BRPI0809371A2 - Sensibilidade aperfeiçoada da definição de perfil de anticorpo atráves do assentamento aumentado do anticorpo repórter - Google Patents

Description

SENSIBILIDADE APERFEIÇOADA DA DEFINIÇÃO DE PERFIL DE ANTICORPO ATRAVÉS DO ASSENTAMENTO AUMENTADO/ DO ANTICORPO

REPÓRTER

PEDIDOS CORRELATOS

Este pedido reivindica o benefício do Pedido US

Definitivo Número 11/691.096, depositado em 26 de março de 2007, intitulado IMPROVED ANTIBODY PROFILING SENSITIVITY THROUGH INCREASED REPÓRTER ANTIBODY LAYERING, a revelação total do mesmo sendo incorporada ao presente documento como referência.

ORIGEM CONTRATUAL DA INVENÇÃO

A Federação dos Estados Unidos da América possui determinados direitos com relação à invenção que se segue, de acordo com o Contrato Número DE-AC07-94ID13223, Contrato 15 número DE-AC07-99ID13727 e DE-AC07-05ID14517 entre o United States Department of Energy e Battelle Energy Alliance, LLC.

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção se refere ao ensaio de amostras 20 biológicas. Mais especificamente, a invenção se refere aos métodos para análise das amostras biológicas compreendendo a definição de perfil de anticorpo. Em uma concretização da invenção, a análise das amostras biológicas compreende uma combinação da definição de perfil de anticorpo para 25 caracterização de anticorpos específicos do indivíduo nas amostras biológicas e ensaio simultâneo de um analito nas amostras biológicas.

HISTÓRICO

Muitos métodos são conhecidos para identificar 3 0 indivíduos ou amostras biológicas obtidas de tais indivíduos. Por exemplo, a tipagem de sangue se baseia na existência de antígenos na superfície das hemácias. 0 sistema ABO se refere às quatro condições ;diferentes com relação aos dois antígenos, AeB. Os indivíduos do tipo A 5 exibem o antígeno A; os indivíduos do Tipo B exibem o antígeno B; os indivíduos do Tipo AB exibem ambos os antígenos AeB; e os indivíduos do Tipo 0 não exibem o antígeno A nem B. Analisando uma amostra do sangue da pessoa, é possível classificar o sangue como pertencendo a 10 um destes grupos sanguíneos. Embora este método possa ser usado para identificar um indivíduo fora de um pequeno grupo de indivíduos, o método é limitado quando o grupo de indivíduos é maior, uma vez que não é feita distinção entre as pessoas do mesmo grupo sanguíneo. Por exemplo, a 15 distribuição dos grupos sanguíneos ABO nos Estados Unidos é de aproximadamente 45% de O, 42% de A, 10% de B, e 3% de AB. Os testes com base em outros antígenos do grupo sanguíneo ou isozimas presentes nos fluidos corpóreos sofrem das mesmas desvantagens que os testes de tipagem do

2 0 sangue ABO. Estes métodos podem excluir determinados indivíduos, porém não podem diferenciar entre os elementos do mesmo grupo sanguíneo.

Uma variedade de testes imunológicos e bioquímicos com base na genética é usada rotineiramente nos testes de 25 paternidade, bem como para determinar a compatibilidade dos doadores e recipientes envolvidos nos procedimentos de transplante ou transfusão e também algumas vezes como uma ajuda na identificação dos seres humanos e animais. Por exemplo, o teste sorológico das proteínas codificadas pelo 30 local do gene do antígeno de leucócito humano (HLA) é bem conhecido. Embora uma boa quantidade de informações seja conhecida com relação à constituição genética do local de HLA, existem muitas desvantagens com relação ao emprego da tipagem sorológica de HLA para identificação de indivíduos 5 em um grupo grande. Cada um dos antígenos dje HLA deve ser testado em um ensaio separado e muitos de tais antígenos devem ser ensaiados para identificar um indivíduo, um processo árduo quando da identificação de um indivíduo em um grupo grande.

Na década passada, técnicas de análise com base no

DNA, tais como, polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLPs) e reação da cadeia da polimerase (PCR) ganharam rapidamente aceitação nas análises forenses e de paternidade para combinação das amostras biológicas em 15 relação a um indivíduo. As técnicas de RFLP são problemáticas, contudo, devido à necessidade dos tamanhos de amostras relativamente grandes, equipamento

especializado, técnicos altamente treinados e tempos longos de análises. Para aplicações forenses, não existe frequentemente amostra suficiente disponível para este tipo de ensaio e em áreas remotas o equipamento necessário frequentemente não está disponível. Além disto, esta técnica pode levar de duas a seis semanas para término e pode resultar em retardos caros em uma investigação criminal. Além disto, o custo da análise de RFLP pode ser proibitivo se a análise de muitas amostras for necessária. As técnicas de PCR possuem as vantagens em relação à análise de RFLP de requerer amostras de tamanhos muito menores e permitir análise muito mais rápida, porém elas ainda requerem equipamento especializado e técnicos treinados sendo também dispendiosas.

A Patente US número 4.880.750 e a PatSnte US número

5.270.167 revelam "antibody profiling" (definição de perfil de anticorpo) ou "AbP" como um método que supera muitas das desvantagens associadas à análise do DNA. A definição de perfil de anticorpo se baseia na descoberta de que cada indivíduo possui um conjunto único de anticorpos presentes em seus fluidos corpóreos. R.M. Bernstein e outros, Cellular Protein and RNA Antigens in Autoimmune Disease, 2 Mol. Biol. Med. 105-120 (1984) . Estes anticorpos, denominados "anticorpos específicos dos indivíduos" ou "ISaS", foram encontrados no sangue, soro, saliva, urina, sêmen, transpiração, lágrimas e tecidos corpóreos. A.M. Francoeur, Antibody Fingerprinting: A Novel Method for Identifying Individual People and Animais, 6 Bio/technology

821-825 (1988). ISAs não são associados à doença e acredita-se sejam direcionados contra componentes celulares do corpo. Cada pessoa nasce com um perfil de anticorpo que combina com o perfil de anticorpo da mãe. T.F. Unger & A. Strauss, Individual-specific Antibody Profiles as a Means of Newborn Infant Identification, 15 J. Perinatology 152- 155 (1995) . 0 perfil do anticorpo da criança muda gradualmente, contudo, até um único padrão estável ser obtido por volta dos dois anos de idade. Foi mostrado que mesmo indivíduos geneticamente idênticos possuem perfis de anticorpo diferentes. Um perfil do indivíduo é aparentemente estável para a vida e não é afetado por doenças de curto prazo. A.M. Francoeur, supra. Alguns estudos foram conduzidos em indivíduos com doenças de longo 3 0 prazo. Os resultados preliminares, contudo, indicaram que, embora algumas faixas extras pudessem aparecer, o padrão total permaneceu intacto. Esta técnica foi fisàda no campo médico para rastrear amostras de pacierítes e evitar misturas de amostras. Além disto, a técnica Sem sendo usada 5 nos hospitais nos casos onde é alegada troca ou rapto de bebês. O método possui várias vantagens èm relação às técnicas de DNA, incluindo baixo custo, análise rápida (2 horas a partir do tempo da amostra ser obtida) e simplicidade (nenhum equipamento especial ou treinamento é 10 necessário). Além disto, este método potencializará o trabalho nas amostras que não contêm DNA.

WO 97/29206 revela um método para identificar a fonte de uma amostra biológica empregada para teste de diagnóstico por ligação dos resultados 1 de teste de 15 diagnóstico a um perfil de anticorpo da amostra biológica. Em razão da geração do perfil de cada amostra biológica, a origem da amostra biológica é identificada.

Muitos ensaios estão agora disponíveis os quais utilizam anexação das sondas de ácido nucléico específicas ou outras moléculas biológicas para superfícies, tais como, vidro, silício, polimetacrilato, filtros poliméricos, microesferas, resinas e semelhantes. Em uma configuração onde a superfície é plana, estes ensaios são algumas vezes referidos como "biochips". Inicialmente, os biochips continham sondas de ácido nucléico anexadas aos substratos de vidro ou silício em micromatrizes. Estes chips de DNA são fabricados por tecnologias de microfabricação inicialmente desenvolvidas para uso na fabricação de chips para computador. Tecnologias para condução de chip de DNA 3 0 incluem abordagem de síntese fotoquímica In situ, P. S. Fodor, 277 Science 393-395 (1997); Patente US número 5.445.934; uma abordagem de posicionamento fêletroquímico, Patente US número 5.605.662; deposição das "sondas gênicas sobre o chip usando um aspersor que lembra fuma impressora 5 de jato de tinta; e o emprego de géis em um processo à base de solução. As matrizes de outros tipos de moléculas, tais como, peptídeos, foram fabricadas nos biochips, por exemplo, Patente US número 5.445.934.

Embora os métodos conhecidos para emprego da definição 10 de perfil de anticorpo sejam geralmente apropriados para seus fins limitados, eles possuem determinadas deficiências inerentes que se destacam de sua utilidade total na análise, caracterização e identificação . das amostras biológicas. Por exemplo, os métodos conhecidos se fiam no 15 fracionamento dos antígenos ou eletroforese e então a transferência dos antígenos fracionados para uma membrana. Devido às diferenças nas condições de um procedimento de fracionamento para outro, existem inúmeras diferenças nas posições dos antígenos na membrana, tal que, os resultados

2 0 obtidos usando as membranas de um lote não podem ser comparados aos resultados obtidos usando a membranas de outro lote. Adicionalmente, quando os procedimentos colorimétricos são empregados para detecção dos complexos imunes na membráha, a determinação de cor pode ser 25 subjetiva, tal que os resultados possam ser interpretados de forma diferente por observadores diferentes.

Em vista do precedente, a provisão de um método para análise de amostras biológicas, onde inúmeras diferenças nos reagentes e subjetividade não afetem a interpretação dos resultados seria um avanço significativo na técnica. Mais especificamente, seria vantajosa a provisão de um método para análise das amostras biológica por desenho do perfil do anticorpo em um formato de biochip, tal que, a análise fosse receptiva à automatização.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Uma concretização da invenção compreende um método para análise de material biológico incluindo anticorpos específicos do indivíduo, compreendendo: formação de uma matriz de múltiplos antígenos por anexação dos múltiplos 10 antígenos à superfície de um suporte sólido em um padrão pré-selecionado tal que os respectivos locais dos múltiplos antígenos são conhecidos; obtenção de uma amostra do material biológico e contato da matriz com a amostra tal que uma porção dos anticorpos específicos do indivíduo 15 contida na amostra reage e se liga aos antígenos na matriz para formar complexos imunes; lavagem do suporte sólido contendo os complexos imunes tal que anticorpos na amostra que não reagem e se ligam aos antígenos na matriz são removidos; e detecção dos complexos imunes e determinação 20 dos locais dos mesmos, tal que um perfil de anticorpo é obtido. Em uma concretização, a detecção dos complexos imunes pode ser realizada por exposição dos complexos imunes a um primeiro anticorpo adicional que reconhece e se liga aos anticorpos específicos do indivíduo. Em uma 25 concretização adicional, um ou mais anticorpos adicionais que reconhecem o primeiro anticorpo adicional ou um ao outro podem ser usados.

