeno. Esta reacción entre la IgE y el alérgeno es como una llave y una 25 cerradura. La IgE, cuando se combina con el alérgeno, hace que las células liberen sustancias químicas (por ejemplo histamina) que producen síntomas de alergia. Una persona puede tener IgE específica de más de una sustancia y puede, por tanto, ser alérgica a más de una sustancia. Los resultados de una prueba de IgE se expresan cono un grado que indica cuánta cantidad de IgE específica de la sustancia que se está probando está presente en la sangre. Cuanto más elevado es el grado, la probabilidad de que el paciente sea alérgico es mayor. Durante las 30 últimas décadas las enfermedades alérgicas se han diagnosticado usando extractos purificados sólo ligeramente derivados de las fuentes principales de alérgenos. Obviamente, estas mezclas en bruto son complejas y de composición variable. Como consecuencia de ello, el potencial diagnóstico de estos extractos puede variar y conducir a la producción de resultados falsos negativos. Esto último se ha atribuido principalmente a la inestabilidad de los alérgenos en los extractos. Otro inconveniente del uso de extractos en el diagnóstico de las alergias es la

35 mala normalización de los productos disponibles en el mercado en relación con su composición alergénica. Las unidades de expresión de la potencia y los métodos de cálculo son diferentes para cada empresa del mercado. Como consecuencia, apenas se pueden comparar productos diagnósticos procedentes de distintas empresas.

Durante las últimas décadas se han identificado los componentes más importantes relacionados con la enfermedad, los alérgenos mayoritarios, aunque su cuantificación no se usa como base para la normalización de los extractos de

40 alérgenos. En la actualidad se dispone de anticuerpos monoclonales frente a la mayoría de los alérgenos mayoritarios.

La prueba de alergia según procedimientos conocidos no es un procedimiento directo. Estos procedimientos pueden ser procedimientos útiles siempre que se conozca el historial del paciente para poder identificar las pruebas que serán más adecuadas. Sin embargo, sólo hay algunas pruebas médicas reconocidas que puedan identificar alergias

45 y, como norma general, su uso se ha restringido a laboratorios clínicos o a centros especialistas. Aunque el diagnóstico de atopia o alergia por parte de un médico experto o de un alergólogo puede establecerse con facilidad, a menudo se requieren más pruebas para confirmarlo.

Existen varios tipos de pruebas de alergia:

1. Prueba de la punción cutánea

50 Los alérgenos a los que se sospecha que el paciente es alérgico se inyectan justo debajo de la superficie de la piel y un profesional de enfermería o médico experto observará la reacción. A medida que la reacción se desarrolla aparece una zona enrojecida, cuanto más fuerte es la reacción, mayor es la zona. La prueba cutánea es bastante sensible, aunque no todas las alergias se pueden identificar mediante este procedimiento.

55 2. Prueba con parches

La prueba con parches puede ser muy útil en los casos de dermatitis de contacto. Por lo general, las sustancias que se van a probar se aplican a la piel cubiertas por un parche y se deja en el sitio durante 48 horas. Una reacción positiva produce una pequeña zona de eccema. De nuevo, un profesional de enfermería o médico experto observará la reacción.

3. Prueba de alergia alternativa

5 Hay muchos tipos alternativos de pruebas de alergia y, por desgracia, pocas son exactas o están reconocidas por la profesión médica. Estas pruebas alternativas a menudo conducen a confusiones y son caras.

4. Prueba de Vega

La prueba de Vega es una prueba eléctrica que se describe como una técnica reguladora bioenergética. La

10 máquina mide la conductividad con un circuito Wheatstone. Los electrodos se conectan a puntos de acupuntura o se dejan en la mano del paciente, Después se colocan soluciones diferentes en una bandeja metálica. A continuación, la máquina se calibra mediante la colocación en la bandeja de un vial de vidrio con una sustancia tóxica. El vial produce una reducción de la conductividad eléctrica. Después se colocan en la bandeja otras sustancias y si proporciona una lectura similar se registra como una reacción alérgica o

15 “de sensibilidad”. Esta técnica se usa mucho en almacenes de alimentos naturales, sin embargo su valor no se ha probado y no hay estudios válidos que sostengan las reivindicaciones.

5. Prueba leucocitotóxica

La prueba leucocitotóxica implica mezclar los leucocitos del paciente con un extracto de alimento específico y después medir las células de varias formas para detectar signos de alguna forma de cambio, Se produce

20 un número elevado de reacciones falsos positivos y falsos negativos y la Academia Americana de Alergias (American Academy of Allergy) concluyó que no había signos de que la prueba fuera eficaz para el diagnóstico de alergias a alimentos o inhalante.

6. Análisis del pelo

Otra forma de prueba es el análisis del pelo. El pelo se puede analizar para determinar la presencia de

25 metales tóxicos tales como plomo, mercurio y cadmio o niveles bajos de selenio, cinc, cromo, manganeso y magnesio. El envenenamiento por metales pesados está bien reconocido y documentado en la ciencia forense y el análisis del pelo puede indicar exposición a metales. Sin embargo, los análisis del pelo como medio para diagnosticar alergias, mediante procedimientos como “radiestesia”, nunca se han validado.

7. Kinesiología aplicada

30 Se toman muestras de alimentos y se colocan debajo de la lengua del paciente o en su mano dentro de un recipiente de vidrio. A continuación se pide al paciente que empuje su brazo libre contra el brazo del médico que está realizando la prueba. Si se detecta una respuesta alérgica, esta se manifiesta como una reducción de la respuesta muscular y el paciente experimenta dificultad para levantar el brazo. Esta técnica no resiste un estudio a doble ciego.

35 Además, existen varios procedimientos in vitro para diagnosticar alergias que detectan la presencia de anticuerpos IgE o IgG en la sangre de un paciente.

8.

Los procedimientos convencionales tales como ELISA o técnicas Western blot se usan para detectar la presencia de anticuerpos (IgE) en el suero de un paciente con la ayuda de alérgenos (recombinantes).

9.

Prueba radioalergosorbente (RAST!):

40 En este procedimiento se acopla un alérgeno a un disco de papel, la IgE inmunoespecífica, si hay en el suero de prueba (el del paciente), se unirá al disco; la detección se lleva a cabo con anti-IgE radiomarcada. Se están usando diferentes sistemas de puntuación que comparan los resultados de la prueba con la unión absoluta de un control negativo. Por lo general, el procedimiento RAST! modificado se sigue de incubación durante la noche y tiene como resultado una sensibilidad mayor.

45 10. Experimentos de inhibición cuantitativa de IgE basados en la prueba RAST en los que el extracto del alérgeno se aplica salpicando con él tiras de nitrocelulosa. Alícuotas de sueros se incuban previamente con una mezcla de alérgenos recombinantes específicos, tras lo cual esta mezcla se incuba en las tiras de nitro celulosa. La IgE unida se detecta con anticuerpos anti IgE humana. En una última etapa se calcula el porcentaje de inhibición de la unión de IgE a los extractos naturales después de la absorción previa con

50 alérgenos recombinantes.

11.

Prueba de estimulación con antígenos celulares (CAST), según la cual las células basófilas del paciente se estimulan con interleucina 3 y alérgeno, seguido por la medición en un ELISA del sulfidoleucotrieno (SLT)

generado y liberado de novo.

12.

UniCAP: alérgenos recombinantes se inmovilizan en una estructura de fase sólida tras lo cual se detecta la unión de los anticuerpos que están presentes en el suero de un paciente a los alérgenos.

5 Sin embargo, estos procedimientos requieren una multitud de etapas experimentales individuales con el fin de probar un número mayor (por ejemplo 100) de alérgenos diferentes. Además, estas pruebas mencionadas antes no muestran una sensibilidad y una fiabilidad lo bastante elevadas y su realización lleva mucho tiempo. Asimismo, las cantidades de alérgenos de muestra (por ejemplo, el suero de un paciente), así como purificados, posiblemente recombinantes, y caros que son necesarias para llevar a cabo estas pruebas son grandes.

10 El documento US 4 444 879 se refiere a procedimientos y aparatos para realizar inmunoensayos para determinar la inmunoglobulina total y la IgE. Los alérgenos se extraen y se inmovilizan en pocillos de una placa de microtitulación revestidos con polímero. A continuación, se añade al pocillo la muestra que se va a analizar y se lleva a cabo un inmunoensayo convencional.

En el documento EP 0 556 745 A1 se describe un procedimiento para la detección de anticuerpos IgE frente a la

15 proteína anti-trigo en los fluidos corporales, en el que un extracto de alérgeno de trigo se inmoviliza en una fase sólida que es, por ejemplo, un material cromatográfico o capilar o una fibra, vidrio, nailon, celulosa o derivados de los mismos en forma de perlas, micropartículas, láminas o pocillos de una placa de microtitulación. Asimismo, en él se lleva a cabo un inmunoensayo convencional con el fin de detectar anticuerpos en una muestra de un paciente.

