ES2235377T3 - Metodo y kit de inmunoensayo. - Google Patents

Abstract

Método de inmunoensayo para determinar un analito adsorbido sobre una superficie o presente en una muestra líquida, que comprende unir dicho analito a una fase sólida, acoplar un marcador al analito, y detectar el marcador acoplado en dicha fase sólida, en el que se utiliza una combinación de un marcador y de medios de detección que es capaz de producir un precipitado sobre una fase sólida que lleva el marcador, y se detecta la unión del analito a la fase sólida sin llevar a cabo manipulaciones tales como enjuague, secado o aclarado, determinando in situ el cambio de la masa superficial de dicha fase sólida debido a la formación de dicho precipitado.

Description

Método y kit de inmunoensayo.

Sector de la invención

El ámbito de la invención se refiere al sector de los inmunoensayos para determinar un analito, especialmente un analito adsorbido sobre una superficie, o analito tal como se presenta en una muestra líquida en solución o en un sitio particular de la misma, tal como en una superficie específica.

Más particularmente, la invención se refiere a ensayos de inmunoabsorbencia (ELISA) relacionados por enzimas, para determinar la concentración de un analito en una muestra líquida, incluyendo su concentración en el volumen de la muestra líquida o su concentración en una superficie particular. Específicamente, la presente invención da a conocer nuevos métodos de inmunoensayo y kits específicamente adaptados para llevar a cabo estos nuevos métodos de inmunoensayo.

Antecedentes de la invención

Se utilizan ampliamente los inmunoensayos, tales como ELISA, para la determinación cualitativa o, principalmente, cuantitativa, de una variedad casi ilimitada de sustancias orgánicas, tanto de origen natural como compuestos químicos sintéticos, tales como péptidos, proteínas, enzimas, hormonas, vitaminas, medicamentos, hidratos de carbono, etc., para varios objetivos, tales como particularmente, para finalidad de diagnóstico, y también para aplicaciones forenses, control de calidad de los alimentos, y generalmente, para cualquier propósito analítico. En la presente invención, todas las sustancias de este tipo que se deben analizar serán designadas en general como analitos.

Existen muchas variantes diferentes de los métodos ELISA. La descripción que se da a continuación tiene como objetivo describir una técnica típica de ELISA. No pretende ser completa ni se debe interpretar de ningún modo como restrictiva del ámbito de la presente invención. Por ejemplo, en la siguiente descripción, se describen los métodos ELISA que comprenden etapas separadas de incubación de una muestra con un primer partícipe de unión del analito, e incubando el producto de reacción formado con un segundo partícipe de unión del analito (a continuación, los partícipes de unión del analito se indican a veces como partícipes de unión para el analito). Sin embargo, algunas realizaciones existentes de ELISA no comprenden dichas etapas separadas de incubación y permiten a los analitos reaccionar simultáneamente, o con poca separación uno después del otro, en la misma y única etapa de incubación, con sus primer y segundo partícipes de unión. Los ELISA competitivos son otro ejemplo de las variantes de ELISA no descritas detalladamente en la presente invención. El objeto de la invención se aplica en principio a cualquiera y todas de las variantes de ELISA, y a métodos de inmunoensayos similares que, estrictamente hablando, no son métodos ELISA porque, por ejemplo, no implican la utilización de una enzima.

En un ELISA típico, para detectar la presencia, o medir la concentración, de un analito de interés, especialmente en una muestra líquida, que puede ser un fluido corporal tal como sangre, plasma, suero, orina, saliva, esputo, etc., la muestra está en contacto con un primer partícipe de unión para el analito, y la muestra y el partícipe de unión para el analito se incuban durante un tiempo suficiente para permitir al analito contenido en la muestra unirse con el partícipe de unión.

Un ejemplo típico de un partícipe de unión de este tipo es un anticuerpo específico para el analito, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal con carácter especifico para el analito en cuestión. Sin embargo, se pueden también aceptar otros tipos de sustancias y estructuras como partícipe de unión. Por ejemplo, el receptor natural del analito en cuestión podría ser útil como partícipe de unión, y también otras sustancias y estructuras a las que se puede unir el analito. Normalmente, el partícipe de unión sería un partícipe específico de unión, aunque no es un requerimiento. Incluso es posible trabajar sin un primer partícipe de unión e inmovilizar (es decir, unir a una fase sólida) el analito tanto directamente (por ejemplo, mediante adsorción) como a través de una sustancia de enlace no específicamente de unión. Todas las variantes de este tipo pretenden explícitamente estar incluidas en el ámbito de esta invención. Las palabras "analito adsorbido sobre una superficie", tal como se utiliza en la presente invención, se refieren a cualquier método que resulta en acoplar o unir el analito a una superficie.

Usualmente, se utiliza dicho primer partícipe de unión en una forma inmovilizada, es decir, acoplado a una fase sólida, tal como bolitas de poliestireno o la superficie interna del recipiente de reacción (por ejemplo, un tubo de reacción o un pocillo de una placa de microtitulación). Se puede adsorber físicamente el partícipe de unión sobre la fase sólida o, usualmente, se puede acoplar mediante enlace covalente. De acuerdo con algunas realizaciones de ELISA, se acopla el partícipe de unión utilizando un agente de acoplamiento adecuado, y en otras realizaciones utilizando sustancias de unión apropiadas, tales como biotina y (estrept)avidina. En algunas realizaciones de ELISA, se lleva a cabo la inmovilización del partícipe de unión después de la incubación de la muestra y del partícipe de unión, permitiendo por lo tanto que la reacción entre el analito y el partícipe de unión se produzca en la fase líquida. Para permitir su inmovilización posterior, se puede aplicar dicho partícipe de unión en una forma biotinilada. En este caso, se puede realizar la inmovilización utilizando una fase sólida que comprende (estrept)avidina.

