ES2235377T3 - Metodo y kit de inmunoensayo. - Google Patents
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Abstract
Método de inmunoensayo para determinar un analito adsorbido sobre una superficie o presente en una muestra líquida, que comprende unir dicho analito a una fase sólida, acoplar un marcador al analito, y detectar el marcador acoplado en dicha fase sólida, en el que se utiliza una combinación de un marcador y de medios de detección que es capaz de producir un precipitado sobre una fase sólida que lleva el marcador, y se detecta la unión del analito a la fase sólida sin llevar a cabo manipulaciones tales como enjuague, secado o aclarado, determinando in situ el cambio de la masa superficial de dicha fase sólida debido a la formación de dicho precipitado.
Description
Método y kit de inmunoensayo.
El ámbito de la invención se refiere al sector de
los inmunoensayos para determinar un analito, especialmente un
analito adsorbido sobre una superficie, o analito tal como se
presenta en una muestra líquida en solución o en un sitio particular
de la misma, tal como en una superficie específica.
Más particularmente, la invención se refiere a
ensayos de inmunoabsorbencia (ELISA) relacionados por enzimas, para
determinar la concentración de un analito en una muestra líquida,
incluyendo su concentración en el volumen de la muestra líquida o su
concentración en una superficie particular. Específicamente, la
presente invención da a conocer nuevos métodos de inmunoensayo y
kits específicamente adaptados para llevar a cabo estos nuevos
métodos de inmunoensayo.
Se utilizan ampliamente los inmunoensayos, tales
como ELISA, para la determinación cualitativa o, principalmente,
cuantitativa, de una variedad casi ilimitada de sustancias
orgánicas, tanto de origen natural como compuestos químicos
sintéticos, tales como péptidos, proteínas, enzimas, hormonas,
vitaminas, medicamentos, hidratos de carbono, etc., para varios
objetivos, tales como particularmente, para finalidad de
diagnóstico, y también para aplicaciones forenses, control de
calidad de los alimentos, y generalmente, para cualquier propósito
analítico. En la presente invención, todas las sustancias de este
tipo que se deben analizar serán designadas en general como
analitos.
Existen muchas variantes diferentes de los
métodos ELISA. La descripción que se da a continuación tiene como
objetivo describir una técnica típica de ELISA. No pretende ser
completa ni se debe interpretar de ningún modo como restrictiva del
ámbito de la presente invención. Por ejemplo, en la siguiente
descripción, se describen los métodos ELISA que comprenden etapas
separadas de incubación de una muestra con un primer partícipe de
unión del analito, e incubando el producto de reacción formado con
un segundo partícipe de unión del analito (a continuación, los
partícipes de unión del analito se indican a veces como partícipes
de unión para el analito). Sin embargo, algunas realizaciones
existentes de ELISA no comprenden dichas etapas separadas de
incubación y permiten a los analitos reaccionar simultáneamente, o
con poca separación uno después del otro, en la misma y única etapa
de incubación, con sus primer y segundo partícipes de unión. Los
ELISA competitivos son otro ejemplo de las variantes de ELISA no
descritas detalladamente en la presente invención. El objeto de la
invención se aplica en principio a cualquiera y todas de las
variantes de ELISA, y a métodos de inmunoensayos similares que,
estrictamente hablando, no son métodos ELISA porque, por ejemplo, no
implican la utilización de una enzima.
En un ELISA típico, para detectar la presencia, o
medir la concentración, de un analito de interés, especialmente en
una muestra líquida, que puede ser un fluido corporal tal como
sangre, plasma, suero, orina, saliva, esputo, etc., la muestra está
en contacto con un primer partícipe de unión para el analito, y la
muestra y el partícipe de unión para el analito se incuban durante
un tiempo suficiente para permitir al analito contenido en la
muestra unirse con el partícipe de unión.
Un ejemplo típico de un partícipe de unión de
este tipo es un anticuerpo específico para el analito, por ejemplo,
un anticuerpo monoclonal con carácter especifico para el analito en
cuestión. Sin embargo, se pueden también aceptar otros tipos de
sustancias y estructuras como partícipe de unión. Por ejemplo, el
receptor natural del analito en cuestión podría ser útil como
partícipe de unión, y también otras sustancias y estructuras a las
que se puede unir el analito. Normalmente, el partícipe de unión
sería un partícipe específico de unión, aunque no es un
requerimiento. Incluso es posible trabajar sin un primer partícipe
de unión e inmovilizar (es decir, unir a una fase sólida) el analito
tanto directamente (por ejemplo, mediante adsorción) como a través
de una sustancia de enlace no específicamente de unión. Todas las
variantes de este tipo pretenden explícitamente estar incluidas en
el ámbito de esta invención. Las palabras "analito adsorbido sobre
una superficie", tal como se utiliza en la presente invención, se
refieren a cualquier método que resulta en acoplar o unir el analito
a una superficie.
Usualmente, se utiliza dicho primer partícipe de
unión en una forma inmovilizada, es decir, acoplado a una fase
sólida, tal como bolitas de poliestireno o la superficie interna del
recipiente de reacción (por ejemplo, un tubo de reacción o un
pocillo de una placa de microtitulación). Se puede adsorber
físicamente el partícipe de unión sobre la fase sólida o,
usualmente, se puede acoplar mediante enlace covalente. De acuerdo
con algunas realizaciones de ELISA, se acopla el partícipe de unión
utilizando un agente de acoplamiento adecuado, y en otras
realizaciones utilizando sustancias de unión apropiadas, tales como
biotina y (estrept)avidina. En algunas realizaciones de
ELISA, se lleva a cabo la inmovilización del partícipe de unión
después de la incubación de la muestra y del partícipe de unión,
permitiendo por lo tanto que la reacción entre el analito y el
partícipe de unión se produzca en la fase líquida. Para permitir su
inmovilización posterior, se puede aplicar dicho partícipe de unión
en una forma biotinilada. En este caso, se puede realizar la
inmovilización utilizando una fase sólida que comprende
(estrept)avidina.
