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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Immunoassays zur Bestimmung
eines Analyten, insbesondere eines an einer Oberfläche adsorbierten
Analyten, oder eines Analyten, wie er in einer flüssigen Probe
in Lösung
oder an einem speziellen Ort darin vorliegt, wie an einer speziellen
Oberfläche.
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Die
Erfindung betrifft insbesondere enzymgebundene Immunosorptionsassays
(ELISA) zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer
flüssigen
Probe einschließlich
seiner Konzentration in der Masse der flüssigen Probe oder seiner Konzentration
an einer speziellen Oberfläche.
Die vorliegende Erfindung betrifft speziell neue Immunoassayverfahren
und Kits, die speziell an die Durchführung dieser neuen Immunoassayverfahren
angepasst sind.
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Hintergrund
der Erfindung
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Immunoassays
wie ELISA werden weitverbreitet zur entweder qualitativen oder meistens
quantitativen Bestimmung einer nahezu unbegrenzten Vielfalt von
organischen Substanzen, die entweder natürlicher Herkunft oder synthetische
chemische Verbindungen sind, wie beispielsweise Peptiden, Proteinen,
Enzymen, Hormonen, Vitaminen, Arzneimittelwirkstoffen, Kohlehydraten,
usw., für
verschiedene Zwecke, wie beispielsweise insbesondere für diagnostische
Zwecke, jedoch auch für
forensische Anwendungen, zur Nahrungsmittelqualitätskontrolle
und allgemein für
jeden analytischen Zweck eingesetzt. Alle derartigen zu bewertenden
Substanzen werden hier allgemein als Analyte bezeichnet.
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Es
gibt viele verschiedene Varianten von ELISA-Verfahren. Die hier
im Folgenden gegebene Beschreibung soll eine typische ELISA-Technik
illustrieren. Sie gibt nicht vor, vollständig zu sein, und sollte in
keinerlei Weise als den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränkend angesehen
werden. In der folgenden Beschreibung werden ELISA-Verfahren beispielsweise
als separate Stufen des Inkubierens einer Probe mit einem ersten
Bindungspartner des Analyten und des Inkubierens des gebildeten
Reaktionsprodukts mit einem zweiten Bindungspartner des Analyten
umfassend beschrieben (anschließend
werden Bindungspartner des Analyten mitunter als Bindungspartner
für den
Analyten beschrieben). Einige existierende ELISA-Ausführungsformen
umfassen jedoch keine derartigen separaten Inkubationsstufen und
ermöglichen
das Reagieren des Analyten simultan oder kurz nacheinander in einer
und derselben Inkubationsstufe mit sowohl seinem ersten als auch
seinem zweiten Bindungspartner. Konkurrierende ELISA sind ein weiteres
Beispiel für
ELISA-Varianten,
die hier nicht detailliert erörtert
werden. Die vorliegende Erfindung ist prinzipiell auf irgendwelche
und alle ELISA-Varianten und auf ähnliche Immunoassayverfahren
anwendbar, die genau genommen keine ELISA-Verfahren sind, z. B.
weil an ihnen nicht die Verwendung eines Enzyms beteiligt ist.
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In
einem typischen ELISA wird die Probe mit einem ersten Bindungspartner
für den
Analyten in Kontakt gebracht, und die Probe und der Bindungspartner
für den
Analyten werden für
eine ausreichende Zeitdauer inkubiert, damit der in der Probe enthaltene
Analyt an den Bindungspartner binden kann, um die Anwesenheit eines
interessierenden Analyten nachzuweisen, oder die Konzentration eines
interessierenden Analyten zu messen, insbesondere in einer flüssigen Probe,
die eine Körperflüssigkeit
wie Blut, Plasma, Serum, Urin, Speichel, Sputum, usw. sein kann.
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Ein
typisches Beispiel für
einen solchen Bindungspartner ist ein Analyt-spezifischer Antikörper, z.
B. ein monoklonaler Antikörper
mit Spezifizität
für den
fraglichen Analyten. Andere Arten von Substanzen und Strukturen
können
sich jedoch ebenfalls als Bindungspartner eignen. Der natürliche Rezeptor
des fraglichen Analyten könnte
beispielsweise als Bindungspartner nützlich sein, ebenso wie andere
Substanzen und Strukturen, an die sich der Analyt binden kann. Der
Bindungspartner ist normalerweise ein spezifischer Bindungspartner,
dies ist jedoch kein Muss. Es ist sogar möglich, ohne einen ersten Bindungspartner
zu arbeiten und den Analyten entweder direkt (z. B. durch Adsorption)
oder durch eine nicht spezifisch bindende Verbindersubstanz zu immobilisieren
(d. h. an eine feste Phase zu binden). Alle derartigen Varianten
sollen ausdrücklich
in den Umfang dieser Erfindung eingeschlossen sein. Die Worte "an einer Oberfläche adsorbierter
Analyt" beziehen
sich hier auf irgendein Verfahren, das zum Anbringen oder Binden
des Analyten an einer Oberfläche
führt.
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Der
erste Bindungspartner wird üblicherweise
in einer immobilisierten Form, d. h. an einer festen Phase wie beispielsweise
Polystyrolperlen oder der Innenfläche des Reaktionsbehälters (z.
B. eines Reaktionsröhrchens
oder eine Mulde einer Mikrotiterplatte) angebracht verwendet. Der
Bindungspartner kann an der festen Phase physikalisch adsorbiert
sein, oder üblicherweise
durch kovalentes Binden befestigt werden. Der Bindungspartner wird
gemäß einigen
ELISA-Ausführungsformen
durch Verwendung eines geeigneten Kupplungsmittels und in anderen
durch Verwendung geeigneter Verbindersubstanzen, wie beispielsweise
Biotin und (Strept)avidin befestigt. In einigen ELISA-Ausführungsformen
wird die Immobilisierung des Bindungspartners nach der Inkubation
der Probe und des Bindungspartners durchgeführt, wodurch die Reaktion zwischen Analyten
und Bindungspartner in der flüssigen
Phase ablaufen kann. Der Bindungspartner kann in einer biotinylierten
Form aufgebracht werden, um seine nachfolgende Immobilisierung zu
ermöglichen.
Immobilisierung kann danach durch Verwendung einer festen Phase
bewirkt werden, die (Strept)avidin trägt.
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Infolge
dieser ersten Reaktion wird sich jeglicher in der Probe vorhandene
Analyt an seinen Bindungspartner und dadurch an die feste Phase
gebunden haben. Nachdem die Flüssigkeit
entfernt worden ist und die feste Phase gewaschen worden ist, werden üblicherweise
Schritte durchgeführt,
um das Ergebnis nachweisbar zu machen. Die feste Phase, an der der
Bindungspartner und der Analyt, soweit vorhanden, angebracht worden
sind, wird mit einem zweiten Bindungspartner für den Analyten in Kontakt gebracht.
