KR20220038183A - Ibs 민감도 테스트 구성, 장치 및 방법 - Google Patents

Abstract

식품 민감도에 대해 고려된 테스트 키트들 및 방법들은 확립된 판별 p-value를 가진 식품 제제들의 합리적인 셀렉션에 기반한다. 특히 바람직한 키트들은 raw p-value에 의해 결정된 ≤0.07의 평균 판별 p-value 또는 FDR 다중도 조정된 p-value에 의해 결정된 ≤0.10의 평균 판별 p-value를 가진 식품 제제들의 최소 수인 키트들을 포함한다. 추가로 고려되는 양상에서, 식품 민감성에 대한 조성물들 및 방법들은 또한 예측 값을 더욱 향상시키기 위해 성별에 의해 계층화된다.

Description

IBS 민감도 테스트 구성, 장치 및 방법{COMPOSITIONS, DEVICES, AND METHODS OF IBS SENSITIVITY TESTING}

본 발명의 분야는 식품 불내성(food intolerance)에 대한 민감성 테스트이며, 그리고 특히 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome)으로 진단되거나 의심되는 환자를 위한 트리거 식품(trigger food)으로서 선택된 식품 품목들의 가능한 제거 및 테스팅에 관한 것이다.

배경 설명은 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 여기에 제공된 정보가 선행 기술이거나 현재 청구된 발명과 관련이 있다거나 특정 또는 암시적으로 언급된 모든 출판물이 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다.

식품 민감도는, 특히 과민성 대장 증후군 (IBS)과 관련되기 때문에, 종종 만성 복통(chronic abdominal pain), 불편함, 부풀음(bloating) 및/또는 대장 습관들에 변화를 나타내며 의료계에서는 잘 이해되지 않는다.

가장 일반적으로, IBS는 유사하거나 중첩되는 증상들을 가질 수 있는 다른 병리학적(pathological) 조건들 (예를 들어, 박테리아 또는 원충(protozoan) 감염, 유당 불내성(lactose intolerance) 등)을 배제함으로써 진단된다. 그러나 IBS는 종종 증상들을 유발하는 식이 용품(dietary item)들에 관련하여 꽤 다양하고, 합리적인 정도의 확실성을 가진 트리거 식품 품목(food item)들을 식별하는 것을 돕는 표준화된 테스트는 알려져 있지 않아, 그러한 환자들을 종종 시행 착오(trial-and-error)에 빠지게 한다.

트리거 식품들 식별을 돕는 상업적으로 이용 가능한 테스트들 및 실험실들이 있지만, 이러한 실험실들의 테스트 결과들의 품질은 일반적으로 소비자 보호 단체(consumer advocacy group )에 의해 보고된 대로 열악하다(예를 들어, http://www.which.co.uk/news/2008/08/food-allergy-tests-could-risk-your-health-154711/). 가장 주목할만한 것은, 이러한 테스트들 및 연구실들과 관련된 문제들은 이러한 테스트를 거의 쓸모 없게 만드는 높은 위양성율(false positive rate)들, 높은 위음성율(false negative rate)들, 높은 환자내(intra-patient) 변동성 및 실험실간 변동성이다. 유사하게, 결정적이지 않고(inconclusive) 매우 가변적인 테스트 결과들이 다른 곳(Alternative Medicine Review, Vol.9, No.2, 2004 : pp 198-207)에서도 보고 되었으며, 그리고 저자들은 이것이 여러 다른 메카니즘(mechanism)들을 통해 일어나는 식품 반응(food reaction)들과 식품 민감도(food sensitivity)들로 인한 것일 수 있다고 결론 지었다. 예를 들어, 모든 IBS 환자들이 식품 A에 대해 양성 반응을 보이는 것은 아니며, 또한 모든 IBS 환자들이 식품 B에 대해 음성 반응을 보이는 것은 아니다. 따라서, IBS 환자들이 식품 A에 양성 반응을 보일지라도, 환자들의 식단으로부터 식품 A의 제거가 환자들의 IBS 증상들을 완화시키지 않을 수 있다. 즉, 현재 이용 가능한 테스트들에서 사용된 식품 샘플들이 IBS에 대한 이들 식품 샘플들에 민감도들을 상호 연관시키기 위해서 높은 확률들을 기반으로 적절히 선택되었는지 여부는 잘 결정되지 않았다.

많은 사람들은 면역 분석법(immunoassay) 테스트를 위한 테스트 패널(panel)에 포함시킬 식품들 또는 알레르기 항원(allergen)들을 선택하기 위해 노력했다. 예를 들어, Cousins의 미국 특허 출원 제 2007/0122840 호는 ELISA 분석(assay)을 위한 테스트 패널에 포함된 29가지 식품 알레르기 항원들의 셀렉션(selection)을 개시한다. 29 가지 식품 알레르기 항원들은 식품 알레르기 항원들의 더 큰 패널과 함께한 예비 실험에서 IgG 양성의 빈도에 기초하여 선택된다. 그러나 Cousins은 선택된 항원(antigen)들에 대한 어떠한 정량적 및/또는 통계적 분석들을 제시(teach)하는 것에 실패했고, 이처럼 선택에 대한 이론적 근거(rationale)를 제공하는 것에 실패했다. 실제로, Cousin의 29 가지 식품 알레르기 항원을 선택하는 방법은 선택이 다소 임의적이라는 비판을 받아왔다. 예를 들어, Croft는 Gastroenterology, Vol. 128, Issue 4, p.1135-1136에서 발매된 "IgG 식품 항체(antibody)들과 장의 자극(irritating the bowel)"이라는 제목의 논문에서 Cousin의 방법은 정상 또는 비-IBS 통제 대상의 통제들이 부족하여 측정되는 식품 항체들의 양과 범위가 비-IBS 환자들 또는 비-식품 불내성 환자(non-food intolerant patient)들과 비슷하거나 또는 완전히 다른지 여부는 분명하지 않다라고 비판했다. 그러므로, Cousins이 위양성 및 위음성 결과들에 관련하여 어떠한 개선을 이루었는지 여부는 분명하지 않다.

다른 예로서, Stierstorfer의 미국 특허 출원 제 2011/0306898 호는 피부 패치(patch)들 상의 테스트 물질로서 41가지 식품 물질들의 셀렉션을 개시한다. 41 가지 식품 물질들은 식품 물질(예를 들어, 바닐린(vanillin), 신남산 알데히드(cinnamic aldehyde), 소르빈산(sorbic acid) 등)들에 포함된 화학 물질들을 기준으로 선택되었다. 식품 물질들은 알레르기 접촉 피부염(allergic contact dermatitis)에 대해 IBS 환자들 또는 IBS 의심 환자에 대하여 검사되었다. 그러나 Stierstorfer도 역시 어떻게 위양성 또는 위음성 식품 알레르기 항원들이 제거되는지 그리고 알레르기 항원들이 IgG 양성 결과들 중 성 계층화(gender stratification)를 기준으로 선택되는지를 개시하는데 실패했다.

여기에 명시된 모든 간행물은 각 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로 통합되도록 표시된 것처럼 동일한 정도로 참조로 통합된다. 통합된 참조에서 정의 또는 사용이 일관성이 없거나 본 명세서에 제공된 해당 용어의 정의와 상반되는 경우, 여기에 제공된 해당 용어의 정의가 적용되며 참조에서의 해당 용어의 정의는 적용되지 않는다.

따라서, 식품 민감도에 대한 다양한 테스트들이 본 기술분야에 공지되어 있지만, 모두 또는 거의 모든 것들이 하나 이상의 단점들을 갖는다. 따라서, 특히 IBS로 확인되거나 의심되는 환자를 위한 트리거 식품의 식별 및 가능한 제거를 위해, 식품 민감도 테스트의 개선된 조성물, 디바이스들 및 방법들에 대한 수요(need)가 여전히 존재한다.

본 출원은 그 전체가 참조로 통합된 2014년 11월 14일자로 출원된 일련 번호 제 62/079783호인 우리의 미국 특허 가출원에 우선권을 주장한다.

본 발명의 주제는 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome)으로 진단되거나 의심되는 환자들에게 식품 불내성(food intolerance)을 테스트하기위한 시스템들 및 방법들을 제공한다. 본 발명의 일면은 과민성 대장 증후군으로 진단되거나 의심되는 환자들에게 식품 불내성을 테스트하기위한 테스트 키트(test kit)이다. 테스트 키트는 개별적으로 어드레스 가능한(addressable) 각각의 고체 캐리어(carrier)들에 결합된(coupled) 복수의 별개 식품 제제(distinct food preparation)들을 포함한다. 복수의 별개 식품 제제들은 raw p-value에 의해 결정된 ≤ 0.07의 평균 판별 p-value 또는 FDR 다중도 조정된 p-value(FDR multiplicity adjusted p-value)에 의해 결정된 ≤ 0.10의 평균 판별(discriminatory) p-value를 갖는다.

