ES2254330T3 - Inmunoensayo para proteina c-reactiva. - Google Patents
Inmunoensayo para proteina c-reactiva.Info
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Abstract
Un procedimiento para llevar a cabo un inmunoensayo competitivo para detectar proteína C-reactiva que comprende: i o bien poner en contacto una muestra con un anticuerpo de proteína C-reactiva antihumano inmovilizado que tiene una afinidad para PCR que es aproximadamente 10-7 M y un anticuerpo antiidiotípico marcado, que es capaz de unirse a CRP5-23 (ATCC PTA- 1354) con afinidad relativamente alta (Kd < 10-8 M) en el que se excluyen mutuamente la unión a CRP5-23 (ATCC PTA-1354) y la unión de la proteína C-reactiva o poner en contacto una muestra con un anticuerpo antiidiotípico inmovilizado, que sea capaz de unirse a CRP5-23 (ATCC PTA-1354) con afinidad relativamente alta (Kd < 10-8 M) en el que se excluyen mutuamente la unión a CRP5-23 (ATCC PTA-1354) y la unión de la proteína C- reactiva y un anticuerpo de proteína C-reactiva antihumana marcado que tiene una afinidad para PCR de aproximadamente 10-7 M; ii detectar el marcador; y iii correlacionar la detección del marcador con la cantidadde proteína C-reactiva de la muestra.
Description
Inmunoensayo para proteína
C-reactiva.
La presente invención se refiere a un
inmunoensayo de diagnóstico in vitro para detectar proteína
C-reactiva (PCR).
Es difícil que la mayoría de los inmunoensayos
actuales para analitos de alta concentración y alto peso molecular
funcionen en los analizadores de química clínica usados ampliamente,
que usan sistemas de detección colorimétricos o de luminiscencia
química.
Típicamente, los inmunoensayos para analitos de
alta concentración y alto peso molecular, del mercado, están
basados en la multivalencia el analito. En última instancia, el
analito se detecta mediante algún tipo de entrecruzamiento, por
aglutinación (en ensayos turbidimétricos o nefelométricos),
precipitación (inmunodifusión radial), o inmunoensayos
intercalados. Cada uno de estos tipos de inmunoensayos tienen
desventajas significativas en comparación con sistemas
automatizados. Los ensayos de inmunodifusión radial son
extremadamente lentos (horas o días) y requieren cantidades
sustanciales de antisueros seleccionados cuidadosamente. Los ensayos
basados en aglutinación requieren tanto dilución inicial como
cantidades sustanciales de inmunomateriales. Además, cada uno de
estos procedimientos requieren sistemas ópticos especializados,
generalmente no presentes en los analizadores clínicos
contemporáneos. Los inmunoensayos intercalados o de dos sitios
requieren diluciones iniciales altas o concentraciones altas
indeseables de inmunomateriales caros.
La capacidad actual de las presentaciones
dirigidas a inmunoensayos competitivos se aplica mejor a analitos
de alta concentración y peso molecular bajo, como muchos fármacos
terapéuticos o estupefacientes. Tradicionalmente, estos
inmunoensayos competitivos se basan en la competición para un número
limitado de sitios de unión específicos del fármaco (moléculas de
anticuerpo inmovilizadas) entre fármaco libre y un marcador
enzimático preparado mediante conjugación química de un hapteno
derivado del fármaco y peroxidasa de rábano (HRP). Típicamente, los
criterios de selección para los reactivos para estas pruebas
diagnósticas pueden incluir: en primer lugar, la Kd (constante de
disociación) de fármaco:complejo anticuerpo debe ser similar a
(dentro de un factor de 10) la concentración de fármaco en la
muestra de suero; y, en segundo lugar, la Kd del marcador: complejo
anticuerpo debe ser sustancialmente más baja (de uno a varios
órdenes de magnitud dependiendo de la concentración absoluta del
analito) que la del fármaco: complejo anticuerpo bajo las mismas
condiciones. Un problema encontrado reside en la dificultad de
hacer anticuerpos y marcadores con los requisitos de afinidad
necesarios.
