ES2234909T3 - Procedimiento de ensayo de alergenos con micromatrices. - Google Patents
Procedimiento de ensayo de alergenos con micromatrices.Info
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Abstract
Un procedimiento para la detección de una inmunoglobulina que se une a un alergeno en una muestra, caracterizado porque uno o más alergenos únicos purificados se inmovilizan en un chip micromatriz, después de lo cual la muestra se incuba con los alergenos inmovilizados de forma que las inmunoglobulinas que son específicas de los alergenos se unen al alergeno específico, tras lo cual se detectan las inmunoglobulinas que está unidas a los alergenos inmovilizados específicos.
Description
Procedimiento de ensayo de alergenos con
micromatrices.
La presente invención trata de un procedimiento
para la detección de una inmunoglobulina que se une a un alergeno en
una muestra, así como a un procedimiento para el diagnóstico in
vitro de alergias en un paciente.
Una alergia es una reacción producida por el
sistema inmunológico del organismo a una sustancia que normalmente
se consideraría como inocua. Es esta respuesta la que causa los
síntomas que se clasifican como reacciones alérgicas. Por tanto, la
alergia no es un fallo del sistema inmunológico sino que es una
sobreactividad del mismo. La respuesta de una persona alérgica a un
alergeno puede producir un amplio abanico de síntomas. Algunas
personas sufren síntomas tales como asma, eczema, exantemas, picor
de ojos, sinusitis, nariz tapada o rinorrea y fiebre del heno, sin
embargo se pueden producir síntomas más serios. Con alergias tales
como, por ejemplo, las que se producen frente a los venenos, las
nueces y los mariscos se puede producir un estado potencialmente
mortal denominado choque anafiláctico. Esto sucede cuando el cuerpo
produce una reacción tan intensa que la garganta se inflama, la
presión arterial disminuye y la persona tiene dificultades para
respirar. En algunos casos, este tipo de reacción puede ser
mortal.
En los países desarrollados, la incidencia de
alergias es cada vez mayor (es decir, en Europa, Norteamérica y
Japón). Se ha estimado que afecta a un intervalo del
20-50% de la población. En la actualidad se sabe que
las alergias son el resultado de un desequilibrio en el
compartimento de las células T del sistema inmunológico. Más
exactamente, las alergias se acompañan de un aumento de la actividad
de las células T denominadas colaboradoras de tipo 2 (Th2) con
respecto a las células T colaboradoras de tipo 1 (Th1), lo que da
lugar a un incremento de la producción de IgE.
La IgE (inmunoglobulina E) es al menos una de las
sustancias que causan reacciones alérgicas. La IgE específica de un
alergeno normalmente no se detecta en sangre y sólo se produce
cuando una persona se sensibiliza frente a una sustancia. Las
sustancias que causan alergia (Denominadas alergenos) producen una
IgE específica que es única y sólo reaccionara con su alergeno. Esta
reacción entre la IgE y el alergeno es como una llave y una
cerradura. La IgE, cuando se combina con el alergeno, hace que las
células liberen sustancias químicas (por ejemplo histamina) que
producen síntomas de alergia. Una persona puede tener IgE específica
de más de una sustancia y puede, por tanto, ser alérgica a más de
una sustancia. Los resultados de una prueba de IgE se expresan cono
un grado que indica cuánta cantidad de IgE específica de la
sustancia que se está probando está presente en la sangre. Cuanto
más elevado es el grado, la probabilidad de que el paciente sea
alérgico es mayor. Durante las últimas décadas las enfermedades
alérgicas se han diagnosticado usando extractos purificados sólo
ligeramente derivados de las fuentes principales de alergenos.
Obviamente, estas mezclas en bruto son complejas y de composición
variable. Como consecuencia de ello, el potencial diagnóstico de
estos extractos puede variar y conducir a la producción de
resultados falsos negativos. Esto último se ha atribuido
principalmente a la inestabilidad de los alergenos en los extractos.
Otro inconveniente del uso de extractos en el diagnóstico de las
alergias es la mala normalización de los productos disponibles en el
mercado en relación con su composición alergénica. Las unidades de
expresión de la potencia y los métodos de cálculo son diferentes
para cada empresa del mercado. Como consecuencia, apenas se pueden
comparar productos diagnósticos procedentes de distintas
empresas.
Durante las últimas décadas se han identificado
los componentes más importantes relacionados con la enfermedad, los
alergenos mayoritarios, aunque su cuantificación no se usa como base
para la normalización de los extractos de alergenos. En la
actualidad se dispone de anticuerpos monoclonales frente a la
mayoría de los alergenos mayoritarios.
La prueba de alergia según procedimientos
conocidos no es un procedimiento directo. Estos procedimientos
pueden ser procedimientos útiles siempre que se conozca el historial
del paciente para poder identificar las pruebas que serán más
adecuadas. Sin embargo, sólo hay algunas pruebas médicas reconocidas
que puedan identificar alergias y, como norma general, su uso se ha
restringido a laboratorios clínicos o a centros especialistas.
Aunque el diagnóstico de atopia o alergia por parte de un médico
experto o de un alergólogo puede establecerse con facilidad, a
menudo se requieren más pruebas para confirmarlo.
Existen varios tipos de pruebas de alergia:
Los alergenos a los que se sospecha que el
paciente es alérgico se inyectan justo debajo de la superficie de la
piel y un profesional de enfermería o médico experto observará la
reacción. A medida que la reacción se desarrolla aparece una zona
enrojecida, cuanto más fuerte es la reacción, mayor es la zona. La
prueba cutánea es bastante sensible, aunque no todas las alergias se
pueden identificar mediante este procedimiento.
La prueba con parches puede ser muy útil en los
casos de dermatitis de contacto. Por lo general, las sustancias que
se van a probar se aplican a la piel cubiertas por un parche y se
deja en el sitio durante 48 horas. Una reacción positiva produce una
pequeña zona de eccema. De nuevo, un profesional de enfermería o
médico experto observará la reacción.
Hay muchos tipos alternativos de pruebas de
alergia y, por desgracia, pocas son exactas o están reconocidas por
la profesión médica. Estas pruebas alternativas a menudo conducen a
confusiones y son caras.
La prueba de Vega es una prueba eléctrica que se
describe como una técnica reguladora bioenergética. La máquina mide
la conductividad con un circuito Wheatstone. Los electrodos se
conectan a puntos de acupuntura o se dejan en la mano del paciente,
Después se colocan soluciones diferentes en una bandeja metálica. A
continuación, la máquina se calibra mediante la colocación en la
bandeja de un vial de vidrio con una sustancia tóxica. El vial
produce una reducción de la conductividad eléctrica. Después se
colocan en la bandeja otras sustancias y si proporciona una lectura
similar se registra como una reacción alérgica o "de
sensibilidad". Esta técnica se usa mucho en almacenes de
alimentos sanos, sin embargo su valor no se ha probado y no hay
estudios válidos que sostengan las reclamaciones
La prueba leucocitotóxica implica mezclar los
leucocitos del paciente con un extracto de alimento específico y
después medir las células de varias formas para detectar signos de
alguna forma de cambio, Se produce un número elevado de reacciones
falsos positivos y falsos negativos y la Academia Americana de
Alergias (American Academy of Allergy) concluyó que no había signos
de que la prueba fuera eficaz para el diagnóstico de alergias a
alimentos o inahalante.
Otra forma de prueba es el análisis del pelo. El
pelo se puede analizar para determinar la presencia de metales
tóxicos tales como plomo, mercurio y cadmio o niveles bajos de
selenio, cinc, cromo, manganeso y magnesio. El envenenamiento por
metales pesados está bien reconocido y documentado en la ciencia
forense y el análisis del pelo puede indicar exposición a metales.
Sin embargo, los análisis del pelo como medio para diagnosticar
alergias, mediante procedimientos como "radiestesia", nunca se
han validado.
Se toman muestras de alimentos y se colocan
debajo de la lengua del paciente o en su mano dentro de un
recipiente de vidrio. A continuación se pide al paciente que empuje
su brazo libre contra el brazo del médico que está realizando la
prueba. SI se detecta una respuesta alérgica, esta se manifiesta
como una reducción de la respuesta muscular y el paciente
experimenta dificultad para levantar el brazo. Esta técnica no
resiste un estudio a doble ciego.
Además, existen varios procedimientos in
vitro para diagnosticar alergias que detectan la presencia de
anticuerpos IGE o IgG en la sangre de un paciente.
8. Los procedimientos convencionales tales como
ELISA o técnicas Western blot se usan para detectar la presencia de
anticuerpos (IgE) en el suero de un paciente con la ayuda de
alergenos (recombinantes).