본 발명의 또 다른 양상은 과민성 대장 증후군으로 진단되거나 의심되는 환자들에서 식품 불내성을 테스트하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 과민성 대장 증후군으로 진단되거나 의심되는 환자의 체액(bodily fluid)과 식품 제제를 접촉시키는 단계를 포함한다. 체액은 성별 확인과 관련이 있다. 상기 접촉시키는 단계는 체액으로부터의 IgG가 식품 제제의 하나 이상의 컴포넌트에 결합하는 것을 허용하는 조건 하에 수행되는 것이 특히 바람직하다. 상기 방법은 신호를 획득하기 위해 식품 제제의 적어도 하나의 성분에 결합된 IgG 를 측정하는 단계로 계속되며, 그리고 결과를 획득하기 위해 성별 식별을 사용하여 식품 제제에 대한 성 계층화 기준값(gender-stratified reference)과 신호를 비교하는 단계로 계속된다. 그 다음, 상기 방법은 결과를 이용하여 리포트를 업데이트하거나 생성하는 단계도 포함한다.

본 발명의 또 다른 양상은 과민성 대장 증후군으로 진단되거나 의심되는 환자들에서 식품 불내성에 대한 테스트를 생성하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 복수의 별개 식품 제제들에 대한 테스트 결과들을 획득하는 단계를 포함한다. 테스트 결과들은 과민성 대장 증후군으로 진단되거나 의심되는 환자들의 체액들 및 과민성 대장 증후군으로 진단되지 않거나 의심되지 않는 통제군(control group)의 체액들을 기반으로 한다. 상기 방법은 또한 별개 식품 제제들 각각에 대해 성별에 의해 테스트 결과들을 계층화하는 단계를 포함한다. 그 다음, 상기 방법은 사전 결정된 백분위 수(percentile rank)에 대해 개별 식품 제제들 각각에 대한 남성 및 여성 환자에 대한 상이한 컷오프(cutoff) 값을 할당하는 단계로 계속된다.

본 발명의 또 다른 양상은 과민성 대장 증후군의 진단에서 개별적으로 어드레스 가능한 각각의 고체 캐리어에 결합된 복수의 별개 식품 제제들의 사용을 포함한다. 복수의 별개 식품 제제들은 raw p-value에 의해 결정된 ≤ 0.07의 평균 판별 p-value 또는 FDR 다중도 조정된 p-value에 의해 결정된 ≤ 0.10의 평균 판별 p-value에 기초하여 선택된다.

본 발명의 주제의 다양한 목적들, 특징들, 양상들 및 장점들은 첨부된 도면들과 함께 바람직한 실시 예에 대한 다음의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이며, 도면에서 동일한 번호들은 동일한 컴포넌트들을 나타낸다.

표 1은 식품 제제들이 준비될 수 있는 식품 품목들의 목록을 나타낸다.
표 2는 양방향(2-tailed) FDR 다중도-조정된 p-value들에 따라 순위가 매겨진 식품들의 통계 데이터를 나타낸다.
표 3은 식품 및 성별에 의한 ELISA 점수의 통계 데이터를 나타낸다.
표 4는 사전 결정된 백분위 수에 대한 식품들의 컷오프 값을 나타낸다.
도 1a는 백밀(white wheat)로 테스트된 통제군 및 남성 IBS 환자들의 ELISA 신호 점수를 도시한다.
도 1b는 백밀로 테스트된 90 번째 백분위 수 및 95 번째 백분위 수를 초과하는 남성 IBS 피험자(subject)들의 백분율 분포를 도시한다.
도 1c는 백밀로 테스트된 여성 통제군 모집단으로부터 결정된 95 번째 백분위 수 컷오프와 함께 여성에서의 신호 분포를 도시한다.
도 1d는 백밀로 테스트된 90 번째 및 95 번째 백분위 수를 초과하는 여성 IBS 피험자들의 백분율 분포를 도시한다.
도 2a는 코코아로 테스트된 통제군 및 남성 IBS 환자들의 ELISA 신호 점수를 도시한다.
도 2b는 코코아로 테스트된 90 번째 및 95 번째 백분위 수를 초과하는 남성 IBS 피험자들의 백분율 분포를 도시한다.
도 2c는 코코아로 테스트된 여성 통제군 모집단으로부터 결정된 95 번째 백분위 수 컷오프와 함께 여성에서의 신호 분포를 도시한다.
도 2d는 코코아로 테스트된 90 번째 및 95 번째 백분위 수를 초과하는 여성 IBS 피험자들의 백분율 분포를 도시한다.
도 3a는 호밀(rye)로 테스트된 통제군 및 남성 IBS 환자들의 ELISA 신호 점수를 도시한다.
도 3b는 호밀로 테스트된 90 번째 및 95 번째 백분위 수를 초과하는 남성 IBS 피험자들의 백분율 분포를 도시한다.
도 3c는 호밀로 테스트된 여성 통제군 모집단으로부터 결정된 95 번째 백분위 수 컷오프와 함께 여성에서의 신호 분포를 도시한다.
도 3d는 호밀로 테스트된 90 번째 및 95 번째 백분위 수를 초과하는 여성 IBS 피험자들의 백분율 분포를 도시한다.
도 4a는 홍차로 테스트된 통제군 및 남성 IBS 환자들의 ELISA 신호 점수를 도시한다.
도 4b는 홍차로 테스트된 90 번째 및 95 번째 백분위 수를 초과하는 남성 IBS 피험자들의 백분율 분포를 도시한다.
도 4c는 홍차로 테스트된 여성 통제군 모집단으로부터 결정된 95 번째 백분위 수 컷오프와 함께 여성에서의 신호 분포를 도시한다.
도 4d는 홍차로 테스트된 90 번째 및 95 번째 백분위 수를 초과하는 여성 IBS 피험자들의 백분율 분포를 도시한다.
도 5a 내지 5b는 90 번째 백분위 수 및 95 번째 백분위 수에서 트리거 식품으로 식별된 식품들의 수에 따른 IBS 피험자들의 분포들을 도시한다.
표 5는 90번째 백분위 수에 기초한 양성 결과들의 수인 통제군 및 IBS 환자들의 raw 데이터를 나타낸다.
표 6은 표 5에 나타난 IBS 환자 모집단들의 raw 데이터를 요약한 통계 데이터를 나타낸다.
표 7은 표 5에 나타난 통제군 모집단들의 raw 데이터를 요약한 통계 데이터를 나타낸다.
표 8은 대수 변환(logarithmic transformation)에 의해 변환된 표 5에 나타난 IBS 환자 모집단들의 raw 데이터를 요약한 통계 데이터를 나타낸다.
표 9는 대수 변환에 의해 변환된 표 5에 나타난 통제군 모집단들의 raw 데이터를 요약한 통계 데이터를 나타낸다.
표 10은 IBS와 비-IBS 샘플들 사이에서 양성 식품들의 기하 평균 수(geometric mean number)를 비교하기 위한 독립적인 T-test의 통계 데이터를 나타낸다.
표 11은 IBS 및 비-IBS 샘플들 사이에서 양성 식품들의 기하 평균 수를 비교하기 위한 Mann-Whitney 테스트의 통계 데이터를 나타낸다.
도 6a는 표 5에 나타난 데이터의 상자그림(box and whisker plot)을 도시한다.
도 6b는 표 5에 나타난 데이터의 눈금 상자그림을 도시한다.
도 7은 표 12에 나타난 통계 데이터에 대응하는 ROC 곡선을 도시한다.
표 12는 표 5 내지 11에 나타난 데이터의 수신기 동작 특성(Receiver Operating Characteristic, ROC) 곡선 분석의 통계 데이터를 도시한다.
표 13은 양성 식품들의 수로부터 여성 환자들의 IBS 상태를 예측하는 성능 측정 항목(metric)들의 통계 데이터를 도시한다.
표 14는 양성 식품들의 수로부터 남성 환자들의 IBS 상태를 예측하는 성능 측정 항목들의 통계 데이터를 나타낸다.

본 발명자들은 IBS가 있는 것으로 진단되거나 의심되는 환자들에서 트리거 식품(trigger food)들을 식별하기 위해 식품 테스트에 사용되는 식품 제제(food preparation)들이 IBS / IBS 증상과 동등하게 예측 및/또는 관련되지 않는다는 것을 발견했다. 실제로 다양한 실험들은 다양한 식품 품목들 중 특정 식품 품목들이 IBS와 예측성/관련성이 높은데 반해 다른 식품 품목들은 IBS와 통계적으로 의미있는 연관성을 가지지 않음을 밝혀냈다.