De acordo com concretizações da invenção, a detecção dos complexos imunes compreende tratamento do suporte sólido apresentando complexos imunes anexados ao mesmo, tal que a presença de complexos imunes em^· um local é caracterizada por uma alteração de cor quaríSo comparada á ausência de complexos imunes no local. Em umaí concretização, o processo para detecção dos Complexosi 5 imunes compreende, adicionalmente, monitoramento do suporte sólido com circuito elétrico de detecção de cor em estado sólido para comparação do padrão de cor antes e após contato da matriz com a amostra. Em outra concretização, o processo para detecção dos complexos imunes compreende, 10 adicionalmente, obtenção de uma imagem colorida em uma câmera antes e após contato da matriz com a amostra e análise das informações de pixel obtidas da mesma. Ainda em outra concretização da invenção, o suporte sólido é um chip de ressonância de plasmônio de superfície e a detecção dos 15 complexos imunes compreende, adicionalmente, varredura do chip de ressonância de plasmônio antes e após contato da matriz com a amostra e comparação dos dados obtidos da mesma. Ainda em outra concretização da invenção, a detecção de complexos imunes compreende obtenção de uma imagem

2 0 empregando um dispositivo acoplado de carga para detectar a alteração de cor compreendendo emissão fluorescente.

Ainda em outra concretização da invenção, o método é empregado como um teste pra uso de medicamentos. Ainda outra concretização da invenção compreende análise de um 25 perfil de anticorpo obtida de uma amostra forense e comparação com um perfil de anticorpo obtido de uma amostra de um suspeito criminal ou vitima de crime.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 mostra perfis de anticorpo ilustrativos obtidos de amostras de saliva de acordo com o procedimento do Exemplo 1.

A figura 2 mostra comparações perfis d% anticorpo de sangue e saliva emparelhados de seis indivíduos de acordo com o procedimento do Exemplo 1.

A figura 3 mostra perfis de anticorpo obtido ae

amostras de saliva de um único indivíduo após contaminação com vários adulterantes de acordo com o procedimento do Exemplo 1.

A figura 4 mostra resultados ilustrativos obtidos de

imunoensaio de cocaína nas amostras de saliva de acordo com o procedimento do Exemplo 1.

A figura 5 mostra resultados ilustrativos obtidos de imunoensaio de metanfetamina nas amostras de saliva de acordo com o procedimento do Exemplo 1.

A figura 6 mostra resultados ilustrativos da

imunodetecção de cocaína em uma membrana de PVDF: a fita 5, 0 pg/mL de cocaína; a fita 6, 0,1 pg/mL de cocaína; a fita 7, 10 pg/mL de cocaína; a fita 8, 1.000 pg/mL de cocaína.

A figura 7 mostra resultados ilustrativos da

2 0 imunodetecção da metanfetamina em uma membrana de PVDF: a

fita 1, 0 pg/mL de metanf etamina; a fita 2, 0,1 pg/mL de metanfetamina; a fita 3, 10 pg/mL de metanfetamina; a fita 4, 1.000 pg/mL de metanfetamina.

A figura 8 mostra perfis de anticorpo de três

indivíduos diferentes; uma fita de cada par não contém drogas e a outra fita de cada par contém 1.000 pg/mL de cocaína e de metanfetamina.

A figura 9 mostra perfis de anticorpo para quantidades diferentes de soro empregando um processo de dois

3 0 assentamentos de anticorpo. A fita A foi exposta a 50 pL de soro; a fita B foi exposta a 10 pL de soro® a fita C foi' exposta a 5 pL de soro; a fita D foi expc^sta a 3 pL de' soro; a fita E foi exposta a 1 pL de soro a fita F foi exposta a 0,5 pL de soro; a fita G foi exporta a 0,1 pL de soro; e a fita H foi exposta a 0 pL de soro.

A figura 10 mostra perfis de anticorpo para quantidades diferentes de soro empregando um processo de três assentamentos de anticorpo. A fita A foi exposta a 50 pL de soro; a fita B foi exposta a 25 pL de soro; a fita C 10 foi exposta a 15 pL de soro; a fita D foi exposta a 7,5 pL de soro; a fita E foi exposta a 10 pL de soro; a fita F foi exposta a 2,5 pL de soro; a fita G foi exposta a 1 pL de soro; a fita H foi exposta a 0,5 pL de soro; a fita I foi exposta a 0,1 pL de soro; a fita J foi exposta a 0 pL de 15 soro.

A figura 11 mostra perfis de anticorpo lado a lado de 3 pL de soro, considerando-se que a fita A foi desenvolvida com um processo de três anticorpos e a fita B foi desenvolvida com um processo de dois anticorpos.

A figura 12 mostra os dados de densitometria das fitas

A e B da figura 11. A linha superior é a fita Aea linha inferior é a fita B.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Antes dos presentes métodos para análise das amostras 25 biológicas serem descritos em detalhes, deve ser entendido que esta invenção não está limitada às configurações específicas, ações do processo e materiais descritos no presente documento como tais configurações, ações do processo e materiais podem variar um pouco. Deve ser 3 0 entendido que a terminologia empregada no presente documento é usada para fins apenas da ^descrição das concretizações específicas e não como uma limitação, uma vez que o escopo da presente invenção será ifimitado apenas pelas reivindicações apensas e seus equivalentes.

As publicações e outros materiais £de referência

citados no presente documento para descrever'o histórico da invenção e prover detalhes adicionais com relação a sua prática são incorporados ao presente documento como referência. As referências discutidas no presente documento

são providas unicamente para sua revelação antes da data de depósito do presente pedido. Nada no presente documento deve ser tido como admitindo que os inventores não estão aptos a antedatar tal revelação em virtude da invenção anterior.

Deve ser observado que, conforme empregado neste

relatório descritivo e nas reivindicações apensas, as formas singulares "um, uma" e "o, a" incluem as referências ao plural a menos que o contexto claramente .dite o contrário. Assim, por exemplo, referência a um método para

2 0 análise de uma amostra biológica de "um animal" inclui

referência a ou mais de tais animais, referência a "um suporte sólido" inclui referência a um ou mais de tais suportes sólidos e referência a "uma matriz" inclui referência a duas ou mais de tais matrizes.

Na descrição e reivindicação da presente invenção, a

terminologia que se segue será empregada de acordo com as definições estabelecidas a seguir.

Conforme usado no presente documento, "compreendendo," "incluindo," "contendo," "caracterizado por" e equivalentes

3 0 gramaticais dos mesmos são termos inclusivos ou de extremidade aberta que não excluem elementos adicionais, não citados ou etapas de métodos. "Compreencfèndo" deve ser interpretado como incluindo os termos rifeis restritos "consistindo em" e "consistindo essencialmentfe em" .

Conforme usado no presente documento, "consistindo em"

e equivalentes gramaticais dos mesmos excluem qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especificado nas reivindicações.

Conforme usado no presente documento, "consistindo 10 essencialmente em" e equivalentes gramaticais dos mesmos limitam o escopo de uma reivindicação aos materiais especificados ou etapas e aqueles que não afetam materialmente a característica ou características básicas e novas da invenção reivindicada.

Conforme usado no presente documento, "suporte sólido"

significa um substrato geral ou substancialmente plano no qual uma matriz de antígeno está disposta. Um suporte sólido pode compreender qualquer material ou combinação de materiais apropriados para transporte da matriz. Os materiais usados para construir estes suportes sólidos precisam satisfazer vários requisitos, tais como, (1) a presença dos grupos superficiais que podem ser facilmente derivatizados, (2) a inércia aos reagentes usados no ensaio, (3) a estabilidade em relação ao tempo, e (4) compatibilidade com as amostras biológicas. Por exemplo, materiais apropriados incluem vidro, silício, dióxido de silício (isto é, sílica), plástico, polímeros, suportes inorgânicos hidrófilos e materiais cerâmicos. Plásticos ilustrativos e polímeros incluem poli(tetrafluoretileno), poli(difluoreto de vinilideno), poliestireno, policarbonato, poliraetacrilato e combinações dos mesmos. Suportes inorgânicos hidrófilos ilustrativos incluem alumina, zircônia, titânia e óxido de níquel Um exemplo de um substrato de vidro seria uma lâmina par^L microscópio.

Discos de silício usados para fabrica chips para computadores foram usados também para fabricar biochips. Vide, por exemplo, Patente US número 5.605.662.

Conforme usado no presente documento "matriz" significa uma disposição de locais sobre um suporte sólido.

Os locais geralmente serão dispostos em matrizes bidimensionais, porém outros formados são possíveis. O número de locais pode variar de vários a pelo menos centenas de milhares. O padrão da matriz e a densidade da mancha podem variar. Por exemplo, usando um formador de

matrizes GMS 417 disponível comercialmente na Genetic Microsystems (Woburn, Massachusetts), o tamanho e densidade da mancha podem ser selecionados pelo usuário. Com manchas de 15 0 μπι de diâmetro de 3 00 μιη de espaçamento de centro a centro, mais de 1.000 manchas podem ser colocadas em um

centímetro quadrado e mais de 10.000 manchas podem ser colocadas em uma lâmina para microscópio padrão. Com espaçamento de 200 μιη do centro ao centro, estes números aumentam para 2.500 por centímetro quadrado e mais de

25.00 0 por lâmina.

2 5 Conforme usado no presente documento, "colorigênico"

se refere a um substrato que produz um produto colorido quando da digestão com uma enzima apropriada. Tais produtos coloridos incluem produtos fluorescentes e luminescentes.

Uma primeira ação no presente método é preparar uma

3 0 matriz de antígenos por anexação dos antígenos à superfície do suporte sólido em um padrão pré-selecionajdo, tal que os locais dos antígenos na matriz sejam conhectLdos. Conforme usado no presente documento, um antígeno é fuma substância que é ligada por um anticorpo. Antígenos podem incluir 5 proteínas, carboidratos, ácidos nucléico^, hormônios, drogas, receptores, marcadores de tumor e’ semelhantes e misturas dos mesmos. Um antígeno também pode ser um grupo de antígenos, tal como uma fração específica de proteínas eluídas de uma coluna de cromatografia de exclusão por 10 tamanho. Adicionalmente, um antígeno pode ser também identificado como um clone designado de uma biblioteca de expressão ou uma biblioteca aleatória de epítopo.