En este procedimiento se acopla un alergeno a un
disco de papel, la IgE inmunoespecífica, si hay en el suero de
prueba (el del paciente), se unirá al disco; la detección se lleva a
cabo con antiIgE radiomarcada. Se están usando diferentes sistemas
de puntuación que comparan los resultados de la prueba con la unión
absoluta de un control negativo. Por lo general, el procedimiento
RAST® modificado se sigue de incubación durante la noche y tiene
como resultado una sensibilidad mayor.
10. Experimentos de inhibición cuantitativa de
IgE basados en la prueba RAST en los que el extracto del alergeno se
aplica salpicando con él tiras de nitrocelulosa. Alícuotas de sueros
se incuban previamente con una mezcla de alergenos recombinantes
específicos, tras lo cual esta mezcla se incuba en las tiras de
nitro celulosa. La IGE unida se detecta con anticuerpos anti IgE
humana. En una última etapa se calcula el porcentaje de inhibición
de la unión de IgE a los extractos naturales después de la absorción
previa con alergenos recombinantes.
11. Prueba de estimulación con antígenos
celulares (CAST), según la cual las células basófilas del paciente
se estimulan con interleucina 3 y alergeno, seguido por la medición
en un ELISA del suldifoleucotrieno (SLT) generada de novo y
liberada.
12. UniCAP: alergenos recombinantes se
inmovilizan en una estructura de fase sólida tras lo cual se detecta
la unión de los anticuerpos que están presentes en el suero de un
paciente a los alergenos.
Sin embargo, estos procedimientos requieren una
multitud de etapas experimentales individuales con el fin de probar
un número mayor (por ejemplo 100) de alergenos diferentes. Además,
estas pruebas mencionadas antes no muestran una sensibilidad y una
fiabilidad lo bastante elevadas y su realización lleva mucho tiempo.
Asimismo, las cantidades de alergenos de muestra (por ejemplo, el
suero de un paciente), así como purificados, posiblemente
recombinantes, y caros que son necesarias para llevar a cabo estas
pruebas son grandes.
El documento US 4 444 879 se refiere a
procedimientos y aparatos para realizar inmunoensayos para
determinar la inmunoglobulina total y la IgE. Los alergenos se
extraen y se inmovilizan en pocillos de una placa de microtitulación
revestidos con polímero. A continuación, se añade al pocillo la
muestra que se va a analizar y se lleva a cabo un inmunoensayo
convencional.
En el documento EP 0 556 745 A1 se describe un
procedimiento para la detección de anticuerpos IgE frente a la
proteína anti-trigo en los fluidos corporales, en el
que un extracto de alergeno de trigo se inmoviliza en una fase
sólida que es, por ejemplo, un material cromatográfico o capilar o
una fibra, vidrio, nailon, celulosa o derivados de los mismos en
forma de perlas, micropartículas, láminas o pocillos de una placa de
microtitulación. Asimismo, en él se lleva a cabo un inmunoensayo
convencional con el fin de detectar anticuerpos en una muestra de un
paciente.
El documento US 3 720 760 se refiere a un
procedimiento para analizar los fluidos corporales en busca de
inmunoglobulinas. Asimismo, los extractos que contienen el alergeno
disponible comercialmente se unen a un polímero insoluble en agua,
tras lo cual se lleva a cabo un inmunoensayo convencional.
El documento US 4 849 337 también se refiere a un
procedimiento para identificar los niveles de IgE específicos del
alergeno en el suero de un paciente mediante la conjugación de la
IgE en el suero con alergenos adheridos a un soporte insoluble.
Aquí, de nuevo, el alergeno puede ser un extracto o un alergeno
derivado directamente de pólenes, polvos, animales, etc.
La detección de inmunoglobulinas específicas del
alergeno mediante ELISA con extractos de alergenos unidos a una
superficie sólida se describe en los documentos US 4.444.879 y EP 0
556 745 A. Mendoza y col. (Biotechniques 27(4) (1999))
describen un ELISA con micromatrices de alto rendimiento.
Sin embargo, estos procedimientos de inmunoensayo
convencionales no son útiles para realizar pruebas a un paciente con
respecto a la presencia de alergias, ya que la cantidad de alergias
diferentes ha llegado a más de algunos cientos y aumenta de forma
constante. El tiempo y el trabajo necesarios para analizar el suero
de un paciente en busca de todas las posibles alergias raras es
demasiado y no se realizarán en laboratorios en las que diariamente
se deben analizar algunos cientos de muestras de pacientes.
Por tanto, el objeto de la presente invención es
proporcionar un procedimiento para la detección de una
inmunoglobulina que se une a un alergeno en una muestra que no
muestre los inconvenientes mencionados anteriormente y que se pueda
llevar a cabo en un tiempo corto con sólo una pequeña cantidad de
muestra y alergenos, que sea altamente fiable y sensible y, todavía
más importante, que permita la detección de un número prácticamente
ilimitado de alergenos en un único ensayo.
Otro objeto más de la presente invención es
proporcionar un procedimiento para el diagnóstico in vitro de
alergias en un paciente sin los inconvenientes mencionados
anteriormente.
El procedimiento mencionado antes se caracteriza
porque uno o más alergenos purificados se inmovilizan en un chip
micromatriz, tras lo cual la muestra se incuba con los alergenos
inmovilizados de forma que las inmunoglobulinas que son específicas
de los alergenos se unen al alergeno específico, y después se
detectan las inmunoglobulinas que están unidas a los alergenos
específicos inmovilizados.
Las micromatrices se han adoptado recientemente
para una serie de técnicas de manipulación del ADN establecidas en
la comunidad científica desde hace tiempo. Estas micromatrices de
ADN están disponibles en numerosos formatos diferentes y terminarán
por cambiar la forma de diseñar los experimentos en el trabajo de
laboratorio habitual. El diagnóstico del ADN in vitro
requiere menos tiempo y carga de trabajo, ya que esta nueva
tecnología permite la complejidad de los ensayos en un formato de
alto rendimiento. En consecuencia, en el campo de la investigación
de proteomas, los sustratos de fase sólida clásicos, tales como las
placas de microtitulación, los filtros de membrana y los portas
microscópicos, se están convirtiendo al formato de micromatrices de
de alta densidad. En último término, la nueva y versátil tecnología
matricial proteica permite la detección selectiva de alto
rendimiento para la expresión génica y las interacciones moleculares
(Walter y col., Curr. Opin Microbiol 2000 Jun; 3 (3):
298-302; Emili & Cagney, Nat Biotechnol 2000
Apr; 18 (4) 393-7). Recientemente se ha adoptado el
concepto de las matrices proteicas para su uso en los ensayos
inmunológicos.
Se ha descrito que un chip micromatriz biológico
es capaz para soportar ensayos de inmunosorción ligado a enzimas
múltiplex (ELISA) de alto rendimiento (AR). Estos chips
micromatrices biológicos pueden estar constituidas por, por ejemplo,
una placa de vidrio ópticamente plana que contiene 96 pocillos
formados por una máscara de Teflón hidrófobo incluida, sin embargo,
también se conocen y usan otros materiales y formas de micromatrices
biológicas. Experimentos demuestran que la detección múltiplex de
antígenos proteicos matrices en un sustrato de vidrio es factible.
Más aplicaciones de este nuevo formato de detección selectiva de
alto rendimiento (HTS) incluyen la obtención del perfil de expresión
proteica celular, ensayos múltiplex para la detección de agentes
infecciosos y diagnósticos de cáncer (Mendoza LG y col.,
Biotechniques 1999 Oct; 27 (4): 778-80).
Sin embargo, en estos procedimientos conocidos
con chip micromatrices para probar proteínas, los anticuerpos se
inmovilizan en el chip micromatriz. Sorprendentemente, se ha
descubierto que no sólo es posible unir los anticuerpos al chip
micromatriz, sino también incluso los alergenos que sean los
antígenos correspondientes a anticuerpos específicos, en particular
la IgE y la IgG, respectivamente. Este hecho es particularmente
sorprendente ya que los alergenos funcionales muestran una
estructura secundaria concreta que puede modificarse cuando se une a
una densidad tan alta a una fase sólida como el chip micromatriz.
Esta modificación de la estructura del alergeno interferiría en la
unión anticuerpo-alergeno, lo que conduciría a
resultados falsos negativos. Los anticuerpos, los fragmentos de
anticuerpos o los péptidos son relativamente pequeños y muestran una
estabilidad elevada, por tanto, los anticuerpos muestran una
estabilidad mayor en solución con respecto a sus antígenos
conocidos. Sin embargo, cuando se inmovilizan en un soporte sólido,
incluso en el caso de los anticuerpos, sólo un pequeño porcentaje
permanece intacto y activo.