더 놀라운 결과로, 본 발명자들은 식품 품목들의 높은 가변성(variability) 이외에, 테스트에서의 반응에 관한 성별 가변성이 IBS와의 식품 품목 또는 연관성(association)의 결정에 중요한 역할을 한다는 것을 발견했다. 결과적으로, 발명자의 발견 및 추가 고려 사항들에 기초하여, 테스트 키트들 및 방법들은 현재 IBS 사인(sign)들 및 증상들의 감소를 위해 제거될 수 있는 식품 품목들의 선택에서 실질적으로 더 높은 예측력으로 제시된다.

이하의 논의는 본 발명의 주제의 많은 예시적인 실시 예들을 제공한다. 각각의 실시 예가 본 발명의 엘리먼트들의 단일 조합을 나타내더라도, 본 발명의 주제는 개시된 엘리먼트들의 모든 가능한 조합들을 포함하는 것으로 고려된다. 따라서, 일 실시 예가 엘리먼트들 A, B 및 C를 포함하고 제 2 실시 예가 엘리먼트들 B 및 D를 포함하는 경우, 본 발명의 주제는 명시적으로 개시하지않아도 A, B, C 또는 D의 다른 나머지 조합들을 포함하는 것으로 고려된다.

일부 실시 예들에서, 본 발명의 특정 실시 예들을 설명하고 청구하는데 사용되는 양들 또는 범위들을 나타내는 숫자들은 어떤 경우들에는 "약"이라는 용어로 수정되는 것으로 이해되어야한다. 따라서, 일부 실시 예들에서, 서술된 설명 및 첨부된 청구 범위들에 제시된 수치 파라미터들는 특정 실시 예에 의해 획득될 수 있는 원하는 특성에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 일부 실시 예에서, 수치 파라미터들은 보고된 유효 자릿수의 수 및 일반적인 반올림 기법들을 적용하여 해석 되어야한다. 본 발명의 일부 실시 예의 넓은 범위들을 설명하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도, 특정 실시 예들에 기재된 수치들은 가능한 한 정확하게 보고된다. 본 발명의 일부 실시 예들에서 제시된 수치들은 이들 각각의 시험 측정들에서 발견된 표준 편차로부터 필연적으로 발생하는 특정 오차를 포함 할 수 있다. 문맥에 상반되는 내용이 명시되어 있지 않는 한, 여기에 명시된 모든 범위들은 그 종점들을 포함하는 것으로 해석되어야하며 개방형 범위들은 상업적으로 실용적인 가치들만을 포함하도록 해석되어야 한다. 마찬가지로, 문맥에 상반되는 것을 나타내지 않는 한 모든 값들의 목록들은 중간 값들을 포함하는 것으로 고려되어야 한다.

본 명세서의 설명 및 하기의 청구 범위를 통해 사용된 바와 같이, "한(a)", "한(an)"및 "상기(the)"의 의미는 문맥상 달리 명시하지 않는 한 복수의 인용 문헌을 포함한다. 또한, 본 명세서의 설명에서 사용되는 바와 같이, 문맥에 따라 달리 명시하지 않는 한 "~에서(in)"의 의미는 "~에서(in)" 및 "~상에(on)"를 포함한다.

본 명세서에 기술된 모든 방법들은 본 명세서에서 달리 지시되거나 또는 문맥에 의해 명백하게 부인되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행 될 수 있다. 본 명세서의 특정 실시 예와 관련하여 제공된 임의의 그리고 모든 예들 또는 예시적인 언어(예를 들어, 이러한(such as))의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 나타내도록 의도된 것이며, 다르게 청구된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서에서 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 청구되지 않은 엘리먼트를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.

본 명세서에 개시된 본 발명의 실시 예들 또는 대체 엘리먼트들의 그룹핑(Grouping)들은 제한들로 해석되어서는 안된다. 각 그룹 멤버는 개별적으로 또는 그룹의 다른 멤버들 또는 여기에 있는 다른 엘리먼트들과 조합하여 언급되거나 청구될 수 있다. 한 그룹의 하나 이상의 멤버는 편의성 및/또는 특허성의 이유로 그룹에 포함되거나 그룹에서 삭제 될 수 있다. 그러한 포함 또는 삭제가 발생하는 경우에, 명세서는 수정된 그룹을 포함하는 것으로 간주되어 첨부된 청구 범위들에서 사용된 모든 마쿠쉬 그룹들에 대한 서면 설명(written description)을 이행(fulfill)한다.

따라서, 특히 바람직한 한 양상에서, 본 발명자들은 환자가 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome)으로 진단되거나 의심되는 환자들에서 식품 불내성(food intolerance)을 테스트하기에 적합한 테스트 키트(test kit) 또는 테스트 패널(test panel)을 고려한다. 가장 바람직하게는, 이러한 테스트 키트 또는 패널은 개별적으로 어드레싱 가능한(addressable) 각각의 고체 캐리어(carrier)들에 결합되는(예를 들어, 어레이(array) 또는 미세 우물 플레이트의 형태) 복수의 별개의 식품 제제들(예: 미가공 또는 가공 추출물를 포함할, 바람직하게는 여과될 수 있거나 여과되지 않을 수 있는 선택적인 보조 용매가 있는 수성 추출물)을 포함할 것이고, 복수의 식품 제제들은 raw p-value에 의해 결정된 ≤0.07의 평균 판별 p-value 또는 FDR 다중도 조정된 p-value에 의해 결정된 ≤0.10의 평균 판별 p-value를 가진다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 가공된 추출물들은 기계적 또는 화학적으로 변형된 (예를 들어, 다져지거나(minced), 가열되거나, 삶거나, 발효되거나(fermented), 훈제되는 등) 식품 품목들로 만들어진 식품 추출물들을 포함한다.

일부 양상들에서, 본 발명의 특정 실시 예들을 기술하고 청구하는데 사용되는 성분의 양들, 농도들, 반응 조건들 등과 같은 특성들을 나타내는 숫자들은 어떤 경우들에서 용어 "약(about)"으로 수정되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 일부 실시 예들에서, 서술된 설명 및 첨부된 청구 범위들에 기재된 수치 파라미터들은 특정 실시 예에 의해 획득될 수 있는 원하는 특성에 따라 변할 수 있는 근사치들이다. 일부 실시 예들에서, 수치 파라미터들은 보고된 유효 자릿수의 수 및 일반적인 반올림 기법들을 적용하여 해석되어야 한다. 본 발명의 일부 실시 예들의 넓은 범위들을 설명하는 수치 범위들 및 파라미터들이 근사치들임에도 불구하고, 특정 예들에 기재된 수치 값들은 가능한 한 정확하게 보고된다. 본 발명의 일부 실시 예들에서 제시된 수치들은 각각의 테스트 측정들에서 발견되는 표준 편차로부터 필연적으로 발생하는 특정 오차들을 포함 할 수 있다. 더욱이, 문맥이 상반되는 것을 지시하지 않는 한, 본 명세서에 기재된 모든 범위들은 종단점들을 포함하는 것으로 해석되어야 하고, 개방형 범위들은 상업적으로 실용적인 값들만을 포함하도록 해석되어야 한다. 마찬가지로 문맥이 상반되는 것을 나타내지 않는 한 모든 값들의 목록들은 중간 값들을 포함하는 것으로 고려되어야 한다.

본 발명의 주제를 제한하지 않고, 식품 제제들은 일반적으로 IBS의 사인(sign)들 또는 증상들을 유발하는 것으로 알려지거나 의심되는 식품들로부터 추출된다. 특히 적합한 식품 제제들은 아래에 개설된 실험 절차들에 의해 식별될 수 있다. 따라서, 식품 품목들은 여기에 기술된 품목들에 한정 될 필요는 없고, 본 명세서에 제시된 방법에 의해 식별 될 수 있는 모든 품목들이 고려 될 수 있음을 이해되어야 한다. 그러므로 예시적인 식품 제제들은 코코아(cocoa), 차(tea)(예를 들어 녹차, 홍차 등), 귀리(oat), 양배추(cabbage), 우유(cow milk), 양파(onion)(예를 들어 노란색, 흰색, 마우이(maui) 등), 꿀(honey), 호밀(rye), 옥수수(corn), 이스트(yeast), 밀(wheat)(예를 들어, 붉은, 흰 등), 콩(soybean), 계란(egg), 참치(tuna), 레몬(lemon), 파인애플(pineapple), 오이(cucumber), 오렌지(orange), 넙치(halibut), 호두(walnut), 자몽(grapefruit), 사탕수수 설탕(cane sugar), 닭(chicken), 블루베리(blueberry) 및 새우(shrimp)(예를 들어 미국 걸프 흰(US Gulf white), 태국, 타이거 등)로 제조되는 적어도 2개의, 적어도 4개의, 적어도 12개의 식품 제제들을 포함한다. 추가적으로 고려되는 식품 제제들은 게(crab)(예를 들어, 던 네스, 블루, 알래스카 킹 등), 보리(barley), 딸기(strawberry), 돼지고기(pork), 쌀(rice)(예를 들어, 현미, 백미등), 쇠고기(beef), 캐슈(cashew), 대구(codfish), 감자(potato), 흰깨(white Sesame), 브로콜리(broccoli), 아몬드(almond), 칠면조(turkey), 가리비(scallop) 및/또는 연어(Salmon)로부터 제조된다. 더 나아가서 특히 고려되는 식품 품목들 및 식품 제제들이 제조될 수 있는 식품 첨가물들이 표 1에 열거된다.