Em uma concretização da invenção, aos antígenos são isolados de célula HeLa conforme descrito, de modo geral em 15 A. M. Francoeur e outros, 13 6 J. Immunol. 1648 (1986) . Em resumo, as células HeLa são desenvolvidas em meio padrão sob condições de cultura de tecido padrão. Culturas de célula HeLa são então enxaguadas, preferivelmente com Tampão Fosfato-Salino (PBS), lisadas com detergente e 20 centrifugadas para remover fragmentos celulares insolúveis. O sobrenadante contém aproximadamente 10.000 antígenos imunologicamente distintos para geração de uma matriz.

Não há necessidade de que os antígenos usados para geração da matriz sejam conhecidos. Tudo que é necessário é 25 que a fonte de antígenos seja consistente, tal que, uma matriz reprodutível possa ser gerada. Por exemplo, o sobrenadante de HeLa contendo os antígenos pode ser fracionado em uma coluna de exclusão de tamanho, gel eletroforético, gradiente de densidade ou semelhante, como 3 0 é bem conhecido na técnica. As frações são coletadas e cada fração coletada representaria um conjunto único de antígenos para a finalidade de gerar a matrix; Assim, mesmo que os antígenos sejam desconhecidos, uma matriz reprodutível pode ser gerada se os antígenos, da célula HeLa 5 forem isolados e fracionados usando o mesmo método e condições.

Outros métodos, tais como, preparação das bibliotecas aleatórias de peptídeo são bem conhecidos na arte e podem ser empregados para fabricação reprodutível de antígenos. Por exemplo, J. K. Scott & G. P. Smith, Searching for Peptide Ligands with an Epitope Library, 249 Science 386 (1990); JJ. Devlin e outros, Random Peptide Libraries: A Source of Specific Protein Binding Molecules, 24 9 Science 404-406 (1990); S. E. Cwirla e outros, Peptides on Phage: A Vast Library of Peptides for Identifying Ligands, 8 7 Proc. Nat1I Acad. Sei. USA 6378-6382 (1990); K.S. Lam e outros, A New Type of Synthetic Peptide Library for Identifying Ligand-binding Activity, 354 Nature 82-84 (1991); S. Cabilly, Combinatorial Peptide Library Protocols (Humana Press, 304 pg, 1997); Patente US número 5.885.780. Tais bibliotecas podem ser construídas por ligação de oligonucleotídeos sintéticos em um fago de fusão apropriado. Os fagos de fusão são vetores de bacteriófago filamentosos nos quais as sequencias estranhas são clonadas no gene de fago III e exibidas como parte da proteína gênica III (plll) em uma ponta do vírion. Cada fago codifica uma sequencia aleatória simples e expressa a mesma como um complexo de fusão com plll, uma proteína de revestimento menor presente em cerca de cinco moléculas por 3 0 fago. Por exemplo, nas técnicas de fago de fusão de J. K. Scott & G.P. Smith, supra, foi construída umá biblioteca do fago contendo um cassete variável de sei^ resíduos de aminoácido. Os módulos de hexapeptídeo fundidos às proteínas de bacteriófago proveram uma biblioteca para a 5 metodologia de classificação que pode examinar >1012 fagos (ou cerca de IO8 - IO10 diferentes clones) de uma vez, cada um com uma sequencia de teste na superfície do vírion. A biblioteca obtida foi empregada para classificar anticorpos monoclonais específicos para sequencias de hexapeptídeo 10 específicas. 0 sistema de fago de fusão também foi empregado por outros grupos e bibliotecas contendo inserções de peptídeo mais longas foram construídas. O fago de fusão preparado de acordo com esta metodologia pode ser selecionado aleatoriamente ou não aleatoriamente por 15 inclusão na matriz de antígenos. Os fa.gos de fusão selecionados para inclusão na matriz podem ser propagados por métodos padrão para resultar no que é virtualmente um fornecimento sem fim dos antígenos selecionados.

Outros métodos para produção dos antígenos também são

2 0 conhecidos na técnica. Por exemplo, bibliotecas de

expressão podem ser preparadas por clonagem aleatória dos fragmentos de DNA ou DNAc em um vetor de expressão. Por exemplo, R.A. Young & R.W. Davis, Yeast RNA Polimerase II Genes: Isolation with Antibody Probes, 222 Science 778-782 25 (1983) ; G. M. Santangelo e outros, Cloning of Open Reading Frames and Promoters from the Saccharomyces cerevisiae Genome: Construction of Genomic Libraries of Random Small Fragments, 46 Gene 181-186 (1986). Os vetores de expressão que poderiam ser empregados para fabricação de tais

3 0 bibliotecas são comercialmente disponíveis de várias fontes. Por exemplo, fragmentos aleatórios dé DNA de célula HeLa ou DNAc podem ser clonados em um vetor ITe expressão, e então os clones expressando proteínas da cé JJula HeLa podem ser selecionados. Estes clones podem então Iser propagados 5 pelos métodos bem conhecidos na ate. As proteínas expressas são então isoladas ou purificadas e podem ser usadas na fabricação da matriz.

Alternativamente, os antígenos podem ser sintetizados empregando tecnologia de DNA recombinante bem conhecida na arte. Os genes que codificam muitas proteínas virõticas, bacterianas e de mamíferos foram clonados e assim grandes quantidades de proteínas altamente puras podem ser sintetizadas rapidamente e de forma barata. Por exemplo, os genes que codificam muitos receptores ligados a membrana de mamíferos e eucariótica, fatores de crescimento, moléculas de adesão celular e proteínas reguladoras foram clonados e são úteis como antígenos. Muitas proteínas produzidas por tais técnicas recombinantes, tais como, fator transformador do crescimento, fatores de crescimento de fibroblasto ácido e básico, interferon, fator de crescimento semelhante a insulina e várias interleucinas de espécies diferentes se encontram comercialmente disponíveis.

Na maioria dos exemplos, o polipeptídeo total não precisa ser usado como um antígeno. Por exemplo, qualquer 25 tamanho ou porção do polipeptídeo que contém pelo menos um epítopo, isto é, determinante antigênico ou porção de um antígeno que interage especificamente com um anticorpo será suficiente para uso na matriz.

Os antígenos, se selecionados aleatoriamente ou não,

v

3 0 são dispostos sobre o suporte sólido para resultarem na matriz. O padrão de antígenos sobre o suporfè sólido seria reprodutível. Isto é, o local e identidade discada antígeno sobre o suporte sólido seriam conhecidos. Plõr exemplo, em uma matriz 10 x 10, um versado na técnica* pode colocar 5 antígenos 1-100 nos locais 1-100, respectivamente da matriz.

As proteínas podem ser colocadas em matrizes sobre a superfície do suporte sólido empregando um dispositivo de pipetagem ou uma máquina ou dispositivo configurado para

colocação das amostras de líquido sobre um suporte sólido, por exemplo, usando uma micromatriz disponível comercialmente, tal como aquelas da Cartesian Technologies, Inc. (Irvine, Califórnia); Gene Machines (San Carlos, Califórnia); Genetic Microsystems (Woburn, Massachusetts);

GenePack DNA (Cambridge, Reino Unido); Genetix Ltd. (Christchurch, Dorset, Reino Unido) e Packard Instrument Company (Meriden, Connecticut).

Os métodos relevantes para enmatrizr uma série de antígenos de proteína sobre uma superfície incluem queda

2 0 sem contato em dispensa quando da demanda e tecnologia de

jato de tinta. Instrumentos encontram-se comercialmente disponíveis para ambos os métodos. A Cartesian Technologies oferece vários instrumentos de dispensa em nanolitros que podem dispensar volumes de líquidos de 20 nL até 250 pL em

placas de microtitulação de 96, 384, 1.536, 3.456 e 9.600 poços e colocar as mesmas precisamente sobre uma superfície com densidades de até 400 manchas/cm2. Os instrumentos mancharão as superfícies em ^vários tipos de padrão. Conforme o nome indica, tecnoloçjtLa de jato de tinta utiliza

3 0 os mesmos princípios usados pelas impressoras de jato de tinta. A Microfab Technologies oferece urn cabeçote de impressão de 10 fluidos que pode dispensar Quantidades em picolitros de líquidos sobre a superfície cfe vários tipos de padrão. Um padrão ilustrativo para a premente aplicação seria uma matriz simples variando de 10 x 10|faté 100 x 100.

Existem vários métodos que podem ser usados para anexar as proteínas ou outros antígenos à süperfície de um suporte sólido. 0 mais simples é a absorção simples através de forças hidrófobas, iônicas ou van der Waals. Contudo, este não é um ótimo método, uma vez que as proteínas tendem a se destacarem da superfície com o tempo. Uma química de anexação apropriada envolve o uso de organossilanos bifuncionais. Por exemplo, Thompson and Maragos, 44 J. Agric. Food Chem. 1041-1046 (1996) . Uma extremidade do organossilano reage com os grupos -OH expostos na superfície do chip para formar uma ligação de silanol. A outra extremidade do organossilano contém um grupo que é reativo com vários grupos na superfície da proteína, tais como, grupos -NH2 e -SH. Este método de anexação das proteínas ao chip resulta na formação de uma ligação covalente entre a proteína e o chip. Outros métodos apropriados que foram empregados para anexação da proteína às superfícies incluem arilazida, nitrobenzila e metodologias de fotoquímica diazirina. A exposição das substâncias químicas acima à luz UV causa a formação de grupos reativos que podem reagir com as proteínas para formar uma ligação covalente. A substância química arilazida forma um grupo nitreno reativo que pode ser inserido nas ligações C-H, enquanto a substância química 3 0 diazirina resulta em um grupo carbeno reativo. A substância química nitrobenzila é referida como substância química, de aprisionante, pelo que o grupo aprisionanlfè inativà uma molécula reativa. A exposição à luz UV libera a molécula e torna a mesma disponível para reação. Aindaj [putros métodos 5 para anexação das proteínas aos suportes solidos são bem conhecidos na técnica, por exemplo, S. S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking (CRC Press, página 340, 1991).

Seguindo-se a anexação dos antígenos sobre o suporte sólido na matriz selecionada, o suporte sólido seria lavado por enxágüe com um líquido apropriado para remover antígenos não ligados. Líquidos apropriados para lavagem incluem salmoura tamponada com fosfato (PBS) e semelhantes, isto é, resistência iônica relativamente baixa, soluções de sal biocompatíveis tamponadas em ou próximas à neutralidade. Muitos de tais líquidos de lavagem apropriados são conhecidos na técnica ou podem ser previstos por um versado na técnica sem experimentação indevida. Por exemplo, N. E. Good & S. Izawa, Hydrogen Ion Buffers, 24 Methods Enzymology 53-68 (1972) .