Wiederum ist ein spezifischer Bindungspartner die Regel, jedoch
nicht absolut erforderlich. Dieser zweite Bindungspartner trägt üblicherweise
eine Markierung/einen Marker, der seinen Nachweis ermöglicht.
In einigen ELISA-Ausführungsformen
wird der zweite Bindungspartner jedoch in nicht-markierter Form
verwendet und wird nach seiner Bindung markiert, indem ein markierter
Bindungspartner für
den zweiten Bindungspartner verwendet wird. Der zweite Bindungspartner
kann beispielsweise ein (entweder polyklonaler oder monoklonaler)
Maus-Antikörper gegen
den fraglichen Analyten sein, und nach seiner Bindung an den Analyten,
der über
seinen ersten Bindungspartner an der festen Phase angebracht worden
ist, wird ein markiertes Anti-Maus-IgG der Ziege verwendet, um eine
Markierung an dem immobilisierten Komplex anzubringen.
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Bei
ELISA besteht die Markierung aus einem Enzym, das zu einer nachweisbaren
Umwandlung eines Substrats in der Lage ist, z. B. einer Peroxidase
wie Meerrettich-Peroxidase, die in Gegenwart von Wasserstoffperoxid
ein Substrat wie 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin in ein farbiges
Produkt umwandeln kann.
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Nachdem
der Enzym-markierte Reaktant an dem immobilisierten Komplex angebracht
worden ist, wird normalerweise vor Eintreten in die eigentliche
Nachweisphase die feste Phase mit daran gebundenem Komplex gewaschen.
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In
der Nachweisphase wird Substratlösung
zu der festen Phase mit angebrachtem Komplex gegeben, und die Umwandlung
des Substrats, soweit vorhanden, wird nachgewiesen. Um quantitative
Messung des Analyten zu ermöglichen,
wird die feste Phase mit der Substratlösung für einen festgelegten Zeitraum
inkubiert, der ausreichend lang sein sollte, um eine wesentliche
enzymatische Umwandlung des Substrats in eine gefärbte Substanz
zu ermöglichen.
Nach Beendigung der Substratumwandlungsreaktion wird die Intensität der Färbung, die
proportional zu der Menge des immobilisierten Enzyms ist, durch
optische Mittel wie ein Photometer gemessen, um die Extinktion bei
einer gewählten
Wellenlänge,
wie 450 nm, zu messen.
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Ein
Nachteil der existierenden ELISA-Techniken ist, dass die Adsorptions-
und Nachweisphasen, um Assay-Empfindlichkeit zu gewährleisten,
bei niedrigen Analytkonzentrationen sehr zeitraubend sind. Die Adsorptionsgeschwindigkeit
des Analyten an der Oberfläche
ist proportional zu der Konzentration des Analyten in der Lösung und
wird daher auch sehr niedrig, selbst in gut gerührten Systemen. Um eine zuverlässige Messung
von Analyten zu ermöglichen,
die in einer Flüssigkeit
in einer Konzentration in der Größenordnung
von Nanogramm oder sogar Picogramm pro ml vorliegen, kann die Adsorptionsphase
eine Reaktionszeit von einer bis mehreren Stunden erfordern.
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Ein
weiterer Nachteil der bestehenden ELISA-Techniken ist, dass sie
nicht die Messung extrem niedriger Oberflächenkonzentrationen von Analyten
ermöglichen,
wie sie an der Oberfläche
biologischer (Modell)-Membranen vorkommen.
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Eine
Aufgabe dieser Erfindung liegt in der Bereitstellung einer modifizierten
Immunoassay-, z. B. ELISA-, -Technik, wodurch die Inkubationszeit
in der Adsorptions- und/oder Nachweisphase verringert oder die Empfindlichkeit
der Assays erhöht
wird, oder beides.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung modifizierter
Immunoassay-, z. B. ELISA-, -Techniken, die die Messung der Analytkonzentrationen
an einer speziellen Oberfläche
ermöglichen.
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Eine
weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung von Produkten,
die speziell zur Durchführung
dieser modifizierten Immunoassaytechniken adaptiert sind.
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Die
Erfindung betrifft eine fundamentale Modifikation des Assayprinzips
der Immunoassays, z. B. ELISA, wobei die Messung der Ansammlung
des Enzymprodukts in der (Massephasen)-Lösung durch in-situ-Messung
der Akkumulation des Niederschlags auf einer festen Oberfläche ersetzt
wird. Die vorliegende Erfindung bezieht die Verwendung eines Niederschlag
bildenden Systems, wie einer Enzym-Substrat-Kombination, die zur
Bildung, eines Niederschlags auf einer festen Oberfläche führt, und
die Messung der Oberflächenmasse
ein, z. B. durch Ellipsometrie oder andere Oberflächenmassenmesstechniken.
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Durch
Anwendung dieser Erfindung können
sehr niedrige Konzentrationen von adsorbiertem Analyten auf der
festen Oberfläche
bestimmt werden, und die Adsorptionsphase des Analyten aus der Flüssigkeit
an die Oberfläche
kann wesentlich verkürzt
werden. Der zeitraubende Aufbau der Produktkonzentration in der
Massenflüssigphase
ist auch nicht länger
erforderlich und wird durch eine Adsorption einer dünnen Niederschlagsschicht
mit nur molekularen Abmessungen auf der festen Oberfläche ersetzt.
Diese Modifikation führt
zu einem wesentlichen Anstieg der Assayempfindlichkeit und bietet
die Möglichkeit
deutlich kürzerer
Assayzeiten. Sie ermöglicht
auch die Bestimmung extrem niedriger Oberflächenkonzentrationen, wie sie.
an der Oberfläche
biologischer (Modell)-Membranen vorliegen können.
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Die
Bestimmung der Analytkonzentrationen durch "Immunoausfällung" ist eine wohl bekannte Technik. Der
Niederschlag der Analyt-Antikörper-Aggregate,
der nach diesem Verfahren nach Zugabe des ausfällenden Antikörpers gebildet
wird, wird üblicherweise
einfach sedimentieren gelassen, aufgefangen und gewogen. Trotz schlechter
Ausfällung,
wenn entweder der Analyt oder der Antikörper in großem Überschuss vorhanden ist, ist
gezeigt worden, dass diese Technik unter gut definierten Bedingungen
quantitative Interpretation der Daten ermöglicht (siehe z. B. die EP-A-0
368 462). In einer empfindlicheren und schnelleren Version dieser
Technik werden mit Antikörper
beschichtete (Latex)-Partikel zugefügt, und die Aggregatbildung
wird durch Lichtstreuung gemessen. Auf diese Weise wird die zeitraubende
Sedimentierung vermieden, und die Messungen können in Sekunden fertig sein.