과민성 대장 증후군으로 진단되거나 의심되는 환자들 및 건강한 통제군 개체들(즉, 과민성 대장 증후군으로 진단되지 않거나 의심되지 않는)로부터의 체액을 사용하여, 다수의 추가적인 식품 품목들이 식별 될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 식별된 식품 품목들은 높은 판별력(discriminatory power)을 가지며, 이처럼 raw p-value에 의해 결정된 ≤0.15, 더 바람직하게는 ≤0.10, 그리고 가장 바람직하게는 ≤0.05의 p-value 및/또는 허위 발견률(False Discovery Rate, FDR) 다중도 조정된 p-value에 의해 결정된 ≤0.10, 더 바람직하게는 ≤0.08, 그리고 가장 바람직하게는 ≤0.07의 p-value를 가진다.

따라서, 패널(panel)이 다수의 식품 제제를 가지는 경우, 복수의 별개의 식품 제제들은 raw p-value에 의해 결정된 ≤0.05의 평균 판별 p-value 또는 FDR 다중도 조정된 p-value(FDR multiplicity adjusted p-value)에 의해 결정된 ≤0.08의 평균 판별 p-value, 또는 더욱 바람직하게는 raw p-value에 의해 결정된 ≤0.25의 평균 판별 p-value 또는 FDR 다중도 조정된 p-value에 의해 결정된 ≤0.07의 평균 판별 p-value를 가지는 것으로 고려된다. 더 바람직한 양상들에서, FDR 다중도 조정된 p-value는 연령 및 성별 중 적어도 하나에 대해 조정될 수 있고, 가장 바람직하게는 연령 및 성별 모두에 대해 조정될 수 있다. 한편, 테스트 키트 또는 패널이 단일 성별로 사용하기 위해 계층화되는 경우, 단일 성별로 조정되는 경우에 테스트 키트 또는 패널에서 복수의 별개 식품 제제들의 50 % 이상 (그리고 보다 일반적으로는 70 % 또는 전부)은 raw p-value에 의해 결정된 ≤0.07의 평균 판별 p-value 또는 FDR 다중도 조정된 p-value에 의해 결정된 ≤0.10의 평균 판별 p-value를 가지는 것도 고려 된다. 더욱이, 다른 계층화 (예를 들어, 식이 선호도, 민족성, 거주지, 유전적 소인(genetic predisposition) 또는 가족력 등)도 고려되며, 그리고 PHOSITA는 적절한 계층화 선택을 쉽게 평가받을 수 있다는 것이 이해되어야한다.

본 명세서에서의 값들의 범위의 기술은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 참조하는 약식(shorthand) 방법으로서 제공하기 위해 의도된 것이다. 본 명세서에서 별도로 지시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 본 명세서에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 통합된다. 본 명세서에 기술된 모든 방법들은 본 명세서에서 달리 지시되거나 문맥에 의해 명백하게 부정되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행 될 수 있다. 본 명세서의 특정 실시 예들에 관련하여 제공된 임의의 및 모든 예들, 또는 예시적인 언어 (예를 들어, "~와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 나타내도록 의도 된 것이며, 달리 청구된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 명세서에서 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 청구되지 않은 엘리먼트를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.

물론, 테스트 키트 또는 패널의 특정 포맷(format)은 상당히 변할 수 있으며, 그리고 고려되는 포맷들은 미세 우물 플레이트(micro well plate)들, 미세 유체 디바이스(a microfluidic device), 딥 스틱(dip stick)들, 멤브레인-바운드 어레이(membrane-bound array)들 등을 포함한다는 것을 주목해야한다. 결과적으로, 식품 제제들이 결합되는 고체 캐리어(carrier)는 미세 유체 디바이스, (칼라-코드된(color-coded) 또는 자기) 비드, 흡착 필름(예를 들어, 니트로 셀룰로오스(nitrocellulose), 마이크로 / 나노다공성 폴리머 필름(micro/nanoporous polymeric film)), 화학 센서, 전기 센서(예를 들어, 프린트된 구리 센서 또는 마이크로 칩) 또는 다중 벽 플레이트(multiwall plate)의 우물(well)을 포함할 수 있다. 일부 실시 양상들에서, 분자 흡수(molecular absorption) 및 광 검출기(예를 들어, 표면 플라스몬 공명기(surface plasmon resonance) 등)에 의한 신호 검출에 적합한 고체 캐리어가 사용될 수 있다는 것도 또한 고려된다.

결론적으로, 본 발명자들은 과민성 대장 증후군으로 진단되거나 의심되는 환자에서 식품 불내성을 테스트하는 방법을 고려한다. 가장 일반적으로, 그러한 방법들은 과민성 대장 증후군으로 진단되거나 의심되는 환자의 체액(예를 들어, 전혈(whole blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 타액(saliva) 또는 대변 부유물(fecal suspension))과 음식 제제를 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 체액은 성별 식별과 관련된다. 전술 한 바와 같이, 접촉시키는 단계는 바람직하게는 체액으로부터의 IgG(또는 IgE 또는 IgA 또는 IgM)가 식품 제제의 적어도 하나의 성분에 결합하는 것을 허용하는 조건들 하에 수행되고, 식품 제제의 컴포넌트(들)에 결합된 IgG는 신호를 획득하기 위해 정량/측정된다. 가장 바람직하게는, 신호는 결과를 획득하기 위해 성별 식별을 사용하는 식품 제제를 위한 성 계층화 기준값(예를 들어, 적어도 90번째 백분위 수)과 비교되고, 그런 다음에 결과는 보고서를 업데이트하거나 생성하는 데 사용된다. 바람직하게는, 보고서는 개별 분석 결과들의 종합 결과로 생성 될 수 있다.

가장 일반적으로, 그러한 방법들은 단일 식품 제제로 제한되지 않으며, 다수의 상이한 식품 제제들을 사용할 것이다. 전술 한 바와 같이, 적합한 식품 제제들은 하기에 기술된 바와 같이 다양한 방법들을 사용하여 식별 될 수 있지만, 특히 바람직한 식품 제제들은 코코아, 차(예를 들어 녹차, 홍차 등), 귀리, 양배추, 우유, 양파(예를 들어 노란색, 흰색, 마우이 등), 꿀, 호밀, 옥수수, 이스트, 밀(예를 들어, 붉은, 흰 등), 콩, 계란, 참치, 레몬, 파인애플, 오이, 오렌지, 넙치, 호두, 자몽, 사탕수수 설탕, 닭, 블루베리 및 새우(예를 들어 미국 걸프 흰, 태국, 타이거 등)를 포함한다. 추가적으로 고려되는 식품 제제들은 게(예를 들어, 던 네스, 블루, 알래스카 킹 등), 보리, 딸기, 돼지고기, 쌀(예를 들어, 현미, 백미 등), 쇠고기, 캐슈, 대구, 감자, 흰깨, 브로콜리, 아몬드, 칠면조, 가리비 및/또는 연어 및/또는 표 1의 품목들로부터 제조된다. 상기 언급 한 바와 같이, 상이한 식품 제제들의 적어도 일부 또는 전부는 raw p-value에 의해 결정된 ≤0.07(또는 ≤0.05, 또는 ≤0.025)의 평균 판별 p-value, 및/또는 FDR 다중도 조정된 p-value(FDR multiplicity adjusted p-value)에 의해 결정된 ≤0.10(또는 ≤0.08, 또는 ≤0.07)의 평균 판별 p-value를 가진다.

식품 제제들이 수성 추출물(crude aqueous extract) 또는 필터링된 수성 추출물(crude filtered aqueous extract)로서 단일 식품 품목들로부터 제조되는 것이 바람직하지만, 반면에 식품 제제들이 복수의 식품 품목들의 혼합물들로부터 제조 될 수 있다는 것도 고려된다(예를 들어, 레몬, 오렌지 및 라임(lime)을 포함하는 감귤류(citrus)의 혼합물, 푸른 게, 왕 게 및 던지니스(Dungeness) 게를 포함하는 게의 혼합물, 흰 밀과 붉은 밀을 포함하는 밀의 혼합물, 미국 걸프 흰, 태국 및 타이거 새우들을 포함하는 새우의 혼합물 등). 일부 실시 예들에서, 식품 제제들은 정제된(purified) 식품 항원(antigen)들 또는 재조합(recombinant) 식품 항원들로부터 제조 될 수 있다는 것도 고려된다.