Satisfacer las condiciones anteriores de analitos
con alta concentración y alto peso molecular, es difícil. En
particular, la segunda condición (afinidad más alta por el analito
marcado), que aparece anteriormente, es difícil de lograr. Para
moléculas pequeñas, como fármacos, la afinidad del anticuerpo por el
marcador puede aumentar por diversos efectos que incluyen el
"efecto de enlace" (energía de unión adicional debida a la
interacción del anticuerpo con el enlace), multisustitución del
marcador por el hapteno, y, posiblemente, orientación favorable del
fármaco hacia la superficie del marcador. Efectos equivalentes para
analitos macromoleculares son poco probables ya que el epitopo para
la interacción con el analito y el analito: enzima conjugada es
idéntico y reside totalmente en el analito. Dicho de otra manera, el
analito parece el mismo que el anticuerpo si está libre en solución
o conjugado con una molécula HRP.
Se conocen en la técnica los anticuerpos
monoclonales para la proteína C-reactiva. Por
ejemplo, el documento WO91/00.872, describe una línea celular de
hibridoma capaz de producir anticuerpos PCR antihumano que reconocen
un epitopo independiente de calcio en PCR humana materna.
Kilpatrick y colaboradores (Molecular Immunology) 1982) 19:9
págs. 1159-1165), describe la producción de tres
anticuerpos monoclonales que se unen a PCR en presencia de
Ca^{2+} 2,5 mM. Se describe un cuarto anticuerpo monoclonal frente
a PCR que no requiere la presencia de Ca^{2+}.
Se conocen también en la técnica los sistemas de
inmunoensayos que usan anticuerpos antiidiotipo en lugar de
antígeno. La patente de Estados Unidos 4.699.880 describe tales
inmunoensayos y procedimientos competitivos para producir
anticuerpos antiidiotípicos conocidos en la técnica de la proteína
C-reactiva (PCR) de una manera cuantitativa.
Englebienne y Weiland (Journal of Immunological Methods (1996),
191:159-170) describe el uso del analito de
referencia (antígeno que compite con el analito PCR) para unir al
anticuerpo antianalito.
Se han superado las deficiencias de usar los
planteamientos convencionales para detectar analitos de
concentración alta, peso molecular bajo en una situación en la que
el analito objetivo tiene concentración alta, peso molecular bajo.
Se describe en este documento un procedimiento para obtener
poblaciones de anticuerpo monoclonal antiidiotípico dirigidas a un
anticuerpo que es específico para un antígeno objetivo de
concentración alta, peso molecular alto en el que dichas
poblaciones de anticuerpo antiidiotípico tienen un amplio intervalo
de afinidades de unión para los anticuerpos seleccionados
específicos para dicho antígeno objetivo y en el que un subconjunto
de dichas poblaciones de anticuerpo antiidiotípico pueden
seleccionarse para que tengan la afinidad requerida para una
aplicación en particular. Las poblaciones de anticuerpo
antiidiotípico se seleccionan de modo que expresen una afinidad por
el anticuerpo dirigido al antígeno objetivo que es sustancialmente
mayor que la del antígeno objetivo para el anticuerpo. De manera
adicional, se describe un medio para obtener un anticuerpo de baja
afinidad para el antígeno objetivo.
Esta invención se refiere a nuevas composiciones
de inmonoensayos de PCR. Dichas composiciones comprenden el
anticuerpo monoclonal (CRP5-23) PCR antihumano de
baja afinidad (K_{D} \sim 10^{-7} M) y un anticuerpo
antiidiotípico elevado frente a CRP5-23. Encontramos
que la unión de CRP5-23 a PCR, ventajosamente, es
insensible al calcio ionizado. El hibridoma para este anticuerpo se
ha depositado con el ATCC con la denominación de
PTA-1354.
Todavía en otro aspecto, nuestra invención se
refiere en general a procedimientos, equipos de inmunoensayos
competitivos y específicamente, a un ensayo para PCR.
Comenzando con un anticuerpo que tiene la
afinidad apropiada para el analito objetivo (anticuerpo
antianalito), puede prepararse y seleccionarse un anticuerpo
antiidiotípico que tenga i) afinidad alta por el anticuerpo
antianalito y ii) que compita con el antígeno objetivo de manera que
se excluyan mutuamente para la unión al anticuerpo antianalito.