El artículo de Haab y col. (Genom Biology 2000, I
(6): pre-print 0001, 1-0001, 22),
que se recibió el 9 de noviembre de 2000, se refiere a micromatrices
proteicas para la detección y cuantificación de proteínas y
anticuerpos en soluciones. Los resultados del análisis llevado a
cabo según esta publicación muestran que sólo el 50% de los
antígenos en la matriz y el 20% de los anticuerpos en la matriz
proporcionaron una medida específica y precisa de los alergenos
conocidos.
Además, la diversidad de los posibles alergenos
es, por supuesto, mucho mayor que las diversidades de los
anticuerpos con respecto a la manipulación de proteínas,
especialmente para inmovilizar y marcar tal serie de alergenos
estructuralmente diversos. Sin embargo, sorprendentemente se ha
mostrado que los alergenos inmovilizados en un chip micromatriz
muestran una elevada fiabilidad y sensibilidad en un procedimiento
para la detección de inmunoglobulinas en una muestra.
Este procedimiento permite llevar a cabo un
ensayo para una multitud de inmunoglobulinas que se unen a un
alergeno específico en una etapa experimental, donde el ensayo
también puede fraccionarse: se pueden probar más de 100 alergenos
diferentes sin tener que llevar a cabo una multitud de etapas
experimentales individuales como cuando se realizan en una forma
convencional de microtitulación. Además, este ensayo muestra un alto
grado de sensibilidad y fiabilidad. Asimismo, los resultados de la
prueba de este procedimiento se pueden obtener en un corto periodo
de tiempo, por ejemplo, en aproximadamente tres horas, lo que acorta
el tiempo del ensayo cuando se compara con las pruebas RAST y ELISA
convencionales.
Además, el ensayo con micromatrices es muy
reproducible cuando se realizan experimentos repetitivos con chips
que contienen muestras de diferentes personas, por ejemplo con una
máscara del tipo de una placa de microtitulación por el cual cada
pocillo comprende un número de puntos de alergenos diferentes y, por
cada pocillo, se añade una muestra de una persona. Otra ventaja de
este procedimiento según la presente invención se debe al hecho de
que un gran número de sondas diferentes ocupa un área relativamente
pequeña, lo que proporciona una densidad elevada. La pequeña área de
superficie de la matriz permite condiciones de unión extremadamente
uniformes (regulación de la temperatura, contenido en sal, etc.)
mientras que el extremadamente elevado número de sondas permite el
procesamiento paralelo masivo de hibridaciones. Dado que las
micromatrices de alta densidad contienen un número tan elevado de
sondas, es posible proporcionar numerosos controles incluidos, por
ejemplo, controles de las variaciones o mutaciones de un alergeno
concreto, controles de las condiciones globales de hibridación,
controles de las condiciones de preparación de la muestra y
controles incompatibles para la unión inespecífica o la hibridación
cruzada.
Además, el ensayo requiere sólo una fracción
mínima de material (tanto de alergeno como de muestra) cuando se
compara con los sistemas de prueba convencionales. Esto significa
que con una cantidad igual de material de partida se puede fabricar
un número mucho mayor de kits de prueba cuando se usa la forma de
micromatriz y se puede usar una cantidad menor de muestra para
probar una cantidad mayor de inmunoglobulinas que se unen a los
alergenos. Asimismo, a volúmenes pequeños, la unión puede progresar
muy deprisa.
Las "inmunoglobulinas" naturales intactas o
anticuerpos comprenden una molécula tetramérica por lo general en
forma de Y, que tiene un sitio de unión al antígeno al final de cada
brazo superior. Un sitio de unión al antígeno está constituido por
el dominio variable de una cadena pesada asociado con el dominio
variable de una cadena ligera. Más específicamente, el sitio de
unión al antígeno de un anticuerpo está formado esencialmente por
las 3 CDR (regiones determinantes de complementariedad) del dominio
variable de una cadena pesada (V. sub. H) y las 3 CDR del dominio
variable de la cadena ligera (V. sub. L.).
En general, el término "antígeno" se refiere
a una sustancia capaz de provocar una respuesta inmunitaria y
normalmente, esta es también la sustancia que se usa para la
detección de los correspondientes anticuerpos mediante uno de los
muchos procedimientos inmunológicos in vitro e in vivo
disponibles para la demostración de las interacciones
antígeno-anticuerpo.
De igual forma, el término "alergeno" se usa
para indicar un antígeno con la capacidad de inducir y combinarse
con anticuerpos específicos (es decir, IgE) que son responsables de
las alergias comunes; sin embargo, esta última definición no excluye
la posibilidad de que los alergenos puedan también inducir
anticuerpos, que pueden incluir inmunoglobulinas de otros tipos
distintos a las IgE.
"Inmovilizar" en el contexto de las
proteínas o péptidos se refiere a la unión o fijación de la
proteína/péptido a soportes sólidos por medios convencionales, con o
sin un espaciador adicional entre el soporte sólido y el alergeno.
La inmovilización de péptidos/proteínas a un soporte se conoce bien
en la técnica; el alcance de la presente invención comprende
cualquier inmovilización, por ejemplo covalente, no covalente, en
particular interacciones hidrófobas con, por ejemplo, membranas y
superficies sintéticas, respectivamente etc.
Una "micromatriz" es una matriz de
característica (por ejemplo, "puntos") que tiene una densidad
de pequeñas características de al menos aproximadamente 16/cm^{2},
preferentemente de al menos aproximadamente 64/cm^{2}, todavía más
preferido de aproximadamente 96/cm^{2} y lo más preferido de al
menos 1000/cm^{2}. Las características en una micromatriz tienen
dimensiones típicas, por ejemplo diámetros, en el intervalo de entre
aproximadamente 10-2000 \mum, preferentemente
aproximadamente 50-500 \mum, todavía más preferido
de aproximadamente 150-250 \mum, y están separadas
de otras características en la matriz por aproximadamente la misma
distancia. Por tanto, una micromatriz según la presente invención
utilizable para la selección en masa de rutina puede tener al menos
500, preferentemente al menos 1000 puntos individuales que
comprenden alergenos, referencias y controles.
El "chip" según la presente invención puede
ser de casi cualquier forma, por ejemplo un porta o un pocillo de
una placa de microvaloración, o incluso una multitud de superficies,
aunque se prefiere una superficie matricial planar.
La etapa de detección la puede llevar a cabo un
experto en la técnica por cualquier procedimiento convencional, por
ejemplo mediante reacción física, enzimática, química, etc.
Según una forma de realización preferida de la
presente invención, las IgE se detectan como inmunoglobulinas. La
IgE se conoce como una sustancia que causa reacciones alérgicas y
sólo se produce cuando una persona se sensibiliza a una sustancia,
una alergia. Por tanto, con el fin de comprobar si la muestra es de
un paciente alérgico al alergeno específico, la muestra se somete a
pruebas de detección de IgE como inmunoglobulinas. Cuanto mayor es
la cantidad de IgE en la muestra, mayor es la probabilidad de que el
paciente del que se ha tomado la muestra sea alérgico al alergeno
específico.
Preferentemente, las IgG se detectan como
inmunoglobulinas. Se sabe que la IgG está presente en una muestra de
un paciente alérgico a alimentos, por tanto la detección de IGG se
puede usar como una indicación de intolerancia a alimentos.
De un modo ventajoso, uno o más alergenos
purificados se inmovilizan en el chip micromatriz. Por ejemplo,
Estos, únicos, alergenos se purifican de un extracto alergénico, por
ejemplo de un alimento o una planta específico. Por supuesto, uno o
más alergenos de una especie específica se pueden analizar a la
vez.
El experto en la técnica conoce los
procedimientos de purificación, por ejemplo purificación
cromatográfica, purificación por separación de masa, purificación
por unión específica del alergeno a una fase sólida, por ejemplo
sobre un anticuerpo, etc. La aplicación de alergenos altamente
purificados para la producción en masa de pruebas de alergia todavía
no se ha propuesto.
Alergenos "purificados" se refiere, al
contrario que los extractos, a alergenos únicos que pueden ser, por
ejemplo, alergenos nativos, recombinantes o de producción sintética.
Estos alergenos purificados muestran una serie de ventajas
importantes sobre los extractos alergénicos cuando se inmovilizan en
un soporte sólido: Debido a la presencia de mezcla de varias
proteínas en cualquier extracto, la concentración de alergenos que
se deben probar es muy baja en comparación con las preparaciones con
un único alergeno purificado. Los alergenos únicos purificados
pueden, por tanto, inmovilizarse en la micromatriz a una
concentración muy elevada. Debido a las moléculas exactas y
definidas presentes en una preparación que comprende alergenos
purificados, sólo los alergenos definidos se inmovilizarán en la
micromatriz. Por tanto, la micromatriz y el procedimiento para
detectar anticuerpos con la ayuda de alergenos purificados se pueden
estandarizar y someter a controles de calidad precisos.