El documento US 3 720 760 se refiere a un procedimiento para analizar fluidos corporales en busca de

20 inmunoglobulinas. Asimismo, los extractos que contienen el alérgeno disponible comercialmente se unen a un polímero insoluble en agua, tras lo cual se lleva a cabo un inmunoensayo convencional.

El documento US 4 849 337 también se refiere a un procedimiento para identificar los niveles de IgE específicos del alérgeno en el suero de un paciente mediante la conjugación de la IgE en el suero con alérgenos adheridos a un soporte insoluble. Aquí, de nuevo, el alérgeno puede ser un extracto o un alérgeno derivado directamente de

25 pólenes, polvos, animales, etc.

La detección de inmunoglobulinas específicas del alérgeno mediante ELISA con extractos de alérgenos unidos a una superficie sólida se describe en los documentos US 4.444.879 y EP 0 556 745 A. Mendoza y col. (Biotechniques 27(4) (1999)) describen un ELISA con micromatrices de alto rendimiento.

Sin embargo, estos procedimientos de inmunoensayo convencionales no son útiles para realizar pruebas a un

30 paciente con respecto a la presencia de alergias, ya que la cantidad de alergias diferentes ha llegado a más de algunos cientos y aumenta de forma constante. El tiempo y el trabajo necesarios para analizar el suero de un paciente en busca de todas las posibles alergias raras es demasiado y no se realizarán en laboratorios en las que diariamente se deben analizar algunos cientos de muestras de pacientes.

Por tanto, el objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento para la detección de una

35 inmunoglobulina que se une a un alérgeno en una muestra que no muestre los inconvenientes mencionados anteriormente y que se pueda llevar a cabo en un tiempo corto con sólo una pequeña cantidad de muestra y alérgenos, que sea altamente fiable y sensible y, todavía más importante, que permita la detección de un número prácticamente ilimitado de alérgenos en un único ensayo.

Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar un procedimiento para el diagnóstico in vitro de alergias 40 en un paciente sin los inconvenientes mencionados anteriormente.

El procedimiento mencionado antes se caracteriza porque uno o más alérgenos purificados se inmovilizan en un chip micromatriz, tras lo cual la muestra se incuba con los alérgenos inmovilizados de forma que las inmunoglobulinas que son específicas de los alérgenos se unen al alérgeno específico, y después se detectan las inmunoglobulinas IgE que están unidas a los alérgenos específicos inmovilizados.

45 Las micromatrices se han adoptado recientemente para una serie de técnicas de manipulación del ADN establecidas en la comunidad científica desde hace tiempo. Estas micromatrices de ADN están disponibles en numerosos formatos diferentes y terminarán por cambiar la forma de diseñar los experimentos en el trabajo de laboratorio habitual. El diagnóstico del ADN in vitro requiere menos tiempo y carga de trabajo, ya que esta nueva tecnología permite la complejidad de los ensayos en un formato de alto rendimiento. En consecuencia, en el campo de la

50 investigación de proteomas, los sustratos de fase sólida clásicos, tales como las placas de microtitulación, los filtros de membrana y los portas microscópicos, se están convirtiendo al formato de micromatrices de alta densidad. En último término, la nueva y versátil tecnología matricial proteica permite la detección selectiva de alto rendimiento para la expresión génica y las interacciones moleculares (Walter y col., Curr. Opin Microbiol 2000 Jun; 3 (3): 298302; Emili & Cagney, Nat Biotechnol 2000 Apr; 18 (4) 393-7). Recientemente se ha adoptado el concepto de las

55 matrices proteicas para su uso en los ensayos inmunológicos.

Se ha descrito que un chip micromatriz biológico es capaz para soportar ensayos de inmunosorción ligado a enzimas múltiplex (ELISA) de alto rendimiento (AR). Estos chips micromatrices biológicos pueden estar constituidos por, por ejemplo, una placa de vidrio ópticamente plana que contiene 96 pocillos formados por una máscara de Teflón hidrófobo incluida, sin embargo, también se conocen y usan otros materiales y formas de micromatrices biológicas.

5 Experimentos demuestran que la detección múltiplex de antígenos proteicos matrices en un sustrato de vidrio es factible. Más aplicaciones de este nuevo formato de detección selectiva de alto rendimiento (HTS) incluyen la obtención del perfil de expresión proteica celular, ensayos múltiplex para la detección de agentes infecciosos y diagnósticos de cáncer (Mendoza LG y col., Biotechniques 1999 Oct; 27 (4): 778-80).

Sin embargo, en estos procedimientos conocidos con chip micromatrices para probar proteínas, los anticuerpos se

10 inmovilizan en el chip micromatriz. Sorprendentemente, se ha descubierto que no sólo es posible unir los anticuerpos al chip micromatriz, sino también incluso los alérgenos que sean los antígenos correspondientes a anticuerpos específicos, en particular la IgE y la IgG, respectivamente. Este hecho es particularmente sorprendente ya que los alérgenos funcionales muestran una estructura secundaria concreta que puede modificarse cuando se une a una densidad tan alta a una fase sólida como el chip micromatriz. Esta modificación de la estructura del alérgeno

15 interferiría en la unión anticuerpo-alérgeno, lo que conduciría a resultados falsos negativos. Los anticuerpos, los fragmentos de anticuerpos o los péptidos son relativamente pequeños y muestran una estabilidad elevada, por tanto, los anticuerpos muestran una estabilidad mayor en solución con respecto a sus antígenos conocidos. Sin embargo, cuando se inmovilizan en un soporte sólido, incluso en el caso de los anticuerpos, sólo un pequeño porcentaje permanece intacto y activo.

20 El artículo de Haab y col. (Genom Biology 2000, I (6): pre-print 0001, 1-0001, 22), que se recibió el 9 de noviembre de 2000, se refiere a micromatrices proteicas para la detección y cuantificación de proteínas y anticuerpos en soluciones. Los resultados del análisis llevado a cabo según esta publicación muestran que sólo el 50% de los antígenos en la matriz y el 20% de los anticuerpos en la matriz proporcionaron una medida específica y precisa de los alérgenos conocidos.

25 Además, la diversidad de los posibles alérgenos es, por supuesto, mucho mayor que las diversidades de los anticuerpos con respecto a la manipulación de proteínas, especialmente para inmovilizar y marcar tal serie de alérgenos estructuralmente diversos. Sin embargo, sorprendentemente se ha mostrado que los alérgenos inmovilizados en un chip micromatriz muestran una elevada fiabilidad y sensibilidad en un procedimiento para la detección de inmunoglobulinas IgE en una muestra.

30 Este procedimiento permite llevar a cabo un ensayo para una multitud de inmunoglobulinas IgE que se unen a un alérgeno específico en una etapa experimental, donde el ensayo también puede fraccionarse: se pueden probar más de 100 alérgenos diferentes sin tener que llevar a cabo una multitud de etapas experimentales individuales como cuando se realizan en una forma convencional de microtitulación. Además, este ensayo muestra un alto grado de sensibilidad y fiabilidad. Asimismo, los resultados de la prueba de este procedimiento se pueden obtener en un corto

35 periodo de tiempo, por ejemplo, en aproximadamente tres horas, lo que acorta el tiempo del ensayo cuando se compara con las pruebas RAST y ELISA convencionales.

Además, el ensayo con micromatrices es muy reproducible cuando se realizan experimentos repetitivos con chips que contienen muestras de diferentes personas, por ejemplo con una máscara del tipo de una placa de microtitulación por el cual cada pocillo comprende un número de puntos de alérgenos diferentes y, por cada pocillo, 40 se añade una muestra de una persona. Otra ventaja de este procedimiento según la presente invención se debe al hecho de que un gran número de sondas diferentes ocupa un área relativamente pequeña, lo que proporciona una densidad elevada. La pequeña área de superficie de la matriz permite condiciones de unión extremadamente uniformes (regulación de la temperatura, contenido en sal, etc.) mientras que el extremadamente elevado número de sondas permite el procesamiento paralelo masivo de hibridaciones. Dado que las micromatrices de alta densidad

45 contienen un número tan elevado de sondas, es posible proporcionar numerosos controles incluidos, por ejemplo, controles de las variaciones o mutaciones de un alérgeno concreto, controles de las condiciones globales de hibridación, controles de las condiciones de preparación de la muestra y controles incompatibles para la unión inespecífica o la hibridación cruzada.