Se describe en este documento el desarrollo de un
inmunoensayo enzimático competitivo para proteína
C-reactiva humana basado en el uso de anticuerpos
antiidiotípicos que tienen una afinidad mayor que PCR para un
anticuerpo anti-PCR. La invención incluye dos
novedosos inmunomateriales. El primero es un anticuerpo monoclonal
PCR antihumano de afinidad relativamente baja,
CRP5-23, que tiene la propiedad adicional muy usada
de que su interacción con PCR es insensible (K_{D} difiere en
menos de un factor, de dos si [Ca^{++}] varía de 0 a 1 mM) a
calcio ionizado. La conformación de PCR es dependiente de calcio y
el hecho de que la unión de anticuerpo y PCR no sea tan
dependiente, es útil y de hecho ventajosa. Como las muestras
biológicas que contienen el antígeno, PCR, pueden tener variados
los niveles de calcio, la falta de sensibilidad de unión es
beneficiosa en un inmunoensayo para PCR.
El segundo inmunomaterial es un anticuerpo
antiidiotípico elevado frente CRP5-23 y seleccionado
por su habilidad para competir con PRC humana por la unión a
CRP5-23, de modo que la unión de PCR y el anticuerpo
antiidiotipo a CRP5-23 se excluyen mutuamente. Se
ha depositado un hibridoma capaz de producir dicho anticuerpo
antiidiotípico con el ATCC y se la ha dado la denominación
PTA-1353.
La presente invención proporciona un
procedimiento para llevar a cabo un inmunoensayo competitivo para
detectar proteína C-reactiva que comprende: poner en
contacto una muestra con un anticuerpo de proteína
C-reactiva antihumano inmovilizado que tiene una
afinidad para PCR que es aproximadamente 10^{-7} M y un anticuerpo
antiidiotípico marcado, que es capaz de unirse a
CRP5-23 (ATCC PTA-1354) con afinidad
relativamente alta (K_{d} < 10^{-8} M) en el que se excluyen
mutuamente la unión a CRP5-23 (ATCC
PTA-1354) y la unión de la proteína
C-reactiva, o poner en contacto una muestra con un
anticuerpo antiidiotípico inmovilizado, que sea capaz de unirse a
CRP5-23 (ATCC PTA-1354) con afinidad
relativamente alta (K_{d} < 10^{-8} M) en el que se excluyen
mutuamente la unión a CRP5-23 (ATCC
PTA-1354) y la unión de la proteína
C-reactiva y un anticuerpo de proteína
C-reactiva antihumana marcado que tiene una afinidad
para PCR de aproximadamente 10^{-7} M; detectar el marcador; y
correlacionar la detección del marcador con la cantidad de proteína
C-reactiva de la muestra.
Preferentemente, el anticuerpo de proteína
C-reactiva antihumano usado en la presente invención
es CRP5-23 (ATCC PTA-1354) y el
anticuerpo antiidiotípico es capaz de unirse a
CRP5-23 (ATCC PTA-1354).
La presente invención proporciona también un
equipo para un inmunoensayo competitivo que comprende: un primer
anticuerpo en el que dicho primer anticuerpo es un anticuerpo de
proteína C-reactiva que tiene una afinidad para PCR
de aproximadamente 10^{-7} M y un segundo anticuerpo en el que
dicho segundo anticuerpo es un anticuerpo antiidiotípico capaz de
unirse a dicho primer anticuerpo.
La presente invención proporciona también una
línea celular de hibridoma, identificada como
CRP5-23 (ATCC PTA-1354), capaz de
producir un anticuerpo de proteína C-reactiva
antihumana de baja afinidad. La invención proporciona también un
anticuerpo antiidiotípico elevado frente a un anticuerpo de proteína
C-reactiva antihumano de baja afinidad que es capaz
de unirse a CRP5-23 (ATCC PTA-1354)
con afinidad relativamente alta (K_{d} < 10^{-8} M) en el
que se excluyen mutuamente la unión a CRP5-23 (ATCC
PTA-1354) y la unión de la proteína
C-reactiva.
La presente invención proporciona una línea
celular de hibridoma más, identificada como
C23id2-6.3 (ATCC PTA-1353), capaz
de producir anticuerpo antiidiotípico.