Además, a causa de la elevada concentración de
alergenos purificados en la composición, los alergenos se
inmovilizan a una densidad más elevada en la micromatriz y, por
tanto, cualquier procedimiento de detección con la ayuda de tal
micromatriz resulta más sensible que las correspondientes
micromatrices con extractos que comprenden alergenos. Otra ventaja
de los alergenos únicos purificados sobre los extractos alergénicos
reside en el hecho de que los alergenos purificados inmovilizados
están definidos de forma exacta. Al contrario que los alergenos
purificados, los extractos alergénicos comprenden, por ejemplo, dos,
tres o más alergenos distintos de un organismo u objeto. Por
ejemplo, en el caso de una manzana, un extracto comprenderá una
mezcla de diferentes alergenos de la manzana, mientras que la
composición de la invención comprenderá uno de los alergenos de la
manzana purificado o, según el uso, una mezcla definida de dos o más
alergenos de la manzana u otros.
Otra ventaja de los alergenos purificados con
respecto a los alergenos no purificados presentes, por ejemplo en un
extracto, reside en el hecho de que debido a las impurezas
adicionales presentes en el extracto, éste no es estable durante más
de una cierta cantidad de tiempo y puede, por ejemplo, enmohecerse.
Sin embargo, esto influirá sobre la detección de alergias, ya que
también existen alergias frente al moho, en cuyo caso se produciría
un resultado falso positivo.
Además, debido a la presencia de proteasa en el
extracto, los extractos son inestables, algo que no se produce con
los alergenos purificados.
Asimismo, debido a las terapias existentes en la
actualidad, con la ayuda de alergenos purificados un diagnóstico con
los mismos componentes del alergeno purificado constituiría una gran
ventaja sobre el diagnóstico con alergenos sin purificar. Tales
diagnósticos son particularmente ventajosos para seguir el
tratamiento con alergenos purificados y probar la reacción
individual a un tratamiento específico y, por tanto, proporcionar un
tratamiento "ajustado para el paciente".
Por las razones anteriores, es particularmente
ventajoso un procedimiento para la detección de una inmunoglobulina
que se una al alergeno en una muestra por el cual uno o más
alergenos se han inmovilizado en el chip micromatriz.
Preferentemente, en el chip micromatriz se han
inmovilizado uno o más alergenos recombinantes. Durante los últimos
años se ha producido un número de alergenos recombinantes. La
producción de alergenos recombinantes es una técnica conocida pero
tuvo poco impacto sobre las pruebas rutinarias de alergia. Mediante
el uso de alergenos recombinantes es posible proporcionar un gran
número de uno o más alergenos específicos y, por tanto, optimizar la
sensibilidad de la prueba. Además es posible modificar los alergenos
recombinantes de forma específica con el fin de producir mutaciones
en los alergenos para detectar inmunoglobulinas específicas. Además,
el uso de los alergenos principales como proteínas recombinantes
proporciona una alternativa a las pruebas basadas en extractos con
respecto a la estabilidad del ensayo así como a la estandarización
diagnóstica. Las ventajas mencionadas anteriormente acerca de los
alergenos purificados sobre los alergenos sin purificar (extractos)
se aplican todavía más a los alergenos recombinantes que para los
alergenos nativos purificados: Los alergenos recombinantes pueden
diseñarse de un modo todavía más específico que los alergenos
nativos purificados y, por tanto, es posible optimizar la afinidad y
la especificidad de una prueba con alergenos recombinantes.
Asimismo, es mejor estandarizar los alergenos recombinantes con
respecto a su procedimiento de producción. Es más, las diferencias
entre los lotes de producción son más pequeñas para los alergenos
recombinantes que para los alergenos derivados de fuentes naturales.
Sorprendentemente se ha mostrado con la presente invención que el
uso de estos alergenos recombinantes en las pruebas diagnósticas
rutinarias realizadas in vitro según la presente invención es
superior a los sistemas de pruebas convencionales basados en
extractos. En contraste con las pruebas en serie rutinarias según el
estado de la técnica, las presentes pruebas con alergenos que
también usan alergenos recombinantes proporcionan un calidad
completamente nueva en relación a la estandarización, capacidad de
control, sensibilidad, reproducibilidad, capacidad para probar y
determinar la información diagnóstica relevante, etc. para las
pruebas estándar con alergenos.
Los alergenos recombinantes son, por ejemplo, los
descritos en las publicaciones de Chapman y col. Allergy, 52:
374-379 (1997), Laffer y col. J. Allergy Cli Immunol
Vol 98 número 2 652-658 (1996), Müller y col.
Clinical and Experimental Allergy Vol 27 9. 915-920
(1997), Niederberger y col. J Allergy Clin Immunol Vol 102 número 4,
parte 1 579-591 (1998), Menz y col. Clinical and
Experimental Allergy Vol 26, 50-60 (1996), que se
incorporan en la presente memoria descriptiva como referencia. Otros
ejemplos de alergenos (recombinantes) son, aunque no se limita a
ellos, rBetv1, rBetv2, rBetv3, rBetv4, rJun02, Cass1, rPhlp1,
rPhlp2, rPhlp4, rPhlp5a, rPhlp6, rPhlp7, rPhlp11, rPhlp12, rParj2,
Artv1a, Mugwort, profilina, Apig1, Apig1.0201, Daucl.2, rArah2,
rArah5, Mald1, Mald2, rPenal, recCarp, rDerp1, rDerp2.0101, rDerp2,
rDerp2b, rDerp5, rDerp5a, rDerp7, rDerp8, rDerp10, rTyrp2,
rLepd2.01, rLepd13, rEurm2.0101, rFeld1, rFeld1a, rBosd2, un
alergeno representativo de gato, un alergeno representativo de
perro, un alergeno representativo de BSA, un alergeno representativo
de ratón, un alergeno representativo de rata, un alergeno
representativo de cerdo, un alergeno representativo de oveja, un
alergeno representativo de pollo, un alergeno representativo de
conejo, un alergeno representativo de hámster, un alergeno
representativo de caballo, un alergeno representativo de paloma, un
alergeno representativo de guinealbúmina, HSA,
a-NAC, rPenc3, Penn13, rPEnc19a, rPenc19b, rAspf1,
rAspf1a, rAspf3, rAspf3a, rAspf4, rAspf4a, rAspf6, rAspf6a, rAspf7,
rAspf8, rAlta1, rAlta2, rMalf1, rMalf5, rMalf6, rMalf7, rMalf8,
rMalf9, rHevb1, rHevb1a, rHevb3, rHevb8, rHevb9, rHevb10, rHevb11,
rAK, rBlag2, rBlag4, rBlag5, fosfolipasa A, hialuronidasa, rVesv5,
rVesg5.
Según otra forma de realización ventajosa, uno o
más alergenos producidos por vía sintética se inmovilizan en el chip
micromatriz. Aquí, de nuevo se aplican para los alergenos
recombinantes las mismas ventajas que las mencionadas anteriormente
sobre los extractos alergénicos y también sobre los alergenos
nativos purificados. El procedimiento por el cual se producen
sintéticamente péptidos y proteínas se conoce bien en la técnica;
mediante la producción sintética de alergenos es posible
proporcionar alergenos altamente purificados en un gran número y a
bajo coste, ya que tales procedimientos de producción están muy
automatizados. Además, se puede producir la secuencia exacta de
cualquier alergeno con o sin modificaciones, lo que incrementa la
sensibilidad y la fiabilidad del procedimiento de detección de
inmunoglobulinas.
También es posible usar sólo el determinante
antigénico o el dominio antigénico de un alergeno específico en la
prueba según la presente invención. Esto puede eliminar los riesgos
e inconvenientes del trabajo con proteínas grandes, porque las
estructuras peptídicas más cortas son más fáciles de manejar para la
producción de rutina de las micromatrices biológicas. Esto se aplica
a todos los alergenos purificados nativos, recombinantes y
sintéticos. Esto permitiría la detección de epítopos peptídicos
únicos, lo que mejorará todavía más la prueba diagnóstica y los
tratamientos en particular con respecto a la específica.