Además, el ensayo requiere sólo una fracción mínima de material (tanto de alérgeno como de muestra) cuando se

50 compara con los sistemas de prueba convencionales. Esto significa que con una cantidad igual de material de partida se puede fabricar un número mucho mayor de kits de prueba cuando se usa la forma de micromatriz y se puede usar una cantidad menor de muestra para probar una cantidad mayor de inmunoglobulinas IgE que se unen a los alérgenos. Asimismo, a volúmenes pequeños, la unión puede progresar muy deprisa.

Las “inmunoglobulinas” naturales intactas o anticuerpos comprenden una molécula tetramérica por lo general en

55 forma de Y, que tiene un sitio de unión al antígeno al final de cada brazo superior. Un sitio de unión al antígeno está constituido por el dominio variable de una cadena pesada asociado con el dominio variable de una cadena ligera. Más específicamente, el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo está formado esencialmente por las 3 CDR (regiones determinantes de complementariedad) del dominio variable de una cadena pesada (V. sub. H) y las 3 CDR del dominio variable de la cadena ligera (V. sub. L.).

En general, el término “antígeno” se refiere a una sustancia capaz de provocar una respuesta inmunitaria y normalmente, esta es también la sustancia que se usa para la detección de los correspondientes anticuerpos mediante uno de los muchos procedimientos inmunológicos in vitro e in vivo disponibles para la demostración de las interacciones antígeno-anticuerpo.

5 De igual forma, el término “alérgeno” se usa para indicar un antígeno con la capacidad de inducir y combinarse con anticuerpos específicos (es decir, IgE) que son responsables de las alergias comunes; sin embargo, esta última definición no excluye la posibilidad de que los alérgenos puedan también inducir anticuerpos, que pueden incluir inmunoglobulinas de otros tipos distintos a las IgE.

“Inmovilizar” en el contexto de las proteínas o péptidos se refiere a la unión o fijación de la proteína/péptido a

10 soportes sólidos por medios convencionales, con o sin un espaciador adicional entre el soporte sólido y el alérgeno. La inmovilización de péptidos/proteínas a un soporte se conoce bien en la técnica; el alcance de la presente invención comprende cualquier inmovilización, por ejemplo covalente, no covalente, en particular interacciones hidrófobas con, por ejemplo, membranas y superficies sintéticas, respectivamente etc.

Una “micromatriz” es una matriz de características (por ejemplo, “puntos”) que tiene una densidad de pequeñas

15 características de al menos aproximadamente 16/cm2, preferiblemente de al menos aproximadamente 64/cm2, todavía más preferido de aproximadamente 96/cm2 y lo más preferido de al menos 1000/cm2. Las características en una micromatriz tienen dimensiones típicas, por ejemplo diámetros, en el intervalo de entre aproximadamente 102000 ∀m, preferiblemente aproximadamente 50-500 ∀m, todavía más preferido de aproximadamente 150-250 ∀m, y están separadas de otras características en la matriz por aproximadamente la misma distancia. Por tanto, una

20 micromatriz según la presente invención utilizable para la selección en masa de rutina puede tener al menos 500, preferiblemente al menos 1000 puntos individuales que comprenden alérgenos, referencias y controles.

El “chip” según la presente invención puede ser de casi cualquier forma, por ejemplo un porta o un pocillo de una placa de microvaloración, o incluso una multitud de superficies, aunque se prefiere una superficie matricial planar.

La etapa de detección la puede llevar a cabo un experto en la técnica por cualquier procedimiento convencional, por 25 ejemplo mediante reacción física, enzimática, química, etc.

Según la presente invención, las IgE se detectan como inmunoglobulinas. La IgE se conoce como una sustancia que causa reacciones alérgicas y sólo se produce cuando una persona se sensibiliza a una sustancia, una alergia. Por tanto, con el fin de comprobar si la muestra es de un paciente alérgico al alérgeno específico, la muestra se somete a pruebas de detección de IgE como inmunoglobulinas. Cuanto mayor es la cantidad de IgE en la muestra, mayor es

30 la probabilidad de que el paciente del que se ha tomado la muestra sea alérgico al alérgeno específico.

Se sabe que la IgG está presente en una muestra de un paciente que el alérgico a alimentos.

De un modo ventajoso, uno o más alérgenos purificados se inmovilizan en el chip micromatriz. Por ejemplo, Estos, únicos, alérgenos se purifican de un extracto alergénico, por ejemplo de un alimento o una planta específico. Por supuesto, uno o más alérgenos de una especie específica se pueden analizar a la vez.

35 El experto en la técnica conoce los procedimientos de purificación, por ejemplo purificación cromatográfica, purificación por separación de masa, purificación por unión específica del alérgeno a una fase sólida, por ejemplo sobre un anticuerpo, etc. La aplicación de alérgenos altamente purificados para la producción en masa de pruebas de alergia todavía no se ha propuesto.

Alérgenos “purificados” se refiere, al contrario que los extractos, a alérgenos únicos que pueden ser, por ejemplo,

40 alérgenos nativos, recombinantes o de producción sintética. Estos alérgenos purificados muestran una serie de ventajas importantes sobre los extractos alergénicos cuando se inmovilizan en un soporte sólido: Debido a la presencia de mezcla de varias proteínas en cualquier extracto, la concentración de alérgenos que se deben probar es muy baja en comparación con las preparaciones con un único alérgeno purificado. Los alérgenos únicos purificados pueden, por tanto, inmovilizarse en la micromatriz a una concentración muy elevada. Debido a las

45 moléculas exactas y definidas presentes en una preparación que comprende alérgenos purificados, sólo los alérgenos definidos se inmovilizarán en la micromatriz. Por tanto, la micromatriz y el procedimiento para detectar anticuerpos con la ayuda de alérgenos purificados se pueden estandarizar y someter a controles de calidad precisos.

Además, a causa de la elevada concentración de alérgenos purificados en la composición, los alérgenos se inmovilizan a una densidad más elevada en la micromatriz y, por tanto, cualquier procedimiento de detección con la 50 ayuda de tal micromatriz resulta más sensible que las correspondientes micromatrices con extractos que comprenden alérgenos. Otra ventaja de los alérgenos únicos purificados sobre los extractos alergénicos reside en el hecho de que los alérgenos purificados inmovilizados están definidos de forma exacta. Al contrario que los alérgenos purificados, los extractos alergénicos comprenden, por ejemplo, dos, tres o más alérgenos distintos de un organismo u objeto. Por ejemplo, en el caso de una manzana, un extracto comprenderá una mezcla de diferentes alérgenos de

55 la manzana, mientras que la composición de la invención comprenderá uno de los alérgenos de la manzana purificado o, según el uso, una mezcla definida de dos o más alérgenos de la manzana u otros.

Otra ventaja de los alérgenos purificados con respecto a los alérgenos no purificados presentes, por ejemplo en un extracto, reside en el hecho de que debido a las impurezas adicionales presentes en el extracto, éste no es estable durante más de una cierta cantidad de tiempo y puede, por ejemplo, enmohecerse. Sin embargo, esto influirá sobre la detección de alergias, ya que también existen alergias frente al moho, en cuyo caso se produciría un resultado

5 falso positivo.

Además, debido a la presencia de proteasa en el extracto, los extractos son inestables, algo que no se produce con los alérgenos purificados.

Asimismo, debido a las terapias existentes en la actualidad, con la ayuda de alérgenos purificados un diagnóstico con los mismos componentes del alérgeno purificado constituiría una gran ventaja sobre el diagnóstico con

10 alérgenos sin purificar. Tales diagnósticos son particularmente ventajosos para seguir el tratamiento con alérgenos purificados y probar la reacción individual a un tratamiento específico y, por tanto, proporcionar un tratamiento “ajustado para el paciente”.

Por las razones anteriores, es particularmente ventajoso un procedimiento para la detección de una inmunoglobulina IgE que se una al alérgeno en una muestra por el cual uno o más alérgenos se inmovilicen en el chip micromatriz.