Como resultado de esta primera reacción,
cualquier analito presente en la muestra estará unido a su partícipe
de unión y, por consiguiente, a la fase sólida. Usualmente después
de eliminar el líquido y lavar la fase sólida, se realizan las
etapas para hacer detectable el resultado. La fase sólida que lleva
acoplado al partícipe de unión y el analito, si existe, se pone en
contacto con un segundo partícipe de unión para el analito.
Nuevamente, un partícipe de unión específico es la norma, aunque no
se requiere estrictamente. Usualmente, este segundo partícipe de
unión comprende una etiqueta/marcador que permite su detección. Sin
embargo, en algunas realizaciones de ELISA se utiliza el segundo
partícipe de unión en forma no etiquetada y se etiqueta después de
su unión utilizando un partícipe de unión etiquetado para el segundo
partícipe de unión. Como ejemplo de ello, el segundo partícipe de
unión puede ser un anticuerpo de ratón (tanto policlonal como
monoclonal) frente al analito en cuestión, y después de su unión al
analito que se ha acoplado mediante su primer partícipe de unión a
la fase sólida, se utiliza un IgG de cabra
anti-ratón etiquetado para acoplar una etiqueta al
complejo inmovilizado.
En los métodos ELISA, el etiquetado consiste en
una enzima capaz de una conversión detectable de un sustrato, por
ejemplo, una peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante, capaz
de convertir, en presencia de peróxido de hidrógeno, un sustrato tal
como 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina, en un producto
coloreado.
Normalmente, después de que se haya acoplado el
reactivo etiquetado con la enzima al complejo inmovilizado, se lava
la fase sólida con el complejo unido a la misma antes de entrar en
la fase real de detección.
En la fase de detección, se añade la solución del
sustrato a la fase sólida con el complejo acoplado y se detecta la
conversión del sustrato, si existe. Para permitir una medición
cuantitativa del analito, se incuba la fase sólida con la solución
del sustrato durante un tiempo fijo, que debería ser suficientemente
largo para permitir una conversión enzimática sustancial del
sustrato a una sustancia coloreada. Después de terminar la reacción
de conversión del sustrato, se mide la intensidad de la coloración,
que es proporcional a la cantidad inmovilizada de la enzima, por
medios ópticos, tales como un fotómetro para medir la absorbancia a
una longitud de onda elegida, tal como 450 nm.
Una desventaja de las técnicas existentes de
ELISA es que las fases de adsorción y de detección, para asegurar la
sensibilidad del ensayo, tardan mucho tiempo para concentraciones
bajas del analito. La velocidad de adsorción del analito en la
superficie es proporcional a la concentración del analito en la
solución, y por lo tanto, llega a ser también muy baja, incluso en
sistemas dotados de buena agitación. Para permitir una medición
fiable de los analitos presentes en un líquido a una concentración
del orden de nanogramos o incluso de picogramos por ml, la fase de
adsorción puede requerir un tiempo de reacción de una a varias
horas.
Otra desventaja de las técnicas existentes de
ELISA es que no permiten medir concentraciones superficiales
extremadamente bajas de los analitos, tal como se tienen lugar en
la superficie de membranas biológicas (modelos).
Un objetivo de la presente invención es dar a
conocer una técnica de inmunoensayo, por ejemplo ELISA, modificada
que permite reducir el tiempo de incubación en la fase de adsorción
y/o de detección, o incrementar la sensibilidad del ensayo, o ambas
cosas.
Un objetivo adicional de la presente invención es
dar a conocer una técnica de inmunoensayo, por ejemplo ELISA,
modificada que permite medir las concentraciones del analito en una
superficie particular.
Otro objetivo de la presente invención es dar a
conocer productos específicamente adaptados para llevar a cabo las
técnicas de inmunoensayo modificadas de este tipo.
La invención pertenece a una modificación
fundamental del principio de análisis de los inmunoensayos, por
ejemplo ELISA, en la que se reemplaza la medición de la acumulación
del producto de enzima en la solución (fase voluminosa) por una
medición in situ de la acumulación del precipitado sobre una
superficie sólida. El ámbito de la invención implica la utilización
de un sistema que forma un precipitado, tal como una combinación de
enzima-sustrato que conduce a la formación de un
precipitado sobre una superficie sólida, y la medición de la masa
superficial, por ejemplo, mediante elipsometría u otras técnicas de
medición de la masa superficial.
Utilizando esta invención, se pueden determinar
concentraciones muy bajas del analito adsorbido sobre la superficie
sólida y se puede reducir sustancialmente la fase de adsorción a
partir del analito del líquido a la superficie. También, ya no se
requiere el largo tiempo acumulado para la concentración del
producto en la fase líquida voluminosa, y se reemplaza por una
adsorción de una capa fina de precipitado, de dimensiones
moleculares solamente, sobre la superficie sólida. Esta modificación
implica un gran incremento de la sensibilidad del ensayo y ofrece la
posibilidad de obtener tiempos de ensayo mucho más cortos. También
permite determinar concentraciones superficiales extremadamente
bajas tal como puede tener lugar en la superficie de membranas
biológicas (modelo).