El hecho de proporcionar una forma nativa del
alergeno, así como una forma recombinante o sintético del alergeno
en el mismo chip resulta una ventaja de importancia. Mientras lo que
se prefiere es el uso de, principalmente, alergenos recombinantes o
sintéticos, la forma nativa de un alergeno puede proporcionarse al
menos como control o como información adicional acerca de la
calidad. Por tanto, un chip preferido según la presente invención
comprende una forma recombinante o sintética y una nativa de al
menos un alergeno. Esto también proporciona una mejora en el control
de calidad y la estandarización de los diferentes lotes de
alergenos.
Preferentemente, uno o más haptenos se
inmovilizan cono alergenos en el ensayo con el chip micromatriz. Un
"hapteno" es una sustancia de bajo peso molecular (típicamente
por debajo de aproximadamente 7000 daltons, que por lo general es
incapaz de causar, pos sí solo, una producción significativa de
anticuerpos tras la administración al cuerpo de un animal, incluido
un cuerpo humano. Esto se puede producir porque un hapteno es
demasiado pequeño como para ser reconocido por el sistema
inmunológico del cuerpo. Sin embargo, cuando un hapteno está
acoplado a una molécula transportadora más grande, el antígeno puede
adquirir propiedades antigénicas. En otras palabras, la unión del
hapteno a la molécula transportadora (para preparar una combinación
componente analizado/molécula transportadora) permite que el hapteno
unido sea reconocido por el sistema inmunitario de un animal. Puede
tener lugar una reacción de inmunoprecipitación entre el hapteno
(acoplado a la molécula transportadora) y un anticuerpo frente al
hapteno. Al proporcionar haptenos inmovilizados en el chip
micromatriz se puede conseguir una densidad más elevada en la
micromatriz.
Por supuesto, es posible combinar estas formas
diferentes mencionadas de alergenos, por ejemplo, usar al mismo
tiempo alergenos recombinantes y nativos (purificados). La
combinación de estas formas diferentes permite compararlas y llevar
a cabo un control de los por ejemplo alergenos recombinantes y
también un control de loas diversos lotes nativos de alergenos que
pueden variar a causa de las diferencias en las fuentes biológicas,
los procedimientos de preparación, la pureza, etc.
Para una prueba altamente eficaz es preferible
usar alergenos que muestren características óptimas, por ejemplo una
capacidad de unión elevada. Sin embargo, para la detección de
variantes de alergenos de unión eficaz, por ejemplo, para el uso en
técnicas de hiposensibilización, se prefiere usar antígenos con una
actividad menor o diferente
Según una forma de realización preferida de la
presente invención los alergenos se inmovilizan en el chip
micromatriz con un punto de un diámetro de 10 a 2000 \mum,
preferentemente un diámetro de 50-500 \mum,
todavía más preferido diámetro de 150-250 \mum.
Dado que los puntos tienen un diámetro pequeño, es posible
inmovilizar una gran cantidad de alergenos diferentes y varias
concentraciones de alergenos específicos en puntos distintas del
chip micromatriz, lo que por tanto permite proporcionar un chip
micromatriz que se puede usar en una etapa, automatizada, para
analizar un número elevado de alergenos o de concentraciones
alergénicos.
Preferentemente, los alergenos se inmovilizan en
un soporte sólido, preferiblemente un vehículo de vidrio, un
vehículo sintético, una oblea de silicio y una membrana,
respectivamente. Tales chips se pueden producir, por ejemplo, según
los procedimientos descritos en Ge, H. (2000), Nucleic Acids
Research, 28, e3 (i-vii); Qian W. y col. (2000),
Clinical Chemistry, 46 (1456-1463); MacBeath G. y
col. (2000), Science, 289, (1760-1763), que se
describen en la presente memoria descriptiva como referencia. Cada
uno de estos materiales muestra características y ventajas
específicas que son bien conocidas para el experto en la técnica.
Por tanto, el material para el chip micromatriz se escogerá según el
alergeno que se va a probar, el procedimiento para la detección de
inmunoglobulinas unidas, los tampones usados. Además, la elección de
material también es una cuestión económica.
Preferentemente, el chip micromatriz se modifica
químicamente, preferentemente mediante modificación aminorreactiva y
carboxirreactiva, respectivamente. Esto permite determinar con
exactitud la forma en la que el alergeno se une al chip
micromatriz.
De un modo ventajoso, los alergenos se unen
covalentemente al chip micromatriz. Esto proporciona una unión
estable de los alergenos al chip micromatriz, proporcionando de este
modo un procedimiento que es particularmente fiable.
Según otra forma de realización ventajosa de la
presente invención, las inmunoglobulinas se detectan en el suero de
la sangre como muestra. En pacientes alérgicos a un alergeno, las
inmunoglobulinas se producen principalmente en el suero sanguíneo,
de forma que el análisis del suero sanguíneo proporciona un
procedimiento fiable para detectar inmunoglobulinas. Además, el
suero sanguíneo se puede obtener de un paciente con facilidad de un
modo muy sencillo y la extracción de la muestra se puede llevar a
cabo incluso en la casa del paciente.
Preferentemente, el suero sanguíneo se diluye al
1:1-1:15, preferentemente al 1:5. La dilución se
puede llevar a cabo con cualquier solución adecuada, por ejemplo
TBST 1x (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, TWEEN
20 al 0,5%).
De un modo ventajoso, la muestra se incuba de 1
minuto a 24 horas, preferentemente durante 1-2
horas, con los alergenos. Por supuesto, es posible incubar la
muestra con los alergenos incluso durante un periodo de días. Sin
embargo, esto no tiene como resultado un incremento en la intensidad
o la especificidad de la señal. En general, un tiempo de incubación
de 1 hora basta para obtener un resultado fiable y sensible.
Además, la muestra se incuba con los alergenos,
preferentemente, a una temperatura de entre 0ºC y 60ºC,
preferentemente a 37ºC. Las incubaciones a temperaturas inferiores
no tienen como resultado un incremento de la señal, sino que
conducen a un incremento de la unión inespecífica y el ruido de
fondo. Se ha mostrado que una incubación a 37ºC proporciona
resultados exactos y fiables para las pruebas con alergenos en seres
humanos.
De un modo ventajoso, la inmunoglobulina unida se
detecta con al menos un anticuerpo antiinmunoglobulina específico
marcado. Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término
"anticuerpo" se refiere a moléculas intactas así como a
fragmentos de las mismas, tales como Fa, F(ab). Sub. 2 y Fv,
que sean capaces de unirse al determinante epitópico. Los
anticuerpos se pueden preparar usando como antígeno de inmunización
polipéptidos intactos o fragmentos que contienen pequeños péptidos
de interés. El polipéptido o el péptido usado para inmunizar a un
animal puede derivar de la transición de ARN o se puede sintetizar
por medios químicos, y puede conjugarse a una proteína
transportadora si se desea. Entre los vehículos usados de forma
habitual que están químicamente acoplados a péptidos se incluyen
seroalbúmina bovina y tiroglobulina. El péptido acoplado se usa
después para inmunizar al animal (por ejemplo, un ratón, una rata o
un conejo).
En el alcance de la presente invención, el
término anticuerpo se refiere a anticuerpos monoclonales o
policlonales en los que los anticuerpos monoclonales pueden
prepararse usando cualquier técnica que proporcione la producción de
moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en
cultivo. Estas incluyen, aunque no se limitan a ellas, la técnica
del hibridoma, la técnica de hibridoma célula B humana y la técnica
del hibridoma IBV.
Además, se pueden producir anticuerpos
quiméricos, anticuerpos de cadena simple así como anticuerpos
producidos por vía sintética.
El anticuerpo se puede marcar según cualquier
procedimiento conocido que permita cualificar, y preferentemente
cuantificar, el anticuerpo unido. Entre los marcadores detectables
adecuados para usar en la presente invención se incluye cualquier
composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos,
bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Entre
los marcadores útiles se incluyen biotina para marcar con conjugado
de estreptavidina, esferas magnéticas, pigmentos fluorescentes (por
ejemplo, fluoresceína, rojo texas, rodamina, proteína verde
fluorescente y similares), marcadores radiactivos (por ejemplo,
^{3}H, ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C o ^{32}P), enzimas (por
ejemplo peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina y otras usadas de
forma habitual en las técnicas de ELISA) y marcadores colorimétricos
tales como oro coloidal o esferas de vidrio o plástico coloreado
(por ejemplo, poliestireno, látex de polipropileno, etc.).
Los expertos en la técnica conocen bien los
medios para detectar tales marcadores. Por tanto, por ejemplo, los
marcadores radiactivos se pueden detectar usando películas
fotográficas o contadores de centelleo, los marcadores fluorescentes
se pueden detectar usando un fotodetector para detectar la luz
emitida. Los marcadores enzimáticos se detectan normalmente mediante
el suministro a la enzima de un sustrato y la detección del producto
de reacción producido por la acción de la enzima sobre el sustrato,
y los marcadores colorimétricos se detectan simplemente visualizando
el marcador coloreado.