Como resultado de esta primera reacción, cualquier analito presente en la muestra estará unido a su partícipe de unión y, por consiguiente, a la fase sólida. Usualmente después de eliminar el líquido y lavar la fase sólida, se realizan las etapas para hacer detectable el resultado. La fase sólida que lleva acoplado al partícipe de unión y el analito, si existe, se pone en contacto con un segundo partícipe de unión para el analito. Nuevamente, un partícipe de unión específico es la norma, aunque no se requiere estrictamente. Usualmente, este segundo partícipe de unión comprende una etiqueta/marcador que permite su detección. Sin embargo, en algunas realizaciones de ELISA se utiliza el segundo partícipe de unión en forma no etiquetada y se etiqueta después de su unión utilizando un partícipe de unión etiquetado para el segundo partícipe de unión. Como ejemplo de ello, el segundo partícipe de unión puede ser un anticuerpo de ratón (tanto policlonal como monoclonal) frente al analito en cuestión, y después de su unión al analito que se ha acoplado mediante su primer partícipe de unión a la fase sólida, se utiliza un IgG de cabra anti-ratón etiquetado para acoplar una etiqueta al complejo inmovilizado.

En los métodos ELISA, el etiquetado consiste en una enzima capaz de una conversión detectable de un sustrato, por ejemplo, una peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante, capaz de convertir, en presencia de peróxido de hidrógeno, un sustrato tal como 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina, en un producto coloreado.

Normalmente, después de que se haya acoplado el reactivo etiquetado con la enzima al complejo inmovilizado, se lava la fase sólida con el complejo unido a la misma antes de entrar en la fase real de detección.

En la fase de detección, se añade la solución del sustrato a la fase sólida con el complejo acoplado y se detecta la conversión del sustrato, si existe. Para permitir una medición cuantitativa del analito, se incuba la fase sólida con la solución del sustrato durante un tiempo fijo, que debería ser suficientemente largo para permitir una conversión enzimática sustancial del sustrato a una sustancia coloreada. Después de terminar la reacción de conversión del sustrato, se mide la intensidad de la coloración, que es proporcional a la cantidad inmovilizada de la enzima, por medios ópticos, tales como un fotómetro para medir la absorbancia a una longitud de onda elegida, tal como 450 nm.

Una desventaja de las técnicas existentes de ELISA es que las fases de adsorción y de detección, para asegurar la sensibilidad del ensayo, tardan mucho tiempo para concentraciones bajas del analito. La velocidad de adsorción del analito en la superficie es proporcional a la concentración del analito en la solución, y por lo tanto, llega a ser también muy baja, incluso en sistemas dotados de buena agitación. Para permitir una medición fiable de los analitos presentes en un líquido a una concentración del orden de nanogramos o incluso de picogramos por ml, la fase de adsorción puede requerir un tiempo de reacción de una a varias horas.

Otra desventaja de las técnicas existentes de ELISA es que no permiten medir concentraciones superficiales extremadamente bajas de los analitos, tal como se tienen lugar en la superficie de membranas biológicas (modelos).

Un objetivo de la presente invención es dar a conocer una técnica de inmunoensayo, por ejemplo ELISA, modificada que permite reducir el tiempo de incubación en la fase de adsorción y/o de detección, o incrementar la sensibilidad del ensayo, o ambas cosas.

Un objetivo adicional de la presente invención es dar a conocer una técnica de inmunoensayo, por ejemplo ELISA, modificada que permite medir las concentraciones del analito en una superficie particular.

Otro objetivo de la presente invención es dar a conocer productos específicamente adaptados para llevar a cabo las técnicas de inmunoensayo modificadas de este tipo.

La invención pertenece a una modificación fundamental del principio de análisis de los inmunoensayos, por ejemplo ELISA, en la que se reemplaza la medición de la acumulación del producto de enzima en la solución (fase voluminosa) por una medición in situ de la acumulación del precipitado sobre una superficie sólida. El ámbito de la invención implica la utilización de un sistema que forma un precipitado, tal como una combinación de enzima-sustrato que conduce a la formación de un precipitado sobre una superficie sólida, y la medición de la masa superficial, por ejemplo, mediante elipsometría u otras técnicas de medición de la masa superficial.

Utilizando esta invención, se pueden determinar concentraciones muy bajas del analito adsorbido sobre la superficie sólida y se puede reducir sustancialmente la fase de adsorción a partir del analito del líquido a la superficie. También, ya no se requiere el largo tiempo acumulado para la concentración del producto en la fase líquida voluminosa, y se reemplaza por una adsorción de una capa fina de precipitado, de dimensiones moleculares solamente, sobre la superficie sólida. Esta modificación implica un gran incremento de la sensibilidad del ensayo y ofrece la posibilidad de obtener tiempos de ensayo mucho más cortos. También permite determinar concentraciones superficiales extremadamente bajas tal como puede tener lugar en la superficie de membranas biológicas (modelo).

La determinación de las concentraciones del analito mediante la "inmunoprecipitación" es una técnica muy conocida. Usualmente y de modo simple, el precipitado de los agregados analito-anticuerpo, formados mediante este método después de la adición del anticuerpo precipitante, se lleva a sedimentar, se recoge y se pesa. A pesar de la precipitación pobre cuando tanto el analito como el anticuerpo están presentes en gran exceso, se ha mostrado que, bajo condiciones bien definidas, esta técnica permite una interpretación cuantitativa de los datos (ver, por ejemplo, la solicitud de la Patente Europea 0368452). En una versión más sensible y más rápida de esta técnica, se añaden partículas (látex) cubiertas con anticuerpo y se mide la formación del agregado mediante la dispersión de luz. De este modo, se evita la sedimentación lenta y se pueden completar las mediciones en segundos. El presente método es fundamentalmente diferente de estas técnicas. En dichas técnicas, el analito no se concentra en una interfase sólido/líquido y la cantidad del precipitado no aumenta continuamente con el tiempo, a medida que se produce mediante una enzima. Debido a estos factores, y debido a la agregación específica, las técnicas de este tipo tienen una sensibilidad limitada y generalmente no permiten la medición de las concentraciones del analito por debajo del rango de ng/ml.