15 Preferiblemente, en el chip micromatriz se inmovilizan uno o más alérgenos recombinantes. Durante los últimos años se ha producido una serie de alérgenos recombinantes. La producción de alérgenos recombinantes es una técnica conocida pero tuvo poco impacto sobre las pruebas rutinarias de alergia. Mediante el uso de alérgenos recombinantes es posible proporcionar un gran número de uno o más alérgenos específicos y, por tanto, optimizar la sensibilidad de la prueba. Además es posible modificar los alérgenos recombinantes de forma específica con el fin

20 de producir mutaciones en los alérgenos para detectar inmunoglobulinas IgE específicas. Además, el uso de los alérgenos principales como proteínas recombinantes proporciona una alternativa a las pruebas basadas en extractos con respecto a la estabilidad del ensayo así como a la estandarización diagnóstica. Las ventajas mencionadas anteriormente acerca de los alérgenos purificados sobre los alérgenos sin purificar (extractos) se aplican todavía más a los alérgenos recombinantes que para los alérgenos nativos purificados: Los alérgenos recombinantes

25 pueden diseñarse de un modo todavía más específico que los alérgenos nativos purificados y, por tanto, es posible optimizar la afinidad y la especificidad de una prueba con alérgenos recombinantes. Asimismo, es mejor estandarizar los alérgenos recombinantes con respecto a su procedimiento de producción. Es más, las diferencias entre los lotes de producción son más pequeñas para los alérgenos recombinantes que para los alérgenos derivados de fuentes naturales. Sorprendentemente se ha mostrado con la presente invención que el uso de estos alérgenos

30 recombinantes en las pruebas diagnósticas rutinarias realizadas i vitro según la presente invención es superior a los sistemas de pruebas convencionales basados en extractos. En contraste con las pruebas en serie rutinarias según el estado de la técnica, las presentes pruebas con alérgenos que también usan alérgenos recombinantes proporcionan un calidad completamente nueva en relación a la estandarización, capacidad de control, sensibilidad, reproducibilidad, capacidad para probar y determinar la información diagnóstica relevante, etc. para las pruebas

35 estándar con alérgenos.

Los alérgenos recombinantes son, por ejemplo, los descritos en las publicaciones de Chapman y col. Allergy, 52: 374-379 (1997), Laffer y col. J. Allergy Cli Immunol Vol 98 número 2 652-658 (1996), Müller y col. Clinical and Experimental Allergy Vol 27 9. 915-920 (1997), Niederberger y col. J Allergy Clin Immunol Vol 102 número 4, parte 1 579-591 (1998), Menz y col. Clinical and Experimental Allergy Vol 26, 50-60 (1996), que se incorporan en la presente 40 memoria descriptiva como referencia. Otros ejemplos de alérgenos (recombinantes) son, aunque no se limita a ellos, rBetv1, rBetv2, rBetv3, rBetv4, rJun02, Cass1, rPhlp1, rPhlp2, rPhlp4, rPhlp5a, rPhlp6, rPhlp7, rPhlp11, rPhlp12, rParj2, Artv1a, Mugwort, profilina, Apig1, Apig1.0201, Daucl.2, rArah2, rArah5, Mald1, Mald2, rPenal, recCarp, rDerp1, rDerp2.0101, rDerp2, rDerp2b, rDerp5, rDerp5a, rDerp7, rDerp8, rDerp10, rTyrp2, rLepd2.01, rLepd13, rEurm2.0101, rFeld1, rFeld1a, rBosd2, un alérgeno representativo de gato, un alérgeno representativo de perro, un 45 alérgeno representativo de BSA, un alérgeno representativo de ratón, un alérgeno representativo de rata, un alérgeno representativo de cerdo, un alérgeno representativo de oveja, un alérgeno representativo de pollo, un alérgeno representativo de conejo, un alérgeno representativo de hámster, un alérgeno representativo de caballo, un alérgeno representativo de paloma, un alérgeno representativo de guinealbúmina, HSA, a-NAC, rPenc3, Penn13, rPEnc19a, rPenc19b, rAspf1, rAspf1a, rAspf3, rAspf3a, rAspf4, rAspf4a, rAspf6, rAspf6a, rAspf7, rAspf8, rAlta1,

50 rAlta2, rMalf1, rMalf5, rMalf6, rMalf7, rMalf8, rMalf9, rHevb1, rHevb1a, rHevb3, rHevb8, rHevb9, rHevb10, rHevb11, rAK, rBlag2, rBlag4, rBlag5, fosfolipasa A, hialuronidasa, rVesv5, rVesg5.

Según otra forma de realización ventajosa, uno o más alérgenos producidos por vía sintética se inmovilizan en el chip micromatriz. Aquí, de nuevo se aplican para los alérgenos recombinantes las mismas ventajas que las mencionadas anteriormente sobre los extractos alergénicos y también sobre los alérgenos nativos purificados. El

55 procedimiento por el cual se producen sintéticamente péptidos y proteínas se conoce bien en la técnica; mediante la producción sintética de alérgenos es posible proporcionar alérgenos altamente purificados en un gran número y a bajo coste, ya que tales procedimientos de producción están muy automatizados. Además, se puede producir la secuencia exacta de cualquier alérgeno con o sin modificaciones, lo que incrementa la sensibilidad y la fiabilidad del procedimiento de detección de inmunoglobulinas IgE.

60 También es posible usar sólo el determinante antigénico o el dominio antigénico de un alérgeno específico en la prueba según la presente invención. Esto puede eliminar los riesgos e inconvenientes del trabajo con proteínas grandes, porque las estructuras peptídicas más cortas son más fáciles de manejar para la producción de rutina de las micromatrices biológicas. Esto se aplica a todos los alérgenos purificados nativos, recombinantes y sintéticos. Esto permitiría la detección de epítopos peptídicos únicos, lo que mejorará todavía más la prueba diagnóstica y los

5 tratamientos en particular con respecto a la específica.

El hecho de proporcionar una forma nativa del alérgeno, así como una forma recombinante o sintética del alérgeno en el mismo chip resulta una ventaja de importancia. Aunque se prefiere el uso de, principalmente, alérgenos recombinantes o sintéticos, la forma nativa de un alérgeno puede proporcionarse al menos como control o como información adicional acerca de la calidad. Por tanto, un chip preferido según la presente invención comprende una

10 forma recombinante o sintética y una nativa de al menos un alérgeno. Esto también proporciona una mejora en el control de calidad y la estandarización de los diferentes lotes de alérgenos.

Preferiblemente, uno o más haptenos se inmovilizan cono alérgenos en el ensayo con el chip micromatriz. Un “hapteno” es una sustancia de bajo peso molecular (típicamente por debajo de aproximadamente 7000 daltons, que por lo general es incapaz de causar, pos sí solo, una producción significativa de anticuerpos tras la administración al 15 cuerpo de un animal, incluido un cuerpo humano. Esto se puede producir porque un hapteno es demasiado pequeño como para ser reconocido por el sistema inmunológico del cuerpo. Sin embargo, cuando un hapteno está acoplado a una molécula transportadora más grande, el antígeno puede adquirir propiedades antigénicas. En otras palabras, la unión del hapteno a la molécula transportadora (para preparar una combinación componente analizado/molécula transportadora) permite que el hapteno unido sea reconocido por el sistema inmunitario de un animal. Puede tener

20 lugar una reacción de inmunoprecipitación entre el hapteno (acoplado a la molécula transportadora) y un anticuerpo frente al hapteno. Al proporcionar haptenos inmovilizados en el chip micromatriz se puede conseguir una densidad más elevada en la micromatriz.

Por supuesto, es posible combinar estas formas diferentes mencionadas de alérgenos, por ejemplo, usar al mismo tiempo alérgenos recombinantes y nativos (purificados). La combinación de estas formas diferentes permite

25 compararlas y llevar a cabo un control de los por ejemplo alérgenos recombinantes y también un control de los diversos lotes nativos de alérgenos que pueden variar a causa de las diferencias en las fuentes biológicas, los procedimientos de preparación, la pureza, etc.

Para una prueba altamente eficaz es preferible usar alérgenos que muestren características óptimas, por ejemplo una capacidad de unión elevada. Sin embargo, para la detección de variantes de alérgenos de unión eficaz, por

30 ejemplo, para el uso en técnicas de hiposensibilización, se prefiere usar antígenos con una actividad menor o diferente

Según una forma de realización preferida de la presente invención los alérgenos se inmovilizan en el chip micromatriz en un punto de un diámetro de 10 a 2000 ∀m, preferiblemente un diámetro de 50-500 ∀m, todavía más preferido un diámetro de 150-250 ∀m. Dado que los puntos tienen un diámetro pequeño, es posible inmovilizar una

35 gran cantidad de alérgenos diferentes y varias concentraciones de alérgenos específicos en puntos distintas del chip micromatriz, lo que por tanto permite proporcionar un chip micromatriz que se puede usar en una etapa, automatizada, para analizar un número elevado de alérgenos o de concentraciones alergénicos.