Preferentemente, las inmunoglobulinas unidas se
detectan con al menos un anticuerpo antiinmunoglobulina específico
marcado, fluorescente y radiactivo, respectivamente. Estos son
procedimientos clásicos para analizar cualitativa y
cuantitativamente el anticuerpo unido, que son muy específicos y
fiables.
Otros sistemas de detección ventajosos para
micromatrices son, por ejemplo, los descritos en Schult K. y col.
(1999), Anal Chem, 71 (5430-5435);
Vo-Dinh T. y col. (1999), Anal Chem, 71
(358-363); Brignac SJ Jr. y col. (1999), IEEE Eng
Med Biol Mag, 18 (120-122); Otamiri M. y col.,
(1999), Int J Biol Macrfomol, 26 (263-268); Wright,
GL Jr. y col. (2000), Prostate Cancer and Prostatic Diseases, 2
(264-276); Nelson RW. y col (2000), Electrophoresis
21 (1155-1163); Rich RL. y col. (2000), Curr Opin
Biotechnol 11 (54-61); Chen JJ. Y col. (1998),
Genomics, 51 (313-324), publicaciones que se
adjuntan a la presente memoria descriptiva como referencia.
De forma ventajosa, uno o más alergenos de
interior se inmovilizan como alergenos. Estos pueden ser, aunque no
se limita a ellos, ácaros, Tyr. Put, Lep. dest. O mayrei, felinos,
BOS, albúmina, Pen. cit, Pen. not, Asp. ffmigatus, Alt. slt.,
Malassezia furfur, látex, Plodia, Blatella.
Según otra forma de realización preferida, uno o
más alergenos de exterior se inmovilizan como alergenos. Estos
pueden ser, aunque no se limita a ellos, Betula, enebro, fleo,
Parietaria judicea.
Además, uno o más alergenos alimentarias se
pueden inmovilizar como alergenos. Ejemplos son apio zanahoria,
cacahuete, manzana, gamba, pescado.
Además, uno o más alergenos de venenos se pueden
inmovilizar como alergenos. Estos pueden ser, aunque no se limita a
ellos, veneno de abeja o de avispa.
Asimismo, uno o más autoalergenos se pueden
inmovilizar como alergenos. Tales autoalergenos pueden ser, por
ejemplo, antígenos de membrana hepática, antígenos de ADNss,
antígenos en o sobre las células de músculo esquelético, etc.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un procedimiento para el diagnóstico in vitro de alergias
en un paciente, donde se extrae una muestra de suero del paciente
tras lo cual la muestra se analiza en busca de inmunoglobulinas que
se unan a los alergenos según un procedimiento mencionado
anteriormente de acuerdo con la presente invención, donde se usa un
chip micromatriz en el que se inmovilizan al menos 10,
preferentemente al menos 50, todavía más preferido al menos 90,
alergenos diferentes, después de lo que una reacción positiva entre
la muestra y los alergenos inmovilizados se diagnostica como una
alergia. Las definiciones y ventajas mencionadas anteriormente se
refieren también a este procedimiento para el diagnóstico in
vitro de alergias en comparación con los procedimientos
conocidos para diagnosticar alergias. El presente procedimiento
muestra la ventaja de que una gran cantidad de alergias se pueden
diagnosticar de forma simultánea con sólo una muestra, ya que todos
los alergenos que se van a probar se inmovilizan en un único chip
micromatriz. Por tanto, cada etapa se lleva a cabo sólo en un chip,
donde el chip puede comprender puntos sin alergenos inmovilizados y,
por tanto, permitir la detección negativa simultánea, La cantidad de
alergenos que se van a probar no es limitada y, por supuesto es
posible proporcionar dos o más chip micromatrices.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un chip micromatriz en la que se inmovilizan uno o más alergenos
purificados. Asimismo, en este aspecto se aplican las definiciones y
ventajas mencionadas anteriormente.
Preferentemente, los alergenos se inmovilizan en
un punto de 100 a 500 \mum de diámetro, preferentemente de
200-300 \mum de diámetro.
Todavía más preferentemente, el chip micromatriz
es un vehículo de vidrio, un vehículo sintético, una oblea de
silicio y una membrana, respectivamente.
De forma ventajosa, el chip micromatriz se
modifica químicamente, preferentemente mediante modificación
aminorreactiva y carboxirreactiva, respectivamente.
De forma ventajosa, los alergenos están
covalentemente unidos al chip micromatriz.
Otro aspecto según la presente invención se
refiere a un kit que comprende un chip micromatriz según la presente
invención como se ha mencionado anteriormente y un primer agente que
comprende al menos un reactivo detector de inmunoglobulina,
preferentemente un anticuerpo antiinmunoglobulima, preferentemente a
una concentración conocida, y posiblemente un segundo reactivo como
muestra positiva que comprende al menos una inmunoglobulina que se
una a un alergeno. El primer reactivo que comprende el al menos un
reactivo detector de inmunoglobulina, preferentemente un anticuerpo
antiinmunoglobulina, puede usarse para la detección de una
inmunoglobulina unida, en cuyo caso el anticuerpo
antiinmunoglobulina está marcado preferentemente como se ha
mencionado antes. Preferentemente, en el primer reactivo un
anticuerpo está presente a una concentración conocida, lo que
permite proporcionar resultados reproducibles. Además, el kit
comprende, preferentemente, un segundo reactivo como muestra
positiva, que comprende al menos una inmunoglobulina que se une a un
alergeno. También aquí es preferible que la inmunoglobulina esté
presente a una concentración conocida en el segundo reactivo,
permitiendo de este modo cuantificar la inmunoglobulina presente en
la muestra al comparar los resultados de la muestra del paciente con
los resultados de la muestra positiva (el segundo reactivo).
Preferentemente, el kit se proporciona para
llevar a cabo un procedimiento según la presente invención como se
ha mencionado antes. Para esto, el primero y el segundo reactivo
pueden diseñarse con el fin de detectar una inmunoglobulina
específica que se una a un alergeno específico o una alergia
específica en un paciente. Sin embargo, el kit también puede
diseñarse para detectar una variedad de inmunoglobulinas que se unan
a alergenos específicos o para diagnosticar una variedad de alergias
en un paciente.
A continuación se describe la presente invención
con más detalle con los siguientes ejemplos y figuras, a las que,
por supuesto, no está limitada
La Fig. 1 muestra una ilustración de una
micromatriz de alergenos;
La Fig. 2 muestra una imagen de barrido de una
matriz de alergenos analizada con suero de una persona alérgica;
Las Fig. 3a-3c muestra diagrama
de dispersión de un ensayo por triplicado.
Las Fig. 4a-4c muestran el % de
fluorescencia medido para extracto inmovilizado y alergenos
recombinantes inmovilizados.
Los alergenos se dispusieron en una matriz usando
un dispositivo para rociado GMS 417 de Genetic Microsystems. Las
proteínas se rocían en portaobjetos de vidrio derivatizado. Los
alergenos se rocían a un valor de un rociado por punto y por
triplicado. Los puntos (características) mostraron un diámetro de
aproximadamente 200 \mum.
Los alergenos se juntaron en grupos funcionales
del siguiente modo: (A) de exterior (I. Árboles [1= rBetv1, 2=
rBtev2, 3= rBetv4, 4= rJun02, 5= Cass1], II. Hierbas [6=rPhlp2, 7=
rPhlp4, 8= rPhlp5a, 9= rPhlp1, 10= rPhlp6, 11= rPhlp7, 12= rPhlp11,
13= rPhlp12], III. WEEDS [14= rParj2, 15=Artv1a, 16= Mugwort
profilina]).
(C) Aletfgenos de alimentos (X. Vegetales [17=
Apig1, 18= Apig2.0201, 19= Daucl.2, 20= rArah2, 21= rArah5], XI.
Frutas [22=Mald1, 23= Mald2], XII. Gambas [24= rPena1], XIII.
Pescados [25= recCarp]).