Das vorliegende Verfahren unterscheidet sich fundamental von diesen
Techniken. In jenen Techniken wird der Analyt nicht an einer Feststoff/Flüssig-Grenzfläche konzentriert,
und die Niederschlagmenge wird nicht kontinuierlich im Zeitverlauf
erhöht,
wie wenn sie durch ein Enzym produziert wird. Wegen dieser Faktoren
und wegen einer unspezifischen Aggregation haben diese Techniken
eine begrenzte Empfindlichkeit und lassen Messung von Analytkonzentrationen
unter dem ng/ml-Bereich im Allgemeinen nicht zu.
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Analytische
Verfahren, die eine Enzym-gesteuerte Bildung eines (gefärbten) Niederschlags
beinhalten, sind an sich bekannt. Ein solches Verfahren ist beispielsweise
auf dem Sektor der Immunocytochemie bekannt. Bei diesem bekannten
Verfahren wird ein spezielles Protein in dem Gewebe bestimmt, indem
nach Gefrieren des Gewebes oder mittels verschiedener Formen chemi scher
Fixierung zuerst dünne
Gewebeschnitte hergestellt werden und danach Antikörper zugegeben
werden, die spezifisch das Protein erkennen und sich an dieses binden,
um die Anwesenheit und/oder Lokalisierung verschiedener Gewebeproteine
in histologischen Untersuchungen zu zeigen. Überschüssige Antikörper werden entfernt, und danach
wird ein zweiter Enzym-verbundener Antikörper, beispielsweise ein IgG-HRP-Konjugat,
zugefügt.
Nach Entfernen des überschüssigen Konjugats
wird ein geeignetes Substrat, wie beispielsweise 3,3'-Diaminobenzidin
(DAB), zugefügt.
Wenn das spezifische Protein in dem Gewebe vorhanden ist, erfolgt
eine lokalisierte Anfärbung
infolge der Bildung eines von DAB abgeleiteten Niederschlags.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft jedoch nicht die Lokalisierung und
den Nachweis von Proteinen in Gewebe, sondern den Nachweis und die
Messung von Analyt (Konzentrationen), der auf festen Oberflächen adsorbiert
ist oder in Lösungen
vorliegt. Die vorliegende Erfindung betrifft zudem eine (vorzugsweise
quantitative) Messung der Oberflächenmasse
(im ng/cm2-Bereich), während bei dem bekannten immunocytochemischen
Verfahren qualitative Ergebnisse erhalten werden, üblicherweise
durch visuelle oder mikroskopische Untersuchung. In einigen Untersuchungen
ist die Intensität
der Verfärbung
gemessen worden, indem optische Dichtemessungen verwendet wurden,
die Technik ist jedoch nie mit einer Technik zur quantitativen Messung der
Oberflächenmasse
kombiniert werden, wie Ellipsometrie oder anderen. Dies wäre in der
Durchführung auch
sehr schwierig, weil die Dicke der Gewebeschnitte (Mikrometer) in
einer anderen Größenordnung
als die Dicke der Niederschlagschichten (Nanometer) liegt, die in
dem erfindungsgemäßen Verfahren
gemessen wird.
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Der
Stand der Technik schlägt
die Verwendung von Immunoassays auf Basis von optischer Interferenz auf
speziell herge stellten, optisch aktiven Aufnahmeoberflächen vor,
die mit dünnen
Oxid-, Nitrid- oder Polymerfilmen beschichtet sind. Mittels dieser
Vorbeschichtung führt
die zusätzliche
Adsorption einer Niederschlagschicht zu visuell nachweisbaren Farbveränderungen.
Solche Anwendungen sind in der US-A-5 418 136 vorgestellt worden.
Die EP-A-0 546 222 beschreibt einen Immunoassay auf Basis von optischer
Interferenz auf einer Analyt bindenden Substratoberfläche, wobei
ein enzymatischer Marker an den oberflächengebundenen Analyten gebunden
wird und wobei ein Niederschlag als Ergebnis einer Reaktion zwischen
dem Marker und einem Ausfällungsmittel
auf der Oberfläche
gebildet wird. Nach Waschen und Trocknen der Oberfläche wird
der Niederschlag nachgewiesen, um die Anwesenheit des Analyten auf
der Oberfläche
zu zeigen. Neben visuellem Nachweis der Niederschlagsbildung wurde
in diesen Verfahren des Standes der Technik auch Messung des Niederschlags
durch Ellipsometrie verwendet. Die verschiedenen Spül- und/oder
Trocknungsstufen, die in diesen Techniken erforderlich sind, schließen jedoch
die hohe Empfindlichkeit aus, die durch in-situ-Messungen erhalten
werden kann. Zum Nachweis sehr niedriger Analytkonzentrationen in
biologischen Flüssigkeiten
wie Plasma, Serum, Blut, Milch oder Urin übersteigt die unspezifisch
adsorbierte Masse anderer Massensubstanzen, wie Albumin, oft die
winzigen Mengen des adsorbierten. Niederschlags, und Spülen oder
Trocknen führt
zu Veränderungen
in der Oberflächenmasse,
die den spezifischen Effekt bei weitem übertreffen. In-situ-Messung
bietet auch die Möglichkeit
eines einstufigen ELISA, wobei der Analyt, das Konjugat und das
chromogene Substrat zusammen ohne dazwischen liegende Wasch- oder
Trocknungsstufen zugegeben werden. Dies wäre bei einem normalen ELISA
unmöglich,
weil die Farbproduktion durch den Überschuss des nicht-gebundenen
Konjugats die Farbproduktion der geringen Menge an Analyt-gebundenem
Konjugat an der Oberfläche
bei weitem übertreffen
würde.
Im Unter schied dazu misst die vorliegende Technik nur den Niederschlag,
der durch oberflächengebundenes
Konjugat produziert wird. Zusätzlich
zu einer höheren Empfindlichkeit
ermöglicht
die vorliegende Verwendung der in-situ-Messung auch einen schnelleren
Assay, weil zeitraubende Spül-
und/oder Trocknungsstufen mit anschließender separater Messung des
Niederschlagsvermieden werden.
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Ein
weiterer fundamentaler Unterschied zu den in den beiden genannten
Patenten beschriebenen Techniken liegt darin, dass erfindungsgemäß keine
speziell hergestellten, optisch aktiven oder polymerbeschichteten
Oberflächen
erforderlich sind. Solche Oberflächen
sind teuer, genau wie die optisch aktiven Scheibchen, die in Techniken
auf Basis von Oberflächenplasmonresonanz
(SPR) verwendet werden, während in
dem erfindungsgemäßen Verfahren
preisgünstige
reflektierende (Einweg)-Oberflächen,
wie Siliciumwafer oder mit Chrom bedampfte Glasscheibchen verwendet
werden können.