La determinación de las concentraciones del
analito mediante la "inmunoprecipitación" es una técnica muy
conocida. Usualmente y de modo simple, el precipitado de los
agregados analito-anticuerpo, formados mediante este
método después de la adición del anticuerpo precipitante, se lleva a
sedimentar, se recoge y se pesa. A pesar de la precipitación pobre
cuando tanto el analito como el anticuerpo están presentes en gran
exceso, se ha mostrado que, bajo condiciones bien definidas, esta
técnica permite una interpretación cuantitativa de los datos (ver,
por ejemplo, la solicitud de la Patente Europea 0368452). En una
versión más sensible y más rápida de esta técnica, se añaden
partículas (látex) cubiertas con anticuerpo y se mide la formación
del agregado mediante la dispersión de luz. De este modo, se evita
la sedimentación lenta y se pueden completar las mediciones en
segundos. El presente método es fundamentalmente diferente de estas
técnicas. En dichas técnicas, el analito no se concentra en una
interfase sólido/líquido y la cantidad del precipitado no aumenta
continuamente con el tiempo, a medida que se produce mediante una
enzima. Debido a estos factores, y debido a la agregación
específica, las técnicas de este tipo tienen una sensibilidad
limitada y generalmente no permiten la medición de las
concentraciones del analito por debajo del rango de ng/ml.
Los métodos analíticos que implican una formación
dirigida por enzimas de un precipitado (coloreado) son conocidos de
por sí. Se conoce un método de este tipo, por ejemplo, en el sector
de la inmunocitoquímica. En este método conocido, para demostrar la
presencia y/o localización en varios tejidos de proteínas en
estudios histológicos, se determina una proteína específica en el
tejido produciendo primeramente secciones finas de tejido, después,
congelar el tejido o utilizar varias formas de fijación química, y
luego añadiendo anticuerpos que reconocen específicamente la
proteína y se unen a la misma. Se elimina el exceso de los
anticuerpos y luego se añade un segundo anticuerpo unido a la
enzima, por ejemplo, un conjugado IgG-HRP. Después
de eliminar el exceso del conjugado, se añade un sustrato adecuado,
tal como 3,3'-diaminobenzidina (DAB). Si la proteína
específica está presente en el tejido, tendrá lugar un manchado
localizado debido a la formación de un precipitado derivado de
DAB.
Sin embargo, la presente invención no da a
conocer la localización ni la detección de proteínas en el tejido
pero sí la detección y la medición del analito (concentraciones)
adsorbido en superficies sólidas o presente en soluciones.
Adicionalmente, el ámbito de la invención aplica una medición
(preferentemente cuantitativa) de masa superficial (en el rango de
ng/cm^{2}) en cambio, en dicho método inmunocitoquímico conocido,
se obtienen resultados cualitativos, usualmente mediante inspección
visual o microscópica. En algunos estudios, se ha medido la
intensidad de las manchas mediante la aplicación de mediciones de
densidad óptica, pero nunca se ha combinado la técnica con otra
técnica para la medición cuantitativa de la masa superficial, tal
como la elipsometría u otras. Esto sería también muy difícil de
realizar porque el espesor de las secciones de tejido (en
micrómetros) está en otro orden de magnitud respecto al espesor de
las capas del precipitado (en nanómetros) medidas con el método de
la presente invención.
La técnica anterior sugiere la utilización de
inmunoensayos basados en interferencia óptica sobre superficies
receptivas ópticamente activas y especialmente preparadas, cubiertas
con capas delgadas de óxido, de nitruro o poliméricas. Utilizando un
recubrimiento previo de este tipo, la adsorción adicional de una
capa de precipitado resulta en cambios de color visualmente
detectables. Se han presentado aplicaciones de este tipo en la
Patente USA 5.418.136. La Patente Europea 0546222 describe un
inmunoensayo basado en interferencia óptica sobre una superficie de
sustrato unido a un analito, en el que un marcador enzimático está
unido al analito que a su vez está unido a la superficie y en el que
se forma un precipitado sobre la superficie como resultado de una
reacción entre el marcador y un agente de precipitación. Después de
lavar y secar la superficie, se detecta el precipitado para indicar
la presencia del analito sobre la superficie. A parte de la
detección visual de la formación del precipitado, se aplica también,
en estos métodos de la técnica anterior, la medición del precipitado
mediante elipsometría. Sin embargo, las varias etapas de aclarado
y/o secado requeridas en estas técnicas evitan la alta sensibilidad
que se puede obtener mediante mediciones in situ. Para la
detección de concentraciones muy bajas del analito en fluidos
biológicos como plasma, suero, sangre, leche u orina, la masa
específicamente adsorbida de otras sustancias voluminosas, tal como
albúmina, excederá a menudo las pequeñas cantidades del precipitado
adsorbido, y el aclarado o el secado provocará cambios en la masa
superficial sobrepasando en mucho el efecto específico. La medición
in situ ofrece también la posibilidad de un ELISA en una
etapa, en el que se añaden conjuntamente el analito, el conjugado y
el sustrato cromogénico, sin la intervención de las etapas de lavado
o secado. En un ELISA normal, esto sería imposible porque la
producción del color mediante el exceso de un conjugado no unido
sobrepasaría en mucho la producción de color de la pequeña cantidad
del conjugado unido al analito sobre la superficie. Por el
contrario, la técnica presentada mide solamente el precipitado
producido mediante el conjugado unido a la superficie. Además, a una
sensibilidad más alta, la presente utilización de medición in
situ permite también un análisis más rápido, porque se evitan
las largas etapas de aclarado y/o secado, con mediciones separadas
posteriores del precipitado.
Otra diferencia fundamental con las técnicas
descritas en las dos patentes mencionadas es que no se requieren
superficies ópticamente activas especialmente preparadas o
superficies cubiertas con polímero de acuerdo con la presente
invención. Las superficies de este tipo son caras, al igual que las
láminas ópticamente activas utilizadas en técnicas basadas en la
resonancia de plasmones superficiales (SPR), en cambio, se pueden
utilizar en el presente método superficies de reflexión
(desechables) baratas tales como obleas de silicona o láminas de
vidrio pulverizadas con cromo.