(B) De interior (IV. Ácaros [26= rDerp1, 27=
rDerp2.0101, 28= rDerp2, 29= rDerp2b, 30= rDerp5, 31= rDerp5a, 32=
rDerp7, 33= rDerp8, 34= rDerp10, 35= rTyrp2], V. Animales [36=
rLepd2.01, 37= rLepd13, 38= rEum2.0101, 39= rFeld1, 40= rFeld1z, 41=
rBosd2, 42= un alergeno representativo procedente de un gato, 43= un
alergeno representativo procedente de un perro, 44= BSA, 45= un
alergeno representativo procedente de ratón, 46= alergeno
representativo procedente de rata, 47= alergeno representativo
procedente de cerdo, 48= alergeno representativo procedente de
oveja, 49= alergeno representativo procedente de pollo, 50= alergeno
representativo procedente de conejo, 51= alergeno representativo
procedente de hámster, 52= alergeno representativo procedente de
caballo, 53= alergeno representativo procedente de paloma, 54=
guineaalbúmina, VI, Mohos [55= rPenc3, 56= rPenc19a, 57= rPenc19b,
58= Penn13, 59= rAspf1, 60= rAspf3, 61= rAspf4, 62= rAspf6, 63=
rAspf1a, 64= rAspf3a, 65= rAspf4a, 66= rAspf6a, 67= rAspf7, 68=
rAspf8, 69= rAlta1, 70= rALta2], VII. Levaduras [71= rMalf7, 72=
Malf71, 73= Malf5, 74= Malf6, 75= Malf8, 76= Malf9], VIII. Látex
[77= rHevb1, 78= rHevb1a, 79= rHevb3, 80= rHevb8, 81= rHevb9, 82=
rHevb10, 83= rHevb11], IX. Insectos [84= rAK, 85= rBlag2, 86=
rBlag4, 87= rBlag5]),
(D) Venenos (XIV. Abeja [88= Ag5, 89= Fosfolipasa
A, 90= Hialuronidasa, 91= rVesv5, 92= rVesg5], XV. Avispa [93=
Ag5]),
(E) Autoalergenos (94= HSA, 95=
a-NAC).
Además, se interpusieron puntos con tampoco entre
los subgrupos de los alergenos que sirven como control, marcados
como X, el anticuerpo marcado se indica como "ab". (Fig. 1:
1864x1182 pixels, 1,86x1,18 cm, 1000 pixels por cm, píxel
profundidad/colores 8/256, 1 píxel corresponde a 10 \mum).
Se tomaron alícuotas de 100 \mul de los
alergenos y se repartieron en los pocillos de un aplaca de
microtitulación de 96 pocillos a una concentración de \sim200 ng/
\mul en tampón de rociado (fosfato sódico 300 nM, pH 8,5). La
concentración óptima para la inmovilización de los alergenos se
calculó a partir de experimentos de titulación con diversos
alergenos en diferentes soluciones tampón así como en diferentes
portaobjetos. Las proteínas analizadas exhibieron un comportamiento
de saturación a concentraciones iguales o superiores a 100
ng/\mul, como se hizo evidente con la observación de una fuerte
señal constante blanca al realizar un barrido con un dispositivo
GMS. A esta concentración, el comportamiento de unión de los
alergenos fue independiente de la composición del depósito así como
del tampón de rociado.
Después de la incubación durante la noche, los
portaobjetos obtenidos de CEL Associates (portaobjetos con aldehído)
o preparados internos se lavaron en 1xTBST (TrisHCl 10 mM, pH
8,0/NaCl 150 mM/Tween 20 al 0,5%) con agitación enérgica en un tubo
Falcon a temperatura ambiente. Como etapa bloqueantes, los
portaobjetos se transfirieron a una solución de 1xTBST con BSA al
0,01% durante 2 horas a temperatura ambiente. Los portaobjetos se
fueron lavando sucesivamente en 1 x TBST durante 15 minutos y se
enjuagaron en agua destilada durante un tiempo breve.
La matriz de alergenos se incubó con suero
diluido (1:5 en 1 xTBST) durante (Al menos) 60 minutos a 37ºC con
agitación. Se han probado varios grados de dilución del suero,
variables desde 1:1 a 1:15. Por lo general, una dilución de 1:5 dio
los mejores resultados. A los portaobjetos en Cámaras de sellado a
presión obtenidas de SIGMA Technologies, se añadieron 30 \mul de
suero diluido. Las cámaras se usaron siguiendo el protocolo de los
fabricantes. Se analizaron varios tiempos de incubación para el
suero, variables desde 60 minutos hasta toda la noche. Sin embargo,
una incubación extensa no tuvo como resultado un incremento de la
intensidad o la especificidad de la señal. Después de la incubación
con suero, los portaobjetos se lavaron con 1 xTBST (15 minutos,
temperatura ambiente) con agitación.
Para una prueba de referencia de la matriz de
alergenos se escogieron de forma adecuada cinco sueros diferentes de
pacientes alérgicos que se han analizado con pruebas diagnósticas
convencionales (prueba de punción cutánea, RAST, ELISA) y un suero
de un paciente no atópico. Los sueros individuales se analizaron al
menos dos veces en diferentes matrices de alergenos producidas por
lotes.
A la matriz de alergenos se añadió anticuerpo IgE
\alpha marcado para fluorescencia con el pigmento fluorescente
AlexaFluor siguiendo el protocolo del fabricante (Molecular Probes)
en una solución con BSA al 0,01%/1 x TBST y se incubó durante 60
minutos a temperatura ambiente. Las soluciones a usar para el
anticuerpo variaron desde 1:1000 a 1:5000, según el tiempo y la
eficacia del marcaje. Después del inmunoensayo, los portaobjetos se
lavaron con 1 x TBST (15 minutos, temperatura ambiente, agitación) y
se enjuagaron brevemente con agua destilada.
Después del ensayo de inmunosorción, los
portaobjetos se evaluaron en un SCANNER GMS de dos colores. En
general, las intensidades de la señal sólo variaron ligeramente
entre los diferentes ensayos y los distintos portaobjetos. Sin
embargo, los valores generales sí diferían en función del tipo de
portaobjeto usado. En la Figura 2 se representa un ejemplo de una
imagen de barrido de una matriz de alergenos analizada con suero de
un paciente con alergia. Este paciente muestra una fuerte reacción
con Fleo, ácaros, felinos y abejas (cf. Fig. 1). No se observaron
señales causadas por una interacción inespecífica con los puntos con
tampón ni con los autoalergenos. Tras la evaluación completa de los
sueros del paciente alérgico, los resultados se compararon con los
datos preliminares obtenidos para sueros idénticos usando pruebas
RAST. Los datos obtenidos con el procedimiento según la presente
invención eran acordes con los conjuntos de datos disponibles.
El suero de un paciente C se analizó tres veces
en micromatrices de alergenos preparadas de forma individual. El
procedimiento experimental fue esencialmente como se ha descrito
antes.
Después del ensayo, los portaobjetos se someten a
técnicas de barrido usando parámetros de hardware idénticos. El
análisis de los datos se realizó con el paquete de software GenePix.
Los valores medios calculados de las intensidades de la señal para
cada alergeno por triplicado se compararon después de tres
repeticiones del experimento.
Para el análisis final se escogieron sólo los
valores correspondientes a las señales que eran al menos más de 1,5
veces mayores que el valor medio de las señales del punto con
tampón. El valor medio, la desviación estándar y el porcentaje de
desviación estándar para las señales importantes se representan en
la Tabla 1.
La desviación estándar media calculada a partir
de los valores obtenidos después de tres ensayos individuales fue
12,36%. Esto significa que el ensayo basado en matriz, cuestionando
la presencia de IgE en los sueros de los pacientes, es altamente
reproducible. Esto también es evidente al estudiar las gráficas de
dispersión derivadas del ensayo triple 3,s. Las figuras
3a-3c, donde la Fig. 3a muestra un diagrama de
dispersión de la Prueba 1 frente a la Prueba 3, la Figura 3b es un
diagrama de dispersión de la Prueba 2 frente a la Prueba 3 y la Fig.
3c es un diagrama de dispersión de la Prueba 1 frente a la Prueba 2;
A muestra los alergenos e FI la intensidad de la fluorescencia.
Para comprobar el portaobjetos óptimo para la
presente invención, se evaluaron portaobjetos preparados
individualmente según una serie de criterios que se resumen a
continuación:
Proceso de producción: Los portaobjetos
preparados se avaluaron según una serie de parámetros, tales como el
requerimiento de sustancias químicas peligrosas y el tiempo de
producción.
Coste de producción: los portaobjetos producidos
de forma interna y los portaobjetos comercialmente disponibles se
compararon según sus costes.
Capacidad de unión: se evaluaron diferentes
portaobjetos según la capacidad de unión de una proteína
marcada.
Reproducibilidad: se llevaron a cabo experimentos
con portaobjetos previamente tratados de forma diferente y se
evaluaron según el rendimiento global del ensayo.
Información general: todos los portaobjetos se
evaluaron antes y después de un ensayo de alergia para un barrido
sistemático de la superficie que podría disminuir la proporción
entre señal y ruido.