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Der
Stand der Technik schlägt
die Verwendung verstärkter
Ellipsometrie als Mittel zur Erhöhung
der Empfindlichkeit von Proteinadsorptionsmessungen vor [5]. Bei
dem betreffenden Verfahren des Standes der Technik wurde die Masse
des Markierungsantikörpers
erhöht,
indem er an Siliciumdioxidpartikel gekuppelt wurde. Antikörperbeschichtete
Goldpartikel sind auch verwendet worden, vorwiegend in Kombination
mit Elektronenmikroskopie in Lokalisierungsuntersuchungen [6]. Eine
weitere Technik des Standes der Technik zur Verstärkung der
Oberflächenmasse
verwendet biotinylierte oder analytbeschichtete Liposomen [7, 8].
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Diese
Techniken unterscheiden sich fundamental von der vorliegenden Erfindung,
weil sie keine kontinuierliche Akkumulation von Niederschlag pro
Markierungsmolekül
verwenden, sondern einfach schwerere Markierungen verwenden. Der
Vorteil der besseren Nachweisbarkeit solcher schweren Markierungen
muss wegen ihrer langsameren Diffusion in Richtung Oberfläche gegen
ihre langsamere Adsorption abgewogen werden, und daher kommt die
Verwendung dieser Verfahren für
schnelle Assays nicht in Frage.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
Erfindung liefert ein Immunoassayverfahren zum Bestimmen eines Analyten,
der an einer Oberfläche
adsorbiert ist oder in einer flüssigen
Probe vorhanden ist, bei dem der Analyt an eine feste Phase gebunden
wird, ein Marker an dem Analyten angebracht wird und an der festen
Phase angebrachter Marker nachgewiesen wird, wobei eine Kombination
aus Marker und Nachweismittel verwendet wird, die in der Lage ist,
einen Niederschlag an einer festen Phase zu produzieren, die den
Marker trägt,
und das Binden des Analyten an die feste Phase nachgewiesen wird,
ohne Manipulationen wie Waschen, Trocknen oder Spülen durchzuführen, indem
die Änderung
der Oberflächenmasse
der festen Phase infolge der Bildung des Niederschlags in situ bestimmt
wird.
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Die
Erfindung liefert ferner einen Kit zur Durchführung eines Immunoassayverfahrens
zum Bestimmen eines Analyten, der an einer Oberfläche adsorbiert
oder in einer flüssigen
Probe vorhanden ist, wobei der Kit mindestens ein spezifisch an
die Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
angepasstes Mittel umfasst.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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Die
Figur zeigt die Ergebnisse einer Niederschlag-verstärkten ellipsometrischen
Messung von Fettsäure
bindendem Protein (a) und Annexin V (b) auf PVC-beschichteten Siliciumscheiben.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung liefert gemäß einem ersten Aspekt ein Immunoassayverfahren
zum Bestimmen eines Analyten, der auf einer Oberfläche adsorbiert
ist oder in einer flüssigen
Probe vorhanden ist, bei dem der Analyt an eine feste Phase gebunden
wird, ein Marker an dem Analyten angebracht wird und an der festen
Phase angebrachter Marker nachgewiesen wird, wobei eine Kombination
aus Marker und Nachweismittel verwendet wird, die in der Lage ist,
einen Niederschlag an einer festen Phase zu produzieren, die den
Marker trägt,
und das Binden des Analyten an die feste Phase in-situ nachgewiesen
wird, indem die Oberflächenmasse
der festen Phase infolge der Bildung des Niederschlags in situ bestimmt
wird.
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Der
Begriff "in-situ
Nachweis" soll wiederspiegeln,
dass eine Änderung
der Oberflächenmasse
bestimmt wird, wenn der Niederschlag gebildet wird. Mit anderen
Worten werden kein Waschen, Trocknen, Spülen oder andere Manipulationen
durchgeführt,
die zu Fehlern des gemessenen Ergebnisses führen können, weil sie eine weitere Änderung
der Oberflächenmasse
bewirken. Ein in-situ-Nachweis ermöglicht zudem die Messung der
Niederschlagsbildung durch oberflächengebundenes Enzym, sogar
in Anwesenheit von Substratumwandlung durch überschüssiges Enzym in der Lösungsphase
(einstufiger ELISA).
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Wie
bereits zuvor im Hintergrundabschnitt angegeben wurde, betrifft
die Erfindung eine große
Vielfalt unterschiedlicher Immunoassayverfahren. Die meisten haben
die Gemeinsamkeit, dass der Analyt, falls er in der Probe vorhanden
ist, durch das Zwischenstadium eines Bindungspartners des Analyten
an die feste Phase gebunden wird, üblicherweise eines spezifischen
Bindungspartners, wie eines Antikörpers, der den Analyten spezifisch
bindet. In einigen Ausführungsformen
kann der Analyt jedoch direkt durch Adsorption oder durch unspezifische
Verbindermittel an die feste Phase gebunden werden.
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Der
Bindungspartner kann, falls verwendet, vorab an die feste Phase
angebracht worden sein. Alternativ wird er an die feste Phase gebunden,
nachdem er mit dem Analyten, falls vorhanden, reagiert hat.
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Die
meisten Immunoassayausführungsformen
haben ferner die Gemeinsamkeit, dass ein zweiter Bindungspartner
des Analyten verwendet wird, um einen Marker an dem Analyten anzubringen.
Der Bindungspartner, falls verwendet, ist wiederum vorzugsweise
ein spezifischer Bindungskörper,
wie ein Antikörper,
der spezifisch an den Analyten bindet.
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Dieser
zweite Bindungspartner des Analyten kann den Marker tragen. Alternativ
trägt den
Marker jedoch eine Substanz, die an den zweiten Bindungspartner
des Analyten binden kann. Wenn der zweite Bindungspartner des Analyten
beispielsweise ein monoklonaler Antikörper der Ratte gegen den Analyten
ist, kann der Marker direkt an diesem monoklonalen Antikörper angebracht
werden, oder er kann alternativ an einen Anti-Maus-Ig-Antikörper angebracht
werden (d. h. einen Antikörper,
der spezifisch an Immunoglobuline der Ratte bindet).
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Das
Anbringen des Markers an dem Analyten kann entweder gleichzeitig
mit dem Anbringen des Analyten an der festen Phase durchgeführt werden,
oder vorher, oder danach. Es ist in den meisten Immunoassayverfahren
bevorzugt, den Analyten zuerst zu immobilisieren und lediglich danach
den Marker an den immobilisierten Analyten zu binden.