Al menos dos patentes de EE.UU. concedidas
anteriormente describen inmunoensayos que usan anticuerpos
antiidiotípicos: patente de EE.UU. nº 4.828.981, concedida el 9 de
mayo de 1989 y patente de EE.UU. nº 5.219.730, concedida el 15 de
junio de 1993.
Figura 1: muestra un gráfico que representa la
estimación de las constantes de afinidad para perfiles de
competición de anticuerpos antiPCR y PCR soluble en ELISA. Se
muestran los perfiles de competición de cinco anticuerpos para PCR
que exhiben un intervalo de afinidades determinado por la
concentración de PCR que produce una reducción de 50% de la
absorbancia máxima. El valor de afinidad nominal para
CPR5-10 es 0,4 nM y el valor de afinidad nominal
para CPR5-23 es 0,4 \muM.
Figura 2: representa las dos presentaciones en
las que pueden configurarse los inmunoensayos competitivos usando
un anticuerpo antiPCR de baja afinidad y su correspondiente
anticuerpo antiidiotípico. En la presentación 1 (fig. 2A), el
anticuerpo antiidiotípico C23id2-6.3, que sirve como
un sustituto de PCR, se inmoviliza en la superficie de una placa de
microtítulo plástica. El anticuerpo monoclonal antiPCR
HRP-conjugado CRP5-23, se añade a
lo largo del pocillo con la muestra que contiene PCR. La cantidad de
PCR se refleja en última instancia en la cantidad de
HRP-CRP5-23 que se une al anticuerpo
antiidiotípico inmovilizado. En la presentación 2 (fig. 2B), el
anticuerpo monoclonal CRP5-23 se inmoviliza y el
anticuerpo antiidiotípico HRP-conjugado compite con
PCR en la muestra para los sitios de unión de
CRP5-23.
Figura 3: curvas dosis respuesta de PCR para cada
presentación en placas de microtítulo convencionales. Ambas
presentaciones exhiben curvas dosis respuesta que descienden con
aumento de concentraciones de PCR y la curva dosis respuesta se
sitúa en el intervalo relevante clínicamente para cada ensayo. La
presentación 1 se representa en (A); la presentación 2 en (B). La
absorbancia a 414 nm refleja la cantidad de actividad HRP
detectable. En (A), los rombos cerrados definen la curva dosis
respuesta obtenida con CRP5-23 inmovilizado y
C23id2-6.3 HRP-marcado; los
cuadrados cerrados definen la respuesta si CRP5-23
se sustituye por C23id2-6.3, como control. En (B),
los cuadrados cerrados definen la curva
dosis-respuesta obtenida con
C23id2-6.3 inmovilizado y CRP5-23
HRP-marcado; los rombos cerrados definen la curva
dosis respuesta si C23id2-6.3 se sustituye por
CRP5-23, como control. Las barras de error indican
la desviación media y estándar de duplicados.
Figura 4: Curvas dosis-respuesta
de PCR de las presentaciones 1 y 2 en inmunoensayos de capa fina
que usan marcadores moteados. En cada presentación se incorpora el
anticuerpo inmovilizado en una capa seca fina mediante
procedimientos de recubrimiento bien conocidos en la técnica. El
reactivo HRP-marcado se mezcló con la muestra que
contiene PCR y se manchó con la mezcla el centro de la capa fina.
Después de cinco minutos de incubación, la capa fina se lavó
mediante adición controlada de fluido de lavado para conducir los
elementos sin unir a los márgenes de la zona de incubación. La
fracción unida (actividad HRP) se midió mediante adición simultánea
de peróxido cuyo color inicial se desarrolló a partir de un tinte
incorporado anteriormente en la capa fina. La velocidad máxima de
desarrollo de color (V_{máx}) se determinó como una función de
[PCR]. La presentación 1 se presenta en cuadrados cerrados; la
presentación 2 en círculos cerrados.
Figura 5: Curvas dosis-respuesta
de PCR en inmunoensayos de capa fina que usan marcadores
incorporados mediante impresión por chorro de tinta. La
presentación 1 se muestra en cuadrados cerrados; la presentación 2
en rombos cerrados.