O suporte sólido é então processado para bloquear a ligação não específica das proteínas e outras moléculas ao suporte sólido. Esta etapa de bloqueio impede a ligação dos antígenos, anticorpos e semelhantes ao suporte sólido, onde 25 tais antígenos, anticorpos ou outras moléculas não pretendem se ligar. O bloqueio reduz o fundo que pode atordoar o sinal, assim aumentando a taxa de sinal para ruído. 0 suporte sólido é bloqueado por incubação do suporte sólido em um meio que contém moléculas inertes que 30 se ligam aos sítios onde a ligação não específica pode de outra forma ocorrer. Exemplos de bloqueadores apropriados incluem albumina de soro bovino, albumina humana, gelatina, leite em pó sem gordura, álcool polivinílico, Tween 20 e vários bloqueadores comerciais, tais como, tampões 5 bloqueadores SEA BLOCK® (marca registrada da East Coast Biologies, Inc., Berwick, Maine) e SuperBlock™ (marca registrada da Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois).

Seguindo-se a lavagem para remoção dos antígenos não ligados da matriz e bloqueio, o suporte sólido é contatado

com a amostra líquida a ser testada. A amostra pode ser de qualquer animal que gere anticorpos específicos do indivíduo. Por exemplo, seres humanos, cães, gatos, camundongos, cavalos, bois e coelhos todos mostraram possuir ISAs. A amostra pode ser de vários fluidos

corpóreos e sólidos incluindo sangue, saliva, sêmen, soro, plasma, urina, fluido amniótico, fluido pleural, fluido cérebro-espinhal e misturas dos mesmos. Estas amostras são obtidas de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Dependendo do método de detecção usado, pode ser necessário

2 0 manipular a amostra biológica para obter ótimas condições

de reação. Por exemplo, a resistência iônica ou concentração do íon hidrogênio ou concentração da amostra biológica pode ser ajustada para formação do complexo imune ótimo, catálise enzimática e semelhantes.

Conforme descrito em detalhes na Patente US número

5.270.167 de Francoeur, quando os ISAs são reagidos com um conjunto de antígenos aleatórios, é formado üm determinado número de complexos imunes. Por exemplo, empregando um painel de cerca de 1.000 antígenos únicos., cerca de 30

3 0 complexos imunes entre ISAs em uma amostra" biológica que foram diluídos 20 vezes podem ser detectados;! Se a amostra biológica não for diluída, o número tota?3| de complexos imunes detectáveis possíveis que seria fdiamado superaria IO23. 0 número total de complexos imunes possíveis também 5 poderia ser aumentado por seleção de antígênos "maiores", isto é, proteínas ao invés de peptídeos; que possuem múltiplos epítopos. Portanto, será apreciado que dependendo dos antígenos e número dos mesmos usados, da diluição da amostra biológica e do método de detecção, um versado na 10 técnica pode regular o número de complexos imunes que serão formados e detectados. 0 conjunto de complexos imunes únicos que se formam e que não se formam entre os ISAs na amostra biológica e os antígenos na matriz constituem um perfil de anticorpo.

Os métodos para detecção do anticorpo/antígeno ou

complexos imunes são bem conhecidos na técnica. A presente invenção pode ser modificada por um versado na técnica para acomodar os vários métodos de detecção conhecidos na técnica. O método de detecção específico escolhido por um 20 versado na técnica dependerá de vários fatores, incluindo a quantidade de amostra biológica disponível, do tipo de amostra biológica, da estabilidade da amostra biológica, da estabilidade do antígeno e da afinidade entre o anticorpo e o antígeno. Além disto, conforme discutido acima, 25 dependendo dos métodos de detecção escolhidos, pode ser necessário modificar a amostra biológica.

Embora estas técnicas sejam bem conhecidas na arte, exemplos de alguns dos métodos de detecção que podem ser usados para praticar a presente invenção são descritos 3 0 resumidamente a seguir. Existem muitos tipos de imunoensaios- "conhecidos na arte. O tipo mais comum de imunoensaio é' ío imunoensaio heterogêneo competitivo e o imunoensaio hBterogêneo não competitivo, tal como, ensaios imunosorver|èes ligados a 5 enzima (ELISA). Em um ELISA não competitivo, o antígeno não rotulado é ligado a um suporte sólido,; tal como a superfície do biochip. A amostra biológica é combinada com antígenos ligados ao recipiente de reação, e anticorpos (anticorpos primários) na amostra biológica são deixados 10 ligar aos antígenos, formando os complexos imunes. Após os complexos imunes terem sido formados, amostra biológica em excesso é removida e o biochip é lavado para remover anticorpos não especificamente ligados. Os complexos imunes podem então ser reagidos com uma anti-imunoglobulina 15 rotulada com enzima (anticorpo secundário). O anticorpo secundário reage com os anticorpos nos complexos imunes, não com outros antígenos ligados ao biochip. Os anticorpos secundários específicos para ligação de anticorpos de espécies diferentes, incluindo de seres humanos, são bem

2 0 conhecidos na arte e se encontram comercialmente

disponíveis, tais como, na Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri) e Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Califórnia). Após uma lavagem adicional, o substrato de enzima é adicionado. A enzima ligada ao anticorpo 25 secundário catalisa uma reação que converte o substrato no produto. Quando antígeno em excesso está presente, a quantidade de produto é diretamente proporcional à quantidade de anticorpos primários presentes na amostra biológica. O produto pode ser fluorescente ou luminescente,

3 0 o que pode ser medido usando tecnologia e equipamento bem conhecidos na técnica. Também é possível uF3'r esquemas de reação que resultam em um produto colorido: que pode sér medido espectrofotometricamente.

Em outras concretizações da invenção; o anticorpo 5 secundário pode não ser rotulado para facilifar a detecção. Anticorpos adicionais podem ser assentados (isto é, terciário, quaternário, etc.) tal que, cada anticorpo adicional reconheça o anticorpo previamente adicionado ao complexo imune. Qualquer um destes (isto é, terciário, 10 quaternário, etc.) pode ser rotulado, de modo a permitir a detecção do complexo imune conforme descrito no presente documento.

Ensaios de intercalamento ou captura podem também ser usados para identificar e quantificar complexos imunes. Os ensaios de intercalamento são uma imagem idêntica dos ELISAs não competitivos, pelo que os anticorpos são ligados à fase sólida e o antígeno na amostra biológica é medido. Estes ensaios são especificamente úteis na detecção dos antígeno possuindo múltiplos epítopos, que estão presentes em concentrações baixas. Esta técnica requer que anticorpo em excesso seja anexado a fase sólida, tal como o biochip. O anticorpo ligado é então incubado com as amostras biológicas e os antígenos na amostra podem forma complexos imunes com o anticorpo ligado. O complexo imune é incubado com um anticorpo secundário ligado com enzima que reconhece o mesmo ou um epítopo diferente no antígeno como o anticorpo primário. Consequentemente, a atividade da enzima é diretamente proporcional à quantidade de antígeno na amostra biológica. D.M. Kemeny & S. J. Challacombe, ELISA and Other Solid Phase Immunoassays (1988). As enzimas típicas que podem ser ligadas aos anti corpos secundários incluem peroxidase de rárífârio silvestre, glicose oxidase, glicose-6-fosfato desidrogenase, fosfatase alcalina, {3-galactosidase e urease. Anticorgos específicos 5 de antígeno específicos ligados às várias enzimas se encontram comercialmente disponíveis, por exemplo, na Sigma Chemical Co. and Amersham Life Sciences (Arlington Heights, Illinois).

ELISAs competitivos são semelhantes aos ELISAs não competitivos, exceto que os anticorpos ligados a enzima competem com anticorpos não ligados na amostra biológica para sítios de ligação de antígeno limitados. Em resumo, um número limitado de antígenos são ligados ao "suporte sólido. A amostra biológica e os anticorpos rotulados com enzima são adicionados ao suporte sólido. Anticorpos específicos para antígenos na amostra biológica competem com os anticorpos rotulados com enzima pelo número limitado de antígenos ligados ao suporte sólido. Após os complexos imunes terem se formado, anticorpos não especificamente ligados são removidos por lavagem, o substrato da enzima é adicionado e a atividade da enzima é 'medida. Nenhum anticorpo secundário é necessário. Uma vez ‘que o ensaio é competitivo, a atividade da enzima é inversamente proporcional à quantidade de anticorpos na amostra biológica.

Outro ELISA competitivo também pode ser empregado dentro do escopo da presente invenção. Nesta concretização, quantidades limitadas de anticorpos da amostra biológica são ligados à superfície do suporte sólido conforme

3 0 descrito no presente documento. Antígenos rotulados e não rotulados são então colocados em contato com os suportes sólidos, tal que os antígenos rotulados et não rotulados competem entre si para ligação aos anticorpos na superfície do suporte sólido. Após os complexos imunes terem se 5 formado, os antígenos não especificamente ligados são removidos por lavagem. Os complexos imunes 'são detectados por incubação com um anticorpo secundário ligado a enzima, que reconhece o mesmo ou um epítopo diferente no antígeno como o anticorpo primário, conforme descrito acima. A 10 atividade da enzima é então ensaiada, o que rende um sinal que é inversamente proporcional à quantidade de antígeno presente.

Imunoensaios homogêneos podem também ser empregados quando da prática do método da presente invenção. Os 15 imunoensaios homogêneos podem ser preferidos para detecção de compostos de peso molecular baixo, tal como hormônios, medicamentos terapêuticos e drogas ilícitas que não podem ser analitos por outros métodos ou compostos encontrados em alta concentração. Os ensaios homogêneos são 20 especificamente úteis porque nenhuma etapa de separação é necessária. R. C. Boguslaski e outros, Clinicai Immunochemistry: Principies of Methods and Applications (1984) .

Nas técnicas homogêneas, antígenos ligados ou não

2 5 ligados são ligados por enzima. Quando os anticorpos na

amostra biológica se ligam ao antígeno ligado por enzima, impedimentos estéricos inativam a enzima. Isto resulta em uma perda mensurável na atividade da enzima. Antígenos livres (isto é, não ligados por enzima) competem com o

3 0 antígeno ligado por enzima para sítios de ligação de anticorpo limitados. Assim, a atividade da enzima é diretamente proporcional à concentração do antígeno na amostra biológica.

As enzimas úteis nos imunoensaios homogêneos incluem 5 lisozima, neuraminidase, tripsina, papaíná, bromelaina, glicose-6-fosfato desidrogenase e p-galactosidase. T. Persoon, Immunochemical Assays in the Clinicai Laboratory, 5 Clinicai Laboratory Science 31 (1992). Os antígenos ligados por enzima se encontram comercialmente disponíveis 10 ou podem ser ligados usando várias substâncias químicas bem conhecidas na técnica, incluindo glutaraldeído e derivados de maleimida.