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Das
Verfahren ist vorzugsweise ein quantitatives Verfahren zur Bestimmung
der Konzentration des Analyten in der Probe. In einer anderen bevorzugten
Ausführungsform
ist das vorliegende Verfahren ein quantitatives Verfahren zur Bestimmung
der Kon zentration des Analyten an einer speziellen Oberfläche. Die
fragliche Oberfläche
kann eine biologische (Modell)-Membran, d. h. die Oberfläche einer
zellulären
Membran, oder eine künstliche
Oberfläche
sein, z. B. eine künstliche
Oberfläche,
die eine natürlich
vorkommende, interessierende Oberfläche imitieren soll, die vorzugsweise
auf einer einheitlich zugänglichen
Oberfläche
abgesetzt ist und quantitative Interpretation der Niederschlagsbildung
ermöglicht.
Die Erfindung ist jedoch nicht. auf quantitative Verfahren begrenzt
und kann nützlich
sein, um die Anwesenheit einer extrem niedrigen Konzentration des
Analyten in der Probe entweder in der Masse der Probe oder an einem
speziellen Ort, wie einer speziellen Oberfläche, qualitativ zu bestimmen.
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Die Änderung
der Oberflächenmasse
der festen Phase wird vorzugsweise durch Ellipsometrie bestimmt.
Die Erfindung erstreckt sich jedoch auf andere Techniken zur Bestimmung
der Änderung
der Oberflächenmasse
der festen Phase, wie Oberflächenplasmonresonanz
und totale innere Reflexionsfluoreszenz.
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In
den am meisten bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung ist der Marker ein Enzym, und das Nachweismittel umfasst
ein Substrat des Enzyms. Der Immunoassay ist vorzugsweise ein ELISA-Verfahren. Vorzugsweise
werden eine Meerrettich-Peroxidase als das Enzym und 3,3'-Diaminobenzidin
als das Substrat verwendet. Die vorliegende Erfindung erstreckt
sich jedoch auf andere Enzym-Substrat-Kombinationen, die einen Niederschlag
produzieren können,
wie alkalische Phosphatase als das Enzym und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat
und Nitroblau-tetrazolium als Substrat. Die Erfindung deckt ferner
irgendwelche anderen Kombination von Marker und Nachweismittel ab,
die einen Niederschlag auf einer festen Phase, die den Marker trägt, produzieren
kann. Die Bildung eines Niederschlags kann beispielsweise das Ergebnis
von Nukleierung durch nukleiertes Wachstum von Metall- oder Nichtmetallpartikeln
oder das Ergebnis von Ketten- oder Polymerisationsreaktionen von
z. B. ungesättigten
Kohlenwasserstoffen sein, die durch Einwirkung von z. B. Ultraviolettstrahlung,
usw. polymerisiert werden können.
Der Marker könnte
beispielsweise einen ungesättigten Kohlenwasserstoff
umfassen, und das Nachweismittel könnte eine weitere Menge des
gleichen oder eines anderen Kohlenwasserstoffs zusammen mit Mitteln
zum Initiieren der Polymerisation (wie UV-Strahlung) umfassen. Alternativ könnte der
Marker kolloidale Partikel eines Metalls, z. B. Gold, Silber, usw.,
oder eines Nichtmetalls, z. B. Selen, Tellur, Kohlenstoff, Siliciumdioxid,
usw. umfassen, während
das Nachweismittel eine Quelle einer weiteren Menge des gleichen
oder eines anderen Metalls oder Nichtmetalls zusammen mit Mitteln
(z. B. einem geeigneten Reduktionsmittel, wie einer Borhydridverbindung,
die das Metall aus einer chemischen Verbindung freisetzen kann,
die das Metall enthält)
umfasst, um das Wachstum der als Marker verwendeten kolloidalen
Partikel zu fördern.
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Es
ist erfindungsgemäß bevorzugt,
dass eine Siliciumscheibe als feste Phase verwendet wird. Die Erfindung
erstreckt sich jedoch auf andere feste Phasen, die zur Verwendung
in einer Technik zur Bestimmung der Änderung der Oberflächenmasse
der festen Phase geeignet sind, wie ein mit Chrom bedampftes Glasscheibchen.
Prinzipiell kann die feste Phase aus irgendeiner einfachen und preisgünstigen
reflektierenden Oberfläche
bestehen und erfordert keine Vorbehandlung, wie Ablagerung spezieller,
optisch aktiver Schichten, wie beispielsweise in der US-A-5 418
136 beschrieben ist.
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Die
Menge des Analyten, die auf feste Oberflächen adsorbiert wird, hängt im Allgemeinen
von den Transportbedingungen. (Diffusion und Rühren) in dem System ab. Bei
den üblichen
laminaren Strömungssystemen
impliziert dies, dass adsorbierte Mengen in Strömungsrichtung abnehmen können, weil
die Fluidgrenzflächenschicht
zunehmend an Analyt verarmt. Diese Ortsabhängigkeit der Menge an adsorbiertem
Analyten kann die quantitative Beschreibung der Rate der Niederschlagsbildung
stören,
wenn beispielsweise die biologische Auswirkung einer winzigen Proteinmenge,
die an einer Membran adsorbiert wird, gemessen wird [4] und danach
die für
diesen Effekt verantwortliche Proteinmenge die Messung wäre. Es ist
gefunden worden, dass dieses Problem überwunden werden kann, indem
das vorliegende Verfahren quantitativ an sogenannten einheitlich
zugänglichen
Oberflächen
durchgeführt
wird, das heißt,
mit identischen Adsorptionsbedingungen über die gesamte Oberfläche. Unter
Verwendung einer solchen Oberfläche
kann die biologische Wirkung mit der adsorbierten Menge an Analyt
verknüpft
werden, ausgedrückt
pro Flächeneinheit.
Eine einheitlich zugängliche
Oberfläche,
eine rotierende Scheibe in Lösung,
ist entwickelt worden und ermöglicht
ellipsometrische Messung der Analytadsorption auf ihrer Oberfläche [9].
Die Kombination mit Ellipsometrie an einer rotierenden Scheibe ist
daher eine bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung.
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Die
Adsorption von Analyten aus Pufferlösungen auf und allgemeiner
die Akkumulation fester Substanzen an planaren Oberflächen kann
mittels Ellipsometrie nachgewiesen und quantifiziert werden. Dies
ist eine optische Technik, die Reflexion von monochromatischem Licht
gegen die adsorbierende Oberfläche
verwendet, wobei die Technik eine quantitative Messung der Analytadsorption
mit einer Nachweisgrenze von 1 bis 5 ng/cm2 ermöglicht.
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Die
reflektierende Oberfläche,
in den hier gegebenen Beispielen ein vorbehandeltes Siliciumscheibchen,
wird beispielsweise in einer Quarzküvette angeordnet, die mit z.