일반적으로 식품 제제는 고체 표면 상에(전형적으로는 어드레싱 가능한 방식으로) 고정화(immobilized)되는 것이 바람직하기 때문에, 식품 제제의 컴포넌트에 결합된 IgG 또는 다른 유형의 항체(antibody)를 측정하는 단계는 면역 검정법(immunoassay test)를 통해 수행되는 것이 고려된다(예를 들어, ELISA 테스트, 항체 캡쳐 효소 면역 측정법(antibody capture enzyme immunoassay), 다른 유형의 항체 캡쳐 분석(antibody capture assay)들 등).

상이한 관점에서 볼 때, 본 발명자들은 과민성 대장 증후군으로 진단되거나 의심되는 환자들에서 식품 불내성에 대한 테스트를 생성하는 방법을 고려한다. 이 테스트는 이미 과민성 대장 증후군으로 진단되거나 의심되는 환자들에게 적용되기 때문에, 본 저자들은 이 방법이 IBS의 주요 진단 목적을 가진다는 것을 고려하지 않는다. 그 대신, 이 방법은 이미 진단 받거나 의심되는 IBS 환자들 중에서 유발하는 음식물을 식별하는 것이다. 이러한 테스트는 일반적으로 다양한 별개 식품 제제에 대한 하나 이상의 테스트 결과(예를 들어, ELISA, 항체 캡쳐 효소 면역 측정법)들을 획득하는 단계를 포함할 것이며, 여기서 테스트 결과들은 과민성 대장 증후군으로 진단되거나 의심되는 환자들의 체액(예를 들어, 혈액 타액, 대변 부유물)들 및 과민성 대장 증후군으로 진단되지 않은 통제군의 체액들에 기초한다. 가장 바람직하게는, 테스트 결과들은 별개 식품 제제들 각각에 대해 성별로 계층화되며, 별개 식품 제제들에 대한 남성 및 여성 환자들에 대한 상이한 컷오프 값(예를 들어, 남성 및 여성 환자의 컷오프 값은 적어도 10 % (abs) 상이함)이 사전 결정된 백분위 수(예를 들어, 90 번째 또는 95 번째 백분위 수)에 할당된다.

앞서 언급 한 바와 같이, 그리고 본 발명의 주제를 제한하지 않는, 별개 식품 제제들은 코코아, 차(예를 들어 녹차, 홍차 등), 귀리, 양배추, 우유, 양파(예를 들어 노란색, 흰색, 마우이 등), 꿀, 호밀, 옥수수, 이스트, 밀(예를 들어, 붉은, 흰 등), 콩, 계란, 참치, 레몬, 파인애플, 오이, 오렌지, 넙치, 호두, 자몽, 사탕수수 설탕, 닭, 블루베리 및 새우(예를 들어 미국 걸프 흰, 태국, 타이거 등)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 식품 품목들로부터 제조된 2 개(또는 6 개 또는 10개 또는 15개)의 식품 제제들을 포함하는 것이 고려된다. 추가적으로 고려되는 식품 제제들은 게(예를 들어, 던지니스, 블루, 알래스카 킹 등), 보리, 딸기, 돼지고기, 쌀(예를 들어, 현미, 백미 등), 쇠고기, 캐슈, 대구, 감자, 흰깨, 브로콜리, 아몬드, 칠면조, 가리비 및/또는 연어 및/또는 표 1의 품목들로부터 제조된다. 반면에, 새로운 식품 품목들이 테스트되는 경우, 별개 식품 제제들은 코코아, 차(예를 들어 녹차, 홍차 등), 귀리, 양배추, 우유, 양파(예를 들어 노란색, 흰색, 마우이 등), 꿀, 호밀, 옥수수, 이스트, 밀(예를 들어, 붉은, 흰 등), 콩, 계란, 참치, 레몬, 파인애플, 오이, 오렌지, 넙치, 호두, 자몽, 사탕수수 설탕, 닭, 블루베리 및 새우(예를 들어 미국 걸프 흰, 태국, 타이거 등) 이외의 식품 품목들로부터 제조된 식품 제제를 포함할 수 있다는 점이 이해되어야 한다. 그러나 식품 품목들의 특정 선택에 관계없이, 일반적으로 별개 식품 제제들은 raw p-value에 의해 결정된 ≤0.07(또는 ≤0.05, 또는 ≤0.025)의 평균 판별 p-value 또는 FDR 다중도 조정된 p-value에 의해 결정된 ≤0.10(또는 ≤0.08, 또는 ≤0.07)의 평균 판별 p-value를 가지는 것이 바람직하다. 예시적인 양상들 및 프로토콜(protocol)들 및 고려 사항은 하기 실험적 설명에서 제공된다.

따라서, 본 명세서에 설명 된 바와 같이 높은 신뢰도의 테스트 시스템을 가짐으로써, 위양성(false-positive) 및 위음성(false negative)들의 비율이 상당히 감소 될 수 있다는 점이 이해되어야하고, 특히 테스트 시스템들 및 방법들은 아래에서 나타나듯 성 계층화되거나 성별 차이들에 대해 조정된다. 그러한 장점들은 지금까지는 실현되지 않았으며, 본 명세서에 제시된 시스템들 및 방법들은 IBS로 진단되거나 의심되는 환자들에 대한 식품 민감도 테스트의 예측력을 실질적으로 증가시킬 것으로 기대된다.

실험들

식품 제제 생성을 위한 일반적인 프로토콜: 각각의 미가공(raw) 식품들의 식용 부분으로부터 제조된 상업적으로 이용가능한 식품 추출물(Biomerica Inc., 17571 Von Karman Ave, Irvine, CA 92614로부터 이용 가능함)이 제조사의 지침들에 따라 ELISA 플레이트들을 제조하는데 사용되었다.

일부 식품 추출물들에 대하여, 본 발명자들은 식품 추출물들을 생성하기 위한 특정 절차들로 제조된 식품 추출물들이 상업적으로 이용 가능한 식품 추출물들과 비교하여 IBS 환자들에서 증가된 IgG 반응성을 검출함에 있어 보다 우수한 결과들을 제공한다는 것을 찾아냈다. 예를 들어, 곡물들 및 견과류들에 대해, 식품 추출물을 생성하는 3 단계 절차가 선호된다. 제 1 단계는 탈지(defatting) 단계이다. 이 단계에서 곡물과 견과류의 지질(lipid)들은 곡물과 견과류의 가루(flour)를 비극성 용매(non-polar solvent)와 접촉시키고 잔유물(residue)을 수집하여 추출된다. 그 다음, 탈지된 곡물 또는 견과류 가루는 혼합물을 획득하기 위해서 가루를 높은(elevated) pH와 접촉시키고, 액체 추출물을 획득하기 위해서 혼합물로부터 고체(solid)를 제거하는 것에 의해 추출된다. 액체 추출물이 생성되면, 액체 추출물은 수성 제형(aqueous formulation)을 첨가하여 안정화된다. 바람직한 실시 예에서, 수성 제형은 4 내지 9 pH의 버퍼(buffer)의 버퍼 컴포넌트 20 내지 50 mM, 미네랄 염(mineral salt), 프로테아제 억제제(protease inhibitor), 금속 킬레이트 제(metal chelating agent) 및 당 알코올(sugar alcohol)을 포함한다. 이 제형은 -70 도에서의 장기 보관 및 활동의 손실(loss of activity) 없는 여러 번의 동결-해동을 허용했다.

다른 예로서, 육류들 및 어류에 대해, 식품 추출물을 생성하는 2 단계 절차가 선호된다. 제 1 단계는 추출 단계이다. 이 단계에서 미가공, 조리되지 않은(uncooked) 육류들 또는 생선의 추출물들은 고압 처리기에서의 수성 버퍼 제형에서 미가공, 조리되지 않은 육류들 또는 생선을 유화(emulsifying)시켜 생성된다. 그 다음 고체 물질들은 액체 추출물을 획득하기위해서 제거된다. 액체 추출물이 생성되면, 액체 추출물은 수성 제형을 첨가하여 안정화된다. 바람직한 실시 예에서, 수성 제형은 4 내지 9 pH의 버퍼의 버퍼 컴포넌트 20 내지 50 mM, 미네랄 염, 프로테아제 억제제, 금속 킬레이트제 및 당 알코올을 포함한다. 이 제형은 -70 도에서의 장기 보관 및 활동의 손실 없는 여러 번의 동결-해동을 허용했다.