A tecnologia de desenho do perfil do anticorpo anterior envolve um anticorpo secundário rotulado com fosfatase alcalina com sal de 5-bromo-4-cloro-3'indolilfosfato p-toluidina (BCIP) e cloreto de nitro-azul de tetrazólio, ambos sendo comercialmente disponíveis em uma variedade de fontes, tais como na Pierce Chemical Co. (Rockford, Illinois). A reação enzimática forma um produto colorido insolúvel que é depositado sobre a superfície das fitas de membrana para formar faixas, onde quer que os complexos de antígeno-anticorpo ocorram. Este método não é o melhor em um formato do biochip, uma vez que é difícil de ser quantificado e uma vez que os métodos colorimétricos são tipicamente menos sensíveis que os ensaios com base em fluorescência ou luminescência.

Os imunoensaios fluorescentes podem também se usados quando se pratica o método da presente invenção. Os imunoensaios fluorescentes são semelhantes ao ELISA exceto

3 0 que a enzima é substituída por compostos fluorescentes denominados fluorforos ou fluôrcromos. Eites compostos possuem a capacidade de absorver energia, da |uz incidente e emitir a energia como luz de um comprimento de onda mais longo e energia menor. A f luoresceina lê- a rodamina,

geralmente na forma de isotiocianatos que podem ser prontamente acoplados aos antígenos e anticorpos são as mais usadas na técnica. D. P. Stites e outros, Basic and Clinicai Immunology (1994). A fluoresceina absorve luz de

4 90 a 4 95 nm de comprimento de onda e emite luz a 52 0 nm de 10 comprimento de onda. A tetrametilrodamina absorve luz de 550 nm de comprimento de onda e emite luz de 58 0 nm de comprimento de onda. Métodos de detecção ilustrativos com base na fluorescência incluem substrato de fosfatase alcalina ELF-97 (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon); 15 PBXL-I e PBXL-3 (ficobilissomas conjugados à

estreptavidina) (Martek Biosciences Corp., Columbia, Maryland); IgG anti-humana de cabra rotulada FITC e Texas Red (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, Pennsylvania); e uma J3-f icoeritrina e R-ficoeritrina 20 conjugada à estreptavidina (Molecular Probes Inc.). ELF-97 é uma substância química não fluorescente que é digerida pela fosfatase alcalina para formar uma molécula fluorescente. Em razão da volta da fosfatase alcalina, o uso do substrato ELF-97 resulta na ampliação do sinal. As 25 moléculas fluorescentes anexadas aos anticorpos secundários não exibem esta ampliação.

Ficobiliproteínas isoladas de algas, porfirinas e clorofilas, todas as quais fluorescem a cerca de 600 nm, são também empregadas na técnica. I. HemmiIa,

3 0 Fluoroimmunoassays and Immunofluorometric Assays, 31 Clin. Chem. 359 (1985); Patente US número 4.542.104. As ficobiliproteínas e derivados das mesmas se encontram comercialmente disponíveis sob as deSominações Rphycoerythrin (PE) e Quantum Red™, por exémülo, na Sigma Chemical Co.

Além disto, os anticorpos secundários e antígenos conjugados com Cy são úteis nos imunoensaios e se encontram comercialmente disponíveis. Cy-3, por exemplo, é excitado ao máximo em 554 nm e emite luz entre 568 nm e 574 nm. Cy-3 10 é mais hidrófilo que outros fluorforos e assim possui menos tendência a se ligar ou agregar de forma não específica. Compostos conjugados ao Cy se encontram comercialmente disponíveis na Amersham Life Sciences.

Métodos de detecção ilustrativos com base na luminescência incluem substratos de fosfatase alcalina estrela CSPD e CDP (Roche Molecular Biochemicals); e substrato de peroxidase de rábano silvestre SuperSignal® (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois).

Os métodos de detecção de quimiluminescência, 20 eletroluminescência e eletroquimiluminescência (ECL) são também meios atraentes para quantificar os antígenos e anticorpos em uma amostra biológica. Os compostos luminescentes possuem a capacidade de absorver energia, que é liberada na forma de luz visível quando da excitação. Na 25 quimiluminescência, a fonte de excitação é uma reação química; na eletroluminescência a fonte de excitação é um campo elétrico; e na ECL um campo elétrico induz uma reação química luminescente.

As moléculas usadas com os métodos de detecção de ECL

3 0 geralmente compreendem um ligante orgânico e um metal de transição. 0 ligante orgânico forma um quelato com um ou mais átomos de transição formando um complexo organometálico. Vários complexos de ligante 'orgânico-metal de transição de organometálicos foram usados como 5 marcadores de ECL para detectar e quantificar analitos nas amostras biológicas. Devido a sua estabilidade térmica, química e fotoquímica, suas emissões intensas e tempos de vida de emissão longos, rutênio, ósmio, rênio, irídio, e metais de transição de ródio são os favorecidos na técnica.

Os tipos de ligantes orgânicos são vários e incluem antraceno e moléculas de polipiridila e compostos orgânicos heterocíclicos. Por exemplo, bipiridila, bipirazila, terpiridila e fenantrolila e seus derivados são ligantes orgânicos comuns na técnica. Um complexo organometálico

comum usado na técnica inclui rutênio tris-bipiridina (II), comercialmente disponível na IGEN, Inc. (Rockville, Maryland) and Sigma Chemical Co.

Vantajosamente, a ECL pode ser realizada sob condições aquosas e sob pH fisiológico, assim minimizando o manuseio

da amostra. J. K. Leland e outros, Electrogenerated Chemiluminescence: An Oxidative-Reduction Type ECL Reactions Sequence Using Triprophyl Amine, 137 J. Electrochemical Soe. 3127-3131 (1990); WO 90/05296; Patente US número 5.541.113. Além disto, a luminescência destes

2 5 compostos pode ser melhorada por adição de vários

cofatores, tais como, aminas.

Na prática, um complexo de tris-bipiridina rutênio (II), por exemplo, pode ser anexado a um anticorpo secundário usando estratégias bem conhecidas na arte,

3 0 incluindo anexação aos grupos lisina amino, grupos cisteína sulfidrila e grupos histidina imidazol. Em um imunoensaio ELISA típico, anticorpos secundários reconheceriam ISAs ligados aos antígenos, porém não antígenos^ não ligados. Após lavagem dos complexos de ligação não específicos, o 5 complexo de tris-bipiridina rutênio (II) seria excitado por meios de excitação químicos, fotoquímicos e eletroquímicos, tal como por aplicação de corrente ao biochip. Por exemplo, WO 86/02734. A excitação resultaria em uma reação de oxidação dupla do complexo de tris-bipiridina rutênio (II), 10 resultando na luminescência que seria detectada, por exemplo, por um tubo fotomultiplicador. Instrumentos para detecção da luminescência são bem conhecidos na técnica e se encontram comercialmente disponíveis, por exemplo, na IGEN, Inc.

Circuito elétrico de detecção de cor em estado sólido

pode também ser empregado para monitorar as reações de cor no biochip e, quando do comando, comparar o padrão de cor antes e após a aplicação da amostra. Uma imagem colorida de uma câmera pode também ser usada e as informações de pixel analisadas para obter as mesmas informações.

Ainda outro método envolve detecção empregando um chip de ressonância de plasmônio de superfície (SPR). A superfície do chip é varrida antes e após aplicação da amostra sendo realizada uma comparação. 0 chip SPR se fia 25 na refração da luz quando as moléculas de interesse são expostas a uma fonte de luz. Cada molécula possui seu próprio índice de refração pelo qual ela pode ser identificada. Este método requer posicionamento preciso e circuito elétrico de controle para varredura acurada do

3 0 chip. Ainda outro método envolve um enxágüe com fluido do biochip com um reagente de fluoresceina. Os 'mícrolocais que combinam com a amostra biológica fluorescém. e podem ser detectados com uma matriz do dispositivo acoplado por carga 5 (CCD) . A saída de tal matriz do CCD é analisada para determinar o único padrão associado a cada amostra. Este abordagem evita os problemas associados às tecnologias de varredura. A velocidade não é importante em qualquer dos métodos, uma vez que a combinação química da amostra e 10 referência demora minutos para ser realizada.

Além disto, os escâneres de matriz se encontram comercialmente disponíveis, tais como, na Genetic Microsystems. O Escâner de Matriz GMS 418 utiliza óptica a laser para mover rapidamente um feixe focado de luz sobre o 15 biochip. O mesmo utiliza um sistema de comprimento de onda duplo incluindo lasers de energia alta, em estado sólido que geram uma energia de excitação alta que permite tempo de excitação reduzido. Em uma velocidade de varredura de 30 Hz, o GMS 418 pode varrer uma lâmina de 2.2 x 75 mm com 20 resolução de 10 μιη em cerca de 4 minutos.

O software para análise de imageamento obtido com um escaner de matriz se encontra prontamente disponível. Os pacotes de software disponíveis incluem ImaGene (BioDiscovery, Los Angeles, Califórnia); ScanAlyze 25 (disponível sem taxas; desenvolvido pela Mike Eisen, Stanford University); De-Array (desenvolvido por Yidong Chen and Jeff Trent of the National Institutes of Health; empregado com IP Lab from Scanalytics, Fairfax, Virginia); Pathways (Research Genetics, Huntsville, Alabama); GEM 30 tools (Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, Califórnia); e Imaging Research (Amer^iam Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, New Jersey).

Uma vez que as interações entre os ant^enos e os ISAs tenham sido identificadas e quantificadas, J[s sinais podem 5 ser digitalizados. O perfil do anticorpo diqpFtalizado serve como uma assinatura que identifica a fonte da amostra biológica. Dependendo do biochip empregado, os dados digitalizados podem assumir várias formas. Por exemplo, o biochip pode compreender uma matriz com 10 colunas e 10 10 carreiras para um número total de 100 microlocais. Cada microlocal contém pelo menos um antígeno. Após a amostra biológica contendo os ISAs ser adicionada a cada microlocal e deixada incubar, as interações entre os antígenos e ISAs na amostra biológica são identificadas e quantificadas. Em 15 cada microlocal, uma interação entre o antígeno naquele microlocal e os ISAs na amostra biológica tanto resulta quanto não resulta em um sinal quantificável. Em uma concretização, os resultados do perfil do anticorpo são digitalizados por atribuição a cada um dos 100 microlocais 20 de um valor numérico de "0", se um sinal quantificável não tiver sido obtido, ou "1" se um sinal quantif icável tiver sido obtido. Empregando este método, o perfil do anticorpo digitalizado compreende um único conjunto de números 0 ou 1.