Figura 6: Curvas dosis-respuesta
de PCR en inmunoensayos de capa fina que usan marcadores
incorporados mediante impresión por huecograbado. Los
HRP-conjugados se incorporaron mediante impresión
por huecograbado en cubiertas de capa fina en inmuno absorción que
contienen el anticuerpo complementario inmovilizado. Se manchan con
las muestras de suero que contienen PCR a diversas concentraciones,
las cubiertas preparadas de cada presentación. Después de cinco
minutos de incubación, la capa fina se lavó mediante la adición
controlada de fluido de lavado para conducir los elementos sin unir
a los márgenes de la zona de incubación. La fracción unida
(actividad HRP) se midió mediante adición simultánea de peróxido
cuyo color inicial se desarrolló a partir de un tinte incorporado
anteriormente en la capa fina. La velocidad máxima de desarrollo de
color (V_{máx}) se determinó como una función de [PCR]. La
presentación 1 se presenta en círculos cerrados; la presentación 2
en cuadrados cerrados.
Figura 7: Curva dosis-respuesta
de PCR de inmunoensayos configurados para el sistema analizador de
inmunoensayos automatizado VITROS® ECi. En estas variaciones el
componente inmovilizado se conjugó con biotina y se presentó
inicialmente como un componente soluble. Se añadieron 50 \mul del
reactivo biotinilado al pocillo cubierto con estreptavidina tras la
adición de 40 \mul de la muestra que contiene PCR y antes de la
adición de 50 \mul del reactivo HRP-conjugado.
Después de una incubación de 8 minutos, se lavó el pocillo
exhaustivamente y se detectó la actividad HRP asociada al pocillo
por medio de un sustrato de luminiscencia química. La presentación 1
se representa en (A); la presentación 2 en (B).
El anticuerpo antiidiotípico, como se usa en este
documento, es, por definición, un anticuerpo que se une al dominio
V_{H} y/o V_{L} del anticuerpo relacionado, en este caso
CRP5-23. En este ejemplo, el antiidiotipo tiene la
propiedad adicional de que se excluyen mutuamente su unión a su
anticuerpo relacionado y la unión al analito PCR.
Una "muestra" como se usa en este documento,
se refiere a cualquier sustancia que pueda contener el analito de
interés. Una muestra puede ser fluido biológico, tal como sangre
completa o componentes de sangre completa que incluyen células de
la sangre rojas, células de la sangre blancas, plaquetas, suero y
plasma, ascitis, orina, fluido cerebroespinal y otros
constituyentes del cuerpo que puedan contener el analito de
interés. Opcionalmente, las muestras pueden obtenerse de agua,
tierra y vegetación.
Un inmunoensayo competitivo se refiere a un
inmunoensayo que se diseña de modo que el analito a medir y una
molécula detectora marcada compiten por un número limitado de sitios
de unión que se excluyen mutuamente. En estos tipos de
inmunoensayos, la abundancia del analito está inversamente
relacionada con la unión de la molécula detectora.
El ensayo puede llevarse a cabo usando cualquier
enzima marcada que pueda acompañar a la molécula detectora para
formar una molécula detectora marcada. Son marcadores preferidos
enzimas tales como oxidasas, por ejemplo, glucosa oxidasa,
peroxidasas, por ejemplo, peroxidasa de rábano (HPR), fosfatasa
alcalina y galactosidasas.
Está dentro de la capacidad del experto normal,
por ejemplo un trabajador de química clínica, determinar un
sustrato adecuado para un marcador dado. El sustrato puede ser un
material que actúe directamente sobre la enzima marcada o un
material que esté implicado en una serie de reacciones que impliquen
reacción enzimática del marcador.
Otros marcadores que pueden usarse eficazmente en
la invención son: marcadores fluorescentes, por ejemplo,
fluoresceína, dansilo; marcadores de luminiscencia química y
marcadores radioactivos que incluyen, por ejemplo, I^{125} o
C^{14}.
La eficacia y ventajas de la invención se
ilustran además mediante los ejemplos siguientes.