Los métodos analíticos que implican una formación dirigida por enzimas de un precipitado (coloreado) son conocidos de por sí. Se conoce un método de este tipo, por ejemplo, en el sector de la inmunocitoquímica. En este método conocido, para demostrar la presencia y/o localización en varios tejidos de proteínas en estudios histológicos, se determina una proteína específica en el tejido produciendo primeramente secciones finas de tejido, después, congelar el tejido o utilizar varias formas de fijación química, y luego añadiendo anticuerpos que reconocen específicamente la proteína y se unen a la misma. Se elimina el exceso de los anticuerpos y luego se añade un segundo anticuerpo unido a la enzima, por ejemplo, un conjugado IgG-HRP. Después de eliminar el exceso del conjugado, se añade un sustrato adecuado, tal como 3,3'-diaminobenzidina (DAB). Si la proteína específica está presente en el tejido, tendrá lugar un manchado localizado debido a la formación de un precipitado derivado de DAB.

Sin embargo, la presente invención no da a conocer la localización ni la detección de proteínas en el tejido pero sí la detección y la medición del analito (concentraciones) adsorbido en superficies sólidas o presente en soluciones. Adicionalmente, el ámbito de la invención aplica una medición (preferentemente cuantitativa) de masa superficial (en el rango de ng/cm^{2}) en cambio, en dicho método inmunocitoquímico conocido, se obtienen resultados cualitativos, usualmente mediante inspección visual o microscópica. En algunos estudios, se ha medido la intensidad de las manchas mediante la aplicación de mediciones de densidad óptica, pero nunca se ha combinado la técnica con otra técnica para la medición cuantitativa de la masa superficial, tal como la elipsometría u otras. Esto sería también muy difícil de realizar porque el espesor de las secciones de tejido (en micrómetros) está en otro orden de magnitud respecto al espesor de las capas del precipitado (en nanómetros) medidas con el método de la presente invención.

La técnica anterior sugiere la utilización de inmunoensayos basados en interferencia óptica sobre superficies receptivas ópticamente activas y especialmente preparadas, cubiertas con capas delgadas de óxido, de nitruro o poliméricas. Utilizando un recubrimiento previo de este tipo, la adsorción adicional de una capa de precipitado resulta en cambios de color visualmente detectables. Se han presentado aplicaciones de este tipo en la Patente USA 5.418.136. La Patente Europea 0546222 describe un inmunoensayo basado en interferencia óptica sobre una superficie de sustrato unido a un analito, en el que un marcador enzimático está unido al analito que a su vez está unido a la superficie y en el que se forma un precipitado sobre la superficie como resultado de una reacción entre el marcador y un agente de precipitación. Después de lavar y secar la superficie, se detecta el precipitado para indicar la presencia del analito sobre la superficie. A parte de la detección visual de la formación del precipitado, se aplica también, en estos métodos de la técnica anterior, la medición del precipitado mediante elipsometría. Sin embargo, las varias etapas de aclarado y/o secado requeridas en estas técnicas evitan la alta sensibilidad que se puede obtener mediante mediciones in situ. Para la detección de concentraciones muy bajas del analito en fluidos biológicos como plasma, suero, sangre, leche u orina, la masa específicamente adsorbida de otras sustancias voluminosas, tal como albúmina, excederá a menudo las pequeñas cantidades del precipitado adsorbido, y el aclarado o el secado provocará cambios en la masa superficial sobrepasando en mucho el efecto específico. La medición in situ ofrece también la posibilidad de un ELISA en una etapa, en el que se añaden conjuntamente el analito, el conjugado y el sustrato cromogénico, sin la intervención de las etapas de lavado o secado. En un ELISA normal, esto sería imposible porque la producción del color mediante el exceso de un conjugado no unido sobrepasaría en mucho la producción de color de la pequeña cantidad del conjugado unido al analito sobre la superficie. Por el contrario, la técnica presentada mide solamente el precipitado producido mediante el conjugado unido a la superficie. Además, a una sensibilidad más alta, la presente utilización de medición in situ permite también un análisis más rápido, porque se evitan las largas etapas de aclarado y/o secado, con mediciones separadas posteriores del precipitado.

Otra diferencia fundamental con las técnicas descritas en las dos patentes mencionadas es que no se requieren superficies ópticamente activas especialmente preparadas o superficies cubiertas con polímero de acuerdo con la presente invención. Las superficies de este tipo son caras, al igual que las láminas ópticamente activas utilizadas en técnicas basadas en la resonancia de plasmones superficiales (SPR), en cambio, se pueden utilizar en el presente método superficies de reflexión (desechables) baratas tales como obleas de silicona o láminas de vidrio pulverizadas con cromo.

La técnica anterior sugiere la utilización de elipsometría amplificada como medio de incrementar la sensibilidad de las mediciones de adsorción de proteína [5]. En el método de interés de la técnica anterior, se ha aumentado la masa del anticuerpo etiquetado mediante su acoplamiento con partículas de sílice. Se han utilizado también partículas de oro cubiertas con anticuerpos, principalmente combinados con microscopía electrónica en estudios de localización [6]. Otra técnica del sector para la amplificación de la masa superficial utiliza biotinilados o liposomas cubiertos con analitos [7, 8].