La técnica anterior sugiere la utilización de
elipsometría amplificada como medio de incrementar la sensibilidad
de las mediciones de adsorción de proteína [5]. En el método de
interés de la técnica anterior, se ha aumentado la masa del
anticuerpo etiquetado mediante su acoplamiento con partículas de
sílice. Se han utilizado también partículas de oro cubiertas con
anticuerpos, principalmente combinados con microscopía electrónica
en estudios de localización [6]. Otra técnica del sector para la
amplificación de la masa superficial utiliza biotinilados o
liposomas cubiertos con analitos [7, 8].
Estas técnicas son fundamentalmente diferentes
del ámbito de la invención porque no miden una acumulación continua
del precipitado por molécula etiquetada, sino que utilizan
simplemente marcadores más pesados. Debido a su difusión más lenta
hacia la superficie, la ventaja de una mejor detectabilidad de
marcadores pesados de este tipo debe ser equilibrada frente a su
adsorción más lenta, y esto obstaculiza la utilización de estos
métodos para ensayos rápidos.
La invención da a conocer un método de
inmunoensayo para determinar un analito adsorbido sobre una
superficie o presente en una muestra líquida, que comprende unir
dicho analito a una fase sólida, acoplar un marcador al analito, y
detectar el marcador acoplado en dicha fase sólida, en el que se
utiliza una combinación de un marcador y de medios de detección que
es capaz de producir un precipitado sobre una fase sólida que lleva
el marcador y se detecta la unión del analito a la fase sólida sin
llevar a cabo manipulaciones tales como enjuague, secado o aclarado
determinando in situ el cambio de la masa superficial de
dicha fase sólida debido a la formación de dicho precipitado.
Adicionalmente, la invención da a conocer un
conjunto o kit para llevar a cabo un método de inmunoensayo para
determinar un analito adsorbido sobre una superficie o presente en
una muestra líquida, en el que el kit comprende, por lo menos,
medios específicamente adaptados para llevar a cabo el método de
acuerdo con la presente invención.
La figura muestra los resultados de una medición
elipsométrica ayudada por un precipitado, de una proteína de unión
a un ácido graso (a) y anexina V (b) sobre discos de silicona
cubiertos con PVC.
La presente invención da a conocer, en un primer
aspecto, un método de inmunoensayo para determinar un analito
adsorbido sobre una superficie o presente en una muestra líquida,
que comprende unir dicho analito a una fase sólida, acoplar un
marcador al analito, y detectar el marcador acoplado en dicha fase
sólida, en el que se utiliza una combinación de un marcador y de
medios de detección que es capaz de producir un precipitado sobre
una fase sólida que lleva el marcador y se detecta la unión del
analito a la fase sólida in situ mediante la determinación de
la masa superficial de dicha fase sólida debido a la formación de
dicho precipitado.
El término "detección in situ"
pretende reflejar la determinación de un cambio en la masa
superficial a medida que se forma el precipitado. En otras palabras,
no se llevan a cabo enjuague, secado, aclarado ni otras
manipulaciones que puedan conducir a errores en el resultado medido
debido a que efectúan un cambio adicional en la masa superficial.
Además, la detección in situ permite, de modo ventajoso, una
medición de la formación del precipitado mediante la enzima unida a
la superficie, incluso en presencia de la conversión del sustrato
mediante el exceso de enzima en la fase de solución (ELISA en una
etapa).
Tal como se ha indicado anteriormente en la
sección de antecedentes de la invención, la invención pertenece a
una gran variedad de diferentes métodos de inmunoensayos. La mayoría
de ellos tienen en común que el analito, si está presente en la
muestra, está unido a la fase sólida a través del intermediario de
un partícipe de unión del analito, usualmente un partícipe
específico de unión, tal como un anticuerpo que se une
específicamente con dicho analito. Sin embargo, en algunas
realizaciones se puede unir el analito directamente a la fase
sólida, mediante adsorción, o por medios de unión no
específicos.
Se puede acoplar previamente dicho partícipe de
unión, si se utiliza, a la fase sólida. Alternativamente, se une a
la fase sólida después de haber reaccionado con el analito, si está
presente.
Adicionalmente, la mayoría de las realizaciones
de los inmunoensayos tendrán en común la utilización de un segundo
partícipe de unión para acoplar un marcador al analito. Nuevamente,
el partícipe de unión, si se utiliza, será preferentemente un
partícipe específico de unión, tal como un anticuerpo
específicamente unido al analito.
Este segundo partícipe de unión del analito puede
llevar un marcador. Sin embargo, de modo alternativo, se transporta
el marcador mediante una sustancia capaz de unirse a dicho segundo
partícipe de unión del analito. Por ejemplo, si el segundo partícipe
de unión del analito es un anticuerpo monoclonal murino contra el
analito, se puede acoplar el marcador directamente a este anticuerpo
monoclonal, o alternativamente a un anticuerpo
anti-ratón Ig (es decir, un anticuerpo
específicamente unido a inmunoglobulinas murinas).
Se puede llevar a cabo el acoplamiento del
marcador al analito tanto simultáneamente con el acoplamiento del
analito a la fase sólida, como antes o después de la misma. En la
mayoría de los métodos de inmunoensayos, es preferente inmovilizar
primero el analito y solamente a posteriori unir el marcador
al analito inmovilizado.