또 다른 예로서, 과일들 및 채소들에 대해, 식품 추출물을 생성하는 2 단계 절차가 선호된다. 제 1 단계는 추출 단계이다. 이 단계에서, 과일들 또는 채소들의 액체 추출물들은 식품들을 분쇄하고 즙(juice)을 추출하기 위한 추출기(예를 들어, 즙 짜기(masticating juicer) 등)를 사용하여 생성된다. 그 다음 고체 물질들은 액체 추출물을 획득하기위해서 제거된다. 액체 추출물이 생성되면, 액체 추출물은 수성 제형을 첨가하여 안정화된다. 바람직한 실시 예에서, 수성 제형은 4 내지 9 pH의 버퍼의 버퍼 컴포넌트 20 내지 50 mM, 미네랄 염, 프로테아제 억제제, 금속 킬레이트제 및 당 알코올을 포함한다. 이 제형은 -70 도에서의 장기 보관 및 활동의 손실 없는 여러 번의 동결-해동을 허용했다.

ELISA 플레이트들의 블로킹(Blocking): 노이즈에 신호를 최적화하기 위해서, 플레이트들은 특별한 블로킹 버퍼(proprietary blocking buffer)에 의해 차단된다. 바람직한 실시 예에서, 블로킹 버퍼는 4 내지 9 pH로부터의 버퍼의 20 내지 50 mM, 동물성 단백질(protein of animal origin) 및 짧은 사슬 알콜(short chain alcohol)을 포함한다. 여러 가지 상업적 제제(commercial preparation)들을 포함하는 다른 블로킹 버퍼들이 시도 되었지만 노이즈에 대한 적절한 신호 및 요구되는 저분석변동성(low assay variability)을 제공 할 수 없었다.

ELISA 제제 및 샘플 테스트: 식품 항원 제제들을 제조사의 지침들에 따라 각각의 미세정량 우물(microtiter wells)들 상에 고정되었다. 분석들을 위해, 식품 항원들은 환자들의 혈청에 존재하는 항체들과 반응하고, 과량의 혈청 단백질들은 세척 단계에 의해 제거된다. IgG 항체 결합의 검출을 위해, 효소 표지 된 항-IgG 항체 접합체(enzyme labeled anti-IgG antibody conjugate)를 항원-항체 복합체(antigen-antibody complex)와 반응시켰다. 색은 결합된 효소와 반응하는 기질의 첨가에 의해 현상된다. 색상 강도가 측정되고 이는 특정 식품 항원에 특이적인 IgG 항체의 농도에 직접 비례한다.

IBS를 통제군들과 구별하기위한 ELISA 신호들의 능력의 순서로 순위가 매겨진 식품 목록을 결정하는 방법: 초기 선택 (예를 들어, 100 개의 식품 품목들, 또는 150 개의 식품 품목들, 또는 그 이상)에서 벗어나, 샘플들은 의도된 인구 집단에서 적은 소비 때문에 분석하기 전에 배제 될 수 있다. 또한, 특정 식품 품목들은 더 큰 일반 식품군을 대표하는 것으로 사용될 수 있고, 특히 이전 테스트는 일반 그룹 내 상이한 종들 간의 상관 관계를 확립하였다 (가장 바람직하게는 성별 모두에서 뿐만 아니라 단일한 성별에 대한 상관관계에도 적합함). 예를 들어, 태국 새우는 미국 걸프 흰 새우의 선호로 "새우" 식품군의 대표에서 떨어지고, 또는 킹크랩(King Crab)이 던지니스 게의 선호로 "게" 식품군의 대표에서 떨어질 수 있다. 더 바람직한 양상에서, 최종 식품 목록은 50 개 식품 품목보다 짧고, 보다 바람직하게는 40 개 식품 품목과 동일하거나 미만이다.

식품 불내성 패널을 위해 궁극적으로 선택된 식품들은 특정 성별에 특유하지 않기 때문에, 성-중립(gender-neutral) 식품 목록이 필요했다. 관찰된 표본은 성별에 의해 불균형이였기 때문에 (예를 들어, 통제군: 22 % 여성, IBS: 64 % 여성), 성별에 의한 ELISA 신호 크기의 차이는 엄격하게 2-표본 t-test를 사용하여 성별에 대한 신호 점수들을 모델링하고 추가 분석을 위한 잔차(residual)들을 저장함으로써 제거 된다. Satterthwaite 근사법은 등분산(homogeneity of variances)의 부족을 설명하기위해 분모 자유도(denominator degrees of freedom)에 대해 사용되고, 양측 치환된(2-tailed permuted) p-value는 각 식품에 대한 raw p-value를 나타낸다. 비교 중 허위 발견률(FDR)은 용인 가능한 통계적 절차(예를 들어, Benjamini-Hochberg, 가족 별 오류율 (Family-wise Error Rate, FWER), 비교 당 오류율 (Per Comparison Error Rate, PCER) 등)에 의해 조정된다.

그 다음, 식품들은 그들 양방향 FDR 다중도 조절된 p-value들에 따라 순위가 정해졌다. 원하는 FDR 임계값과 같거나 더 낮게 조정된 p-value를 가지는 식품들은 통제군들보다 IBS에서 현저하게 더 높은 신호 점수들을 가지는 것으로 간주되어 식품 불내성 패널에 포함시킬 후보자들로 간주된다. 통계적 절차의 결과를 대표하는 일반적인 결과는 표 2에 제공된다. 여기서 식품의 순위는 FDR 조정이 있는 양방향 순열(permutation) T-test p-value에 따른 것이다.

특히, 본 발명자들은 테스트된 동일한 식품 제제들에 대해서도, 적어도 몇몇 식품 품목들에 대한 ELISA 점수가 극적으로 변하다는 점을 발견했고, 예시적인 미가공 데이터가 표 3에 제공된다. 쉽게 이해할 수 있듯이, 성별에 의해 계층화되지 않은 데이터는 남성 및 여성 데이터의 미가공 데이터에 동일한 컷오프 값이 적용되어 의미있는 설명 능력을 잃게 된다. 이러한 단점을 극복하기 위해, 본 발명자들은 하기에 기술된 바와 같이 성별로 데이터를 계층화했다.

각 식품에 대한 컷포인트 선택을 위한 통계적 방법: 어떤 ELISA 신호 점수가 "양성" 반응을 나타낼지(constitute)의 결정은 통제군 피험자들 중에 신호 점수들의 분포를 요약함으로써 이루어진다. 각 식품에 대해, 통제군 피험자 분포의 선택된 분위수(quantiles)보다 크거나 같은 점수들이 관찰된 IBS 피험자들은 "양성"으로 간주되었다. 컷포인트(cutpoint) 결정 상에 어느 한 피험자의 영향을 줄이기 위해 식품 별 (food-specific) 및 성별 별(gender-specific) 데이터 셋 각각은 1000회 리샘플링된 부트스트랩(bootstrap)이였다. 각 부트 스트랩 복제물 내에서, 통제군 신호 점수들의 90 번째 및 95 번째 백분위 수들이 결정되었다. 부트 스트랩 샘플들에서 각 IBS 피험자는 그/그녀가 "양성" 반응을 보였는지 여부를 결정하기 위해서 90 번째 및 95번째 백분위 수와 비교된다. 각 식품 및 성별의 최종 90번째 및 95번째 백분위 수-기반 컷포인트들은 1000 개 샘플들을 거쳐 평균 90 번째 및 95 번째 백분위 수로 계산된다. 각 IBS 피험자가 "양성"으로 평가된 식품들의 수는 식품들에 대한 데이터를 모아서 계산된다. 이러한 방법을 사용하여, 본 발명자들은 지금 표 4에서 취할 수 있는 바와 같이 대부분의 경우들에서 실질적으로 상이한 사전결정된 백분위 수에 대한 컷오프값들을 식별할 수 있었다.

밀에 대한 혈액 내 IgG 반응에서 성별 차이의 일반적인 예들이 도 1a 내지 1d에 도시되며, 도 1a는 남성 통제군 모집단으로부터 결정된 95 번째 백분위 수 컷오프인 남성에서의 신호 분포를 나타낸다. 도 1b는 90번째 및 95번째 백분위 수를 초과하는 남성 IBS 피험자들의 백분율 분포를 나타내는 반면에, 도 1c는 여성 통제군으로부터 결정된 95번째 백분위 수 컷오프인 여성에서의 신호 분포를 나타낸다. 도 1d는 90 번째 및 95 번째 백분위 수를 초과하는 여성 IBS 피험자들의 백분율 분포를 나타낸다. 동일한 방식으로, 도 2a 내지 2d는 코코아에 대한 차등 응답(differential response)을 예시적으로 도시하고, 도 3a 내지 3d들은 호밀에 대한 차등 응답을 예시적으로 도시하며, 도 4a 내지 4d들은 홍차에 대한 차등 응답을 예시적으로 도시한다. 도 5a 내지 5b들은 90번째 백분위 수(5a) 및 95번째 백분위 수(5b)에서 트리거 식품들로 식별된 식품들의 수에 의한 IBS 피험자들의 분포를 나타낸다. 발명자들은 특정 식품 품목들에 관계없이 남성 및 여성 반응들이 현저히 다르다는 것을 고려했다.