Estas técnicas son fundamentalmente diferentes del ámbito de la invención porque no miden una acumulación continua del precipitado por molécula etiquetada, sino que utilizan simplemente marcadores más pesados. Debido a su difusión más lenta hacia la superficie, la ventaja de una mejor detectabilidad de marcadores pesados de este tipo debe ser equilibrada frente a su adsorción más lenta, y esto obstaculiza la utilización de estos métodos para ensayos rápidos.

Características de la invención

La invención da a conocer un método de inmunoensayo para determinar un analito adsorbido sobre una superficie o presente en una muestra líquida, que comprende unir dicho analito a una fase sólida, acoplar un marcador al analito, y detectar el marcador acoplado en dicha fase sólida, en el que se utiliza una combinación de un marcador y de medios de detección que es capaz de producir un precipitado sobre una fase sólida que lleva el marcador y se detecta la unión del analito a la fase sólida sin llevar a cabo manipulaciones tales como enjuague, secado o aclarado determinando in situ el cambio de la masa superficial de dicha fase sólida debido a la formación de dicho precipitado.

Adicionalmente, la invención da a conocer un conjunto o kit para llevar a cabo un método de inmunoensayo para determinar un analito adsorbido sobre una superficie o presente en una muestra líquida, en el que el kit comprende, por lo menos, medios específicamente adaptados para llevar a cabo el método de acuerdo con la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La figura muestra los resultados de una medición elipsométrica ayudada por un precipitado, de una proteína de unión a un ácido graso (a) y anexina V (b) sobre discos de silicona cubiertos con PVC.

Descripción detallada de la invención

La presente invención da a conocer, en un primer aspecto, un método de inmunoensayo para determinar un analito adsorbido sobre una superficie o presente en una muestra líquida, que comprende unir dicho analito a una fase sólida, acoplar un marcador al analito, y detectar el marcador acoplado en dicha fase sólida, en el que se utiliza una combinación de un marcador y de medios de detección que es capaz de producir un precipitado sobre una fase sólida que lleva el marcador y se detecta la unión del analito a la fase sólida in situ mediante la determinación de la masa superficial de dicha fase sólida debido a la formación de dicho precipitado.

El término "detección in situ" pretende reflejar la determinación de un cambio en la masa superficial a medida que se forma el precipitado. En otras palabras, no se llevan a cabo enjuague, secado, aclarado ni otras manipulaciones que puedan conducir a errores en el resultado medido debido a que efectúan un cambio adicional en la masa superficial. Además, la detección in situ permite, de modo ventajoso, una medición de la formación del precipitado mediante la enzima unida a la superficie, incluso en presencia de la conversión del sustrato mediante el exceso de enzima en la fase de solución (ELISA en una etapa).

Tal como se ha indicado anteriormente en la sección de antecedentes de la invención, la invención pertenece a una gran variedad de diferentes métodos de inmunoensayos. La mayoría de ellos tienen en común que el analito, si está presente en la muestra, está unido a la fase sólida a través del intermediario de un partícipe de unión del analito, usualmente un partícipe específico de unión, tal como un anticuerpo que se une específicamente con dicho analito. Sin embargo, en algunas realizaciones se puede unir el analito directamente a la fase sólida, mediante adsorción, o por medios de unión no específicos.

Se puede acoplar previamente dicho partícipe de unión, si se utiliza, a la fase sólida. Alternativamente, se une a la fase sólida después de haber reaccionado con el analito, si está presente.

Adicionalmente, la mayoría de las realizaciones de los inmunoensayos tendrán en común la utilización de un segundo partícipe de unión para acoplar un marcador al analito. Nuevamente, el partícipe de unión, si se utiliza, será preferentemente un partícipe específico de unión, tal como un anticuerpo específicamente unido al analito.

Este segundo partícipe de unión del analito puede llevar un marcador. Sin embargo, de modo alternativo, se transporta el marcador mediante una sustancia capaz de unirse a dicho segundo partícipe de unión del analito. Por ejemplo, si el segundo partícipe de unión del analito es un anticuerpo monoclonal murino contra el analito, se puede acoplar el marcador directamente a este anticuerpo monoclonal, o alternativamente a un anticuerpo anti-ratón Ig (es decir, un anticuerpo específicamente unido a inmunoglobulinas murinas).

Se puede llevar a cabo el acoplamiento del marcador al analito tanto simultáneamente con el acoplamiento del analito a la fase sólida, como antes o después de la misma. En la mayoría de los métodos de inmunoensayos, es preferente inmovilizar primero el analito y solamente a posteriori unir el marcador al analito inmovilizado.

Preferentemente, el método es un método cuantitativo para determinar la concentración del analito en la muestra. En otra realización preferente, el método objetivo es un método cuantitativo para determinar la concentración del analito en una superficie particular. La superficie en cuestión puede ser una membrana biológica (modelo), es decir, la superficie de una membrana celular, o una superficie artificial, por ejemplo, una superficie artificial que pretende imitar una superficie de interés que se lleva a cabo de modo natural, preferentemente depositada sobre una superficie accesible y uniforme y que permite una interpretación cuantitativa de la formación del precipitado. Sin embargo, la invención no está restringida a los métodos cuantitativos y puede ser útil para determinar cualitativamente la presencia de una concentración extremadamente baja del analito en la muestra, tanto en el volumen de la muestra como en un lugar particular, tal como sobre una superficie particular.

Preferentemente, se determina el cambio de la masa superficial de la fase sólida mediante elipsometría. Sin embargo, la invención se extiende a otras técnicas para determinar el cambio de la masa superficial de la fase sólida, tal como la resonancia de plasmones superficiales y la fluorescencia de reflexión interna total.