El intervalo de concentración de la proteína
C-reactiva se encuentra en el suero humano desde un
valor normal de menos de 5 mg/l (40 nM) a mayor de 300 mg/l (2,6
\muM). Para crear un inmunoensayo competitivo adecuado para PCR
se requiere un anticuerpo monoclonal que tenga una Kd para PCR
dentro del mismo intervalo de concentración, que es, entre 40 nM y
2,6 \muM. Los anticuerpos monoclonales para PCR se generaron
siguiendo la inmunización de ratones CAF1 con conjugados
PCR-hemocianina de Limulus y registrados por la
unión a PCR mediante ELISA. Los cultivos reactivos de PCR
resultantes se clonaron y se midieron sus anticuerpos segregados
mediante afinidad para PCR usando una técnica ELISA competitiva. Los
cultivos de anticuerpos se titularon inicialmente en una placa
ELISA de PCR para determinar la concentración a la cual el valor de
absorbancia máxima alcanza una meseta. La concentración mínima a la
cual tiene lugar la meseta de absorbancia máxima se usó en una
ELISA competitiva para asegurar que la concentración de anticuerpo
está limitada. PCR soluble en varias concentraciones se mezcló con
muestra de anticuerpo aplicándose entonces en una placa de ELISA
para generar un perfil de inhibición. La concentración que produjo
50% reducción del valor de absorbancia máxima se aproxima a la Kd
de la interacción anticuerpo: PCR. La figura 1 ilustra las medidas
de afinidad de diversos anticuerpos derivados de sus perfiles de
inhibición. El anticuerpo CRP5-23 (IgGl, x) mostró
una Kd de 0,4 \muM, lo que cumple con el primer criterio esencial
(afinidad relativamente baja para el analito) para crear un
inmunoensayo competitivo para PCR.
Se inmunizaron los ratones CAF1 con anticuerpo
CRP5-23 conjugado con hemocianina de Limulus. Se
sacrificaron los ratones y los esplenocitos obtenidos de los ratones
inmunizados se fusionaron con células de mieloma
SP2/0-Ag14. Los hibridomas resultantes se
registraron inicialmente mediante ELISA convencional para la
secreción de anticuerpo que se unió a fragmentos Fab inmovilizados
preparados a partir de CRP5-23. Este registro
definió una población de anticuerpos con reactividad nominal para el
fragmento Fab de CRP5-23.
Se llevó a cabo una selección más para
identificar aquellos anticuerpos con propiedades esenciales para
inmunoensayo competitivo. El criterio usado para seleccionar un
anticuerpo antiidiotípico adecuado fue:
- 1.
- debería unirse a CRP5-23 con afinidad relativamente alta (K_{d} < 10^{-8} M), y
- 2.
- su unión a CRP5-23 debería excluirse mutuamente con la unión del analito, PCR.
Se volvieron a registrar los clones positivos
usando resonancia de plasmón superficial usando un instrumento
Biacore para medir la afinidad del anticuerpo antiidiotípico para
CRP5-23 (como se refleja en su falta de absorción)
y la exclusividad mutua de unión. La IgG(Fc)
anti-ratón de conejo se inmovilizó en la superficie
del biosensor y se usó para capturar anticuerpos antiidiotípicos de
sobrenadante de cultivos de hibridoma. Los fragmentos Fab de
CRP5-23 a 0,2 nM solos y en presencia de PCR 0,9 nM
se inyectaron sobre la superficie del anticuerpo antiidiotípico
inmovilizado y se comparó la acumulación de masa relativa. Un
anticuerpo antiidiotipo, C23id2-6.3 (IgGl, x), está
dentro de nuestro criterio para un anticuerpo antiidiotípico. Se
une al fragmento Fab de CRP5-23 con afinidad alta
aparentemente como se indica por su falta de absorción, muy lenta
desde la superficie del biosensor y su unión se inhibió
aproximadamente 33% en presencia de la concentración relativamente
baja de PCR usada como competidor.
Se desarrollaron dos versiones de presentación
ELISA basadas en inmunoensayos competitivos usando el anticuerpo
anti-PCR de CPR5-23 y su
antiidiotipo C23id2-6.3 junto con sus parejas
conjugadas HRP. Las dos presentaciones ELISA se ilustraron en la
figura 2 y las curvas dosis-respuesta
correspondientes para PCR se presentan en la figura 3. Como se
representó en la figura, la presentación 1 consiste en el anticuerpo
antiidiotípico inmovilizado en la superficie de la placa y el
anticuerpo anti-PCR HRP-marcado que
compite con PCR soluble por los sitios en el anticuerpo
antiidiotípico inmovilizado. La presentación 2 usa orientación
opuesta de reactivos en la que el anticuerpo anti PCR se inmoviliza
mientras que el anticuerpo antiidiotípico
HRP-marcado y PCR en solución compiten por los
sitios de antiPCR en la placa. Los procedimientos ELISA estándar
fueron seguidos por anticuerpo inmovilizado, bloqueo de sitios no
específicos, marcadores titulados y por generación y detección de
la señal. Se observaron disminuciones de las curvas
dosis-respuesta con el aumento de concentraciones
de PCR usando ambas presentaciones, como se
ilustró.
ilustró.