Preferiblemente, los alérgenos se inmovilizan en un soporte sólido, preferiblemente un soporte de vidrio, un soporte sintético, una oblea de silicio y una membrana, respectivamente. Tales chips se pueden producir, por ejemplo, según 40 los procedimientos descritos en Ge, H. (2000), Nucleic Acids Research, 28, e3 (i-vii); Qian W. y col. (2000), Clinical Chemistry, 46 (1456-1463); MacBeath G. y col. (2000), Science, 289, (1760-1763), que se exponen en la presente memoria descriptiva como referencia. Cada uno de estos materiales muestra características y ventajas específicas que son bien conocidas para el experto en la técnica. Por tanto, el material para el chip micromatriz se escogerá según el alérgeno que se va a probar, el procedimiento para la detección de inmunoglobulinas unidas, los tampones

45 usados. Además, la elección de material también es una cuestión económica.

Preferiblemente, el chip micromatriz se modifica químicamente, preferiblemente mediante modificación aminorreactiva y carboxirreactiva, respectivamente. Esto permite determinar con exactitud la forma en la que el alérgeno se une al chip micromatriz.

De un modo ventajoso, los alérgenos se unen covalentemente al chip micromatriz. Esto proporciona una unión

50 estable de los alérgenos al chip micromatriz, proporcionando de este modo un procedimiento que es particularmente fiable.

Según otra forma de realización ventajosa de la presente invención, las inmunoglobulinas IgE se detectan en el suero de la sangre como muestra. En pacientes alérgicos a un alérgeno, las inmunoglobulinas se producen principalmente en el suero sanguíneo, de forma que el análisis del suero sanguíneo proporciona un procedimiento

55 fiable para detectar inmunoglobulinas IgE. Además, el suero sanguíneo se puede obtener de un paciente con facilidad de un modo muy sencillo y la extracción de la muestra se puede llevar a cabo incluso en la casa del paciente.

Preferiblemente, el suero sanguíneo se diluye al 1:1-1:15, preferiblemente al 1:5. La dilución se puede llevar a cabo con cualquier solución adecuada, por ejemplo TBST 1x (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, TWEEN 20 al 0,5%).

De un modo ventajoso, la muestra se incuba de 1 minuto a 24 horas, preferiblemente durante 1-2 horas, con los alérgenos. Por supuesto, es posible incubar la muestra con los alérgenos incluso durante un periodo de días. Sin 5 embargo, esto no tiene como resultado un incremento en la intensidad o la especificidad de la señal. En general, un tiempo de incubación de 1 hora basta para obtener un resultado fiable y sensible.

Además, la muestra se incuba con los alérgenos, preferiblemente, a una temperatura de entre 0ºC y 60ºC, preferiblemente a 37ºC. Las incubaciones a temperaturas inferiores no tienen como resultado un incremento de la señal, sino que conducen a un incremento de la unión inespecífica y el ruido de fondo. Se ha mostrado que una

10 incubación a 37ºC proporciona resultados exactos y fiables para las pruebas con alérgenos en seres humanos.

De un modo ventajoso, la inmunoglobulina IgE unida se detecta con al menos un anticuerpo antiinmunoglobulina IgE específico marcado. Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “anticuerpo” se refiere a moléculas intactas así como a fragmentos de las mismas, tales como Fa, F(ab). Sub. 2 y Fv, que sean capaces de unirse al determinante epitópico. Los anticuerpos se pueden preparar usando como antígeno de inmunización polipéptidos

15 intactos o fragmentos que contienen pequeños péptidos de interés. El polipéptido o el péptido usado para inmunizar a un animal puede derivar de la transición de ARN o se puede sintetizar por medios químicos, y puede conjugarse a una proteína transportadora si se desea. Entre los vehículos usados de forma habitual que están químicamente acoplados a péptidos se incluyen seroalbúmina bovina y tiroglobulina. El péptido acoplado se usa después para inmunizar al animal (por ejemplo, un ratón, una rata o un conejo).

20 En el alcance de la presente invención, el término anticuerpo se refiere a anticuerpos monoclonales o policlonales en los que los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen, aunque no se limitan a ellas, la técnica del hibridoma, la técnica del hibridoma de linfocito B humano y la técnica del hibridoma de IBV.

Además, se pueden producir anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena simple así como anticuerpos 25 producidos por vía sintética.

El anticuerpo se puede marcar según cualquier procedimiento conocido que permita cualificar, y preferiblemente cuantificar, el anticuerpo unido. Entre los marcadores detectables adecuados para usar en la presente invención se incluye cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Entre los marcadores útiles se incluyen biotina para marcar con conjugado de

30 estreptavidina, esferas magnéticas, pigmentos fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rojo texas, rodamina, proteína verde fluorescente y similares), marcadores radiactivos (por ejemplo, 3H, 125I, 35S, 14C o 32P), enzimas (por ejemplo peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina y otras usadas de forma habitual en las técnicas de ELISA) y marcadores colorimétricos tales como oro coloidal o esferas de vidrio o plástico coloreado (por ejemplo, poliestireno, látex de polipropileno, etc.).

35 Los expertos en la técnica conocen bien los medios para detectar tales marcadores. Por tanto, por ejemplo, los marcadores radiactivos se pueden detectar usando películas fotográficas o contadores de centelleo, los marcadores fluorescentes se pueden detectar usando un fotodetector para detectar la luz emitida. Los marcadores enzimáticos se detectan normalmente mediante el suministro a la enzima de un sustrato y la detección del producto de reacción producido por la acción de la enzima sobre el sustrato, y los marcadores colorimétricos se detectan simplemente

40 visualizando el marcador coloreado.

Preferiblemente, las inmunoglobulinas IgE unidas se detectan con al menos un anticuerpo antiinmunoglobulina IgE específico marcado, fluorescente y radiactivo, respectivamente. Estos son procedimientos clásicos para analizar cualitativa y cuantitativamente el anticuerpo IgE unido, que son muy específicos y fiables.

Otros sistemas de detección ventajosos para micromatrices son, por ejemplo, los descritos en Schult K. y col. (1999),

45 Anal Chem, 71 (5430-5435); Vo-Dinh T. y col. (1999), Anal Chem, 71 (358-363); Brignac SJ Jr. y col. (1999), IEEE Eng Med Biol Mag, 18 (120-122); Otamiri M. y col., (1999), Int J Biol Macrfomol, 26 (263-268); Wright, GL Jr. y col. (2000), Prostate Cancer and Prostatic Diseases, 2 (264-276); Nelson RW. y col (2000), Electrophoresis 21 (11551163); Rich RL. y col. (2000), Curr Opin Biotechnol 11 (54-61); Chen JJ. Y col. (1998), Genomics, 51 (313-324), publicaciones que se adjuntan a la presente memoria descriptiva como referencia.

50 De forma ventajosa, uno o más alérgenos de interior se inmovilizan como alérgenos. Estos pueden ser, aunque no se limita a ellos, ácaros, Tyr. Put, Lep. dest. O mayrei, Felis, Bos, albúmina, Pen. cit, Pen. not, Asp. fumigatus, Alt. alt., Malassezia furfur, látex, Plodia, Blatella.

Según otra forma de realización preferida, uno o más alérgenos de exterior se inmovilizan como alérgenos. Estos pueden ser, aunque no se limita a ellos, abedul, enebro, fleo, Parietaria judicea.

55 Además, uno o más alérgenos alimentarios se pueden inmovilizar como alérgenos. Ejemplos son apio zanahoria, cacahuete, manzana, gamba, pescado.

Además, uno o más alérgenos de venenos se pueden inmovilizar como alérgenos. Estos pueden ser, aunque no se limita a ellos, veneno de abeja o de avispa.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para el diagnóstico in vitro de alergias en un paciente, en el que una muestra de suero del paciente es analizada en busca de inmunoglobulinas IgE que se unan 5 a los alérgenos según un procedimiento mencionado anteriormente de acuerdo con la presente invención, donde se usa un chip micromatriz en el que se inmovilizan al menos 10, preferiblemente al menos 50, todavía más preferido al menos 90, alérgenos diferentes, después de lo cual una reacción positiva entre la muestra y los alérgenos inmovilizados se diagnostica como una alergia. Las definiciones y ventajas mencionadas anteriormente se refieren también a este procedimiento para el diagnóstico in vitro de alergias en comparación con los procedimientos 10 conocidos para diagnosticar alergias. El presente procedimiento muestra la ventaja de que una gran cantidad de alergias se pueden diagnosticar de forma simultánea con sólo una muestra, ya que todos los alérgenos que se van a probar se inmovilizan en un único chip micromatriz. Por tanto, cada etapa se lleva a cabo sólo en un chip, donde el chip puede comprender puntos sin alérgenos inmovilizados y, por tanto, permitir la detección negativa simultánea, La cantidad de alérgenos que se van a probar no es limitada y, por supuesto es posible proporcionar dos o más chips

15 micromatrices.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un chip micromatriz en la que se inmovilizan uno o más alérgenos purificados para la detección de inmunoglobulinas IgE. Asimismo, en este aspecto se aplican las definiciones y ventajas mencionadas anteriormente.