En las realizaciones más preferentes de la invención, dicho marcador es una enzima y dichos medios de detección comprenden un sustrato de dicha enzima. Preferentemente, el inmunoensayo es un método ELISA. Preferentemente, se utiliza peroxidasa de rábano picante como enzima y 3,3'-diaminobenzidina como sustrato. Sin embargo, el sujeto de la invención se extiende a otras combinaciones de enzima-sustrato capaces de producir un precipitado, tales como fosfatasa alcalina como enzima y 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato y tetrazolio de nitroazul como sustrato. Adicionalmente, la invención cubre cualquier otra combinación de marcador y de medios de detección que es capaz de producir un precipitado sobre una fase sólida que lleva dicho marcador. Por ejemplo, la formación de un precipitado puede ser el resultado de nucleación, mediante el crecimiento nucleado del metal, o partículas no metálicas, o el resultado de reacciones en cadena o de polimerización de, por ejemplo, hidrocarburos no saturados que se pueden polimerizar mediante la exposición a la radiación ultravioleta, etc. Por consiguiente, dicho marcador podría comprender un hidrocarburo no saturado y dichos medios de detección una cantidad adicional del mismo hidrocarburo o de otro diferente conjuntamente con los medios para iniciar la polimerización (tal como radiación ultravioleta). Alternativamente, dicho marcador podría comprender partículas coloidales de un metal, por ejemplo, oro, plata, etc., o de un compuesto no metálico, por ejemplo, selenio, telurio, carbono, sílice, etc., mientras que dichos medios de detección comprenden una fuente de una cantidad adicional del mismo o distinto metal o compuesto no metálico, conjuntamente con medios (por ejemplo, agente adecuado de reducción, tal como un compuesto de borohidrato, capaz de liberar el metal de un compuesto químico que contiene dicho metal) para promover el crecimiento de las partículas coloidales utilizadas como marcador.

De acuerdo con la presente invención, es preferente que se utilice una lámina de silicona como fase sólida. Sin embargo, la invención se extiende a otras fases sólidas adecuadas para la utilización de una técnica para determinar el cambio de la masa superficial de la fase sólida, tal como una lámina de vidrio pulverizada con cromo. En principio, la fase sólida puede consistir en cualquier superficie de reflexión simple y barata, y no requiere tratamiento previo como la deposición de capas especiales ópticamente activas, tal como se ha descrito en la Patente USA A-5418136.

La cantidad del analito que se adsorbe sobre las superficies del sólido dependerá generalmente de las condiciones de transporte (difusión y agitación) en el sistema. En los sistemas usuales de flujo laminar, esto implica que las cantidades adsorbidas pueden disminuir en la dirección más abajo de la corriente, porque la capa límite del fluido se gasta progresivamente del analito. Esta dependencia local de la cantidad del analito adsorbido puede obstaculizar la descripción cuantitativa de la velocidad de formación del precipitado, por ejemplo, si se mide primero el efecto biológico de una cantidad pequeña de proteína adsorbida sobre una membrana [4], entonces se mediría la cantidad de proteína responsable de este efecto. Se ha descubierto que se puede superar este problema realizando de modo cuantitativo el presente método sobre las llamadas superficies accesibles y uniformes, es decir, con condiciones de adsorción idénticas sobre toda la superficie. Utilizando una superficie de este tipo, se puede relacionar el efecto biológico con la cantidad adsorbida del analito, expresada por unidad de área superficial. Se ha desarrollado una superficie accesible de modo uniforme, un disco giratorio en la solución, y permite la medición elipsométrica de la adsorción del analito sobre su superficie [9]. Por consiguiente, la combinación con la elipsometría sobre un disco giratorio es una realización preferente de la presente invención.

Se puede detectar y cuantificar la adsorción de analitos a partir de soluciones tampón y más generalmente la acumulación de sustancias sólidas sobre superficies planas mediante elipsometría. Esto es una técnica óptica que utiliza reflexión de la luz monocromática contra la superficie de adsorción, cuya técnica permite una medición cuantitativa de la adsorción del analito con un límite de detección de 1-5 ng/cm^{2}.

Se coloca la superficie reflectante, en los ejemplos de la presente invención una lámina de silicona pretratada, por ejemplo, en una cubeta de cuarzo llena, por ejemplo, con 5 ml de solución tampón. La luz monocromática de un láser de He-Ne, con una longitud de onda de 632,8 nm, pasa primero a través de un prisma de polarización (P) y luego a través de una placa de cuarto de onda con su eje rápido a 45 grados del plano de incidencia. Entonces la luz entra en la cubeta, se refleja contra la lámina de silicona, sale de la cubeta, pasa a través de un segundo prisma de polarización (A), y finalmente se detecta mediante un fotodiodo. Las posiciones de (P) y (A) se ajustan por ordenador de tal modo para mantener la intensidad de la luz resultante que alcance el fotodiodo a un mínimo. Cuando una sustancia sólida se adsorbe sobre la superficie reflectante, se cambian las posiciones de (P) y (A) para mantener la intensidad mínima. Por consiguiente, una adsorción de este tipo provocará un cambio en las posiciones del "polarizador" (P) y el "analizador" (A). En el caso especial de las láminas de silicona utilizadas como superficie reflectante y de las sustancias orgánicas, tales como proteínas, lípidos, azúcares o precipitados orgánicos como analitos de adsorción, el cambio en la masa de la superficie adsorbida es directamente proporcional al cambio en el polarizador. Se han cortado las láminas utilizadas en los ejemplos a partir de obleas de silicona (Wacker Chemitronic; tipo n, dopadas con fósforo). Se han realizado las mediciones a temperatura ambiente (20ºC \pm 1ºC) bajo agitación continua mediante un agitador giratorio. Se han descrito el instrumento y el análisis de los datos en publicaciones anteriores del grupo de los autores de la presente invención [1, 2].