2 5 Os valores numéricos "0" ou "1" podem, naturalmente,

ser normalizados para os sinais obtidos nos microlocais de controle internos, de modo que os perfis de anticorpo digitalizados obtidos em um tempo posterior podem ser apropriadamente comparados. Por exemplo, um ou vários

3 0 microlocais conterão um antígeno conhecido, que permanecerá constante com o tempo. Portanto, se a amostra biológica subsequente for mais ou menos diluída q®2 uma amostra biológica anterior, os sinais podem ser normáüzados usando os sinais do antígeno conhecido.

Será apreciado por um versado na técniÇa que existem

outros métodos de digitalização do perfil do anticorpo e que os mesmos podem ser usados. Por exemplo, ao invés de atribuição de cada microlocal com um valor numérico de "0" ou "1", o valor numérico pode ser incrementai e diretamente proporcional à resistência do sinal.

Quando da digitalização dos sinais de perfil de anticorpo, os resultados da bioquímica podem ser passado a um computador e rapidamente acessados e utilizados. Dentro de segundos da digitalização do perfil do anticorpo, um 15 computador pode comparar um perfil de anticorpo anteriormente digitalizado de modo a determinar se existe uma combinação. Se uma combinação do perfil do anticorpo estiver na base de dados, uma identificação positiva da fonte da amostra biológica poderá ser feita. Assim, o 20 método da presente invenção pode discriminar e identificar positivamente a fonte de uma amostra biológica.

Em uma concretização da invenção é empregado o presente método para análise forense de combinação de uma amostra biológica com a de um suspeito criminal. As 25 amostras forenses obtidas de cenas do crime são frequentemente submetidas a secagem das amostras, em tamanhos pequenos, mistura com as amostras de mais de um indivíduo, adulteração com substâncias químicas e semelhantes. 0 presente método provê as vantagens de

3 0 análise rápida, simplicidade, baixo custo e exatidão quanto à combinação das amostras forenses com as Ifdos suspeitos. Por exemplo, a amostra forense e uma amostrf 3e um ou mais suspeitos são obtidas de acordo com ol> métodos bem· conhecidos na técnica. Os perfis dos anticQTÊoos para cada 5 uma das amostras são preparados, conforme descrito no presente documento. Os perfis dos anticorpos são então comparados. Uma combinação dos perfis dos anticorpos significa que a amostra forense foi obtida da combinação do suspeito. Se nenhuma combinação dos perfis do anticorpo for 10 obtida, então nenhum dos suspeitos foi a fonte da amostra forense.

Em outra concretização da invenção é empregado o presente método para testar drogas em indivíduos. Por exemplo, em muitos locais de trabalho, uma condição para a 15 obtenção ou manutenção do emprego é a não utilização de drogas ilícitas. A presença de drogas ilícitas na corrente sanguínea de uma pessoa pode ser detectada pelo presente método em razão da captura do anticorpo ou métodos semelhantes. Além disto, conforme descrito no WO 97/29206, 20 o teste da droga e a identidade da amostra podem ser correlacionados em um teste simples. Os testes de drogas são também importantes em determinados animais, tais como, cavalos e cães envolvidos em corridas.

A presente invenção é descrita adicionalmente nos exemplos que se seguem, os quais são apresentados como ilustração e não se destinam a limitar de que forma for a presente invenção.

Exemplo 1

A comunidade que realiza o comprimento das leis vem apresentando várias necessidades associadas ao teste de drogas em suspeitos incluindo o fato de se"'lidar com as questões de privacidade associadas à coleW de amostras", manutenção da cadeia de custódia da amostrai prevenção daadulteração da amostra pelo suspeito e . J^acilitação do percurso e tempo necessários para análises d<§"s amostras. Os protocolos de teste de drogas atuais utilizam amostras de urina e, ocasionalmente amostras de sangue.; A invasão da privacidade é um problema constante com as amostras de urina, uma vez que é necessário observar o fornecimento individual da amostra de modo a manter a cadeia de custódia e eliminar a possibilidade de troca ou adulteração da amostra. As amostras de urina também não são um bom indicador do nível atual de intoxicação, uma vez que muitos metabólitos continuam a ser excretados na urina por dias ou semanas após as drogas serem inicialmente utilizadas. Embora as amostras de sangue não sofram destes problemas, a coleta de sangue é um procedimento invasivo, requerendo instalações especiais e pessoal treinado o que nem sempre está disponível quando necessário. O pessoal que realiza o cumprimento das leis precisa manter uma cadèia de custódia estrita para todas as amostras coletadas, de modo a garantir que não ocorram manipulações ou adulterações deliberadas. Um rompimento ou mesmo um rompimento percebido na cadeia de custódia pode resultar em perda da evidência ou diminuição de seu valor.

As concretizações da presente invenção solucionam estas questões de várias formas. Em primeiro lugar, a incorporação do ensaio de identificação da definição de perfil ao teste de droga torna a identificação do doador da

3 0 amostra completa em relação ao teste e elimina a necessidade dos procedimentos complexos da cadeia de custódia. Em segundo lugar, o teste de droga com base ria saliva é melhor que o teste da urina, pelo qH'e os níveis de droga na saliva podem ser prontamente relacionados aos 5 níveis de droga no sangue (W. Schramm e oufcros, Drugs of Abuse in Saliva: A Review, 16 J. Anal. Toxicology 1-9 (1992); EJ. Cone, Saliva Testing for Drugs of Abuse, 694 Ann. N. Y. Acad. Sei. 91-127 (1995)), provendo um melhor indicador do uso corrente de droga (D. A. Kidwell e outros, 10 Testing for drugs of abuse in saliva and sweat, 713 J. Chrom. B 111-135 (1998)). Amostras de saliva de um suspeito podem também ser coletadas facilmente por um oficial encarregado de fazer cumprir as leis e sem invasão de privacidade ou de métodos invasivos. Finalmente, o presente 15 teste é fácil de ser utilizado e pode ser realizado rapidamente pelo pessoal encarregado de fazer cumprir as leis em um local, ao invés de requerer dias a semanas em laboratórios centralizados em locais distantes. V. S. Thompson e outros, Antibody profiling as an identification 20 tool for forensic samples, 3576 Investigation and Forensic Science Technologies 52-59 (1999).

Neste exemplo, um teste à base de anticorpo é provido para duas drogas ilícitas (cocaína e metanfetamina). Estas drogas estão entre as mais utilizadas de forma ilícita e 25 que mais cresce. S. B. Karch, Drug Abuse Handbook (CRC Press, 1998); L.D. Bowers, Athletic Drug Testing, 17 Sports Pharmacology 299-318 (1998).

Materiais e Métodos: Anticorpos de IgG anti-coelho de cabra conjugados à fosfatase alcalina foram obtidos na

3 0 Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA) . Anticorpos de IgA anti-humana de coelho foram adquiridos da U.S. Biologicai' (Swampscott, MA). Seablock™, cloreto de fthitro-azul de tetrazólio/sal de 5-bromo-4-cloro-3 1 -indc|ELilf osf ato p-; toluidina (NBT/BCIP) , sal de p-nitroferilll fosfato de' 5 dissódio (PNPP), EZ-LINKTM kits de fosfatase alcalina ativada com maleimida, e FreeZyme® kits de purificação de conjugado foram obtidos na Pierce Chemical (Rockford, Illinois). Anticorpos monoclonais contra benzoilecgonina e metanfetamina e conjugados de albumina de soro bovino (BSA) 10 de metanfetamina e benzoilecgonina foram adquiridos na O. E.M Concepts (Toms River, New Jersey) . Cocaína e sais cloridrato de metanfetamina foram obtidos na Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri) . As fitas de desenho do perfil do anticorpos foram adquiridas na Miragen, Inc. (Irvine, 15 Califórnia). As fitas empregadas para o teste combinado de droga-AbP foram produzidas de acordo com o protocolo da A.M. Francoeur, Antibody fingerprinting: a novel method for identifying individual people and animais, 6 Bio/Technology

822-825 (1988). Amostras de saliva da Saliva Diagnostic Systems (Vancouver, Washington), Ora Sure Technologies, Inc. (Bethlehem, Pennsylvania) e Sarstedt, Inc. (Newton, North Carolina) foram usadas para coletar as amostras de saliva dos voluntários.

Um ensaio de AbP à base de saliva foi desenvolvido 25 através da modificação de um protocolo anterior designado para processamento das amostrasíde sangue. T.F. Unger & A. Strauss, Individual-specific antibody profiles as a mean of newborn infant Identification, 15 J. Perinatology 152-155 (1995). Em resumo, 500 pL de amostra de saliva diluídos com

3 0 1,0 mL de PBST (50 mM de salmoura tamponada de fosfato, 0,2% Tween 20) foram incubados com uma fita do AbP por toda a noite por um mínimo de 16 horas, e o exeêTsso de amostra1 foi lavado com PBST. Em seguida, a fita foi incubada sucessivamente com 100 ng/mL de IgA anti-humana de coelho 5 por 1 hora e 100 ng/mL de conjugado de IgG; anti-coelho de cabra e fosfatase alcalina por 3 0 minutos com lavagens entre as incubações. A fita foi lavada novamente com PBST sendo adicionado um substrato de precipitação para fosfatase alcalina, NBT/BCIP, de modo a permitir a 10 revelação das faixas sobre a fita.

Os sistemas de coleta de saliva, Saliva Sampler™ (Saliva Diagnostic Systems) e o Salivette™ (Sarstedt, Inc.) foram examinados quanto à compatibilidade com o ensaio do AbP. O sistema Saliva Sampler™ compreende uma almofada de 15 algodão anexada a uma alça plástica. Uma janela na alça se torna azul quando amostra suficiente tiver sido coletada. A almofada é colocada em um tampão preservante após coleta. 0 Salivette™ é um rolete de algodão colocado na boca por cerca de 10 minutos e então centrifugado em um tubo

2 0 plástico para coleta da amostra. Ambos os tipos de amostradores foram colocados na fenda gengival da boca para coleta da amostra. A qualidade das amostras como uma função do tempo de armazenamento em temperaturas de -20°C, 4°C e 25°C foi avaliada pelo desempenho do AbP nas amostras

2 5 coletadas com ambos amostradores.

Cinco voluntários participaram dos estudos para comparar os padrões do AbP no sangue com aqueles obtidos das amostras de saliva. Os \ protocolos para uso de indivíduos humanos foram conduzidos de acordo com o Idaho

3 0 National Engineering and Environmental Laboratory Institutional Review Board. As amostras dè, sangue foram coletadas em tubos contendo o anticoagularífé EDTA e foram utilizadas imediatamente. A saliva foi cole.feada empregando o sistema de coleta de saliva Saliva SampleU™. Amostras de 5 sangue e saliva emparelhadas foram analisadas usando o protocolo sanguíneo de Unger & Strauss, supra e o teste do AbP d saliva descrito acima.