Preferentemente, el método es un método
cuantitativo para determinar la concentración del analito en la
muestra. En otra realización preferente, el método objetivo es un
método cuantitativo para determinar la concentración del analito en
una superficie particular. La superficie en cuestión puede ser una
membrana biológica (modelo), es decir, la superficie de una membrana
celular, o una superficie artificial, por ejemplo, una superficie
artificial que pretende imitar una superficie de interés que se
lleva a cabo de modo natural, preferentemente depositada sobre una
superficie accesible y uniforme y que permite una interpretación
cuantitativa de la formación del precipitado. Sin embargo, la
invención no está restringida a los métodos cuantitativos y puede
ser útil para determinar cualitativamente la presencia de una
concentración extremadamente baja del analito en la muestra, tanto
en el volumen de la muestra como en un lugar particular, tal como
sobre una superficie particular.
Preferentemente, se determina el cambio de la
masa superficial de la fase sólida mediante elipsometría. Sin
embargo, la invención se extiende a otras técnicas para determinar
el cambio de la masa superficial de la fase sólida, tal como la
resonancia de plasmones superficiales y la fluorescencia de
reflexión interna total.
En las realizaciones más preferentes de la
invención, dicho marcador es una enzima y dichos medios de detección
comprenden un sustrato de dicha enzima. Preferentemente, el
inmunoensayo es un método ELISA. Preferentemente, se utiliza
peroxidasa de rábano picante como enzima y
3,3'-diaminobenzidina como sustrato. Sin embargo, el
sujeto de la invención se extiende a otras combinaciones de
enzima-sustrato capaces de producir un precipitado,
tales como fosfatasa alcalina como enzima y
5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato
y tetrazolio de nitroazul como sustrato. Adicionalmente, la
invención cubre cualquier otra combinación de marcador y de medios
de detección que es capaz de producir un precipitado sobre una fase
sólida que lleva dicho marcador. Por ejemplo, la formación de un
precipitado puede ser el resultado de nucleación, mediante el
crecimiento nucleado del metal, o partículas no metálicas, o el
resultado de reacciones en cadena o de polimerización de, por
ejemplo, hidrocarburos no saturados que se pueden polimerizar
mediante la exposición a la radiación ultravioleta, etc. Por
consiguiente, dicho marcador podría comprender un hidrocarburo no
saturado y dichos medios de detección una cantidad adicional del
mismo hidrocarburo o de otro diferente conjuntamente con los medios
para iniciar la polimerización (tal como radiación ultravioleta).
Alternativamente, dicho marcador podría comprender partículas
coloidales de un metal, por ejemplo, oro, plata, etc., o de un
compuesto no metálico, por ejemplo, selenio, telurio, carbono,
sílice, etc., mientras que dichos medios de detección comprenden una
fuente de una cantidad adicional del mismo o distinto metal o
compuesto no metálico, conjuntamente con medios (por ejemplo, agente
adecuado de reducción, tal como un compuesto de borohidrato, capaz
de liberar el metal de un compuesto químico que contiene dicho
metal) para promover el crecimiento de las partículas coloidales
utilizadas como marcador.
De acuerdo con la presente invención, es
preferente que se utilice una lámina de silicona como fase sólida.
Sin embargo, la invención se extiende a otras fases sólidas
adecuadas para la utilización de una técnica para determinar el
cambio de la masa superficial de la fase sólida, tal como una lámina
de vidrio pulverizada con cromo. En principio, la fase sólida puede
consistir en cualquier superficie de reflexión simple y barata, y no
requiere tratamiento previo como la deposición de capas especiales
ópticamente activas, tal como se ha descrito en la Patente USA
A-5418136.
La cantidad del analito que se adsorbe sobre las
superficies del sólido dependerá generalmente de las condiciones de
transporte (difusión y agitación) en el sistema. En los sistemas
usuales de flujo laminar, esto implica que las cantidades adsorbidas
pueden disminuir en la dirección más abajo de la corriente, porque
la capa límite del fluido se gasta progresivamente del analito. Esta
dependencia local de la cantidad del analito adsorbido puede
obstaculizar la descripción cuantitativa de la velocidad de
formación del precipitado, por ejemplo, si se mide primero el efecto
biológico de una cantidad pequeña de proteína adsorbida sobre una
membrana [4], entonces se mediría la cantidad de proteína
responsable de este efecto. Se ha descubierto que se puede superar
este problema realizando de modo cuantitativo el presente método
sobre las llamadas superficies accesibles y uniformes, es decir, con
condiciones de adsorción idénticas sobre toda la superficie.
Utilizando una superficie de este tipo, se puede relacionar el
efecto biológico con la cantidad adsorbida del analito, expresada
por unidad de área superficial. Se ha desarrollado una superficie
accesible de modo uniforme, un disco giratorio en la solución, y
permite la medición elipsométrica de la adsorción del analito sobre
su superficie [9]. Por consiguiente, la combinación con la
elipsometría sobre un disco giratorio es una realización preferente
de la presente invención.
Se puede detectar y cuantificar la adsorción de
analitos a partir de soluciones tampón y más generalmente la
acumulación de sustancias sólidas sobre superficies planas mediante
elipsometría. Esto es una técnica óptica que utiliza reflexión de la
luz monocromática contra la superficie de adsorción, cuya técnica
permite una medición cuantitativa de la adsorción del analito con un
límite de detección de 1-5 ng/cm^{2}.