본 기술 분야에서 성 계층화된 IBS와 관련된 임의의 예측 가능한 식품군들을 제공하지 않았다는 것이 주목해야한다. 따라서 성별에 따라 뚜렷한 반응들을 나타내는 식품 품목들의 발견은 예전에 이용 가능한 모든 기술들을 고려할 때 분명히 예상 될 수 없는 놀라운 결과이다. 즉, 성별 계층화를 기반으로 한 식품 품목들의 선택은 예기치 않은 기술적 효과를 제공하여 남성 또는 여성 IBS 환자들 중 트리거 식품(triggering food)인 특정 식품 품목들에 대한 통계적 의미들이 크게 개선되었다.

IgG 반응 데이터의 정규화(Normalization): 환자의 IgG 반응 결과들의 미가공 데이터가 주어진 식품들 간의 반응의 강도를 비교하는 용도일 수 있지만, 환자의 IgG 반응 결과들은 주어진 식품에 대한 반응의 상대적 강도를 비교를 위해 단위없는 숫자(unit-less number)들을 생성하도록 정규화되고 색인화 되는 것도 고려된다. 예를 들어, 한 환자의 식품 특이적 IgG 결과(예를 들어, 던지니스 게에 특이적인 IgG 및 계란에 특이적인 IgG)들의 하나 이상이 그 환자의 전체 IgG로 정규화될 수 있다. 던지니스 게에 특이적인 환자의 IgG의 정규화된 값은 0.1일 수 있으며, 그리고 계란에 특이적인 환자의 IgG의 정규화된 값은 0.3일 수 있다. 이 시나리오에서, 달걀에 대한 환자의 반응의 상대적 강도는 던지니스 게에 비해 3 배 더 높다. 그런 다음, 계란 및 던지니스 게에 대한 환자의 민감도가 이처럼 색인될 수 있다.

다른 예들에서, 환자의 식품 특이적 IgG 결과들(예를 들어, 새우에 특이적인 IgG 및 돼지 고기에 특이적인 IgG) 중 하나 이상은 환자의 식품 특이적 IgG 결과들의 전역 평균(global mean)으로 표준화 될 수 있다. 환자의 식품 특이적 IgG의 전체 평균(global mean)들은 환자의 식품 특이적 IgG의 총량에 의해 측정될 수 있다. 이 시나리오에서, 새우에 대한 환자의 특이적 IgG는 환자의 총 식품 특이적 IgG의 평균(예를 들어, 새우, 돼지 고기, 던지니스 게, 닭 및 완두콩들 등의 IgG 수준의 평균)으로 표준화 될 수 있다. 그러나, 환자의 식품 특이적 IgG의 전체 평균들은 다중 테스트들을 통해 특정 유형의 식품에 대한 환자의 IgG 수준들에 의해 측정 될 수 있다는 것도 또한 고려된다. 환자가 이전에 그의 민감도에 대하여 새우에 대해 5 번 그리고 돼지 고기에 대해 7 번 테스트된 경우에, 새우 또는 돼지 고기에 대한 환자의 새로운 IgG 값들을 새우에 대한 5 번의 테스트 결과의 평균 또는 돼지 고기에 대한 7번의 테스트 결과의 평균으로 정규화된다. 새우에 특이적인 환자 IgG의 정규화 된 값은 6.0 일 수 있고 돼지 고기에 특이적인 환자의 IgG의 정규화 된 값은 1.0 일 수 있다. 이 시나리오에서, 환자는 새우에 대한 그의 평균 민감도와 비교하여 이 시점에서 새우에 대한 민감도가 6 배 높지만, 돼지 고기와 대체로 비슷하다. 그런 다음, 새우 및 돼지 고기에 대한 환자의 민감도는 이러한 비교에 기초하여 색인 될 수 있다.

IBS의 기초가 되는(underlie) 식품 민감성들을 갖는 IBS 환자들의 서브셋(subset)을 결정하는 방법: 식품 민감도들은 IBS의 사인들 및 증상들에서 중요한 역할을 하는 것으로 의심되는 반면, 일부 IBS 환자들은 IBS의 기초가 되는 식품 민감성들을 가지지 않을 수 있다. 이 환자들은 IBS의 사인들과 증상들을 치료하기 위한 식이 간섭(dietary intervention)의 효과가 없다. 이러한 환자들의 서브셋을 결정하기 위해, IBS 환자들 및 비 IBS 환자들의 체액 샘플들은 24 개의 식품 샘플들이 있는 테스트 디바이스들을 사용하는 ELISA 검사로 테스트 될 수 있다.

표 5는 예시적인 미가공 데이터를 제공한다. 쉽게 이해되듯이, 데이터는 90번째 백분위 수 값을 기준으로 한 24 개의 샘플 식품들의 양성 결과를 낸 수를 나타낸다. 표 5에 보이는 미가공 데이터로부터, 양성 식품들의 수의 표준 편차 및 평균은 IBS 및 비 IBS 환자들에 대해 계산되었다. 또한, 양성 식품들이 없는 환자들의 백분율 및 수는 IBS 및 비 IBS 모두에 대해 계산되었다. 양성 식품들이 없는 환자들의 수 및 백분율은 IBS 모집단에서가 비 IBS 집단(각각 6 % 대 38 %)에서 보다 약 5 배 낮다. 따라서, 양성 식품이 없는 민감성을 가지는 IBS 환자는 IBS의 사인들 및 증상들의 원인이 되는 식품 민감성들을 가지는 것으로 쉽게 인식되지 않는다.

표 6 및 표 7은 표 5에 나타난 2개의 환자 모집단들의 미가공 데이터를 요약하는 예시적인 통계 데이터를 나타낸다. 통계 자료는 IBS 모집단 및 비 IBS 모집단에서의 양성 식품들 수를 나타내는 평균 및 중간 값에 대한 정규성(normality), 산술 평균(arithmetic mean), 중간 값, 백분위 수 및 95 % 신뢰 구간 (CI)이 포함한다.

표 8 및 표 9는 표 5에 나타난 2 개의 환자 모집단들의 미가공 데이터를 요약하는 또 다른 예시적인 통계 데이터를 나타낸다. 표 8 및 9에서, 미가공 데이터는 데이터 해석을 개선하기위해서 대수 변환에 의해 변형된다.

표 10 및 표 11은 IBS와 비 IBS 사이의 양성 식품들의 기하 평균 수를 비교하기위한 독립적인 T-test (표 10, 대수 변환된 데이터) 및 Mann-Whitney test (표 11)의 예시적인 통계 데이터를 나타낸다. 표 10과 표 11에 나타난 데이터는 IBS 모집단과 비 IBS 모집단 사이의 양성 식품들의 수의 기하 평균에서 통계적으로 현저하게 차이를 나타낸다. 두 통계 테스트들에서, 24 개의 식품 샘플들의 양성 반응들의 수는 IBS 모집단에서가 평균 판결 p-value ≤ 0.001을 가지는 비 IBS 모집단보다 현저하게 높은 것이 나타난다. 이러한 통계 데이터는 도 6a의 상자그림(box and whisker plot) 및 눈금 상자그림(notched box)과 도 6b의 눈금 상자그림으로도 또한 나타낸다.

표 12는 비 IBS 피험자들로부터 IBS를 판별할 때에 표 5에서 사용된 테스트의 진단 능력(diagnostic power)을 결정하기 위해서 표 5 내지 표 11에서 나타난 데이터의 수신기 동작 특성(Receiver Operating Characteristic, ROC) 곡선 분석의 예시적인 통계 데이터를 나타내다. 2 가지 이상의 양성 식품들의 컷오프 기준이 사용되는 경우에, 테스트는 0.771의 곡선 아래의 영역(area under the curve, AUROC)의 72.4% 민감도, 72.2 % 특이점의 데이터를 산출한다. ROC에 대한 p-value는 <0.0001의 p-value에서 의미 있다. 도 7은 표 12에 나타난 통계 데이터에 상응하는 ROC 곡선을 도시한다. 테스트 결과들이 2의 양성 수로 컷오프 되는 경우에 IBS 모집단과 비 IBS 모집단 사이의 통계적 차이가 상당해지기 때문에, 환자가 양성 반응을 보이는 식품들의 수는 IBS 1 차 임상 진단 (primary clinical diagnosis IBS)의 확인과, 식품 민감도가 환자의 IBS의 사인들 및 증상들 상에 원인이 되는지 여부에 사용된다. 따라서 위의 테스트는 IBS 진단을 위해 현재 이용 가능한 임상 기준에 더하는 또 다른 '규칙' 테스트로 사용될 수 있다.