En un experimento típico, se coloca la lámina pretratada en la cubeta del elipsómetro y se realiza una lectura nula (P0, A0). Luego, se añade la proteína que se debe analizar al tampón y se lleva a adsorber sobre la lámina durante un tiempo adecuado, por ejemplo 5 minutos. Para concentraciones muy bajas de proteína, tal como se utiliza en la presente invención, la cantidad de proteína adsorbida durante este periodo de tiempo permanece inferior al límite de detección del elipsómetro, por lo tanto las posiciones P0 y A0 permanecen esencialmente sin cambios. A continuación, se enjuaga la cubeta con tampón fresco y se bloquea el espacio de la superficie libre sobre la lámina mediante adsorción de albúmina u otras proteínas voluminosas. Luego, se añade un conjugado anticuerpo-peroxidasa de rábano picante (HRP) y se lleva a adsorber durante un tiempo adecuado, por ejemplo dos minutos. Nuevamente se enjuaga la cubeta y se añade una solución de sustrato que contiene 3,3'-diaminobenzidina (DAB) y H_{2}O_{2}. En sitios en los que se han unido las moléculas conjugadas a la proteína adsorbida, se formará el precipitado DAB mediante la acción enzimática de HRP. Debido a la conversión continua de DAB, la masa superficial del precipitado será pronto mucho más grande que la masa de la proteína original y será detectable por elipsometría.

En otra configuración, con el objetivo de determinar concentraciones muy bajas de la proteína, se descartan las etapas de enjuague entre la adición del analito, conjugado y la precipitación del sustrato y se añaden el analito, conjugado y el sustrato DAB conjuntamente o en un tiempo corto de modo sucesivo. De esta manera, se obtiene un ELISA de una etapa.

De acuerdo con la invención, se realiza preferentemente la medición de la velocidad de formación del precipitado sobre la superficie sólida mediante elipsometría. Sin embargo, el principio del análisis de la presente invención se podría aplicar igualmente a otras técnicas para una medición cuantitativa de la masa superficial, tales como otras formas de reflectometría que no sean elipsometría, resonancia de plasmones superficiales (SPR) y fluorescencia de reflexión interna total (TIRF). La elipsometría es una forma especial de reflectometría y existen formas más simples de la misma, por ejemplo, realizaciones que no utilizan la placa de cuarto de onda. Estas técnicas tienen en común una característica que la reflexión de luz tiene lugar en el mismo lado de la superficie reflectante como adsorción del analito. Para SPR y TIRF esto no es cierto y la reflexión de luz tiene lugar en el lado no adsorbente de la
lámina.

En SPR, la onda de luz llamada "evanescente", que emerge al otro lado de la lámina, es sensible al índice refractario de la capa del analito adsorbido. A un cierto ángulo de incidencia, tiene lugar una resonancia óptica, y se puede calcular la masa adsorbida del analito a partir de estos datos. El SPR tiene aproximadamente el mismo límite de detección que la elipsometría, pero las láminas reflectantes necesitan una capa delgada de una sustancia con un índice de refracción alto sobre el lado de la adsorción del analito de la lámina, usualmente una capa delgada de oro. Debido a que esta capa debe satisfacer especificaciones estrictas, las láminas de SPR son caras. En cambio, las láminas de silicona utilizadas en un elipsómetro son baratas y se pueden utilizar como desechables.

Para el TIRF, la onda evanescente tiene lugar a un ángulo de incidencia que conduce a una reflexión total. La onda penetra una distancia corta en la solución y excita las sondas fluorescentes acopladas a los analitos. La intensidad de la señal fluorescente es proporcional a la cantidad adsorbida del analito. No se requieren láminas caras, pero la técnica es menos sensible que la elipsometría o SPR.

A parte de las diferentes técnicas para la medición de la masa superficial, se pueden utilizar también diferentes combinaciones enzima-sustrato en la presente invención siempre y cuando se produzca un precipitado. En lugar del sistema del ejemplo peroxidasa de rábano picante (HRP) y 3,3'-diaminobenzidina (DAB), por ejemplo, se podría utilizar fosfatasa alcalina (AP) como enzima y 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (BCIP) con tetrazolio de nitroazul (NBT) como sustratos. Se podría utilizar también cualquier combinación enzima/sustrato, o incluso formación de precipitado que no se base en la conversión enzimática, pero sí, por ejemplo, en la nucleación.

Adicionalmente, aunque los ejemplos dados en la presente invención describen la determinación de las concentraciones de proteína en soluciones tampón, el principio es también válido para cualquier otro tipo de solución o suspensión, notablemente aquellos que se utilizan con fines medicinales tales como orina, plasma o sangre.

Para describir la invención, los ejemplos presentados a continuación se refieren a tres diferentes análisis de proteínas, diferenciándose con respecto a la proteína (analito) que se debe ensayar, pero también difieren con respecto a la preparación de la superficie y al principio de detección.

El ejemplo 1 se refiere a un ensayo de anexina V. La anexina V es una proteína intracelular con una función biológica que está todavía desconocida. Se ha utilizado anexina V como proteína modelo por los parámetros bien definidos para su adsorción sobre membranas de fosfolípidos. Es una proteína que, en presencia de calcio, tiene una alta afinidad de unión a las membranas de fosfolípidos, proporcionando que estas membranas contengan aminofosfolípidos tales como fosfatidilserina (PS). El proceso de adsorción está limitado por el transporte, y la velocidad de adsorción de la anexina V que se puede calcular exactamente a partir de las condiciones de agitación y de la concentración de anexina V en la solución. Tal como se muestra en el ejemplo 1, se ha adsorbido anexina V directamente sobre láminas de silicona, que se han recubierto previamente con bicapas de fosfolípidos, y detectado con un procedimiento inmunológico de dos etapas de acuerdo con la invención. Dichas bicapas de fosfolípidos son un ejemplo de un partícipe específico de unión que no es un anticuerpo al analito en cuestión. Este ejemplo muestra que se puede estudiar la unión de anexina V a membranas con la presente invención en el rango de concentración fisiológica normal de anexina V en plasma de 1-5 ng/ml.