Preferiblemente, los alérgenos se inmovilizan en un punto de 100 a 500 ∀m de diámetro, preferiblemente de 200-300 20 ∀m de diámetro.

Todavía más preferiblemente, el chip micromatriz es un soporte de vidrio, un soporte sintético, una oblea de silicio y una membrana, respectivamente.

De forma ventajosa, el chip micromatriz se modifica químicamente, preferiblemente mediante modificación aminorreactiva y carboxirreactiva, respectivamente.

25 De forma ventajosa, los alérgenos están covalentemente unidos al chip micromatriz.

Otro aspecto según la presente invención se refiere al uso de un kit que comprende un chip micromatriz según la presente invención como se ha mencionado anteriormente y un primer agente que comprende al menos un reactivo detector de inmunoglobulina, preferiblemente un anticuerpo antiinmunoglobulima, preferiblemente a una concentración conocida, y posiblemente un segundo reactivo como muestra positiva que comprende al menos una 30 inmunoglobulina que se una a un alérgeno. El primer reactivo que comprende el al menos un reactivo detector de inmunoglobulina, preferiblemente un anticuerpo antiinmunoglobulina, puede usarse para la detección de una inmunoglobulina unida, en cuyo caso el anticuerpo antiinmunoglobulina está marcado preferiblemente como se ha mencionado antes. Preferiblemente, en el primer reactivo un anticuerpo está presente a una concentración conocida, lo que permite proporcionar resultados reproducibles. Además, el kit comprende, preferiblemente, un segundo

35 reactivo como muestra positiva, que comprende al menos una inmunoglobulina IgE que se une a un alérgeno. También aquí es preferible que la inmunoglobulina IgE esté presente a una concentración conocida en el segundo reactivo, permitiendo de este modo cuantificar la inmunoglobulina IgE presente en la muestra al comparar los resultados de la muestra del paciente con los resultados de la muestra positiva (el segundo reactivo).

Preferiblemente, el kit se proporciona para llevar a cabo un procedimiento según la presente invención como se ha

40 mencionado antes. Para esto, el primero y el segundo reactivo pueden diseñarse con el fin de detectar una inmunoglobulina IgE específica que se una a un alérgeno específico o una alergia específica en un paciente. Sin embargo, el kit también puede diseñarse para detectar una variedad de inmunoglobulinas IgE que se unan a alérgenos específicos o para diagnosticar una variedad de alergias en un paciente.

A continuación se describe la presente invención con más detalle con los siguientes ejemplos y figuras, a las que, 45 por supuesto, no está limitada

La Fig. 1 muestra una ilustración de una micromatriz de alérgenos;

La Fig. 2 muestra una imagen de barrido de una matriz de alérgenos analizada con suero de una persona alérgica;

Las Fig. 3a-3c muestra diagrama de dispersión de un ensayo por triplicado.

50 Las Fig. 4a-4c muestran el % de fluorescencia medido para extracto inmovilizado y alérgenos recombinantes inmovilizados.

Ejemplo 1

Aplicación de gotas de alérgenos

Los alérgenos se dispusieron en una matriz usando un dispositivo para aplicación de gotas GMS 417 de Genetic Microsystems. Las proteínas se rocían en portaobjetos de vidrio derivatizado. Los alérgenos se aplican a un valor de 5 una gota por punto y por triplicado. Los puntos (características) mostraron un diámetro de aproximadamente 200 ∀m.

Los alérgenos se juntaron en grupos funcionales del siguiente modo: (A) de exterior (I. Árboles [1= rBetv1, 2= rBtev2, 3= rBetv4, 4= rJun02, 5= Cass1], II. Hierbas [6=rPhlp2, 7= rPhlp4, 8= rPhlp5a, 9= rPhlp1, 10= rPhlp6, 11= rPhlp7, 12= rPhlp11, 13= rPhlp12], III. WEEDS [14= rParj2, 15=Artv1a, 16= Mugwort profilina]).

(C)

Alérgenos de alimentos (X. Vegetales [17= Apig1, 18= Apig2.0201, 19= Daucl.2, 20= rArah2, 21= rArah5], XI. 10 Frutas [22=Mald1, 23= Mald2], XII. Gambas [24= rPena1], XIII. Pescados [25= recCarp]).

(B)

De interior (IV. Ácaros [26= rDerp1, 27= rDerp2.0101, 28= rDerp2, 29= rDerp2b, 30= rDerp5, 31= rDerp5a, 32= rDerp7, 33= rDerp8, 34= rDerp10, 35= rTyrp2], V. Animales [36= rLepd2.01, 37= rLepd13, 38= rEum2.0101, 39= rFeld1, 40= rFeld1z, 41= rBosd2, 42= un alérgeno representativo procedente de un gato, 43= un alérgeno representativo procedente de un perro, 44= BSA, 45= un alérgeno representativo procedente de ratón, 46= alérgeno 15 representativo procedente de rata, 47= alérgeno representativo procedente de cerdo, 48= alérgeno representativo procedente de oveja, 49= alérgeno representativo procedente de pollo, 50= alérgeno representativo procedente de conejo, 51= alérgeno representativo procedente de hámster, 52= alérgeno representativo procedente de caballo, 53= alérgeno representativo procedente de paloma, 54= guineaalbúmina, VI, Mohos [55= rPenc3, 56= rPenc19a, 57= rPenc19b, 58= Penn13, 59= rAspf1, 60= rAspf3, 61= rAspf4, 62= rAspf6, 63= rAspf1a, 64= rAspf3a, 65= rAspf4a,

20 66= rAspf6a, 67= rAspf7, 68= rAspf8, 69= rAlta1, 70= rALta2], VII. Levaduras [71= rMalf7, 72= Malf71, 73= Malf5, 74= Malf6, 75= Malf8, 76= Malf9], VIII. Látex [77= rHevb1, 78= rHevb1a, 79= rHevb3, 80= rHevb8, 81= rHevb9, 82= rHevb10, 83= rHevb11], IX. Insectos [84= rAK, 85= rBlag2, 86= rBlag4, 87= rBlag5]),

(D) Venenos (XIV. Abeja [88= Ag5, 89= Fosfolipasa A, 90= Hialuronidasa, 91= rVesv5, 92= rVesg5], XV. Avispa [93= Ag5]),

25 (E) Autoalérgenos (94= HSA, 95= a-NAC).

Además, se interpusieron puntos con tampón entre los subgrupos de los alérgenos que sirven como control, marcados como X, el anticuerpo marcado se indica como “ab”. (Fig. 1: 1864x1182 pixels, 1,86x1,18 cm, 1000 pixels por cm, píxel profundidad/colores 8/256, 1 píxel corresponde a 10 ∀m).

Se tomaron alícuotas de 100 ∀l de los alérgenos y se repartieron en los pocillos de un aplaca de microtitulación de

30 96 pocillos a una concentración de #200 ng/ ∀l en tampón de aplicación de gotas (fosfato sódico 300 nM, pH 8,5). La concentración óptima para la inmovilización de los alérgenos se calculó a partir de experimentos de titulación con diversos alérgenos en diferentes soluciones tampón así como en diferentes portaobjetos. Las proteínas analizadas exhibieron un comportamiento de saturación a concentraciones iguales o superiores a 100 ng/∀l, como se hizo evidente con la observación de una fuerte señal constante blanca al realizar un barrido con un dispositivo GMS. A

35 esta concentración, el comportamiento de unión de los alérgenos fue independiente de la composición del depósito así como del tampón de aplicación de gotas.

Ejemplo 2:

SOPHIA (Ensayo de inmunosorción en fase sólida)

Después de la incubación durante la noche, los portaobjetos obtenidos de CEL Associates (portaobjetos con

40 aldehído) o preparados internos se lavaron en 1xTBST (TrisHCl 10 mM, pH 8,0/NaCl 150 mM/Tween 20 al 0,5%) con agitación enérgica en un tubo Falcon a temperatura ambiente. Como etapa bloqueantes, los portaobjetos se transfirieron a una solución de 1xTBST con BSA al 0,01% durante 2 horas a temperatura ambiente. Los portaobjetos se fueron lavando sucesivamente en 1 x TBST durante 15 minutos y se enjuagaron en agua destilada durante un tiempo breve.