"양성"이라고 선언된 식품들의 사람당 수의 분포를 결정하는 방법: 인자(son) 당 "양성" 식품들 수의 분포를 결정하고 진단 성능을 측정하기 위해서, IBS 환자들에게 가장 많은 긍정 반응들을 보이는 표 1로부터의 24가지 식품 품목들에 분석이 실행되었다. 24가지 식품 품목들은 코코아, 홍차, 귀리, 양배추, 우유, 노란색 양파, 꿀, 호밀, 옥수수, 이스트, 흰 밀, 콩, 계란, 참치, 레몬, 파인애플, 오이, 오렌지, 넙치, 호두, 자몽, 사탕수수 설탕, 닭, 미국 걸프 흰 새우를 포함한다. 이 분석 상에서 어느 한 피험자의 영향을 줄이기 위해, 각 식품 별 및 성별 별 데이터 셋 각각은 1000 회 재샘플링된 부트 스트랩이였다. 그런 다음, 부트 스트랩 샘플에서 각 식품 품목에 대해, 성별-특이적 컷포인트(sex-specific cutpoint)는 통제군 모집단의 90번째 및 95번째 백분위 수들을 사용하여 결정되었다. 일단 성별-특이적 컷포인트들이 결정되면, 성별-특이적 컷포인트들은 통제군 및 IBS 피험자들 모두에서 관찰된 ELISA 신호 점수들과 비교되었다. 이 비교에서, 관찰된 신호가 컷포인트 값과 같거나 초과하면 "양성" 식품으로 결정되며, 그리고 관찰된 신호가 절단 점 값 미만이면, "음성" 식품으로 결정된다.

모든 식품 품목들이 양성 또는 음성으로 결정되면, 각 피험자에 대한 48개의 조사(call)(24 개 식품 × 2 개 컷포인트들)들의 결과들이 각각의 부트 스트랩 복제물 내에 저장되었다. 그 다음, 각 피험자에 대해, 24개의 조사들은 "양성 식품들 수(90번째)"를 얻기 위해 컷포인트로 90번째 백분위 수를 사용하여 합산되었고 얻었고, 나머지 24개의 조사들은 "양성 식품들 수 (95번째)"를 얻기 위해 컷포인트로 95번째 백분위 수를 사용하여 합산되었다. 그 다음, 각각의 복제물 내에서, "양성 식품들 수 (90번째)" 및 "양성 식품들 수 (95번째)"가 다음과 같이 각 복제에 대한 설명 통계를 얻기위해 피험자들을 거쳐 합산되었다. 그 다음, 각각의 복제물 내에서, "양성 식품들 수 (90번째)" 및 "양성 식품들 수 (95번째)"가 다음과 같이 각 복제에 대한 기술 통계(descriptive statistics)를 얻기 위해 피험자들을 거쳐 합산되었다. 1) 전체 평균은 평균의 평균과 같음, 2) 전체 표준 편차는 표준 편차의 평균과 같음, 3) 전체 중간 평균은 대한 중간 평균과 같음, 4) 전체 최소값은 최소값들의 최소값과 같음, 5) 전체 최대값은 최대값들의 최대 값과 같음. 이 분석에서, 빈도 분포 및 히스토그램을 계산하는 경우에 정수가 아닌 "양성 식품들 수"를 피하기 위해, 저자들은 동일한 원본 데이터셋의 1000 회 반복들이 실제로 원본 샘플에 더해진 같은 크기의 새 피험자들의 999 셋들이라고 가정했다. 데이터 요약이 완료되면, 빈도 분포들 및 히스토그램들은 프로그램 "a_pos_foods .sas, a_pos_foods_by_dx.sas " 을 사용하여 IBS 피험자들과 통제군 피험들에 대해 및 성별 모두에 대해 "양성 식품 수 (90번째)와 "양성 식품 수(95번째)" 모두에 대해 생성된다.

진단 성능 측정 방법: 각 피험자에 대해 각 식품 품목들에 대한 진단 성능을 측정하기 위해서, 위에서 설명한 각 부트 스트랩 복제물 내의 각 피험자에 대해 "양성 식품들 수 (90번째)" 및 "양성 식품 수(95번째)"의 데이터를 사용했다. 이 분석에서, 컷포인트는 1로 설정되었다. 따라서, 피험자가 한 개 이상의 "양성 식품들 수(90번째)"를 가지고 있다면, 그 피험자는 "IBS있음"이라고 간주된다. 만약에 피험자가 "양성 식품들 수(90 번째)"가 없다면, 피험자는 "IBS없음"이라고 간주된다. 모든 조사들이 이루어지는 경우에, 조사들은 정양성(true Positive, TP), 정음성 (true Negative, TN), 위양성(False Positive, FP) 또는 위음성 (False Negative)인지를 결정하기위해 실제 진단과 비교된다. 각 방법에 대해 컷포인트가 1로 설정되는 경우에, 이 비교는 "양성 식품 수(90번째)"와 "양성 식품 수(95번째)" 모두에 대한 민감도, 특이성, 양성 예측값 및 음성 예측값의 성능 측정항목(performance metric)들을 얻기 위해 피험자들을 거쳐 요약된다. 각 (민감도, 1-특이성) 쌍(pair)은 이 복제물에 대한 ROC 곡선 상의 점이 된다.

정확도를 향상시키기 위해, 위의 분석은 2에서 24까지 컷포인트를 증가시킴으로써 반복되었고, 1000 부트 스트랩 복제물들 각각에 대해 반복되었다. 그런 다음 1000 부트 스트랩 복제물들의 성능 측정항목들을 프로그램 "t_pos_foods_by_dx.sas"을 사용하여 평균을 계산하는 것에 의해 요약되었다. 여성 및 남성에 대한 진단 성능의 결과는 는 표 13 (여성) 및 표 14 (남성)에 나타난다.

물론, 식품 제제들의 특정 변형들이 본 명세서에서 제시된 본 발명의 주제를 변경하지 않고 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 식품 품목이 노란 양파라면, 그 품목은 테스트들에서 동등한 활동을 하는 것으로 입증된 다른 양파 종류들을 포함하는 것으로도 이해되어야 한다. 실제로, 발명자들은 각각의 테스트된 식품 제제에 대해 동일한 또는 동등한 방식으로 테스트 된 특정 다른 관련된 식품 제제(데이터는 나타내지 않음)들에도 주목했다. 따라서 테스트되고 및 청구되는 각각의 식품 제제는 테스트에서 동등하거나 유사한 반응들을 보이는 동등한 관련 제제들을 가질 것이라는 점이 이해되어야 한다.

이미 기술된 것들 이외의 더 많은 수정들이 본 발명의 개념들을 벗어나지 않고 가능하다는 것이 본 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하다. 따라서, 본 발명의 주제는 첨부된 청구 범위들의 사상을 제외하고는 제한되지 않는다. 또한, 명세서 및 청구 범위들 모두를 해석함에 있어서, 모든 용어들은 문맥에 따라 가능한 가장 넓은 방식으로 해석되어야 한다. 특히, 용어 "포함하는(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 비-배타적인 방법으로 엘리먼트들, 컴포넌트들 또는 단계들을 참조하는 것으로 해석되어야하며, 참조된 엘리먼트들, 컴포넌트들 또는 단계들은 명시적으로 참조되지 않은 다른 엘리먼트들, 컴포넌트들 또는 단계들과 함께 존재하거나 이용되거나 결합될 수 있음을 나타내는 것으로 해석되어야 한다. 명세서 청구범위들이 A, B, C ... 및 N 으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 언급하는 경우, 본문(text)은 A + N이나 B + N이 아닌 군에서 오직 하나의 엘리먼트만을 요구하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (1)

1. 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome)으로 진단되거나 의심되는 환자에서 식품 불내성(food intolerance)을 테스트하기 위한 테스트 키트(test kit)로서,
   개별적으로 어드레스 가능한(addressable) 각각의 고체 캐리어(carrier)들에 결합된 복수의 별개 음식 제제(distinct food preparation)들;
   을 포함하고,
   상기 복수의 별개 음식 제제들은 raw p-value에 의해 결정된 ≤0.07의 평균 판별(discriminatory) p-value 또는 FDR 다중도 조정된 p-value(FDR multiplicity adjusted p-value)에 의해 결정된 ≤0.10의 평균 판별 p-value를 가지는,
   테스트 키트.
   

Images