Habiendo demostrado que estos inmunomateriales
trabajan bien en presentaciones ELISA, examinamos su utilidad en
presentaciones de capa seca. Se hicieron para cada presentación
cubiertas de inmuno absorción. Las cubiertas de la presentación 1
consistían en anticuerpo antiidiotípico C23id2-6.3
inmovilizado en lechos y cubierto tanto en el receptor como en las
capas en extensión. Las cubiertas se evaluaron después añadiendo
anticuerpo CRP5-23 anti-PCR HRP-
marcado a muestras de suero y se pusieron en analizador VITROS® 250
usando procedimientos de inmuno absorción estándar. Las cubiertas de
la presentación 2 se fabricaron y evaluaron de forma similar
excepto en que ellas constaban de anticuerpo
anti-PCR CRP5-23 inmovilizado en
lechos y se añadió anticuerpo antiidiotípico marcado HRP a cada
muestra. La figura 4 ilustra un ejemplo para cada presentación de
una curva dosis-respuesta para PCR. Ambas
presentaciones muestran curvas dosis-respuesta
descendientes con incremento de las concentraciones de PCR y las
curvas disminuyen en todo el intervalo relevante clínicamente para
PCR.
Para demostrar la utilidad de estos
inmunomateriales en capa seca, se incorporaron los marcadores HRP
en ambas presentaciones recubiertas usando un procedimiento de
impresión por chorro de tinta. Para la presentación 1 se aplicó
CRP5-23 HRP-conjugado en una capa
seca recubierta que contenía C23id2-6.3
inmovilizado. Su concentración nominal tras rehumedecer con 10
\mul de una muestra de suero fue IgG 2,5 nM. De modo similar, se
aplicó C23id2-6.3 HRP-conjugado en
la capa seca recubierta que contenía CRP5-23
inmovilizado hasta aproximadamente una concentración final,
rehumedeciendo con 10 \mul de una muestra de suero, de IgG 0,5 nM.
Se permitió que se secaran las cubiertas impresas con chorro de
tinta, después se evaluaron muestras de suero a diversas
concentraciones de PCR, como ensayos de inmuno absorción en el
analizador VITROS® 250. Ambos formatos produjeron curvas
dosis-respuesta descendientes con incremento de
concentraciones de PCR, como muestra la figura 5.
Se describe un procedimiento para la fabricación
de esta capa seca. Se preparó una cubierta de inmuno absorción
completa como se describió anteriormente para la presentación 1. Se
incorporó después el marcador HRP anti-PCR en la
capa seca usando el procedimiento de impresión en cilindro por
huecograbado en inmuno absorción. La máquina que fabricó la
cubierta por completo la cortó, montó y probó en un analizador
VITROS® 250 con muestras con base de suero de varias concentraciones
de PCR. La curva dosis respuesta descendiente resultante con
incremento de concentración de PCR puede usarse para medir valores
de PCR de muestras desconocidas dentro del intervalo del analito
para PCR sin dilución o pretratamiento (véase figura 6).
Para la presentación 1, se conjugó
CRP5-23.1 con HRP y C23id2-6.3 se
conjugó con biotina mediante procedimientos convencionales. Se
generó una curva dosis-respuesta, representada en la
figura 7A, usando muestras con concentraciones de PCR que varían de
0,1 a 1.000 mg/l. Se presentaron datos similares para la
presentación 2, en la figura 7B.
Algunas ventajas que se vieron en inmunoensayos
elaborados con los inmunomateriales de la presente invención
son:
- 1.
- Inmunoensayos competitivos adaptados fácilmente a una variedad de presentaciones;
- 2.