Se coloca la superficie reflectante, en los
ejemplos de la presente invención una lámina de silicona pretratada,
por ejemplo, en una cubeta de cuarzo llena, por ejemplo, con 5 ml de
solución tampón. La luz monocromática de un láser de
He-Ne, con una longitud de onda de 632,8 nm, pasa
primero a través de un prisma de polarización (P) y luego a través
de una placa de cuarto de onda con su eje rápido a 45 grados del
plano de incidencia. Entonces la luz entra en la cubeta, se refleja
contra la lámina de silicona, sale de la cubeta, pasa a través de un
segundo prisma de polarización (A), y finalmente se detecta mediante
un fotodiodo. Las posiciones de (P) y (A) se ajustan por ordenador
de tal modo para mantener la intensidad de la luz resultante que
alcance el fotodiodo a un mínimo. Cuando una sustancia sólida se
adsorbe sobre la superficie reflectante, se cambian las posiciones
de (P) y (A) para mantener la intensidad mínima. Por consiguiente,
una adsorción de este tipo provocará un cambio en las posiciones del
"polarizador" (P) y el "analizador" (A). En el caso
especial de las láminas de silicona utilizadas como superficie
reflectante y de las sustancias orgánicas, tales como proteínas,
lípidos, azúcares o precipitados orgánicos como analitos de
adsorción, el cambio en la masa de la superficie adsorbida es
directamente proporcional al cambio en el polarizador. Se han
cortado las láminas utilizadas en los ejemplos a partir de obleas de
silicona (Wacker Chemitronic; tipo n, dopadas con fósforo). Se han
realizado las mediciones a temperatura ambiente (20ºC \pm 1ºC)
bajo agitación continua mediante un agitador giratorio. Se han
descrito el instrumento y el análisis de los datos en publicaciones
anteriores del grupo de los autores de la presente invención [1,
2].
En un experimento típico, se coloca la lámina
pretratada en la cubeta del elipsómetro y se realiza una lectura
nula (P0, A0). Luego, se añade la proteína que se debe analizar al
tampón y se lleva a adsorber sobre la lámina durante un tiempo
adecuado, por ejemplo 5 minutos. Para concentraciones muy bajas de
proteína, tal como se utiliza en la presente invención, la cantidad
de proteína adsorbida durante este periodo de tiempo permanece
inferior al límite de detección del elipsómetro, por lo tanto las
posiciones P0 y A0 permanecen esencialmente sin cambios. A
continuación, se enjuaga la cubeta con tampón fresco y se bloquea el
espacio de la superficie libre sobre la lámina mediante adsorción de
albúmina u otras proteínas voluminosas. Luego, se añade un conjugado
anticuerpo-peroxidasa de rábano picante (HRP) y se
lleva a adsorber durante un tiempo adecuado, por ejemplo dos
minutos. Nuevamente se enjuaga la cubeta y se añade una solución de
sustrato que contiene 3,3'-diaminobenzidina (DAB) y
H_{2}O_{2}. En sitios en los que se han unido las moléculas
conjugadas a la proteína adsorbida, se formará el precipitado DAB
mediante la acción enzimática de HRP. Debido a la conversión
continua de DAB, la masa superficial del precipitado será pronto
mucho más grande que la masa de la proteína original y será
detectable por elipsometría.
En otra configuración, con el objetivo de
determinar concentraciones muy bajas de la proteína, se descartan
las etapas de enjuague entre la adición del analito, conjugado y la
precipitación del sustrato y se añaden el analito, conjugado y el
sustrato DAB conjuntamente o en un tiempo corto de modo sucesivo. De
esta manera, se obtiene un ELISA de una etapa.
De acuerdo con la invención, se realiza
preferentemente la medición de la velocidad de formación del
precipitado sobre la superficie sólida mediante elipsometría. Sin
embargo, el principio del análisis de la presente invención se
podría aplicar igualmente a otras técnicas para una medición
cuantitativa de la masa superficial, tales como otras formas de
reflectometría que no sean elipsometría, resonancia de plasmones
superficiales (SPR) y fluorescencia de reflexión interna total
(TIRF). La elipsometría es una forma especial de reflectometría y
existen formas más simples de la misma, por ejemplo, realizaciones
que no utilizan la placa de cuarto de onda. Estas técnicas tienen en
común una característica que la reflexión de luz tiene lugar en el
mismo lado de la superficie reflectante como adsorción del analito.
Para SPR y TIRF esto no es cierto y la reflexión de luz tiene lugar
en el lado no adsorbente de la
lámina.
lámina.
En SPR, la onda de luz llamada
"evanescente", que emerge al otro lado de la lámina, es
sensible al índice refractario de la capa del analito adsorbido. A
un cierto ángulo de incidencia, tiene lugar una resonancia óptica, y
se puede calcular la masa adsorbida del analito a partir de estos
datos. El SPR tiene aproximadamente el mismo límite de detección que
la elipsometría, pero las láminas reflectantes necesitan una capa
delgada de una sustancia con un índice de refracción alto sobre el
lado de la adsorción del analito de la lámina, usualmente una capa
delgada de oro. Debido a que esta capa debe satisfacer
especificaciones estrictas, las láminas de SPR son caras. En cambio,
las láminas de silicona utilizadas en un elipsómetro son baratas y
se pueden utilizar como desechables.
Para el TIRF, la onda evanescente tiene lugar a
un ángulo de incidencia que conduce a una reflexión total. La onda
penetra una distancia corta en la solución y excita las sondas
fluorescentes acopladas a los analitos. La intensidad de la señal
fluorescente es proporcional a la cantidad adsorbida del analito. No
se requieren láminas caras, pero la técnica es menos sensible que la
elipsometría o SPR.
A parte de las diferentes técnicas para la
medición de la masa superficial, se pueden utilizar también
diferentes combinaciones enzima-sustrato en la
presente invención siempre y cuando se produzca un precipitado. En
lugar del sistema del ejemplo peroxidasa de rábano picante (HRP) y
3,3'-diaminobenzidina (DAB), por ejemplo, se podría
utilizar fosfatasa alcalina (AP) como enzima y
5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato
(BCIP) con tetrazolio de nitroazul (NBT) como sustratos. Se podría
utilizar también cualquier combinación enzima/sustrato, o incluso
formación de precipitado que no se base en la conversión enzimática,
pero sí, por ejemplo, en la nucleación.