45 La matriz de alérgenos se incubó con suero diluido (¡:5 en 1 xTBST) durante (Al menos) 60 minutos a 37ºC con agitación. Se han probado varios grados de dilución del suero, variables desde 1:1 a 1:15. Por lo general, una dilución de 1:5 dio los mejores resultados. A los portaobjetos en Cámaras de sellado a presión obtenidas de SIGMA Technologies, se añadieron 30 ∀l de suero diluido. Las cámaras se usaron siguiendo el protocolo de los fabricantes. Se analizaron varios tiempos de incubación para el suero, variables desde 60 minutos hasta toda la noche. Sin

50 embargo, una incubación extensa no tuvo como resultado un incremento de la intensidad o la especificidad de la señal. Después de la incubación con suero, los portaobjetos se lavaron con 1 xTBST (15 minutos, temperatura ambiente) con agitación.

Para una prueba de referencia de la matriz de alérgenos se escogieron de forma adecuada cinco sueros diferentes de pacientes alérgicos que se habían analizado con pruebas diagnósticas convencionales (prueba de punción cutánea, RAST, ELISA) y un suero de un paciente no atópico. Los sueros individuales se analizaron al menos dos veces en diferentes matrices de alérgenos producidas por lotes.

A la matriz de alérgenos se añadió anticuerpo IgE ∃ marcado para fluorescencia con el pigmento fluorescente AlexaFluor siguiendo el protocolo del fabricante (Molecular Probes) en una solución con BSA al 0,01%/1 x TBST y se

5 incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente. Las soluciones a usar para el anticuerpo variaron desde 1:1000 a 1:5000, según el tiempo y la eficacia del marcaje. Después del inmunoensayo, los portaobjetos se lavaron con 1 x TBST (15 minutos, temperatura ambiente, agitación) y se enjuagaron brevemente con agua destilada.

Después del ensayo de inmunosorción, los portaobjetos se evaluaron en un SCANNER GMS de dos colores. En general, las intensidades de la señal sólo variaron ligeramente entre los diferentes ensayos y los distintos 10 portaobjetos. Sin embargo, los valores generales sí diferían en función del tipo de portaobjeto usado. En la Figura 2 se representa un ejemplo de una imagen de barrido de una matriz de alérgenos analizada con suero de un paciente con alergia. Este paciente muestra una fuerte reacción con Fleo, ácaros, Felis y abejas (cf. Fig. 1). No se observaron señales causadas por una interacción inespecífica con los puntos con tampón ni con los autoalérgenos. Tras la evaluación completa de los sueros del paciente alérgico, los resultados se compararon con los datos preliminares

15 obtenidos para sueros idénticos usando pruebas RAST. Los datos obtenidos con el procedimiento según la presente invención eran acordes con los conjuntos de datos disponibles.

Ejemplo 3:

Prueba de reproducibilidad para análisis del suero del paciente C

El suero de un paciente C se analizó tres veces en micromatrices de alérgenos preparadas de forma individual. El 20 procedimiento experimental fue esencialmente como se ha descrito antes.

Después del ensayo, los portaobjetos se sometieron a técnicas de barrido usando parámetros de hardware idénticos. El análisis de los datos se realizó con el paquete de software GenePix. Los valores medios calculados de las intensidades de la señal para cada alérgeno por triplicado se compararon después de tres repeticiones del experimento.

25 Para el análisis final se escogieron sólo los valores correspondientes a las señales que eran al menos más de 1,5 veces mayores que el valor medio de las señales del punto con tampón. El valor medio, la desviación estándar y el porcentaje de desviación estándar para las señales importantes se representan en la Tabla 1.

Tabla 1 La desviación estándar media calculada a partir de los valores obtenidos después de tres ensayos individuales fue 12,36%. Esto significa que el ensayo basado en matriz, cuestionando la presencia de IgE en los sueros de los pacientes, es altamente reproducible. Esto también es evidente al estudiar las gráficas de dispersión derivadas del

Alérgeno

Prueba 1 Prueba 2 Prueba 3 Valor medio Desv. estándar % medio

rBet v1

20731 21325 25060 2237200 1916,11 8,56

rPhl p 2

17176 15529 14227 15644,00 1206,67 7,71

rPhl p 4

36134 33511 29328 32991,00 2802,76 8,50

rPhl p 5a

56600 53068 55594 55087,33 1485,77 2,70

rPhl p 6

56244 51359 37625 48409,33 7882,14 16,28

rPhl p 12

6291 7003 12289 8527,67 2675,50 31,37

rPar j 2

7552 7678 9444 8224,67 863,73 10,50

Art v 1a

6997 7931 11258 8728,67 1828,70 20,95

Mugwortprofilina

7901 7669 9260 8276,67 701,74 8,48

Mal d 1

9890 15295 8176 11120,33 3033,74 25,28

HSA

9868 8732 10708 9769,33 809,71 8,29

Albúmina de oveja

9858 8295 10222 9458,33 835,92 8,84

Albúmina de caballo

9602 9061 10559 9740,67 619,37 6,36

rAsp f 1 (b)

12216 10129 10781 11042,00 8701,77 7,90

rMal f 5

13459 11018 12035 12170,67 1001,14 8,23

rAK

20680 14202 19978 18286,67 2902,48 15,87

5 ensayo triple 3,s. Las figuras 3a-3c, en las que la Fig. 3a muestra un diagrama de dispersión de la Prueba 1 frente a la Prueba 3, la Figura 3b es un diagrama de dispersión de la Prueba 2 frente a la Prueba 3 y la Fig. 3c es un diagrama de dispersión de la Prueba 1 frente a la Prueba 2; A muestra los alérgenos e FI la intensidad de la fluorescencia.

Ejemplo 4:

10 Comparación de micromatrices diferentes

Para comprobar el portaobjetos óptimo para la presente invención, se evaluaron portaobjetos preparados individualmente según una serie de criterios que se resumen a continuación:

% Proceso de producción: Los portaobjetos preparados se avaluaron según una serie de parámetros, tales como el requerimiento de sustancias químicas peligrosas y el tiempo de producción. 15 % Coste de producción: los portaobjetos producidos de forma interna y los portaobjetos comercialmente disponibles se compararon según sus costes. % Capacidad de unión: se evaluaron diferentes portaobjetos según la capacidad de unión de una proteína marcada. % Reproducibilidad: se llevaron a cabo experimentos con portaobjetos previamente tratados de forma diferente y 20 se evaluaron según el rendimiento global del ensayo. % Información general: todos los portaobjetos se evaluaron antes y después de un ensayo de alergia para un barrido sistemático de la superficie que podría disminuir la proporción entre señal y ruido. % Límite de detección: Todos los portaobjetos se evaluaron para determinar la concentración mínima proteica detectable por punto en un ensayo de selección de alergia.

25 % Tolerancia al suero: En general el suero de un paciente es una compleja mezcla de proteínas que a menudo interfiere de forma negativa con un inmunoensayo basado en micromatrices con diferentes lotes de suero de pacientes.

% Bloqueo: Todos los portaobjetos se evaluaron para determinar la necesidad de una etapa de bloqueo previa al ensayo de alergia. 30 % Almacenamiento; Todos los portaobjetos se avaluaron para determinar el almacenamiento a largo plazo después de haber producido una matriz de alérgenos.

Los resultados del estudio de evaluación mencionado antes se representan en la tabla 2:

Tabla 2

Química de la superficie reactiva/tipo de portaobjetos

Producción Coste Cap. de unión Especificidad Reproductibilidad Información general Límite de detección Detección selectiva de alergia Bloqueo/a coplamiento Almacenamiento

Proteo Bind

+ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ No -

CEL (1)

/ ++ ++ ++ - - + ++ Sí ++

3D-Link (2)

/ - ++ ++ + + + - Sí -

Superaldehído (1)

/ - + + ++ - + + Si ++

Aminosilano (3)

+ ++ + + - - + + No ++

Glioxal (3)

- + ++ ++ - - + ++ Sí ++

EGS (3)

- +/ ++ ++ - - + + No -

Sulfo KMUS (3)

- +/ ++ + / - / / No /

Glutaraldehído (3)

- +/ / / - - / / / ++

Fotorreticulante (3)

- +/ + + / - / / / /

PEI/EGS (3)

- - ++ + + + / / / /

Portaobjetos FAST

/ - + - - - - - No ++

Portaobjetos CAST

/ - + + + - - -- Sí ++

Vidrio no modificado

+ ++ - / - ++ - / / /

Tabla 2. Se representan los resultados del estudio de evaluación descrito en el texto. (++) quiere decir resultado excelente, (+) bueno, (-) menor, (--) malo. (/) significa que el portaobjetos no se ha analizado para esa determinada 5 categoría. (1) portaobjetos que contienen una superficie funcional con grupos aldehído. (2) portaobjetos que contienen una superficie aminorreactiva, cuyas propiedades químicas exactas no se conocen. (3) portaobjetos producidos de forma interna con grupos funcionales como los mencionados en la tabla 2. (4) Portaobjetos que contienen una membrana para inmovilización de proteínas. Proteobind es el título para la derivatización de la superficie adaptada para un rendimiento optimizado de un diagnóstico de alergia basado en una micromatriz y

10 comprende (1-[3’’-[trimetoxilil)propil]-1’(4``-isotiocianatofenil)tiourea), que se preparó según Chen y col. (Nucleic Acids Research, 199, vol. 27, nº 2), que se incorpora en la presente memoria descriptiva como referencia.