Quatro voluntários adicionais participaram em um estudo de adulteração de saliva para avaliar os efeitos de

vários alimentos e bebidas no ensaio do AbP. Os voluntários receberam doces amanteigados e de limão, goma de mascar com açúcar e sem açúcar, coca-cola com e sem açúcar e leite com chocolate. Após a ingestão dos alimentos acima, as salivas foram coletadas usando os amostradores de saliva providos.

Foi solicitado aos voluntários que consumissem álcool, café, comessem os alimentos de sua escolha e escovassem os dentes antes de fornecerem as amostras. Um voluntário quê era fumante forneceu a amostra após fumar um cigarro. Amostras de linha de base foram também coletadas dos

2 0 voluntários.

Anticorpos monoclonais contra metanfetamina e benzoilecgonina foram conjugados à fosfatase alcalina usando o kit de fosfatase alcalina ativado com maleimida EZ-LinkTM de acordo com as instruções do fabricante. 0

2 5 anticorpo não conjugado foi separado do conjugado de

anticorpo-enzima usando o kit de purificação de conjugado FreeZyme®, de acordo com os protocolos do fabricante.

Ensaio Imunoabsorvente Ligado a Enzima (ELISAs) competitivos foram desenvolvidos para ambas cocaína e

3 0 metanfetamina. Os conjugados de BSA da metanfetamina ou benzoilecgonina foram diluídos em 50 mM tampão carbonato, pH 9,6 e 50 pL foram adicionados a cada poço de uma placa microtituladora de 96 poços. A placa foi incubada por toda noite a 4 0C para permitir que o conjugado; se ligasse às 5 superfícies do poço. A placa foi então lavada com PBST para remover o excesso de conjugado de BSA. Em seguida, 50 pL tanto da solução de cocaína quanto de metanfetamina na faixa de concentração de 0 a 1.000 pg/mL foram adicionados à placa e 50 pL tanto de anti-benzoilecgonina monoclonal 10 quanto de anti-metanfetamina conjugada com fosfatase alcalina foram adicionados. Durante esta etapa, o conjugado de BSA-droga imobilizado competiu com a droga livre na solução para ligação dos sítios aos anticorpos. Após a reação de competição estar completa, os anticorpos não 15 ligados e a droga livre foram removidos por lavagem. Finalmente, 100 pL da solução de substrato de fosfatase alcalina (PNPP) solúvel foram adicionados aos poços para reação com a fosfatase alcalina ligada às superfícies dos poços através dos anticorpos antidroga. A reação foi parada

2 0 após 20-30 minutos por adição de 2 5 pL de 3 M NaOH, e a absorvência de cada poço foi lida em 4 05 nm usando um leitor de microplaca Tecan Spectra.

A membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) é empregada na fabricação das fitas de Miragen AbP e foi

2 5 empregada para avaliar a viabilidade da ligação dos

conjugados da cocaína e metanfetamina-BSA à sua superfície. A membrana de PVDF foi cortada em fitas do mesmo tamanho como aquelas usadas no ensaio do AbP. Quatro fitas foram preparadas para cada droga e manchas de 10 pL de cada

3 0 conjugado de droga-BSA foram colocadas em três locais sobre cada fita para análise em triplicata. As fiil.s foram secas a 350C por uma hora antes do uso. Sítios fi|é ligação não específicos sobre as fitas foram bloqué<tdos com PBST contendo 1 mg/mL de BSA por uma hora e entaÉlIenxaguados com 5 PBST. Soluções de cocaína e metanf etamina |$$jram preparadas em PBST em concentrações de 0, 0,1, 10 eÍ£:-!000 pg/mL. Em seguida, 750 pL de solução de cocaína ati: metanf etamina foram adicionados às fitas e mais 750 pL dei anticorpos de anti-benzoilecgonina ou anti-metanfetamina conjugados com 10 fosfatase alcalina foram adicionados e deixados incubar por uma hora. Durante este tempo, uma reação competitiva entre a droga livre e a imobilizada para os sítios de ligação ao anticorpo foi realizada. As fitas foram·; lavadas para remover os anticorpos não ligados e as drogas e o substrato 15 NBT/BCIP foi adicionado. As fitas foram reveladas por 15 minutos.

Um ensaio de AbP-droga combinado foi preparado por colocação de manchas de 10 pL de ambos metanfetamina e conjugado de benzoilecgonina-BSA sobre a porção inferior da 20 peça em bruto da fita do AbP e deixando que as mesmas sequem por uma hora a 35°C. Amostras de saliva de três indivíduos foram coletadas usando amostras Ora Sure. Metade da amostra de saliva foi cravejada com 1.000 pg/mL de cocaína e metanfetamina. As fitas foram bloqueadas com PBST 25 contendo 1,0 mg/mL de BSA por uma hora e enxaguadas com PBST. Em seguida, 5 00 pL de saliva cravejada ou não foram adicionados às fitas juntamente com anticorpos antimetanfetamina e anti-benzoilecgonina conjugados com fosfatase alcalina e deixados incubar por, toda noite a

3 0 temperatura ambiente. As fitas foram lavadas com PBST e o ensaio AbP foi conduzido conforme descrito acima.

Resultados e Discussão: O ensaio Ablf' com base na saliva foi otimizado através da variação dajs; concentrações do reagente, volumes da amostra e tempos def incubação. Os 5 resultados ilustrativos dos perfis do anticorpo obtidos das amostras da saliva são mostrados na figura I Em comparação ao ensaio do AbP com base no sangue, o erisaio da saliva demora muito mais (18 horas contra 2 horas) e requer uma quantidade de amostra dez vezes maior. Isto se deve ao fato 10 de existirem níveis cem vezes menores de anticorpos totais presentes na saliva em comparação ao do sangue. Parry, Tests for HIV and hepatitis viruses, 694 Annals N. Y. Acad. Sci. 221 (1993).

A estabilidade dos anticorpos presentes nas amostras de saliva coletadas usando os sistemas Saliva Sampler™ ou o Salivette™ foi determinada por armazenamento a -20°C, 4°C e 25°C e teste do AbP das amostra diariamente pelo período de uma semana para verificar se houve qualquer alteração no padrão observado. As amostras de saliva fresca de cada amostrador forneceram os melhores resultados. A estabilidade com o passar do tempo das amostras coletadas com o sistema Saliva Sampler™ foi superior a das amostras coletadas com o sistema Salivette™ em todas as temperaturas. O tampão preservante para armazenamento fornecido com o sistema Saliva Sampler™ parece impedir a degradação dos anticorpos devido à contaminação bacteriana, enquanto o amostrador Salivette™ não inclui preservante.

As amostras coletadas com o sistema Saliva Sampler™ e mantidas a temperatura ambiente não mostraram alteração no

3 0 padrão em um período de cinco dias. Este resultado contrasta com os resultados obtidos com as amostras armazenadas em um refrigerador, as quais mostraram forte deterioração mesmo após algumas horas de armazenamento. Não ficou claro porque isto ocorreu. As amosfras congeladas 5 também mostraram alguma deterioração devidoao estrago causado pelos ciclos de congelamento-descongelamento, porém armazenamento prolongado em temperaturas de congelamento não resultou em degradação adicional. Uma vez que os sistemas de coleta de saliva Saliva Sampler™ apresentaram 10 propriedades de armazenamento superiores e eram mais fáceis de serem utilizados, eles foram escolhidos para os estudos de adulteração.

0 padrão do AbP sanguíneo foi comparado ao padrão do AbP salivar para determinar se os ISAs presentes naquelas 15 amostras eram os mesmos. Os resultados mostraram que os padrões obtidos das duas amostras diferentes diferiram muito (figura 2) . Este resultado foi algo surpreendente, uma vez que a saliva é um filtrado do sangue e era esperado que os ISAs presentes na saliva fossem os mesmos que os 20 apresentados no sangue. O padrão diferente provavelmente resultou do isotipo de anticorpo examinado em cada caso. No sangue, os anticorpos de IgG foram analitos uma vez que eles prevalecem. Na saliva, anticorpos de IgA prevalecem e foram analitos. Após o resultado acima ser obtido, as 25 amostras de saliva foram também analisadas quanto aos anticorpos de IgG para determinar se aquele padrão seria o mesmo que o padrão sanguíneo. Contudo, isto não teve sucesso em razão dos níveis extremamente baixos de anticorpos de IgG presentes na saliva.

3 0 Os estudos de adulteração da saliva mostraram que virtualmente não ocorreram alterações nõs perfis dos anticorpos quando qualquer adulteração éütáva presente (figura 3) . Em alguns casos, uma faixa pode üfer mais escura ou mais clara, porém não pareceu haver faixais faltantes ou 5 adicionais presentes. Uma vez que este £era um estudo preliminar, as adulterações examinadas foram itens facilmente obtidos, que podem ser usados durante o curso da vida comum. Contudo, como uma pesquisa rápida na Internet revela, existem muitos métodos propostos para mascarar os 10 testes de droga com base na urina, incluindo ingestão e adulteração de amostras com várias substâncias que estão sendo vendidas nestes sites da Internet. Os resultados de adulteração mostrados aqui são promissores uma vez que parece que o teste do AbP não é afetado pelos alimentos que 15 podem ser geralmente consumidos antes da realização do teste de saliva.

Testes de imunoensaio para ambas a cocaína e metanfetamina foram desenvolvidos usando um ensaio competitivo direto. Um anticorpo anti-benzoilecgonina foi 2 0 empregado para o ensaio da cocaína; contudo, este anticorpo forneceu a mesma resposta para a cocaína que para a benzoilecgonina (o metabólito primário da cocaína), assim ele não afetou os resultados do ensaio. Neste ensaio, a droga presente em uma amostra compete ligando os sítios nos

2 5 anticorpos rotulados com a enzima com a droga conjugada ao

BSA imobilizada em relação à superfície de um poço de uma placa de microtitulação. Nas amostras com grandes concentrações de droga, a maior parte do conjugado de anticorpo-enzima se ligará à droga na solução e será

3 0 retirada por lavagem durante a etapa final. Portanto, haverá muito pouca enzima presente (fia placa de microtitulação e a quantidade de revelaça"© da cor será baixa. De modo contrário, caso não exista drçlga na amostra, os anticorpos se ligarão às drogas i|nobi lizadas e 5 permanecerão nos poços após a etapa de Iavaigem resultando em revelação de cor forte. Isto resulta em úm sinal que é inversamente proporcional à concentração da droga (figuras

4 e 5). A faixa linear para detecção de cocaína foi de 0,1 a 5 pg/mL e para metanfetamina foi de 0,1 a 10 pg/mL. Esta

faixa cobre os valores de corte para estas drogas (0,3 e

1,0 pg/mL, respectivamente) concorrentemente ajustados pela Substance Abuse and Mental Health Services Administration. M. Peat & A.E. Davis, Drug Abuse Handbook (CRC Press, Boca Raton, Fia. 1998) .