Adicionalmente, aunque los ejemplos dados en la
presente invención describen la determinación de las concentraciones
de proteína en soluciones tampón, el principio es también válido
para cualquier otro tipo de solución o suspensión, notablemente
aquellos que se utilizan con fines medicinales tales como orina,
plasma o sangre.
Para describir la invención, los ejemplos
presentados a continuación se refieren a tres diferentes análisis de
proteínas, diferenciándose con respecto a la proteína (analito) que
se debe ensayar, pero también difieren con respecto a la preparación
de la superficie y al principio de detección.
El ejemplo 1 se refiere a un ensayo de anexina V.
La anexina V es una proteína intracelular con una función biológica
que está todavía desconocida. Se ha utilizado anexina V como
proteína modelo por los parámetros bien definidos para su adsorción
sobre membranas de fosfolípidos. Es una proteína que, en presencia
de calcio, tiene una alta afinidad de unión a las membranas de
fosfolípidos, proporcionando que estas membranas contengan
aminofosfolípidos tales como fosfatidilserina (PS). El proceso de
adsorción está limitado por el transporte, y la velocidad de
adsorción de la anexina V que se puede calcular exactamente a partir
de las condiciones de agitación y de la concentración de anexina V
en la solución. Tal como se muestra en el ejemplo 1, se ha adsorbido
anexina V directamente sobre láminas de silicona, que se han
recubierto previamente con bicapas de fosfolípidos, y detectado con
un procedimiento inmunológico de dos etapas de acuerdo con la
invención. Dichas bicapas de fosfolípidos son un ejemplo de un
partícipe específico de unión que no es un anticuerpo al analito en
cuestión. Este ejemplo muestra que se puede estudiar la unión de
anexina V a membranas con la presente invención en el rango de
concentración fisiológica normal de anexina V en plasma de
1-5 ng/ml.
En el ejemplo 2, se han determinado la proteína
unida al ácido graso (FABP) (y también anexina V) sobre láminas de
silicona recubiertas con cloruro de polivinilo (PVC), utilizando el
principio de sándwich para la detección. FABP es una proteína de
marcador cardíaco con una concentración normal de plasma de
1-2 ng/ml, que actualmente está bajo investigación
como un marcador anterior para infarto de miocardio agudo, y como un
marcador para terapia de repercusión lograda después del infarto de
miocardio agudo. Hoy en día, los ELISA para esta proteína tardan una
hora aproximadamente de tiempo de ensayo, en cambio se podría
reducir este tiempo a pocos minutos con la técnica de la invención.
Utilizando un instrumento dedicado, esto conduciría a una medición
de comportamiento
rápido.
rápido.
El ejemplo 3 describe la utilización de la
invención para ensayar interleucina 6 (IL6). IL6 es un mediador
importante de la respuesta inflamatoria, con una concentración
normal de plasma inferior a 10 pg/ml. Actualmente, la determinación
de concentraciones de este tipo con ELISA convencional tarda varias
horas, en cambio se puede realizar, tal como se demuestra a
continuación, en 30 minutos utilizando la nueva técnica de la
invención. Para IL6, se ha adsorbido el anticuerpo receptor durante
15 minutos solamente sobre láminas de silicona fuertemente
hidrofóbicas (silanizadas), y se ha utilizado el sistema
biotina-estreptavidina para la detección.
Estos ejemplos demuestran que se puede utilizar
el método para un amplio rango de superficies y principios de
detección. Se podrían utilizar igualmente otras superficies
reflectantes que no sean láminas de silicona, por ejemplo, láminas
de vidrio pulverizadas con cromo, y de hecho se han utilizado
anteriormente por el grupo de los autores de la presente invención
[1, 2].
Considerando estas circunstancias, se consideran
los siguientes aspectos parte de la invención:
- 1)
- Medición cuantitativa de las concentraciones de analitos específicos, tales como proteínas, péptidos, azúcares, etc., en soluciones, por medio de medición elipsométrica in situ de (la velocidad de) acumulación del precipitado formado mediante la acción continua de moléculas de enzima que se unen directamente al analito unido a la superficie o se acoplan a otras moléculas que se unen a estos analitos.
- 2)
- Utilización del principio 1) para la medición de las concentraciones de analitos de este tipo en cualquier tipo de solución o suspensión, tal como agua destilada, soluciones tampón, solución salina fisiológica, orina, plasma, sangre, etc.
- 3)
- Utilización del principio 1) combinado con otras técnicas para medición cuantitativa de masa superficial, tal como otras formas de reflectometría que no sea elipsometría, resonancia de plasmones superficiales, fluorescencia de reflexión interna total, etc.
- 4)
- Utilización del principio 1) combinado con cualquier otra forma de superficies reflectantes u otras formas de preparación superficial, tales como recubrimiento previo de superficies reflectantes con fosfolípidos o polímeros.
- 5)
- Utilización del principio 1) combinado con cualquier modificación del principio de detección, tal como otras combinaciones enzima/sustrato o reacciones de formación de precipitado, técnicas de sándwich, etiquetados de molécula de enzima simples frente a los múltiples, unión directa o competitiva, etc.
- 6)
- Utilización del principio 1) en un inmunoensayo con adición simultánea, o adición sucesiva a tiempo corto del analito, conjugado y sustrato donde se forma el precipitado, sin intervenir las etapas de lavado o enjuague (ELISA en una etapa).
- 7)
- Combinación del principio 1) con la utilización de superficies accesibles y uniformes, preferentemente un disco giratorio, para descripción cuantitativa de la velocidad de formación de precipitado y para la expresión de la actividad (biológica) de la unión de la superficie en la cantidad del agente activo unido por área superficial de unidad.