B. 5 ml Pufferlösung
gefüllt
wird. Monochromatisches Licht aus einem He-Ne-Laser mit einer Wellenlänge von
632,8 nm durchläuft
zuerst ein polarisierendes Prisma P und danach eine Viertelwellenplatte
mit seiner schnellen Achse bei 45° zur
Einfallebene. Das Licht tritt danach in die Küvette ein, wird gegen das Siliciumscheibchen
reflektiert, tritt aus der Küvette
aus, durchläuft
ein zweites polarisierendes Prisma A und wird schließlich durch
eine Photodiode nachgewiesen. Die Positionen von P und A werden
mittels eines Computers eingestellt, um so die resultierende Lichtintensität, die die
Photodiode erreicht, auf einem Minimum zu halten. Wenn eine feste
Substanz auf der reflektierenden Oberfläche adsorbiert, werden die
Positionen von P und A verändert,
um die Intensität
minimal, zu halten. Eine solche Adsorption führt somit zu einer Veränderung
der Positionen von dem "Polarisator" P und dem "Analysator" A. In dem speziellen
Fall von Siliciumscheibchen als reflektierender Oberfläche und
organischen Substanzen, wie beispielsweise Proteinen, Lipiden, Zuckern
oder organischen Niederschlägen,
als adsorbierenden Analyten ist die Änderung der adsorbierten Oberflächenmasse
direkt proportional zu der Veränderung
in dem Polarisator. Die in den Beispielen verwendeten Scheibchen
wurden aus Siliciumwafern geschnitten (Wacker Chemitronic; n-Typ,
phosphordotiert). Die Messungen wurden bei Raumtemperatur (20°C ± 1°C) unter
kontinuierlichem Rühren
mit einem sich drehenden Rührer
durchgeführt.
Das Instrument und die Datenanalyse sind in früheren Veröffentlichungen unserer Gruppe
[1, 2] beschrieben worden.
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In
einem typischen Experiment wird das vorbehandelte Scheibchen in
die Ellipsometerküvette
gegeben und eine Nullablesung (P0, A0) durchgeführt. Danach wird das zu bewertende
Protein zu dem Puffer gegeben und eine geeignete Zeitdauer, beispielsweise
5 Minuten, auf das Scheibchen adsorbieren gelassen. Bei sehr niedrigen
Proteinkonzentrationen, wie in der vorliegenden Beschreibung verwendet
werden, bleibt die Proteinmenge, die in diesem Zeitraum adsorbiert,
unter der Nachweisgrenze des Ellipsometers, so dass die Positionen
P0 und A0 im Wesentlichen unverändert
bleiben. Die Küvette
wird danach mit frischem Puffer gewaschen, und der freie Oberflächenraum
auf dem Scheibchen wird durch Adsorption von Albumin oder anderen
Massenproteinen blockiert. Ein Antikörper-Meerrettichperoxidase-
(HRP)-Konjugat wird danach zugegeben und eine geeignete Zeitdauer
adsorbieren gelassen, beispielsweise zwei Minuten lang. Die Küvette wird wieder
gewaschen, und eine Substratlösung,
die 3,3'-Diaminobenzidin
(DAB) und H2O2 enthält, wird
zugegeben. An Stellen, an denen sich Konjugatmoleküle an das
adsorbierte Protein gebunden haben, bildet sich durch die enzymatische
Wirkung von HRP DAB-Niederschlag. Wegen der fortlaufenden DAB-Umwandlung wird
die Oberflächenmasse
des Niederschlags schon bald viel größer als die ursprüngliche
Proteinmasse und wird durch Ellipsometrie nachweisbar.
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In
einem anderen Aufbau, der die Bestimmung sehr niedriger Proteinkonzentrationen
anstrebt, werden die Waschstufen zwischen der Zugabe von Analyt,
Konjugat und Ausfällungssubstrat
weggelassen und der Analyt, das Konjugat und das DAB-Substrat werden
zusammen oder kurz nacheinander zugegeben. Auf diese Weise wird
ein einstufiger ELISA erhalten.
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Erfindungsgemäß wird die
Messung der Rate der Niederschlagsbildung auf der festen Oberfläche vorzugsweise
durch Ellipsometrie durchgeführt.
Das. Assayprinzip der vorliegenden Erfindung kann jedoch gleichermaßen gut
auf andere Techniken zur quantitativen Messung der Oberflächenmasse
angewendet werden, wie anderen Formen von Reflektometrie als Ellipsometrie,
Oberflächenplasmonresonanz
(SPR) und totale innere Reflexionsfluoreszenz. Ellipsometrie ist
eine spezielle Form von Reflektometrie, und es gibt einfachere Formen
davon, beispielsweise Ausführungsformen
ohne die Viertelwellenplatte. Diese Techniken haben als gemeinsames
Merkmal, dass Lichtreflexion an der gleichen Seite der reflektierenden
Oberfläche
stattfindet wie die Analytadsorption. Dies trifft auf die SPR und
die TIRF nicht zu, und die Lichtreflexion findet an der nichtadsorbierenden
Seite des Scheibchens statt.
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Bei
der SPR ist eine sogenannte "dämpfende" Lichtwelle, die
an der anderen Seite des Scheibchens austritt, empfindlich gegenüber dem
Brechungsindex der adsorbierten Analytschicht. Bei einem bestimmten Einfallwinkel
erfolgt eine optische Resonanz, und die adsorbierte Masse des Analyten
kann aus diesen Daten berechnet werden. Die SPR hat ungefähr die gleiche
Nachweisgrenze wie Ellipsometrie, die reflektierenden Scheibchen
benötigen
jedoch eine dünne
Schicht aus einer Substanz mit einem hohen Brechungsindex auf der
Analyt adsorbierenden Seite des Scheibchens, üblicherweise eine dünne Goldschicht.
Weil diese Schicht enge Spezifikationen erfüllen muss, sind SPR-Scheibchen teuer.
Im Unterschied dazu sind die in einem Ellipsometer verwendeten Siliciumscheibchen
preisgünstig
und können
als Einwegmaterialien verwendet werden.
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Bei
der TIRF liegt die gedämpfte
Welle bei einem Einfallwinkel, der zu Totalreflexion führt. Die
Welle dringt ein kurzes Stück
in die Lösung
ein und regt Fluoreszenzsonden an, die an den Analyten angebracht
sind. Die Intensität
des Fluoreszenzsignals ist proportional zu der adsorbierten Menge
des Analyten. Es sind keine teuren Scheibchen erforderlich, die
Technik ist jedoch weniger empfindlich als die Ellipsometrie oder
die SPR.