- Intervalo analítico: el intervalo analítico está desviado aproximadamente dos órdenes de magnitud y está dentro del intervalo útil conocido de concentraciones de PCR en suero humano. El intervalo analítico puede ser sutilmente reposicionado mediante las concentraciones de los componentes primarios y la selección de qué componente se inmoviliza y cuál es móvil;
- 3.
- Versatilidad: estos ensayos pueden configurarse por más de un camino. Dos ejemplos de configuraciones contempladas en la presente invención son:
- i.
- con CRP5-23 inmovilizado y el conjugado HRP del anticuerpo antiidiotípico móvil, y
- ii.
- el anticuerpo antiidiotípico inmovilizado y el conjugado HRP de CRP5-23 móvil;
- 4.
- Dilución: no se requiere dilución; sin embargo, sería deseable dilución por otros motivos en inmunomateriales similares que pueden seleccionarse para contener la reducción en la concentración de analito;
- 5.
- Requisitos de materiales pequeños: si algunos de los procedimientos alternativos requieren dilución sustancial o cantidades grandes indeseables de inmunomateriales, estas presentaciones requieren sólo 1-10 nM de cada (en el orden de microgramos por ensayo); y
- 6.
- Reducción de susceptibilidad a actividad heterófila en muestras de pacientes: anticuerpos antiPCR y antiidiotípicos pueden seleccionarse o modificarse de modo que sean de diferentes subclases de cadena pesada.
Claims (8)
1. Un procedimiento para llevar a cabo un
inmunoensayo competitivo para detectar proteína
C-reactiva que comprende:
i. o bien poner en contacto una muestra con un
anticuerpo de proteína C-reactiva antihumano
inmovilizado que tiene una afinidad para PCR que es aproximadamente
10^{-7} M y un anticuerpo antiidiotípico marcado, que es capaz de
unirse a CRP5-23 (ATCC PTA-1354) con
afinidad relativamente alta (K_{d} < 10^{-8} M) en el que se
excluyen mutuamente la unión a CRP5-23 (ATCC
PTA-1354) y la unión de la proteína
C-reactiva
o poner en contacto una muestra con un anticuerpo
antiidiotípico inmovilizado, que sea capaz de unirse a
CRP5-23 (ATCC PTA-1354) con
afinidad relativamente alta (K_{d} < 10^{-8} M) en el que se
excluyen mutuamente la unión a CRP5-23 (ATCC
PTA-1354) y la unión de la proteína
C-reactiva y un anticuerpo de proteína
C-reactiva antihumana marcado que tiene una
afinidad para PCR de aproximadamente 10^{-7} M;
ii. detectar el marcador; y
iii. correlacionar la detección del marcador con
la cantidad de proteína C-reactiva de la
muestra.
2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que el anticuerpo de proteína C-reactiva
anti-humana es CRP5-23 (ATCC
PTA-1354).
3. El procedimiento de la reivindicación 2 en el
que el anticuerpo antiidiotípico es capaz de unirse a
CRP5-23 (ATCC PTA-1354).
4. Un equipo para un inmunoensayo competitivo que
comprende:
un primer anticuerpo en el que dicho primer
anticuerpo es un anticuerpo de proteína C-reactiva
anti-humana que tiene una afinidad para PCR que es
aproximadamente 10^{-7} M; y
un segundo anticuerpo en el que dicho segundo
anticuerpo es un anticuerpo antiidiotípico capaz de unirse a dicho
primer anticuerpo.
5. Una línea celular de hibridoma, identificada
como CRP5-23 (ATCC PTA-1354), capaz
de producir un anticuerpo de proteína C-reactiva
anti-humana de baja afinidad.
6. Un anticuerpo producido por el hibridoma de la
reivindicación 5.
7. Un anticuerpo antiidiotípico aumentado frente
a un anticuerpo de proteína C-reactiva
anti-humana de baja afinidad que es capaz de unirse
a CRP5-23 (ATCC PTA-1354) con
afinidad relativamente alta (K_{d} < 10^{-8} M) en el que se
excluyen mutuamente la unión a CRP5-23 (ATCC
PTA-1354) y la unión de la proteína
C-reactiva.
8. Una línea celular de hibridoma, identificada
como C23id2-6.3 (ATCC PTA-1353),
capaz de producir un anticuerpo antiidiotípico.
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