Límite de detección: Todos los portaobjetos se
evaluaron para determinar la concentración mínima proteica
detectable por punto en un ensayo de selección de alergia.
Tolerancia al suero: En general el suero de un
paciente es una compleja mezcla de proteínas que a menudo interfiere
de forma negativa con una inmunoensayo basado en micromatrices con
diferentes lotes de suero de pacientes.
Bloqueo: Todos los portaobjetos se evaluaron para
determinar la necesidad de una etapa de bloqueo previa al ensayo de
alergia.
Almacenamiento; Todos los portaobjetos se
avaluaron para determinar el almacenamiento a largo plazo después de
haber producido una matriz de alergenos.
Los resultados del estudio de evaluación
mencionado antes se representan en la tabla 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se representan los resultados del estudio de
evaluación descrito en el texto. (++) quiere decir resultado
excelente, (+) bueno, (-) menor, (--) malo. (/) significa
que el portaobjetos no se ha analizado para esa determinada
categoría. (1) portaobjetos que contienen una superficie funcional
con grupos aldehído. (2) portaobjetos que contienen una superficie
aminorreactiva, cuyas propiedades químicas exactas no se conocen.
(3) portaobjetos producidos de forma interna con grupos funcionales
como los mencionados en la tabla 2. (4) Portaobjetos que contienen
una membrana para inmovilización de proteínas. Proteobind es el
título para la derivación de la superficie adaptada para un
rendimiento optimizado de un diagnóstico de alergia basado en una
micromatriz y comprende
(1-[3''-[tri-metoxilil)propil]-1'(4''-isotiocianatofenil)tiourea),
que se preparó según Chen y col. (Nucleic Acids Research, 199, vol.
27, nº 2), que se incorpora en la presente memoria descriptiva como
referencia.
Según el estudio de evaluación presentado antes,
Proteobind se seleccionó como una derivatización de superficie
superior para la producción de micromatrices de alergenos.
Con el fin de probar la sensibilidad y la
información relevante para el diagnóstico de los alergenos
recombinantes purificados inmovilizados en una micromatriz y de
extracto de alergeno inmovilizado en una micromatriz, se compararon
alergenos específicos de una fuente con un extracto de alergeno de
la misma fuente.
Tras la inmovilización de las composiciones
alergénicas en una micromatriz, muestras diferentes que comprenden
dichos sueros específicos se añadieron a la micromatriz y se midió
la fluorescencia que corresponde a la cantidad de anticuerpo unido a
los alergenos. Los resultados se muestran en las tablas 3, 4 y 5,
así como en las figuras 4a, 4b y 4c, donde "FL" es el % de
fluorescencia. De estos resultados se deduce claramente que en el
caso de los alergenos recombinantes, la detección y cuantificación
es mucho más sensible que en el caso de los extractos de alergenos.
La intensidad de la fluorescencia de un único antígeno recombinante
es claramente superior a la intensidad de fluorescencia del
extracto. Además, en el caso del extracto sólo se puede probar la
fuente del extracto y no es posible probar cual antígeno específico
de la fuente es el responsable de la alergia, al contrario de lo que
ocurre con la detección con alergenos recombinantes.
Por tanto, el procedimiento de la invención con
alergenos purificados únicos, en particular alergenos recombinantes,
presenta muchas ventajas sobre los extractos que comprenden
alergenos.
Claims (37)
1. Un procedimiento para la detección de una
inmunoglobulina que se une a un alergeno en una muestra,
caracterizado porque uno o más alergenos únicos purificados
se inmovilizan en un chip micromatriz, después de lo cual la muestra
se incuba con los alergenos inmovilizados de forma que las
inmunoglobulinas que son específicas de los alergenos se unen al
alergeno específico, tras lo cual se detectan las inmunoglobulinas
que está unidas a los alergenos inmovilizados específicos.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque las IgE se detectan como
inmunoglobulinas.
3. El procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque las IgG se detectan como
inmunoglobulinas.
4. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque en el chip
micromatriz se inmovilizan uno o más alergenos recombinantes.
5. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque en el chip
micromatriz se inmovilizan uno o más alergenos producidos de forma
sintética.
6. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque en el chip
micromatriz se inmovilizan uno o más haptenos como alergenos.
7. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque los alergenos se
inmovilizan en puntos de 10 a 2000 \mum de diámetro en el chip
micromatriz.
8. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque los alergenos se
inmovilizan en puntos de 50 a 500 \mum de diámetro,
preferentemente un diámetro de 150-250 \mum en el
chip micromatriz.
9. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque los alergenos se
inmovilizan en un soporte sólido como el chip micromatriz.
10. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque los alergenos se
inmovilizan en vehículo de vidrio y sintético, respectivamente, como
el chip micromatriz.
11. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque los alergenos se
inmovilizan en una oblea de silicio, como el chip micromatriz.
12. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque los alergenos se
inmovilizan en una membrana, como el chip micromatriz.
13. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el chip
micromatriz está químicamente modificado, preferentemente mediante
modificación aminorreactiva y carboxirreactiva, respectivamente.
14. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque los alergenos
están unidos de forma covalente al chip micromatriz.
15. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque las
inmunoglobulinas se detectan en suero sanguíneo como la muestra.
16. El procedimiento según la reivindicación 15,
caracterizado porque el suero sanguíneo está diluido a
1:a-1:15, preferentemente a 1:5.
17. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque la muestra se
incuba con los alergenos de 1 minuto a 24 horas, preferentemente de
1 a 2 horas.
18. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque la muestra se
incuba con los alergenos a una temperatura de entre 0 y 60ºC,
preferentemente a 37ºC.
19. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque las
inmunoglobulinas unidas se detectan con al menos un anticuerpo
específico antiinmunoglobulina marcado.
20. El procedimiento según la reivindicación 19,
caracterizado porque las inmunoglobulinas unidas se detectan
con al menos un anticuerpo específico antiinmunoglobulina marcado
con fluorescencia.
21. El procedimiento según la reivindicación 19,
caracterizado porque las inmunoglobulinas unidas se detectan
con al menos un anticuerpo específico antiinmunoglobulina marcado
radiactivo.
22. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque uno o más
alergenos de interior se inmovilizan como alergenos.
23. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque uno o más
alergenos de exterior se inmovilizan como alergenos.
24. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque uno o más
alergenos de alimentos se inmovilizan como alergenos.
25. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque uno o más
alergenos de venenos se inmovilizan como alergenos.
26. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque uno o más
autoalergenos se inmovilizan como alergenos.
27. Un procedimiento para el diagnóstico in
vitro de alergias en un paciente, caracterizado porque
se toma una muestra de suero de un paciente, tras lo cual la muestra
se analiza para determinar las inmunoglobulinas que se unen a
alergenos según un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 26, donde se usa un chip micromatriz sobre
el cual se inmovilizan al menos 10, preferentemente al menos 50,
todavía más preferentemente al menos 90, alergenos diferentes, tras
lo cual se diagnostica una reacción positiva entre la muestra y los
alergenos inmovilizados como una alergia.
28. Chip micromatriz en el que se inmovilizan uno
o más alergenos únicos purificados.
29. El chip micromatriz según la reivindicación
28, caracterizado porque los alergenos se inmovilizan en un
punto de un diámetro de 100-500 \mum,
preferentemente un diámetro de 200-300 \mum.
30. El chip micromatriz según la reivindicación
28 ó 29, caracterizado porque es un soporte de vidrio.
31. El chip micromatriz según la reivindicación
28 ó 29, caracterizado porque es un soporte sintético.
32. El chip micromatriz según la reivindicación
28 ó 29, caracterizada porque es una oblea de silicio.
33. El chip micromatriz según la reivindicación
28 ó 29, caracterizado porque es una membrana.
34. El chip micromatriz según una cualquiera de
las reivindicaciones 28 a 33, caracterizado porque está
modificado químicamente, preferentemente mediante modificación
aminorreactiva y carboxirreactiva, respectivamente.
35. El chip micromatriz según una cualquiera de
las reivindicaciones 28 a 34, caracterizado porque los
alergenos están covalentemente unidos a él.
36. Un kit, caracterizado porque comprende
un chip micromatriz según una cualquiera de las reivindicaciones 28
a 35 y un primer reactivo que comprende al menos un reactivo
detector de inmunoglobulinas, preferentemente un anticuerpo
antiinmunoglobulina, preferentemente a una concentración conocida, y
posiblemente un segundo reactivo como muestra positiva que comprende
al menos una inmunoglobulina que se une a un alergeno.
37. El kit según la reivindicación 36 para llevar
a cabo un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 27.
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