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Neben
anderen Techniken zur Messung der Oberflächenmasse können erfindungsgemäß auch andere
Enzym-Substrat-Kombinationen verwendet werden, solange sie einen
Niederschlag erzeugen. Statt des beispielhaften Systems aus Meerrettichperoxidase (HRP)
und 3,3'-Diaminobenzidin
(DAB) könnten
beispielsweise alkalische Phosphatase (AP) als Enzym und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP)
mit Nitroblautetrazolium (NBT) als Substrate verwendet werden. Irgendeine
andere Enzym/Substrat-Kombination
oder sogar Niederschlagsbildung, die nicht auf enzymatischer Umwandlung,
sondern beispielsweise auf Nukleierung basiert, könnte ebenso
verwendet werden.
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Obwohl
die hier gegebenen Beispiele die Bestimmung von Proteinkonzentrationen
in Pufferlösungen illustrieren,
gilt das Prinzip ebenso für
irgendeinen anderen Lösungs-
oder Suspensionstyp, insbesondere jene, die für medizinische Zwecke verwendet
werden, wie Urin, Plasma oder Vollblut.
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Zur
Veranschaulichung der Erfindung betreffen die hier gegebenen Beispiele
drei verschiedene Proteinassays, die sich in Bezug auf das zu bewertende
Protein (Analyt) unterscheiden, sich jedoch auch in Bezug auf Oberflächenvorbereitung
und Nachweisprinzip unterscheiden.
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Beispiel
1 betrifft einen Assay von Annexin V. Annexin V ist ein intrazelluläres Protein
mit einer noch unbekannten biologischen Funktion. Annexin V ist
wegen der wohl definierten Parameter für seine Adsorption an Phospholipidmembranen
als Modellprotein verwendet worden. Es ist ein Protein, das in Gegenwart
von Calcium hohe Bindungsaffinität
für Phospholipidmembranen
hat, vorausgesetzt, dass diese Membranen Aminophospholipide wie
Phosphatidylserin (PS) enthalten. Der Adsorptionsprozess ist transportbegrenzt,
und die Rate der Annexin V Adsorption kann genau aus den Rührbedingungen
und der Annexin V Konzentration in Lösung berechnet werden. Wie
in Beispiel 1 gezeigt ist, wurde Annexin V direkt auf Siliciumscheibchen
adsorbiert, die mit Phospholipiddoppelschichten vorbeschichtet worden
waren, und wurde erfindungsgemäß mit einem
zweistufigen Immunoverfahren nachgewiesen. Die Phospholi pid-Doppelschichten
sind ein Beispiel für
einen spezifischen Bindungspartner, der kein Antikörper für den fraglichen
Analyten ist. Dieses Beispiel zeigt, dass Binden von Annexin V an
Membranen erfindungsgemäß in dem
normalen physiologischen Konzentrationsbereich von Annexin V im
Plasma von 1 bis 5 ng/ml untersucht werden kann.
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In
Beispiel 2 wurden Fettsäure-Bindungsprotein
(FABP) (und auch Annexin V) auf Polyvinylchlorid(PVC)-beschichteten
Siliciumscheibchen unter Verwendung des Sandwich-Prinzips zum Nachweis
bestimmt. FABP ist ein Herzmarkerprotein mit einer normalen Plasmakonzentration
von 1 bis 2 ng/ml, das momentan als Frühmarker für den akuten Herzinfarkt und
als Marker für
die erfolgreiche Reperfusionstherapie nach akutem Herzinfarkt verwendet
wird. Die heutigen ELISA für
dieses Protein benötigen
etwa eine Stunde Versuchszeit, während
diese Zeit mit der Technik der vorliegenden Erfindung auf wenige
Minuten verkürzt
werden könnte.
Mit einem eigens dafür
verwendeten Instrument würde
dies rasche Messung am Bett ermöglichen.
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Beispiel
3 veranschaulicht die Verwendung der Erfindung zur Bewertung von
Interleukin 6 (IL6). IL6 ist ein wichtiger Mediator der entzündlichen
Reaktion mit einer normalen Plasmakonzentration unter 10 pg/ml.
Die Bestimmung solcher Konzentrationen mit konventionellen ELISA
benötigt
momentan mehrere Stunden, während
sie, wie hier gezeigt wird, mit der neuen erfindungsgemäßen Technik
innerhalb von 30 Minuten durchgeführt werden kann. Bei IL6 wurde
der Abfänger-Antikörper nur
15 Minuten auf stark hydrophoben (silanisierten) Siliciumscheibchen
adsorbiert, und das Biotin-Streptavidin-System wurde zum Nachweis
verwendet.
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Diese
Beispiele zeigen, dass das Verfahren für einen umfassenden Bereich
von Oberflächen
und Nachweisprinzipien verwendet werden kann. Andere reflektierende
Oberflächen
als Si liciumscheibchen, beispielsweise mit Chrom bedampfte Glasscheibchen,
können
gleichermaßen
gut verwendet werden und sind in der Tat von unserer Gruppe in der
Vergangenheit verwendet worden [1, 2].
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Unter
Berücksichtigung
dieser Umstände
werden die folgenden Aspekte als Teil der Erfindung angesehen:
- 1) Quantitative Messung der Konzentrationen
spezieller Analyten, wie Proteine, Peptide, Zucker, usw., in Lösungen mittels
in-situ-Ellipsometriemessung (der Geschwindigkeit) der Akkumulation
des durch die kontinuierliche Wirkung von (Enzym)-Molekülen gebildeten
Niederschlags, welche sich entweder direkt an den oberflächengebundenen
Analyten binden oder an andere Moleküle gekoppelt werden, die sich
an diese Analyten binden.
- 2) Die Verwendung von Prinzip 1) zur Messung der Konzentrationen
dieser Analyten in irgendeinem Typ von Lösung oder Suspension, wie destilliertem
Wasser, Pufferlösungen,
physiologischer Salzlösung,
Urin, Plasma, Vollblut, usw.
- 3) Die Verwendung von Prinzip 1) in Kombination mit anderen
Techniken zur quantitativen Messung der Oberflächenmasse, wie anderen Formen
von Reflektometrie als Ellipsometrie, Oberflächenplasmonresonanz, totale
innere Reflexionsfluoreszenz, usw.
- 4) Die Verwendung von Prinzip 1) in Kombination mit irgendeiner
anderen Form von reflektierenden Oberflächen oder anderen Formen von
Oberflächenherstellung,
wie Vorbeschichten reflektierender Oberflächen mit Phospholipiden oder
Polymeren.
- 5) Die Verwendung von Prinzip 1) in Kombination mit irgendeiner
Modifizierung des Nachweisprinzips, wie anderen Enzym/Substrat-Kombinationen
oder Niederschlag bildenden Reak tionen, Sandwich-Techniken, einzelnen
gegen mehrfachen Enzym-Molekül-Markierungen,
direkter oder kompetitiver Bindung, usw.