En el ejemplo 2, se han determinado la proteína unida al ácido graso (FABP) (y también anexina V) sobre láminas de silicona recubiertas con cloruro de polivinilo (PVC), utilizando el principio de sándwich para la detección. FABP es una proteína de marcador cardíaco con una concentración normal de plasma de 1-2 ng/ml, que actualmente está bajo investigación como un marcador anterior para infarto de miocardio agudo, y como un marcador para terapia de repercusión lograda después del infarto de miocardio agudo. Hoy en día, los ELISA para esta proteína tardan una hora aproximadamente de tiempo de ensayo, en cambio se podría reducir este tiempo a pocos minutos con la técnica de la invención. Utilizando un instrumento dedicado, esto conduciría a una medición de comportamiento
rápido.

El ejemplo 3 describe la utilización de la invención para ensayar interleucina 6 (IL6). IL6 es un mediador importante de la respuesta inflamatoria, con una concentración normal de plasma inferior a 10 pg/ml. Actualmente, la determinación de concentraciones de este tipo con ELISA convencional tarda varias horas, en cambio se puede realizar, tal como se demuestra a continuación, en 30 minutos utilizando la nueva técnica de la invención. Para IL6, se ha adsorbido el anticuerpo receptor durante 15 minutos solamente sobre láminas de silicona fuertemente hidrofóbicas (silanizadas), y se ha utilizado el sistema biotina-estreptavidina para la detección.

Estos ejemplos demuestran que se puede utilizar el método para un amplio rango de superficies y principios de detección. Se podrían utilizar igualmente otras superficies reflectantes que no sean láminas de silicona, por ejemplo, láminas de vidrio pulverizadas con cromo, y de hecho se han utilizado anteriormente por el grupo de los autores de la presente invención [1, 2].

Considerando estas circunstancias, se consideran los siguientes aspectos parte de la invención:

1)

Medición cuantitativa de las concentraciones de analitos específicos, tales como proteínas, péptidos, azúcares, etc., en soluciones, por medio de medición elipsométrica in situ de (la velocidad de) acumulación del precipitado formado mediante la acción continua de moléculas de enzima que se unen directamente al analito unido a la superficie o se acoplan a otras moléculas que se unen a estos analitos.

2)

Utilización del principio 1) para la medición de las concentraciones de analitos de este tipo en cualquier tipo de solución o suspensión, tal como agua destilada, soluciones tampón, solución salina fisiológica, orina, plasma, sangre, etc.

3)

Utilización del principio 1) combinado con otras técnicas para medición cuantitativa de masa superficial, tal como otras formas de reflectometría que no sea elipsometría, resonancia de plasmones superficiales, fluorescencia de reflexión interna total, etc.

4)

Utilización del principio 1) combinado con cualquier otra forma de superficies reflectantes u otras formas de preparación superficial, tales como recubrimiento previo de superficies reflectantes con fosfolípidos o polímeros.

5)

Utilización del principio 1) combinado con cualquier modificación del principio de detección, tal como otras combinaciones enzima/sustrato o reacciones de formación de precipitado, técnicas de sándwich, etiquetados de molécula de enzima simples frente a los múltiples, unión directa o competitiva, etc.

6)

Utilización del principio 1) en un inmunoensayo con adición simultánea, o adición sucesiva a tiempo corto del analito, conjugado y sustrato donde se forma el precipitado, sin intervenir las etapas de lavado o enjuague (ELISA en una etapa).

7)

Combinación del principio 1) con la utilización de superficies accesibles y uniformes, preferentemente un disco giratorio, para descripción cuantitativa de la velocidad de formación de precipitado y para la expresión de la actividad (biológica) de la unión de la superficie en la cantidad del agente activo unido por área superficial de unidad.

Ejemplo 1 Determinación de las concentraciones de anexina V en silicona

Se han cubierto las láminas con bicapas de fosfolípido mediante la adición de 20 \muM de ampollas de fosfolípido, obtenidas mediante sonicación de una mezcla de 20% de DOPS / 80% de DOPS, tal como se ha descrito en las referencias [3, 4]. Después de la formación de una bicapa estable de fosfolípidos sobre la superficie, se ha eliminado el exceso de fosfolípido mediante el enjuague de la cubeta con tampón, y se ha añadido anexina V humana. Después de 200 s de adsorción, se ha enjuagado la cubeta y se ha añadido anti anexina V policlonal de conejo durante 120 s. Se ha enjuagado nuevamente la cubeta y se ha añadido durante 120 s el anti-conejo IgG de cerdo, conjugado a HRP. Nuevamente, se ha enjuagado la cubeta, se han añadido 0,278 mM de DAB y 0,834 mM de H_{2}O_{2} y se ha medido la formación del precipitado sobre la superficie mediante elipsometría. Se muestran los resultados en la tabla 1.

TABLA 1

1

Si el límite de detección se define como un cambio de polarizador que excede el cambio de polarizador más 3 veces el SD para el blanco, se deduce de la tabla 1 que ya se podría medir la concentración superficial más baja de 0,01 ng/cm^{2}, que es 100 veces aproximadamente más baja que la detectable por elipsometría directa, en un tiempo de incubación de 300 s.