Os ensaios para droga foram conduzidos sobre as

membranas de PVDF empregando as ótimas concentrações de conjugados de BSA-droga determinadas durante os estudos de ELISA. Em razão da relação inversa do imunoensaio em relação à concentração da droga, uma mancha escura foi

2 0 observada quando a concentração das drogas estava baixa, e

as manchas desapareceram gradualmente conforme a concentração da droga aumentou (figuras 6 e 7).

Uma vez que o teste da droga nas membranas de PVDF foi promissor, a viabilidade da combinação dos testes das duas

drogas com o ensaio de AbP foi avaliada. 0 padrão do perfil do anticorpo dos três indivíduos não alterou independente se a droga estivesse presente ou não (figura 8) . Estes resultados mostraram que a presença das drogas não interferiu com os reagentes usados para realizar o ensaio

3 0 de desenho do perfil do anticorpo. Exemplo 2

Neste exemplo, o procedimento do Exempffijp 7I é seguido, exceto que os antígenos fracionados da c||lula HeLa são imobilizados sobre uma membrana de PVDF .fêm um padrão.

predeterminado como uma matriz bidimensional. Adicionalmente, cocaína e metanfetamina são imobilizadas sobre a membrana como manchas adicionais sobre a matriz. Após a revelação da cor conforme descrita, os resultados são substancialmente semelhantes aos do Exemplo 1.

Exemplo 3

Neste exemplo, o procedimento do Exemplo 2 é seguido, exceto que a matriz é imobilizada sobre uma lâmina de vidro.

Exemplo 4

Fitas de ensaio foram preparadas como no Exemplo 1 e

pré-bloqueadas em PBS. As fitas foram então expostas à quantidades variadas de soro de cerca de 5 0 pL a 0,1 pL por minutos. As fitas foram então colocadas em uma solução alvejante (0,5% v/v de hipoclorito de sódio) antes da lavagem quatro vezes com PBS.

No caso das fitas que sofreram um processo de assentamento de dois estágios, a fitas foram expostas a uma IgG anti-humana de coelho por 12 minutos antes de serem lavadas 4 vezes com PBS. Estas fitas foram éntão expostas à 25 IgG anti-coelho de cabra conjugada a fosfatase alcalina por 12 minutos. As fitas foram então lavadas e a cor revelada conforme ressaltado no Exemplo 1. Os resultados de duas camadas de anticorpo podem ser vistos na figura 9 onde um padrão que pode ser lido com algumas faixas faltantes é

3 0 visível abaixo de 1 pL de soro e um padrão completo é visível em 3 pL de soro.

No caso das fitas que sofreram UmJ processo de assentamento de três estágios, a fitas foram-|expostas a uma IgG anti-humana de coelho por 12 minutos \antes de serem

lavadas 4 vezes com PBS. Estas fitas foram então expostas à IgG anti-coelho de cabra por 12 minutos. 'A fitas foram então expostas à IgG anti-cabra de burro conjugada a fosfatase alcalina 12 minutos. As fitas foram então lavadas e a cor revelada conforme ressaltado no Exemplo I. Os 10 resultados de duas camadas de anticorpo podem ser vistos na figura 10 onde um padrão que pode ser lido com algumas faixas faltantes é visível abaixo de 0,5 pL de soro e um padrão completo é visível em 1 μ!· de soro.

Uma comparação das figuras 9 e 10 mostra que um processo de três assentamentos de anticorpo aumentou a sensibilidade na provisão de um padrão de anticorpos específicos do indivíduo que pode ser lido em relação ao processo de duas camadas.

Exemplo 5

2 0 Fitas de ensaio foram preparadas como no Exemplo 1 e

pré-bloqueadas em PBS. As fitas foram então expostas a três pL de soro variando por 20 minutos. As fitas foram então colocadas em uma solução alvejada (0,5% v/v de hipoclorito de sódio) antes da lavagem quatro vezes com PBS.

No caso de uma fita que sofreu um processo de

assentamento de dois estágios, as fitas foram expostas a uma IgG anti-humana de coelho por 12 minutos antes de serem lavadas 4 vezes com PBS. Estas fitas foram então expostas à IgG anti-coelho de cabra conjugada a fosfatase alcalina por 12 minutos. As fitas foram então lavadas e a cor revelada conforme ressaltado no Exemplo 1.

No caso das fitas que sofreram umj processo de assentamento de três estágios, as fitas fc>ram expostas a uma IgG anti-humana de cabra por 12 minutoslantes de serem 5 lavadas 4 vezes com PBS. Estas fitas foram exftão expostas a uma IgG anti-cabra de coelho por 12 minutos. A fitas foram então expostas a uma IgG anti-coelho de burro conjugada a fosfatase alcalina 12 minutos. As fitas foram então lavadas e a cor revelada conforme ressaltado no Exemplo 1.

Os resultados dos processos de dois e três

assentamentos podem ser vistos lado a lado na figura 11. A fita A sendo a fita de três camadas e a fita B sendo a fita de duas camadas. Conforme pode ser visto, um sinal e sensibilidade mais fortes foram obtidos com o processo de

três camadas.

Um estudo de densitometria das duas fitas foi realizado e os resultados apresentados na figura 12 onde a fita de três camadas é a linha superior e a fita de duas camadas é a linha inferior. A altura das linhas indica a

intensidade das faixas. Conforme pode ser visto na figura

12, o processo de três camadas possui uma leitura aumentada para faixas especificas sem um aumento proporcional no ruído de fundo. Assim, o processo de três camadas apresenta sensibilidade aumentada em relação ao processo de duas

2 5 camadas.

Embora esta invenção tenha sido descrita em determinadas concretizações, a presente invenção pode ser adicionalmente modificada dentro do espirito” e escopo desta revelação. Este pedido, portanto, se destina a cobrir

3 0 quaisquer variações, usos ou adaptações da invenção empregando seus princípios gerais. Adicionalmente, este pedido se destina a cobrir tais aspectos' que fogem da presente revelação, porém que se encontram dentro da prática habitual ou conhecida na técnice| a qual esta 5 invenção pertence e que se encontram dentroiãos limites das reivindicações apensas.

Claims (15)

1. Método para análise de mateifial biológico compreendendo anticorpos específicos do indivíduo, o método caracterizado pelo fato de que compreende: formação de uma matriz compreendendo múltiplos antígenos anexada a uma superfície de um suporte sólido em um padrão de local pré-selecionado; obtenção de uma amostra de um material biológico possuindo anticorpos específicos do indivíduo e contatando a matriz com a amostra para ligar pelo menos uma porção dos anticorpos específicos do indivíduo aos múltiplos antígenos da matriz, para formar complexos imunes; lavagem da matriz contendo os complexos imunes; detecção dos complexos imunes por aplicação à matriz de pelo menos três anticorpos separados; e identificação dos complexos imunes na matriz, de modo a obter um perfil de anticorpo.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a formação de uma matriz compreende anexação de múltiplos antígenos ao suporte sólido através de uma ligação covalente.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a obtenção de uma amostra de um material biológico selecionado do grupo de material biológico consistindo em tecido, sangue, saliva, urina, transpiração, lágrimas, sêmen, soro, plasma, fluido amniótico, fluido pleural, fluido cérebro-espinhal, e combinações dos mesmos.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a formação da matriz compreende anexação de múltiplos antígenos a um suporte solido compreendendo vidro ou sílica.

5.Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a detecção dos complexos imunes compreende tratar a matriz de modo que a presença dos complexos imunes em um local é caracterizada por uma alteração de cor no local.

6.Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a detecção dos complexos imunes compreende obtenção de uma saída usando dispositivo acoplado de carga e onde a alteração de cor compreende emissão de fluorescência e luminescência.

7.Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a detecção dos complexos imunes compreende, adicionalmente, monitoramento da matriz com circuito elétrico de detecção de cor em estado sólido e comparação do padrão de cor antes e após a detecção dos complexos imunes.

8.Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a detecção dos complexos imunes compreende, adicionalmente, a obtenção de uma imagem colorida em uma câmera antes do contato da matriz com a amostra e após a detecção dos complexos imunes e análise das informações de pixel obtidas da imagem colorida em uma câmera.

9.Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a detecção dos complexos imunes adicionalmente compreende varredura da matriz antes e após contato da matriz com a amostra, onde o suporte sólido é um chip de ressonância de plasmônio de superfície.

10. Método, de acordo com a reify indicação 1, caracterizado pelo fato de que a formarão' da matriz compreende anexação do primeiro subconjunto de antígenos configurado para obtenção de um perfil de |anticorpo e um segundo subconjunto de pelo menos um antígeno configurado para analisar um analito selecionado na amostra.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a anexação do segundo subconjunto de pelo menos um antígeno compreende anexação de pelo menos uma droga.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a anexação de pelo menos uma droga compreende anexação de uma droga selecionada do grupó consistindo em maconha, cocaína, metanfetamina, anfetamina, heroína, metiltestosterona, mesterolona e combinações das mesmas.

13. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a obtenção de uma amostra de um material biológico compreende a obtenção do material biológico de uma amostra forense.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, a comparação do perfil de anticorpo obtido a partir do material biológico da amostra forense com um perfil de anticorpo preparado a partir de uma amostra biológica obtida de um suspeito de crime.

15. Método para análise de material biológico compreendendo anticorpos específicos do indivíduo, o método caracterizado pelo fato de que compreende: formação de uma matriz compreendendo múltiplos antígenos anexada a uma superfície de um suporte sólido em um padrão de local pré-selecionado; obtenção de uma amostra de um maté^rial biológico1 possuindo anticorpos específicos do indivíduo e contatando a matriz com a amostra para ligar pelo menosluma porção dos; anticorpos específicos do indivíduo aos antígenos múltiplos· da matriz, para formar complexos imunes; lavar a matriz contendo os Complexos imunes; contatar os complexos imunes com anticorpos primários capazes de ligarem o complexo imune, onde os anticorpos primários são de uma espécie diferente em relação aos anticorpos específicos do indivíduo; remoção dos anticorpos primários não ligados aos complexos imunes; contatar os anticorpos primários ligados aos complexos imunes com anticorpos secundários capazes de ligar os anticorpos primários, onde os anticorpos secundários são de uma espécie diferente dos anticorpos específicos do indivíduo e dos anticorpos primários; remoção dos anticorpos secundários não ligados; contatar os anticorpos secundários ligados aos anticorpos primários, anticorpos terciários capazes de ligar os anticorpos secundários, onde os anticorpos terciários são de uma espécie diferente dos anticorpos específicos do indivíduo, dos anticorpos primários e dos anticorpos secundários; remoção dos anticorpos terciários não ligados; e detecção dos anticorpos primários, secundários ou terciários; e identificação dos complexos imunes na matriz, de modo a obter um perfil de anticorpo.