- 6) Die Verwendung von Prinzip 1) in einem Immunoassay mit gleichzeitiger
Zugabe, oder Zugabe kurz nacheinander, von Analyt, Konjugat und
Niederschlag bildendem Substrat ohne dazwischen erfolgende Spül- oder
Waschstufen (einstufiger ELISA).
- 7) Kombination von Prinzip 1) mit der Verwendung einheitlich
zugänglicher
Oberflächen,
vorzugsweise einer rotierenden Scheibe, zur quantitativen Beschreibung
der Rate der Niederschlagsbildung und zum Ausdruck der oberflächengebundenen
(biologischen) Aktivität
in der Menge des gebundenen Wirkstoffs pro Oberflächeneinheit.
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Beispiel 1. Bestimmung
der Annexin V Konzentrationen
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Siliciumscheibchen
wurden durch Zugabe von 20 μM
Phospholipidvesikeln, erhalten durch Ultraschallbehandlung einer
20 DOPS/80 % DOPC-Mischung, wie beschrieben [3,4], mit Phospholipiddoppelschichten bedeckt.
Nach Bildung einer stabilen Phospholipid-Doppelschicht auf der Oberfläche wurde überschüssiges Phospholipid
durch Waschen der Küvette
mit Puffer entfernt, und Human-Annexin V wurde zugefügt. Nach
200 s langer Adsorption wurde die Küvette gewaschen, und 120 s
lang wurde polyklonales Anti-Annexin V des Kaninchens zugefügt. Die
Küvette
wurde wiederum gewaschen und Anti-Kaninchen-IgG des Schweins, konjugiert
an HRP, wurde 120 s lang zugefügt.
Die Küvette
wurde wiederum gewaschen, 0,278 mM DAB und 0,834 mM H2O2 zugegeben und die Bildung von Niederschlag
an der Oberfläche
durch Ellipsometrie gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
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Tabelle
1. Bestimmung der Annexin V Konzentrationen
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Die
Werte geben Polarisatoränderungen
in Grad (± Standardabweichung)
von vier Experimenten an.
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Wenn
die Nachweisgrenze als Polarisatoränderung definiert ist, die
die Polarisatoränderung
plus drei Mal die Standardabweichung der Blindprobe übersteigt,
folgt aus Tabelle 1, dass die niedrigste Oberflächenkonzentration von 0,01
ng/cm2, die etwa 100 Mal niedriger als durch
direkte Elipsometrie nachweisbar ist,q bereits innerhalb von 300
s Inkubationszeit gemessen werden kann.
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Beispiel 2. Bestimmung
der FABP-Konzentrationen
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Siliciumscheibchen
wurden durch ein automatisiertes Tauchverfahren der Scheibchen in
eine Lösung von
PVC in Cyclohexanon mit homogenen PVC-Schichten mit 20 bis 25 nm
Dicke beschichtet. Die Scheibchen wurden durch über Nacht erfolgende Adsorption
mit monoklonalen Antikörpern
gegen FABP (und Annexin V) beschichtet, und freier Oberflächenraum
wurde durch entweder Albumin oder Magermilchpulver blockiert. Die Scheibchen
wurden dann 10 Minuten lang verschiedenen Konzentrationen von FABP
(oder Annexin V) ausgesetzt, und die adsorbierten Proteine wurden
direkt mit monoklonalen Antikörper/HRP- Konjugaten, oder
bei Annexin V mit dem beschriebenen Zweistufenverfahren nachgewiesen.
Die Niederschlagsbildung nach Zugabe von DAB, gemessen mittels Ellipsometrie,
ist in der Figur gezeigt. Innerhalb von 120 s DAB-Umwandlungszeit
konnte eine Konzentration von 0,5 ng/ml gemessen werden.
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Beispiel 3. Bestimmung
der IL6-Konzentrationen
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Ein
monoklonaler Abfänger-Antikörper gegen
IL6 wurde nur 15 Minuten lang auf stark hydrophoben (silanisierten)
Siliciumscheibchen adsorbiert, und verschiedene Konzentrationen
von IL6 wurden nur 10 Minuten lang zugegeben. Es folgten zwei kurze
Inkubationsstufen mit biotinylierten Anti-IL6-Antikörpern und
Streptavidin-markierter (Multi)-HRP. Die Ergebnisse der ellipsometrischen
Messung der Niederschlagsbildung nach Zugabe von DAB sind in Tabelle
2 gezeigt. Eine Konzentration von 10 pg/ml IL6 konnte in weniger
als 300 s DAB-Umwandlungszeit und einer Gesamtassayzeit von weniger
als 30 Minuten ermittelt werden.
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Tabelle
2. Bestimmung der IL6-Konzentrationen
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Die
Werte zeigen Polarisatoränderungen
in Grad (± Standardabweichung).
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Referenzen
-
- 1. P. A. Cuypers, J. W. Corsel, M. P. Janssen, J. M. M.
Kop, W. Th. Hermens, H. C. Hemker. The adsorption of prothrom bin
to phosphatidylserine multilayers, quantitated by ellipsometry.
J Biol Chem 1983; 258: 2426-31.
- 2. J. W. Corsel, G. M. Willems, J. M. M. Kop, P. A. Cuypers,
W. Th. Hermens. The role of intrinsic binding rate and transport
rate in the adsorption of prothrombin, albumin and fibrinogen. to
phospholipid bilayers. J. Colloid Interface Sci 1986; 111:544-54.
- 3. P. L. A. Giesen, G. M. Willems, H. C. Hemker, W. Th. Hermens:
Membrane-mediated assembly of the prothrombinase complex. J Biol
Chem 1991; 266: 18720-5.
- 4. P. L. A. Giesen, H. C. Hemker, W. Th. Hermens: Production
of thrombin as a probe for mixing of phospholipids in membranes
on solid supports. Biochim Biophys Acta 1995; 1237: 43-8.
- 5. C. F. Mandenius, K. Mosbach. Detection of biospecific interactions
using amplified ellipsometry. Anal Biochem 1988; 170: 68-72.
- 6. H. Nygren. Experimental demonstration of lateral cohesion
in a layer of adsorbed protein and in layers of goldantibody complexes
bound to surface-immobilized, antigen. J Immunol Meth 1988; 114:
107-114.
- 7. H. A. H. Rongen, H. M. van der Horst, G. W. K. Hugenholtz,
A. Bult, W. P. van Bennekom. Development of a liposome immunosorbent
assay for human interferon-gamma. Anal Chim Acta 1994; 287: 191-199.
- 8. S. G. Reeves, S. T. A. Siebert, M. A. Roberts, R. A. Durst.
Liposome immunosensing devices for environmental Contaminant screening.
Trends in Anal Chem 1995; 14: 351-355.
- 9. G. N. Willems, P. L. A. Giesen, W. Th. Hermens: Adsorption
and conversion of prothrombin on a rotating disc. Blood 1993; 82:
497-504.