Se han cubierto las láminas con bicapas de
fosfolípido mediante la adición de 20 \muM de ampollas de
fosfolípido, obtenidas mediante sonicación de una mezcla de 20% de
DOPS / 80% de DOPS, tal como se ha descrito en las referencias [3,
4]. Después de la formación de una bicapa estable de fosfolípidos
sobre la superficie, se ha eliminado el exceso de fosfolípido
mediante el enjuague de la cubeta con tampón, y se ha añadido
anexina V humana. Después de 200 s de adsorción, se ha enjuagado la
cubeta y se ha añadido anti anexina V policlonal de conejo durante
120 s. Se ha enjuagado nuevamente la cubeta y se ha añadido durante
120 s el anti-conejo IgG de cerdo, conjugado a HRP.
Nuevamente, se ha enjuagado la cubeta, se han añadido 0,278 mM de
DAB y 0,834 mM de H_{2}O_{2} y se ha medido la formación del
precipitado sobre la superficie mediante elipsometría. Se muestran
los resultados en la tabla 1.
Si el límite de detección se define como un
cambio de polarizador que excede el cambio de polarizador más 3
veces el SD para el blanco, se deduce de la tabla 1 que ya se podría
medir la concentración superficial más baja de 0,01 ng/cm^{2}, que
es 100 veces aproximadamente más baja que la detectable por
elipsometría directa, en un tiempo de incubación de 300 s.
Se han dotado de recubrimiento láminas de
silicona con capas homogéneas de PVC de 20-25 nm de
espesor mediante un procedimiento de inmersión automatizado de las
láminas en una solución de PVC en ciclohexano. Se han cubierto las
láminas con anticuerpos monoclonales frente a FABP (y anexina V)
mediante adsorción durante toda la noche, y se ha bloqueado el
espacio de superficie libre con albúmina o polvo de leche desnatada.
Luego, se han expuesto las láminas durante 10 minutos a varias
concentraciones de FABP (o anexina V), y se han detectado las
proteínas adsorbidas directamente con conjugados de anticuerpos
monoclonales/HRP o, para anexina V, con el procedimiento de dos
etapas descrito. Se muestra en la figura la formación del
precipitado después de la adición de DAB, tal como se ha medido por
elipsometría. Se podría medir una concentración de 0,5 ng/ml con un
tiempo de conversión de DAB de 120 s.
Se ha adsorbido un anticuerpo receptor monoclonal
frente a IL6 durante 15 minutos solamente sobre láminas de silicona
fuertemente hidrofóbicas (silanizadas), y se han añadido varias
concentraciones de IL6 durante 10 minutos solamente. Se realizaron
dos etapas cortas de incubación con anticuerpos biotinilados
anti-IL6 y (multi)HRP etiquetado con
estreptavidina. En la tabla 2, se muestran los resultados de la
medición elipsométrica de la formación del precipitado después de la
adición de DAB. Se podría medir una concentración de 10 pg/ml de IL6
en un tiempo de conversión de DAB de menos de 300 s y a un tiempo
total de ensayo de menos de 30 min.
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Claims (13)
1. Método de inmunoensayo para determinar un
analito adsorbido sobre una superficie o presente en una muestra
líquida, que comprende unir dicho analito a una fase sólida, acoplar
un marcador al analito, y detectar el marcador acoplado en dicha
fase sólida, en el que se utiliza una combinación de un marcador y
de medios de detección que es capaz de producir un precipitado sobre
una fase sólida que lleva el marcador, y se detecta la unión del
analito a la fase sólida sin llevar a cabo manipulaciones tales como
enjuague, secado o aclarado, determinando in situ el cambio
de la masa superficial de dicha fase sólida debido a la formación de
dicho precipitado.
2. Método de inmunoensayo, según la
reivindicación 1, que es un método cuantitativo para determinar la
concentración del analito en una muestra.
3. Método de inmunoensayo, según la
reivindicación 1 ó 2, que es un método cuantitativo para medir
concentraciones superficiales del analito, adsorbido o unido a
superficies sólidas o membranas biológicas (modelo).
4. Método de inmunoensayo, según cualquiera de
las reivindicaciones 1-3, en el que se determina el
cambio de la masa superficial de la fase sólida mediante
elipsometría.
5. Método de inmunoensayo, según la
reivindicación 4, en el que se lleva a cabo la elipsometría sobre
una superficie accesible de modo uniforme, preferentemente un disco
giratorio.
6. Método de inmunoensayo, según las
reivindicaciones 1-3, en el que se determina el
cambio de la masa superficial de la fase sólida mediante resonancia
de plasmones superficiales.
7. Método de inmunoensayo, según cualquiera de
las reivindicaciones 1-3, en el que se determina el
cambio de la masa superficial de la fase sólida mediante
fluorescencia de reflexión interna total.
8. Método de inmunoensayo, según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que dicho marcador es una
enzima y dichos medios de detección comprenden un sustrato de dicha
enzima.
9. Método de inmunoensayo, según la
reivindicación 8, en el que se utiliza peroxidasa de rábano picante
como enzima y 3,3'-diaminobezidina como
sustrato.
10. Método de inmunoensayo, según la
reivindicación 8, en el que se utiliza fosfatasa alcalina como
enzima y
5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato
y tetrazolio de nitroazul como sustrato.
11. Método de inmunoensayo, según las
reivindicaciones 1-3, realizado como ELISA en una
etapa.
12. Método de inmunoensayo, según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que se utiliza una lámina de
silicona como fase sólida.
13. Método de inmunoensayo, según las
reivindicaciones 1-11, en el que se utiliza una
lámina de vidrio pulverizada con cromo como fase sólida.
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