Ejemplo 2 Determinación de las concentraciones de FABP

Se han dotado de recubrimiento láminas de silicona con capas homogéneas de PVC de 20-25 nm de espesor mediante un procedimiento de inmersión automatizado de las láminas en una solución de PVC en ciclohexano. Se han cubierto las láminas con anticuerpos monoclonales frente a FABP (y anexina V) mediante adsorción durante toda la noche, y se ha bloqueado el espacio de superficie libre con albúmina o polvo de leche desnatada. Luego, se han expuesto las láminas durante 10 minutos a varias concentraciones de FABP (o anexina V), y se han detectado las proteínas adsorbidas directamente con conjugados de anticuerpos monoclonales/HRP o, para anexina V, con el procedimiento de dos etapas descrito. Se muestra en la figura la formación del precipitado después de la adición de DAB, tal como se ha medido por elipsometría. Se podría medir una concentración de 0,5 ng/ml con un tiempo de conversión de DAB de 120 s.

Ejemplo 3 Determinación de concentraciones de IL6

Se ha adsorbido un anticuerpo receptor monoclonal frente a IL6 durante 15 minutos solamente sobre láminas de silicona fuertemente hidrofóbicas (silanizadas), y se han añadido varias concentraciones de IL6 durante 10 minutos solamente. Se realizaron dos etapas cortas de incubación con anticuerpos biotinilados anti-IL6 y (multi)HRP etiquetado con estreptavidina. En la tabla 2, se muestran los resultados de la medición elipsométrica de la formación del precipitado después de la adición de DAB. Se podría medir una concentración de 10 pg/ml de IL6 en un tiempo de conversión de DAB de menos de 300 s y a un tiempo total de ensayo de menos de 30 min.

TABLA 2

2

Referencias

1. Cuypers PA, Corsel JW, Janssen MP, Kop JMM, Hermens WTh, Hemker HC. The adsorption of prothrombin to phosphatidylserine multilayers, quantitated by ellipsometry. J Biol Chem 1983; 258: 2426-31.

2. Corsel JW, Willems GM, Kop JMM, Cuypers PA, Hermens WTh. The role of intrinsic binding rate and transport rate in the adsorption of prothrombin, albumin and fibrinogen to phospholipid bilayers. J Colloid Interface Sci 1986; 111: 544-54.

3. Giesen PLA, Willems GM, Hemker HC, Hermens WTh: Membrane-mediated assembly of the prothrombinase complex. J Biol Chem 1991; 266: 18720-5.

4. Giesen PLA, Hemker HC, Hermens WTh: Production of thrombin as a probe for mixing of phospholipids in membranes on solid supports. Biochim Biophys Acta 1995; 1237: 43-8.

5. Mandenius CF, Mosbach K. Detection of biospecific interactions using amplified ellipsometry. Anal Biochem 1988; 170: 68-72.

6. Nygren H. Experimental demonstration of lateral cohesion in a layer of adsorbed protein and in layers of gold-antibody complexes bound to surface-immobilized. antigen. J Immunol Meth 1988; 114: 107-114.

7. Rongen HAH, van der Horst HM, Hugenholtz GWK, Bult A, van Bennekom WP. Development of a liposome immunosorbent assay for human interf6ron-gamma. Anal Chim Acta 1994; 287: 191-199.

8. Reeves SG, Siebert STA, Roberts MA, Durst RA. Liposome immunosensing devices for environmental Contaminant screening. Trends in Anal Chem 1995; 14: 351-355.

9. Willems GM, Giesen PLA, Hermens WTh: Adsorption and conversion of prothrombin on a rotating disc. Blood 1993; 82: 497-504.

Claims (13)

1. Método de inmunoensayo para determinar un analito adsorbido sobre una superficie o presente en una muestra líquida, que comprende unir dicho analito a una fase sólida, acoplar un marcador al analito, y detectar el marcador acoplado en dicha fase sólida, en el que se utiliza una combinación de un marcador y de medios de detección que es capaz de producir un precipitado sobre una fase sólida que lleva el marcador, y se detecta la unión del analito a la fase sólida sin llevar a cabo manipulaciones tales como enjuague, secado o aclarado, determinando in situ el cambio de la masa superficial de dicha fase sólida debido a la formación de dicho precipitado.

2. Método de inmunoensayo, según la reivindicación 1, que es un método cuantitativo para determinar la concentración del analito en una muestra.

3. Método de inmunoensayo, según la reivindicación 1 ó 2, que es un método cuantitativo para medir concentraciones superficiales del analito, adsorbido o unido a superficies sólidas o membranas biológicas (modelo).

4. Método de inmunoensayo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que se determina el cambio de la masa superficial de la fase sólida mediante elipsometría.

5. Método de inmunoensayo, según la reivindicación 4, en el que se lleva a cabo la elipsometría sobre una superficie accesible de modo uniforme, preferentemente un disco giratorio.

6. Método de inmunoensayo, según las reivindicaciones 1-3, en el que se determina el cambio de la masa superficial de la fase sólida mediante resonancia de plasmones superficiales.

7. Método de inmunoensayo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que se determina el cambio de la masa superficial de la fase sólida mediante fluorescencia de reflexión interna total.

8. Método de inmunoensayo, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho marcador es una enzima y dichos medios de detección comprenden un sustrato de dicha enzima.

9. Método de inmunoensayo, según la reivindicación 8, en el que se utiliza peroxidasa de rábano picante como enzima y 3,3'-diaminobezidina como sustrato.

10. Método de inmunoensayo, según la reivindicación 8, en el que se utiliza fosfatasa alcalina como enzima y 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato y tetrazolio de nitroazul como sustrato.

11. Método de inmunoensayo, según las reivindicaciones 1-3, realizado como ELISA en una etapa.

12. Método de inmunoensayo, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se utiliza una lámina de silicona como fase sólida.

13. Método de inmunoensayo, según las reivindicaciones 1-11, en el que se utiliza una lámina de vidrio pulverizada con cromo como fase sólida.