Según el estudio de evaluación presentado antes, Proteobind se seleccionó como una derivatización de superficie superior para la producción de micromatrices de alérgenos.

Ejemplo 5:

15 Comparación de la detección de inmunoglobulina en una muestra con alérgenos recombinantesinmovilizados y con extracto inmovilizado

Con el fin de probar la sensibilidad y la información relevante para el diagnóstico de los alérgenos recombinantes purificados inmovilizados en una micromatriz y de extracto de alérgeno inmovilizado en una micromatriz, se compararon alérgenos específicos de una fuente con un extracto de alérgeno de la misma fuente.

20 Tras la inmovilización de las composiciones alergénicas en una micromatriz, muestras diferentes que comprendían dichos sueros específicos se añadieron a la micromatriz y se midió la fluorescencia que corresponde a la cantidad de anticuerpo unido a los alérgenos. Los resultados se muestran en las tablas 3, 4 y 5, así como en las figuras 4a, 4b y 4c, donde “FL” es el % de fluorescencia. De estos resultados se deduce claramente que en el caso de los alérgenos recombinantes, la detección y cuantificación es mucho más sensible que en el caso de los extractos de alérgenos.

25 La intensidad de la fluorescencia de un único antígeno recombinante es claramente superior a la intensidad de fluorescencia del extracto. Además, en el caso del extracto sólo se puede probar la fuente del extracto y no es posible probar cual antígeno específico de la fuente es el responsable de la alergia, al contrario de lo que ocurre con la detección con alérgenos recombinantes.

Por tanto, el procedimiento de la invención con alérgenos purificados únicos, en particular alérgenos recombinantes, 30 presenta muchas ventajas sobre los extractos que comprenden alérgenos.

Tabla 3

Gráfico 1

Suero 1-Sp Suero 4-Sp Suero 19-S Suero 30-S

Bet v 1a

52028 62529 62932 18847

Bet v 1a Mut

6590 237 905 139

Bet v 1d

1576 14352 252 89

Bet v 2

2196 1408 273 1253

Extracto BP

21013 39438 11390 3174

Tabla 4

Gráfico 2

Suero 5-Sp Suero 7-Sp Suero 9-S Suero 17-S Suero 18-S Suero 40-S

Phl p I

45611 21148 21588 5838 23497 23424

Phl p II

209 52043 814 2562 10984 14753

Phl p V

64005 63481 62953 40770 63530 62029

Extracto Phl

63987 40318 14504 10183 44405 10798

Tabla 5

Gráfico 3

Suero 11-Sp Suero 16-Sp Suero 39-S Suero 40-S

Hev b 3

416 387 108 235

Hev b 5-Mal

350 519 30601 62897

Hev b 8

11146 7977 134 853

Hev b 9

460 631 105 188

Hev b 10

360 429 73 152

Extracto de Látex B

264 202 80 3426

Extracto de Látex C

769 866 5343 30970

Claims (30)

1. REIVINDICACIONES

   1.-Un procedimiento para la detección de una inmunoglobulina IgE que se une a un alérgeno en una muestra, caracterizado porque uno o más alérgenos únicos purificados se inmovilizan en un chip micromatriz, después de lo cual la muestra se incuba con los alérgenos inmovilizados de forma que las inmunoglobulinas IgE que son específicas de los alérgenos se unen al alérgeno específico, tras lo cual se detectan las inmunoglobulinas IgE que está unidas a los alérgenos inmovilizados específicos.
2. 2.-El procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque en el chip micromatriz se inmovilizan uno o más alérgenos recombinantes.
3. 3.-El procedimiento según las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque en el chip micromatriz se inmovilizan uno o más alérgenos producidos de forma sintética.
4. 4.-El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque en el chip micromatriz se inmovilizan uno o más haptenos como alérgenos.
5. 5.-E procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los alérgenos se inmovilizan en un punto de 10 a 2000 ∀m de diámetro en el chip micromatriz.
6. 6.-El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los alérgenos se

   inmovilizan en un punto de 50 a 500 ∀m de diámetro, preferiblemente un diámetro de 150-250 ∀m, en el chip micromatriz.
7. 7.-El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque los alérgenos se inmovilizan en un soporte sólido como chip micromatriz.
8. 8.-El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque los alérgenos se inmovilizan en un soporte de vidrio y sintético, respectivamente, como chip micromatriz.
9. 9.-El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque los alérgenos se inmovilizan en una oblea de silicio como chip micromatriz.
10. 10.-El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque los alérgenos se inmovilizan en una membrana como chip micromatriz.
11. 11.-El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el chip micromatriz está químicamente modificado, preferiblemente mediante modificación aminorreactiva y carboxirreactiva, respectivamente.
12. 12.-El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque los alérgenos están unidos de forma covalente al chip micromatriz.
13. 13.-El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque las inmunoglobulinas se detectan en suero sanguíneo como muestra.
14. 14.-El procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque el suero sanguíneo está diluido a 1:1 a 1:15, preferiblemente a 1:5.
15. 15.-El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque la muestra se incuba con los alérgenos de 1 minuto a 24 horas, preferiblemente de 1 a 2 horas.
16. 16.-El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque la muestra se incuba con los alérgenos a una temperatura de entre 0 y 60ºC, preferiblemente a 37ºC.
17. 17.-El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque las inmunoglobulinas unidas se detectan con al menos un anticuerpo específico antiinmunoglobulina marcado.
18. 18.-El procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque las inmunoglobulinas unidas se detectan con al menos un anticuerpo específico antiinmunoglobulina marcado con fluorescencia.
19. 19.-El procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque las inmunoglobulinas unidas se detectan con al menos un anticuerpo específico antiinmunoglobulina marcado radiactivo.
20. 20.-El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque uno o más alérgenos de interior se inmovilizan como alérgenos.
21. 21.-El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque uno o más alérgenos de exterior se inmovilizan como alérgenos.
22. 22.-El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque uno o más alérgenos de alimentos se inmovilizan como alérgenos.
23. 23.-El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque uno o más alérgenos de venenos se inmovilizan como alérgenos.

    5 24.-Un procedimiento para el diagnóstico in vitro de alergias en un paciente, caracterizado porque se analiza una muestra de suero del paciente para determinar las inmunoglobulinas IgE que se unen a alérgenos según un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, donde se usa un chip micromatriz sobre el cual se inmovilizan al menos 10, preferiblemente al menos 50, todavía más preferiblemente al menos 90, alérgenos diferentes, tras lo cual se diagnostica una reacción positiva entre la muestra y los alérgenos inmovilizados

    10 como una alergia.
24. 25.-El uso de un chip micromatriz en el que se inmovilizan uno o más alérgenos únicos purificados para la detección de inmunoglobulinas IgE.
25. 26.-El uso de un chip micromatriz según la reivindicación 25, caracterizado porque los alérgenos se inmovilizan en un punto de un diámetro de 100-500 ∀m, preferiblemente un diámetro de 200-300 ∀m.

    15 27.-El uso de un chip micromatriz según la reivindicación 25 ó 26, caracterizado porque este es un soporte de vidrio.
26. 28.-El uso de un chip micromatriz según la reivindicación 25 ó 26, caracterizado porque este es un soporte sintético.
27. 29.-El uso de un chip micromatriz según la reivindicación 25 ó 26, caracterizado porque este es una oblea de 20 silicio.
28. 30.-El uso de un chip micromatriz según la reivindicación 25 ó 26, caracterizado porque este es una membrana.
29. 31.-El uso de un chip micromatriz según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 30, caracterizado porque este está modificado químicamente, preferiblemente mediante modificación aminorreactiva y carboxirreactiva, respectivamente.

    25 32.-El uso de un chip micromatriz según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 31, caracterizado porque los alérgenos están covalentemente unidos a él.
30. 33.-El uso de un kit para llevar a cabo un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque este comprende un chip micromatriz en el que uno o más uno o más alérgenos purificados individuales se inmovilizan y un primer reactivo que comprende al menos un reactivo de detección de

    30 inmunoglobulina, preferiblemente un anticuerpo anti-inmunoglobulina, preferiblemente en una concentración conocida, y posiblemente un segundo reactivo como muestra positiva que comprende al menos una inmunoglobulina que se une a un alérgeno.